Gehirn-gezielte Polysorbat 80-emulgierte Donepezil-Wirkstoff-beladene Nanopartikel für die Neuroprotektion

Einführung

AD ist eine Erkrankung des zentralen Nervensystems mit komplizierten pathologischen Mechanismen, die eine fortschreitende kognitive Dysfunktion verursacht, aber aufgrund der Schwierigkeiten bei der Arzneimittelverabreichung und der geringen Konzentration des Arzneimittels, die das Hirngewebe erreichen kann, sehr schwer zu behandeln ist [1, 2]. Die Passage der BBB ist zu einer der Hauptschwierigkeiten in der Forschung zu Drug-Delivery-Systemen (DDS) geworden [3, 4]. Die meisten Medikamente öffnen die BHS durch biologische, chemische oder physikalische Mittel; unter ihnen werden physikalische Methoden heute am häufigsten klinisch eingesetzt [5]. Aufgrund der unüberwindlichen Defekte bei der intrakraniellen Wirkstoffabgabe basierend auf invasiver Technologie hat die Herstellung von lipophilen Prodrugs oder aktiven Transportsubstraten durch chemische Modifikation der Wirkstoffoberfläche weitere Vorteile [6]. Unter diesen sind Nanopartikel eine der besten Möglichkeiten, um eine intrakranielle Wirkstoffabgabe durch aktives Angreifen der BHS zu erreichen [7,8,9].

Nano-DDSs sind zum Fokus der Gehirn-Targeting-Forschung geworden und umfassen Polymer-Nanopartikel, organische Nanopartikel, Liposomen, Nanofasern und Mizellen, die entwickelt wurden, um Behandlungen und Diagnosen bereitzustellen [6, 10, 11, 12]. Sowohl mit Wirkstoffen beladene Nanopartikel als auch niedermolekulare lipophile Wirkstoffe können die BBB passieren. Der Unterschied besteht darin, dass arzneimittelbeladene Nanopartikel eher eine passive Diffusion durch Adsorption an der Kapillarwand im Gehirn passieren. Darüber hinaus stehen freie Medikamente einer zweiten Barriere gegenüber, der Blut-Liquor-Schranke (B-CSF) [13]. Im Gegensatz zu anderen Barriere-Gegenstücken sind die meisten Medikamente relativ durchlässig für den Liquor und diffundieren in das Hirnparenchym. Aufgrund des sehr langsamen Diffusionsprozesses ist die Konzentration freier Wirkstoffe im Liquor jedoch viel höher als im Hirnparenchym, und die hohe Konzentration im Liquor verursacht eine gewisse Toxizität [14, 15]. Nanopartikel haben dabei einzigartige und bedeutende Vorteile. Wenn die Oberfläche des Nanoträgers mit einem hydrophilen Tensid beschichtet ist, wird ApoE an der Oberfläche adsorbiert und Liquor kann die Bewegung der Nanopartikel in Richtung des Hirnparenchyms durch den Raum um die Blutgefäße fördern [16]. Mit dem nichtionischen Tensid Polysorbat 80 beschichtete Nanopartikel, hergestellt von Kreuter et al. [17] waren die ersten Medikamente, die dem Gehirnsystem erfolgreich zugeführt und über die Adsorption des Serumproteins ApoE im Plasma transportiert wurden. Daher ermöglicht die Modifikation von Polysorbat 80 auf der Oberfläche von Nanopartikeln, um ein arzneimittelspezifisches Komposit zu bilden, die gezielte Erkennung von Arzneimitteln und endogenen BHS-Rezeptoren, wodurch die Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln stark erhöht wird [18,19,20].

Derzeit wird der Acetylcholinesterase (AChE)-Hemmer Donepezil (DZP) häufig zur Behandlung der mittelschweren AD verwendet, aber aufgrund seiner Fettlöslichkeit, schlechte Auflösung in vivo , und geringer oraler Bioverfügbarkeit müssen herkömmliche Donepezil-Tabletten täglich eingenommen werden, um die therapeutische Wirkung aufrechtzuerhalten [21, 22]. Da die kognitiven Fähigkeiten von AD-Patienten stark beeinträchtigt sind, was große Unannehmlichkeiten bei der Einhaltung eines Medikationsplans verursacht, ist die Entwicklung eines langwirksamen DZP-Präparats mit verzögerter Freisetzung dringend erforderlich. Die Amyloid-Kaskaden-Hypothese legt nahe, dass die Ursache von AD die Ablagerung von Amyloid-Plaques um das Hirnparenchym und die zerebrovaskulären Wände herum ist. Auch in Hirnarealen werden zahlreiche diffuse Spots beobachtet, die aus amorphen, stark fibrotischen und unlöslichen extrazellulären Aβ-Ablagerungen bestehen [23, 24]. Boridyet al. fanden heraus, dass Pullulan-Polysaccharid-Nanopartikel, die nicht toxisch und leicht abbaubar sind, einen Komplex mit dem Aβ-Protein bilden und die Proteinaggregation effektiv verhindern und schnell aus den Zellen entfernt werden können, um die Zelltoxizität zu hemmen [25]. Cholesterin-hydrophob modifiziertes Pullulan (CHP) ist eine amphiphile Substanz, die sich in wässriger Lösung zu einer Nanostruktur mit einem hydrophoben Kern und einer hydrophilen Hülle der Zuckerkette selbst anordnen kann [26, 27]. Gleichzeitig können CHP-Nanopartikel Aβ-Protein adsorbieren, um dessen Ablagerung und Aggregation zu verhindern, und spielen eine synergistische Rolle. Als Nanoträger hat CHP eine deutliche Überlegenheit.

Basierend auf den obigen Erkenntnissen konzipierte das Forschungsteam im Frühstadium eine DZP-CHP-Nanopräparation und ermittelte das optimale Dosierungsverhältnis des Wirkstoffs zum Nanocarrier. Dann wurde Polysorbat auf der Oberfläche der Nanopartikel adsorbiert, um aktiv die Passage durch die BHS zu erreichen, um eine Anreicherung des Gehirns zu erreichen. In dieser Studie wurde eine Reihe von DZP-CHP-Nanolösungen charakterisiert und der Wirkstofffreisetzungsprozess in vitro untersucht und untersucht. Nach erfolgreicher Herstellung der Nanopartikel wurde Aβ25-35 verwendet, um eine Schädigung von Nervenzellen zu induzieren, um ein AD-Zellmodell zu etablieren [28, 29]. Anschließend wurde die Schutzwirkung der DZP-CHP-Nanolösung in PC12- und SH-SY5Y-Zellmodellen untersucht.

Materialien und Methoden

Materialien

Verwendet wurden:Cholesterin-hydrophob modifiziertes Pullulan (hausgemacht) [30]; Donepezil (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.); Polysorbat 80 (Tianjin Fuchen Reagent Institute); Indocyaningrün (ICG)-Farbstoff (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.); Polysorbat 80 (Tween 80, PS) (Tianjin Fuchen Reagenzienbüro); schwarze Mäuse (Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.); Aβ25-35 (US-Sigma); Tetramethylazozolsalz (MTT) (US Sigma); neugeborenes Rinderserum (U.S. Gibco); Lactatdehydrogenase-Kit (LDH) (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.); AO/EB-Doppelfärbungs-Fluoreszenz-Kit (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); und PC12-Zellen (Nebennieren-Phäochromozytomzellen der Ratte), erhalten von der Abteilung für Neurologie, Second Xiangya Hospital, Central South University. SH-SY5Y-Zellen (menschliche Knochenmark-Neuroblastomzellen) wurden von der ATCC Cell Bank (Manassas, VA, USA) gekauft.

Vorbereitung von Nanopartikeln

Drei Arten von Nanopartikeln mit unterschiedlichen DZP- und CHP-Verhältnissen (w/w) (10:20, 4:20 und 2:20) wurden zunächst erfolgreich mittels Wasserdialyse nach in der Literatur beschriebenen Methoden hergestellt [31]. Eine bestimmte Konzentration von DZP-CHP-Nanopartikeln wurde in ein Becherglas mit einem konstanten Volumen von 10 ml gegeben und dann in ein anderes Becherglas mit Polysorbat 80 (PS)-Emulgator (Konzentration 0,7 mmol) zum Absetzen für 1 h gesaugt. Die Mischung wurde dann in eine EP-Röhre gegeben und 3 min lang beschallt (Ausgangsleistung 100 W, intermittierender Pulsarbeitsmodus:Pulsbreite 2,0 s, intermittierende Zeit 2,0 s). Der Vorgang wurde dreimal wiederholt, bis eine gleichmäßige Dispersion erreicht wurde [32]. Polysorbat 80-emulgierte Donepezil-Wirkstoff-beladene Nanopartikel (PS-DZP-CHP) wurden schließlich erhalten, nachdem Verunreinigungen durch Filtration entfernt wurden.

Charakterisierung von Nanopartikeln

Nanopartikel-Morphologie

Die Form, Oberflächenmorphologie und Größe der DZP-CHP-Nanopartikel (DCPs) mit DZP-zu-CHP-Verhältnissen von 1:2, 1:5 und 1:10 wurden mit einem Tecnai F20 Transmissionselektronenmikroskop analysiert. Ein Tropfen CHP-, DZP-CHP- und PS-DZP-CHP-Nanopartikel wurde auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfernetz gegeben, um einen dünnen Flüssigkeitsfilm zu bilden. Dann wurde eine 2%ige (w/v) Phosphorwolframsäurelösung verwendet, um eine negative Färbung der Probe nach dem natürlichen Trocknen des Films zu erhalten. Die frisch zubereitete wässrige Nanopartikellösung wurde tropfenweise auf einen sauberen Siliziumwafer gegeben, bei Raumtemperatur getrocknet und dann unter ein Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop JSM-6700F gelegt, um die Oberflächenstruktur zu beobachten.

Nanopartikelgröße und Zeta-Potenzial

Die Größe, der Polydispersitätskoeffizient (PDI) und das Zetapotential von DZP-CHP- und PS-DZP-CHP-Nanopartikeln wurden mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) analysiert. Die durchschnittliche Partikelgröße und Größenverteilung der erhaltenen homogenen Suspension wurden jeweils dreimal gemessen.

In-vitro-Wirkstofffreisetzung

Die Freisetzung von Donepezil wurde mittels dynamischer Wasserdialyse gemessen. Ein Milligramm DZP-CHP- und PS-DZP-CHP-Nanopartikel wurde in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, Konzentration 0,01 M) gelöst und dann in einen Dialysebeutel überführt, der in derselben Lösung bei a . aufbewahrt wurde konstante Temperatur von 37 °C mit magnetischem Rühren. Vier Milliliter PBS bei 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 und 72 h wurden mit dem gleichen Volumen PBS bei gleichem pH-Wert verdünnt. Ultraviolett-sichtbare Spektrophotometrie wurde verwendet, um die Extinktion des Dialysats bei 312 nm zu verschiedenen Zeiten nachzuweisen; der Gehalt der Lösung wurde mit einer Standardkurve bestimmt und der Freisetzungstest dreimal in vitro wiederholt. Der Freisetzungsprozentsatz von Donepezil wurde nach der folgenden Formel berechnet:

Cn ist die Probenkonzentration zum Zeitpunkt Tn, µg/ml; V ist das Gesamtvolumen der PBS-Freisetzungslösung, ml; Vn ist das Volumen der PBS-Freisetzungsflüssigkeit zum Zeitpunkt Ti, ml; und Ci ist die Donepezil-Konzentration zum Ti-Zeitpunkt, μg/ml.

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)

Eine bestimmte Konzentration von PS-Lösung wurde auf CHP-Nanopartikellösungen getropft und die Wärmeänderungen wurden mit ITC (vip-itc, Microcal, Northampton, MA, USA) gemessen. Die CHP-Nanopartikellösung umfasste drei Arten von Nanopartikeln mit unterschiedlichen DZP-zu-CHP-Verhältnissen (1:2, 1:5 und 1:10). Alle Lösungen wurden vor der Titration entgast. Die Temperatur des gesamten Systems wurde konstant bei 25 °C gehalten.

Tierversuche zur Beobachtung des Brain Targeting

Herstellung von ICG-markierten Donepezil-CHP-Nanopartikeln

400 mg CHP-DZP und 20 mg ICG wurden unter Verwendung einer Analysenwaage abgewogen und eine geeignete Menge DMSO wurde zum gründlichen Mischen und Auflösen zugegeben. Dann wurde die oben erhaltene Lösung tropfenweise mit einer Pipette in den Dialysebeutel gegeben, und das destillierte Wasser wurde einmal stündlich ersetzt. Drei Stunden später wurde das destillierte Wasser alle 2 h ausgetauscht und jedes Mal für 48 h 400–800 ml destilliertes Wasser zugegeben, bis das DMSO vollständig dialysiert war. Danach wurde die obige Lösung mit einer Pipette in einen Messkolben überführt, um ein konstantes Volumen zu erhalten, und dann 2 Minuten lang mit einer Ultraschallwelle behandelt. Die Filtration durch eine 0,45-μm-Filtermembran führte zu ICG-markierten DZP-CHP-Nanopartikeln (ICG-DZP-CHP), die separat verpackt und in einem Kühlschrank bei 4 °C zur späteren Verwendung aufbewahrt wurden.

Herstellung von emulgierten fluoreszierenden Donepezil-CHP-Nanopartikeln

Eine geeignete Menge ICG-DZP-CHP wurde in einen 10-ml-Becher gegeben und 1 l (Vol./Vol.) Polysorbat 80 (PS) Emulgator wurde zugegeben. Das Becherglas wurde 1 h lang aufbewahrt und dann zur Ultraschallbehandlung für 2 min bei 100 W in ein EP-Röhrchen überführt. Der obige Vorgang wurde dreimal wiederholt, bis eine einheitliche Nanolösung erhalten wurde. Schließlich wurden gefilterte und ICG-markierte emulgierte Donepezil-Wirkstoff-beladene Nanopartikel erhalten (PS-ICG-DZP-CHP).

MST-Experimente zur Überprüfung der Bindung des APOE an Nanopartikel

Alle MST-Experimente wurden auf einem Monolith NT.115-System (201810-BR-N024) durchgeführt. Alle Lösungen wurden mit entionisiertem Wasser und Reagenzien von analytischer Qualität hergestellt. Puffer wurden hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert. Proteinproben wurden bis zur Verwendung auf Eis aufbewahrt [33]. PS-ICG-CHP-Nanopartikel (55,6 μM) wurden mit entionisiertem Wasser auf 40 nM verdünnt und ICG wurde für die Fluoreszenz geladen. APOE-Lösung (30 μl, 55,6 μM) wurde hergestellt und 16 Kapillarröhrchen wurden mit 1 bis 16 beschriftet; Zuerst wurden 20 μl APOE in Röhrchen 1 und 10 μl in die Röhrchen 2 bis 16 gegeben. Dann wurden 10 μl Lösung von Röhrchen 1 in Röhrchen 2 überführt und gründlich gemischt. Danach wurden 10 μl Lösung aus Röhrchen 2 entfernt und in Röhrchen 3 überführt. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis schließlich 10 μl Lösung aus Röhrchen 16 entfernt wurden, um sicherzustellen, dass die Lösung in jedem Röhrchen das gleiche Volumen hatte. Zehn Mikroliter verdünnter Nanopartikel wurden in jedes Röhrchen gegeben und gründlich gemischt, um die Messung zu starten. Die MST-Testdaten wurden mit der NT-Analysesoftware analysiert und die KD-Anpassung wurde gemäß dem Massenwirkungsgesetz gemäß den Softwareanweisungen durchgeführt.

In-vivo-Fluoreszenz-Bildgebungstechnologie für die zielgerichtete Beobachtung des Gehirns

Eine Gruppe gesunder schwarzer Mäuse mit einem Gewicht von jeweils ca. 18–22 g wurde ausgewählt und nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen eingeteilt:die PS-ICG-DZP-CHP-Gruppe und die ICG-DZP-CHP-Gruppe. Jeder Maus wurden 200 μl 200 μg/ml der Medikamente der obigen Gruppe über die Schwanzvene injiziert, und 0,5 h später wurden die Mäuse mit 1 % Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg) anästhesiert. Danach wurden alle Mäuse in den Aufnahmebereich des Live-Imager gebracht, wobei die Bildgebungsparameter auf eine Anregungswellenlänge von 765 nm–815 nm und eine Absorptionswellenlänge von 815 nm–845 nm eingestellt waren, um ein Fluoreszenzbild des gesamten Tieres zu erhalten . Nach der Bildgebung wurden alle Mäuse seziert und die Niere, das Herz, die Milz, die Lunge, die Leber und das Gehirn entfernt, um Fluoreszenzbilder zu erhalten. Die Bildgebungsparameter stimmten mit den oben beschriebenen überein.

Studie zur Gewebeverteilung von Nanopartikeln

Gruppierung und Probenahme von Mäusen

45 C57BL/6-Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 15 Gruppen eingeteilt:5 Gruppen erhielten freies Donepezil (freie Gruppe), 5 Donepezil-Nanopartikel (Nano-Gruppe) und weitere 5 mit PS-modifizierten Donepezil-Nanopartikeln (PS-Gruppe) at 0,25 mg/kg durch den Venenschwanz. Dann wurde 1 h, 3 h und 6 h nach der Injektion Blut abgenommen. Danach wurden alle Tiere getötet und Herz-, Gehirn-, Leber- und Nierengewebe wurden gesammelt und zerkleinert. Dann wurden 0,2 g des obigen Gewebes genau abgewogen und zu ungefähr 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung gegeben und mit einem Homogenisator (65 Hz, 150 s) homogenisiert. Einhundert Mikroliter Gewebehomogenat wurden genau in ein 1,5-ml-EP-Röhrchen mit 0,7 ml Methanol aufgezogen, zum Mischen 30 s lang zur Proteinfällung gevortext und dann bei 12.000 U/min ^-1 . zentrifugiert für 10 min. Schließlich wurden 100 µl Überstand zur Analyse in eine Injektionsflasche überführt.

Bestimmungsmethode

Zur Untersuchung wurde zunächst HPLC verwendet, die Sensitivität war jedoch nicht ausreichend hoch. Daher wurden nachfolgende LC-MS-Experimente durchgeführt, die eine starke Spezifität und keine die Wirkstoffbestimmung störenden endogenen Substanzen zeigten. Das LC-MS-Protokoll entsprach den Richtlinien für die Bestimmung biologischer Proben. Die chromatographischen Bedingungen waren wie folgt:Laufmittel A, Wasser (enthaltend 0,1% Ameisensäure); Eluent B, Methanol (enthält 0,1% Ameisensäure); isokratische Elution:A30%-B70%; Flussrate, 0,3 ml· min ⁻¹ ; Säulentemperatur, 35 °C; Injektionsvolumen, 10 µl. Die Kollisionsbedingungen waren wie folgt:Temperatur der Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI), 150 °C; Desolationsgasdurchfluss, 550 L·h ⁻¹ ; Verwüstungsgastemperatur, 500 °C. Die Bedingungen für die Detektion positiver Ionen waren wie folgt:Kapillarspannung 3 kV; Kegelspannung, 30 V; Scanmodus, Multiple Reaction Monitoring (MRM).

Zellexperimente

Zellkultur und Passage

PC12- und SH-SY5Y-Zellen wurden in DMEM mit hohem Zuckergehalt, ergänzt mit 10 % (v/v) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % (v/v) Penicillin und Streptomycin kultiviert und dann in einem Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C. Zellen wurden in verschiedenen Experimenten verwendet oder passagiert, sobald sie eine Konfluenz von 80 % erreicht hatten. Vor den Experimenten wurden PC12- und SH-SY5Y-Zellen auf mit Kollagen Typ I vorbeschichteten Platten mit der erforderlichen Zelldichte gemäß dem experimentellen Maßstab ausgesät.

Kryokonservierung von Zellen

Wenn unter einem Mikroskop beobachtet wurde, dass sie zur logarithmischen Phase wuchsen, wurden PC12- und SH-SY5Y-Zellen eingefroren und zweimal mit PBS gewaschen, trypsiniert, um eine Zellsuspension zu bilden, und in ein steriles Zentrifugenröhrchen zur Zentrifugationssammlung gegeben (1000 r × min ^{– 1} , 3 Minuten). Dann wurde eine Zellkryokonservierungslösung zugegeben, und die Zellen wurden in einem Röhrchen aufbewahrt, wobei der Zellname und das Datum markiert waren. Die Zellen wurden 1 h bei 4 °C, 2 h bei −20 °C, über Nacht bei −80 °C (eingefroren) in einen Kühlschrank gestellt und schließlich in einen Flüssigstickstofftank überführt.

MTT-Methode zur Erkennung der Zellüberlebensrate

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung eines MTT-Reduktionsassays gemessen. Kurz gesagt wurden PC12- und SH-SY5Y-Zellen in 96-Well-Platten (mit Typ-I-Kollagen vorbeschichtet) mit einer Dichte von 1 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/ml, damit die Zellen an jeder Vertiefung anhaften können. Nach einer Inkubation von 24 h wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Donepezil-CHP-Nanolösung oder freier Donepezil-Lösung 2 h vorinkubiert. Anschließend wurde Aβ25-35 (Endkonzentration 20 μM) in jede Vertiefung gegeben. Die behandelte 96-Well-Platte wurde 24 h bei 37 °C inkubiert. Danach wurde MTT (50 μl, 5 mg/ml) zugegeben und mit den behandelten Zellen 4 h bei 37 °C inkubiert. Schließlich wurde das Medium vorsichtig entfernt und die Formazan-Kristalle in 150 µL DMSO gelöst. Die Extinktion wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts erhalten. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird als Prozentsatz lebender Zellen in der behandelten Gruppe und als Prozentsatz lebender Zellen in der unbehandelten Kontrollgruppe ausgedrückt.

Bestimmung der LDH-Aktivität im Zellüberstand

PC12- und SH-SY5Y-Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten (mit Typ-I-Kollagen vorbeschichtet) mit einer Dichte von 2 × 10 ⁵ . ausgesät und 3 × 10 ⁵ Zellen/ml bzw. Nach einer Inkubation von 24 h wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Donepezil-CHP-Nanolösung oder freier Donepezil-Lösung 2 h vorinkubiert. Anschließend wurde Aβ25-35 (Endkonzentration 20 μM) in jede Vertiefung gegeben. Die LDH-Aktivität wurde gemäß den Anweisungen des Kits gemessen. Kurz gesagt, die kultivierten Zellen mit Medium wurden gesammelt und dann bei 3500 U/min zentrifugiert. Der Überstand (50 &mgr;l) wurde mit einem gleichen Volumen an Reaktant vermischt, um die LDH-Reaktion zu starten. Die Absorption wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts erhalten und die LDH-Aktivität wurde berechnet.

AO/EB-Färbemethode zur Beobachtung der Apoptose-Morphologie

AO/EB-Fluoreszenzfarbstoff wurde verwendet, um die Eigenschaften von apoptotischen Zellen zu bewerten. PC12- und SH-SY5Y-Zellen wurden in schwarzen 12-Well-Kulturplatten (mit Typ-I-Kollagen vorbeschichtet) bei Dichten von 3 × 10 ⁵ . ausgesät und 4 × 10 ⁵ Zellen/Well bzw. Nach einer Inkubation von 24 h wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Donepezil-CHP-Nanolösung oder freier Donepezil-Lösung 2 h vorinkubiert. Anschließend wurde Aβ25-35 (Endkonzentration 20 μM) in jede Vertiefung gegeben. Nach der Behandlung wurden Operationen gemäß dem Kit durchgeführt. Licht wurde während des gesamten Experiments vermieden. Schließlich wurde die Zellmorphologie beobachtet.

Rhodamin 123-Färbemethode zum Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials

MMP wurde mit Rhodamin 123 (Rh123) Fluoreszenzfarbstoff gemessen, einem zelldurchlässigen kationischen Farbstoff, der aufgrund seiner stark negativen Eigenschaften bevorzugt in Mitochondrien verteilt wird. PC12- und SH-SY5Y-Zellen wurden in schwarzen 24-Well-Kulturplatten (mit Typ-I-Kollagen vorbeschichtet) bei Dichten von 2 × 10 ⁵ . ausgesät und 3 × 10 ⁵ Zellen/Well bzw. Nach einer Inkubation von 24 h wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Donepezil-CHP-Nanolösung oder freier Donepezil-Lösung 2 h vorinkubiert. Anschließend wurde Aβ25-35 (Endkonzentration 20 μM) in jede Vertiefung gegeben. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 10 μg/ml Rhodamin 123 für 30 Minuten im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und die Fluoreszenzintensität wurde bei 488 nm und 510 nm mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät gemessen.

Statistische Verarbeitung und Datenanalyse

Alle Experimente wurden dreimal wiederholt und die Ergebnisse werden als mittlere ± ± Standardabweichung ausgedrückt. Es wurde die statistische Software GraphPad Prism verwendet und eine Einweg-ANOVA, Student's t Test und andere Methoden wurden für die statistische Analyse verwendet. P < 0,05 zeigt an, dass ein Unterschied statistisch signifikant ist.

Ergebnisse

Eigenschaften von Nanopartikeln

CHP aggregiert selbst zu Nanopartikeln mit hydrophoben Kernen, die mit DZP beladen werden können. DZP-beladene CHP-Nanopartikel (DCNs) mit Wirkstoff-Nanomaterial-Verhältnissen von 1:2, 1:5 und 1:10 wurden DCN1, DCN2 und DCN3 genannt. Den Ergebnissen der Rasterelektronenmikroskopie zufolge zeigten CHP-Nanopartikel eine kugelförmige Struktur, und nach der DZP-Beladung waren die DCNs ebenfalls kugelförmig, wie in Abb. 1 gezeigt. Die mittlere Größe und das Zeta-Potential der CHP-Nanopartikel betrugen 257 ± 3,05 nm und − 2,81 ± 0,27 mV. Nach der DZP-Belastung betrugen die mittleren Größen 273 ± 3,72, 260,7 ± ± 1,76 und 266,8 ± ± 4,56 nm und die Zetapotentiale lagen bei -6,20 ± 0,40, – 5,75 ± ± 0,64 und -9,30 ± ± 0,39 mV für DCN1, DCN2 bzw. DCN3 , wie in Tabelle 1 gezeigt. Die prozentualen Anteile des Arzneimitteleinschlusses betrugen 42,00 ± 5,65 %, 86,54 ± 1,31 % und 59,71 ± 4,43 %, und die prozentualen Anteile der Arzneimittelbelastung betrugen 12,02 ± 1,90 %, 13,42 ± 2,03 % und 7,40 ± ± 1,72 %. bzw.

Rasterelektronenmikroskopische Bilder (a , a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3), Größenverteilung (b a-KWK, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) und Zetapotential (c a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) von Nanopartikeln

ITC-Messung

Bei DCNs zeigte die Reaktion während des gesamten Reaktionsprozesses hauptsächlich einen nach oben gerichteten Peak (Abb. 2), und die Reaktion war endotherm, da der nach oben gerichtete Peak eine wärmefreisetzende Reaktion anzeigt. Daher kann PS spontan an der DCN-Oberfläche adsorbiert werden. Die PS-Affinität betrug (14,7 ± 2,76) × 10 ⁴ M ⁻¹ , (29,8 ± 1,66) × 10 ⁴ M ⁻¹ und (36,7 ± 3,84) × 10 ⁴ M ⁻¹ , und der PS-Bedeckungsgrad betrug 2,65 ± ± 0,193, 2,70 ± ± 0,372 und 1,49 ± ± 0,434 für DCN1, DCN2 bzw. DCN3. Dieses Ergebnis zeigt, dass PS mit hoher Affinität an die DCN-Oberfläche adsorbiert und eine größere Bedeckungsmenge auf DCN2 hatte. ∆H> 0 und ∆S> 0 zeigt an, dass die drei Partikel hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen mit PS gebunden wurden.

Isotherme Kalorimetriedaten für PS (0,9 mM)-Titration in a DCN1, b DCN2 und c DCN3-Lösungen (0,02 mM) bei 25 °C. Bedeckungsgrad, Affinität (KA) und Enthalpie- und Entropieänderungen für die PS-Bindung mit Nanopartikeln (NPs) nach Titration in NP-Lösungen

Charakterisierung der drei Nanopartikeltypen

Die durch Dialyse hergestellten CHP-NPs und DCNs zeigten eine einheitliche Kugelform (Abb. 3a). Gemäß obiger Studie haben wir die DZP-CHP-Nanopartikel mit einem Wirkstoff-Nanomaterial-Verhältnis von 1:5 als Versuchspersonen für das folgende Experiment ausgewählt. Die DZP-CHP-Nanopartikel hatten eine relativ einheitliche Partikelgröße von 260,7 ± ± 1,76 nm und der Dispersionsindex betrug 0,196 ± ± 0,019. Obwohl die Partikelgröße nach der Wirkstoffbeladung relativ stabil blieb, stieg sie nach der PS-Adsorption stark auf 335,2 ± 5,46 nm an. Das Zetapotential der DZP-CHP-Nanopartikel betrug −0,66 ± 0,04 mV, und nach der Beschichtung mit Polysorbat 80 fiel das Zetapotenzial auf −2,22 ± 0,86 mV (Abb. 3b).

Charakterisierung verschiedener Nanopartikel. a a Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von CHP-NPs, b Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von DZP-CHP-NPs, c Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von PS-DZP-CHP-NPs. B:Partikelgrößendiagramm und Zeta-Potential-Diagramm von CHP-DZP-NPs (Einspeisungsverhältnis 1:5) und DZP-CHP-NPs modifiziert mit Polysorbat 80 (Einspeisungsverhältnis 1:5)

In-vitro-Wirkstofffreisetzung von Nanopartikeln

Die Ergebnisse zeigten, dass DZP-CHP-NPs und PS-DZP-CHP-NPs im Vergleich zu freiem Donepezil 72 h lang DZP mit offensichtlichen kontrollierten Freisetzungseffekten freisetzten. Die frühe schnelle Freisetzungsrate von Wirkstoff-beladenen Nanopartikeln kann auf die schnelle Auflösung und Freisetzung von Wirkstoffmolekülen zurückzuführen sein, und dann kann die Verlangsamung durch die Abnahme der Wirkstoffkonzentration verursacht werden, die nur durch Auflösung und Diffusion beeinflusst werden kann. Anschließend wurde die In-vitro-Wirkstofffreisetzung von mit Polysorbat 80 beschichteten und unbeschichteten DZP-CHP-NPs untersucht. Der Grund für die langsamere Freisetzung von PS-DZP-CHP-NPs kann in der starken Adsorption von Polysorbat 80 an kleine hydrophobe molekulare Wirkstoffe liegen (Abb. 4).

In-vitro-Wirkstofffreisetzungskurven für DZP, DZP-CHP-NPs (1:5) und PS-DZP-CHP-NPs

Nanopartikel-Gehirn-Targeting-Effekt

Beobachtung von Gehirn-Targeting mit Live-Fluoreszenz-Bildgebungstechnologie

Die Gehirne von Mäusen, denen freies ICG injiziert wurde, zeigten keine Fluoreszenz, aber die Gehirne, denen mit PS emulgierte Nanopartikel injiziert wurden, zeigten eine stärkere Fluoreszenz im Gehirn als diejenigen, denen nicht emulgierte Nanopartikel injiziert wurden, da beide Nanopartikel das Gehirn nach der Injektion durch die Schwanzvene erreichen konnten (Abb . 5a). Um dies zu überprüfen, sezierten wir die Mäuse 30 Minuten nach der intravenösen Injektion von ICG-DZP-CHP- und PS-ICG-DZP-CHP-Lösungen, entfernten alle für die Studie benötigten Organe und führten dann eine Fluoreszenzbildgebung durch. PS-ICG-DZP-CHP-Nanopartikel zeigten im Gehirn eine starke Fluoreszenz, in anderen Organen wurde jedoch keine beobachtet (Abb. 5b). Bilder zeigten, dass mit PS modifizierte Nanopartikel die stärkste Fluoreszenz im Hirngewebe zeigten, während die nicht modifizierten eine schwache Fluoreszenz zeigten. Im Hirngewebe von Mäusen, denen freies ICG injiziert wurde, wurde keine Fluoreszenz beobachtet (Abb. 5c).

In-vivo-Fluoreszenzbilder nach Injektion verschiedener Lösungen über die Schwanzvene. a Fluoreszenzbilder von ganzen Tieren, denen 200 μg/ml DZP-CHP- oder PS-DZP-CHP-Nanopartikel, die mit ICG als Farbstoff beladen sind, über die Schwanzvene injiziert wurden. a Kostenlose ICG-Lösung (Fluoreszenzintensität × 10 ⁹ ), b ICG-DZP-CHP nanoparticles (fluorescence intensity × 10 ⁷ ), c ICG-DZP-CHP nanoparticles modified by PS (fluorescence intensity × 109). b Fluorescence images of various organs after injection of DZP-CHP nanoparticles modified by PS via the tail vein. c Fluorescence images of the brain after dissection. d Brain of mice injected with ICG-PS-DZP-CHP nanoparticles, e brain of mice injected with ICG-DZP-CHP nanoparticles modified with PS, f brain of mice injected with free ICG

Tissue Distribution of Nanoparticles in Mice

Donepezil was distributed in various tissues and mainly in the brain after injection of PS-DZP-CHP nanoparticles. Because it is metabolized through the kidney, the concentration of donepezil is very high in the kidney at certain times (Fig. 6a). In the brain, the concentration of free donepezil reached a peak in a very short time and then decreased rapidly. However, the concentration of donepezil nanoparticles reached a peak much more slowly and then decreased, especially nanoparticles modified with PS, which indicates a sustained-release effect with a delayed peak and prolonged retention time. Obviously, the nanoparticles improved the bioavailability of the drug (Fig. 6b).

a The concentration of donepezil in the brain, heart, liver and kidney at different times. b The concentrations of free DZP, DZP-CHP nanosolution and DZP-CHP nanosolution modified with PS in brain tissue at different times

MST Results

MST results showed that the thermal surge changed regularly with increasing ligand concentration, and the K_D value was 3.63 μM, indicating that the ligand effectively binds to the target protein, which verifies that PS can bind to Apo E and is relatively stable. After surface modification with PS, CHP nanoparticles can promote adsorption of Apo E, theoretically confirming that the nanoparticles we designed can specifically target brain tissue because the nanoparticles adsorbed Apo E, which may mediate passage through the blood–brain barrier (Fig. 7).

a Raw MST data. The fluorescently labeled molecules were observed for 5 s. At this time, the infrared laser was turned on, and a small part of the capillary tube was heated to 2–5 °C. The molecules migrated along a thermal gradient, resulting in changes in fluorescence intensity. When the infrared laser is turned off, the molecules diffuse along the concentration gradient. b The binding curve is generated by the difference between the initial fluorescence intensity and the intensity in the presence of heat, and the curve conforms to the standard 1:1 binding model

Establishment of a Nerve Injury Model Induced by Aβ_25–35

MTT tests were used to detect the effect of different concentrations of Aβ25-35 on the activity of PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 8a (i), Fig. 8b (i)], and the results showed that with increasing Aβ_25–35 concentration, PC12 and SH-SY5Y cell proliferation activity gradually decreased compared with that in the normal control group. When PC12 and SH-SY5Y cells were treated with 20 μM Aβ_25–35 , PC12 cell activity decreased to 49.5 ± 3.3% that observed in the control group (P  < 0.01), and SH-SY5Y cell activity decreased to 49.7 ± 0.8% (P  < 0.01). An LDH kit was used to detect the effect of different concentrations of Aβ_25–35 on LDH activity in both cell supernatants. Colorimetric tests showed that activity in both supernatants increased gradually with increasing Aβ25–35 concentration. After treatment of the cells with 20 μM Aβ_25–35 , PC12 cell LDH release increased to 359.3 ± 18.3% that in the control group (P  < 0.01), and SH-SY5Y cell LDH release increased to 360.0 ± 18.2% (P  < 0.01). Rhodamine 123 staining was used to detect the effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on the mitochondrial membrane potential in both cell lines [Fig. 8a (ii), b (ii)]. The test showed that the mitochondrial membrane potential in both cell lines decreased gradually with increasing Aβ_{25– 35} concentration (5, 10, 20, 40 μmol/L). Treatment of the cells with 20 μM Aβ_25–35 decreased the PC12 cell mitochondrial membrane potential to 51.3 ± 1.6% that in the control group (P  < 0.01); for SH-SY5Y cells, the MMP decreased to 47.9 ± 1.7% that in the control group (P  < 0.01).

Effects of different concentrations of Aβ_25–35 on injury to PC12 and SH-SY5Y cells. a , b The effect of different concentrations of Aβ_25–35 on the cell survival rate, LDH activity and cell mitochondrial membrane potential in PC12 cells and SH-SY5Y cells (*P  < 0.05, ** P  < 0.01 vs control group). c The effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on damage to the morphology of PC12 cells:a control group, b Aβ_{25– 35} (5 μM) injury group, c Aβ_{25– 35} (10 μM) injury group, d Aβ_{25– 35} (20 μM) injury group, e Aβ_{25– 35} (40 μM) injury group. D:the effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on injury to the morphology of SH-SY5Y cells:f—control group, g Aβ_{25– 35} (5 μM) injury group, h—Aβ_{25– 35} (10 μM) injury group, i—Aβ_{25– 35} (20 μM) injury group, j—Aβ_{25– 35} (40 μM) injury group

Inverted fluorescence microscopy was used to observe morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells injured by different concentrations of Aβ_{25– 35} (Fig. 8c, d). The PC12 and SH-SY5Y cells in the control group had higher density, fusiform shapes, fuller cell bodies and longer protrusions. As the concentration of Aβ_{25– 35} increased (5, 10, 20, 40 μmol/L), the number of cells in both cell lines gradually decreased, the cell bodies shrank slightly, and the protrusions began to shrink sharply. When the concentration of Aβ_{25– 35} was increased to 40 μmol/L, the protrusions broke significantly, most of the cells contracted sharply, their shape became irregular, and some cells detached and became suspended in the solution.

Therefore, we treated PC12 and SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h to establish a nerve injury model.

Neuroprotective Effect of Drug-Loaded Nanoparticles (DZP-CHP)

MTT assays were used to detect the activity of different concentrations of DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) in PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 9a (i), b(i)]. Tests showed that treatment of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.4 ± 2.8% that in the control group (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) solutions, the viability of PC12 cells increased significantly. The viability of PC12 cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.05). Similarly, treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ_{25– 35} alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.5 ± 4.0% that in the control group (P  < 0.01), while after pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (2.5 μM, 5 μM, 10 μM, respectively), the viability of SH-SY5Y cells increased significantly. The viability of SH-SY5Y cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.05).

Effect of DZP-CHP on Aβ25-35-injured PC12 and SH-SY5Y cells. a and b The effects of DZP-CHP on the cell survival rate, LDH activity, and mitochondrial membrane potential of PC12 and SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35 (#P  < 0.05, ## P  < 0.01 vs Aβ25-35 group; ▲ P  < 0.05 vs DZP group). c The effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of PC12 cells injured by Aβ25-35; a—control group, b—Aβ25-35 injury group, c—DZP (5 µM), d—DZP -CHP (5 µM), e—DZP (10 µM), f—DZP-CHP (10 µM). D:the effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35; g—control group, h—Aβ25-35 injury group, i—DZP (5 µM), j—DZP-CHP (5 µM), k—DZP (10 µM), l—DZP-CHP (10 µM). E:red/green fluorescence ratio

LDH kits were used to detect the effects of different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) on the release of LDH from PC12 and SH-SY5Y cells into the culture medium [Fig. 9a (ii), b (ii)]. Colorimetric measurements showed that the release of LDH from PC12 cells that were exposed to 20 μM Aβ25-35 alone increased significantly by 355.1 ± 16.6% (P  < 0.01). In the presence of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from PC12 cells dropped significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.01). Similarly, the release of LDH from SH-SY5Y cells exposed to 20 μM Aβ25-35 increased significantly to 357.8 ± 12.5% (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from SH-SY5Y cells decreased significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.05).

According to previous reports, depolarization of the MMP leads to loss of Rh123 from mitochondria, which in turn leads to a decline in intracellular fluorescence. Therefore, to characterize changes in the mitochondrial membrane potential in PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35, DZP, and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), rhodamine 123 was used for detection [Fig. 9a (iii), b (iii)]. The results showed that the fluorescence intensity of rhodamine 123 decreased significantly to 44.3 ± 3.8% (P  < 0.01) after incubation of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM) solutions resulted in a significant increase in fluorescence intensity in a dose-dependent manner, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.05). Similarly, after treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h, the fluorescence intensity of rhodamine 123 significantly decreased to 42.5 ± 4.6% (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), the fluorescence intensity increased significantly, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group.

An AO-EB double staining kit was used to detect morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells treated with different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) (Fig. 9c, d). After AO-EB double staining, the nuclei of living cells presented green fluorescence under a fluorescence, and the fluorescence of apoptotic cells was orange-red; the higher the degree of apoptosis is, the brighter the fluorescence. Compared with the untreated control group, PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35 alone showed typical apoptotic characteristics, such as highly condensed and broken nuclei and obvious cell injury. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (5 μM and 10 μM) significantly inhibited cell damage and improved cell morphology.

Discussion

Although nanoparticles have been shown to be an effective delivery medium for nervous system diseases, the complexity of their structure and performance makes it challenging to detect and evaluate their physical–chemical properties and biological safety [34,35,36]. Therefore, after nanodrugs are designed, experiments to verify the safety and effectiveness of the nanomaterials at the cell and animal levels are extremely necessary. In the early laboratory stage, PS-DZP-CHP nanoparticles were successfully synthesized, and the optimal dosing ratio of the drug to CHP was set at 1:5. Due to the stable adsorption of PS to apolipoproteins ApoB and ApoE, brain targeting of nanoparticles can be achieved by permeation through the BBB [37]. The expected goal is that nanoparticles begin to decompose after reaching the brain; DZP is released and increases the concentration of cholinesterase; CHP reduces Aβ protein deposition and improves the brain environment; and administration frequency decreases because of the sustained release from nanoparticles [38,39,40,41].

Therefore, this study conducted an in vitro drug release test to assess the sustained release effect of nanoparticles. Compared with free DZP, nanoparticles achieved local sustained release in the brain, and PS can adsorb plasma proteins and reduce the loss of nanoparticles and prolong the release time to achieve a long cycle. After injection of ICG-labeled DZP-CHP and PS-DZP-CHP nanoparticles into rats, emulsified nanoparticles showed stronger fluorescence in the brain than those not emulsified with Tween 80. After organ biopsy, fluorescence imaging of various organs revealed that only the brain presented strong fluorescence, while other organs did not, indicating that nanoparticles did not release the drug until they reached the brain, which met the expected goal. In addition, nanoparticles modified with polysorbate 80 adsorbed ApoE to the surface and simulated low-density lipoprotein to bind to lipoprotein receptors on the surface of endothelial cells and enter the brain through LDLR induction [42, 43]. Moreover, the mechanisms by which nanoparticles regulate the tight junctions between endothelial cells and the inhibition of P-glycoprotein may produce a synergistic effect on their transcellular transport into the brain parenchyma [44]. However, since polysorbate 80 is prone to produce toxic substances, which cause untoward reactions, such as hypotension, dyspnea and shock, the dosage should be strictly controlled [45, 46]. Although a large number of nanodrugs have been developed for treatment of CNS diseases, most have shown poor effects [4]. In this study, we built a brain model of AD patients to evaluate the protective effect of nanoparticles on the brain. Because the toxicity of the Aβ protein to nerve cells varies with the concentration, it is better to screen an appropriate concentration to better simulate the brain environment of AD patients. The model was treated with DZP and DZP-CHP nanosolutions in advance to investigate the protective effect of DZP-CHP against PC12 and SH-SY5Y cell damage induced by Aβ25-35. The results showed that both solutions improved the cell proliferation activity caused by Aβ25-35, LDH release declined, and the mitochondrial potential rose. The inhibitory effect of the DZP-CHP nanosolution on cell damage induced by Aβ25-35 was significantly better than that of free DZP solution, and a concentration of 10 M DZP-CHP nanosolution proved to be the best, which may be due to the optimal drug concentration approach.

Basically, this study deduced the activity process of nanoparticles in vivo , verifying that PS-DZP-CHP nanoparticles have strong brain targeting, a good sustained release effect and a good AD therapeutic effect, thus demonstrating that they are clinically promising nanodrugs. The difficulty of treating the brain with medication has always been a major problem for researchers. The BBB leads to difficulty in curing CNS diseases, such as Parkinson's disease, brain tumors and brain stroke [47]. PS-DZP-CHP nanoparticles can effectively pass the BBB without destroying it, and DZP can be replaced as a model drug. Loading other drugs with high fat solubility and poor dissolution in vivo into the hydrophobic center of the NPs can not only increase brain targeting but also improve the water solubility of the drug. In addition, the design of CHP nanoparticle solutions is simple, and the drug dosage of the hydrophobic center can be flexibly controlled to ensure the best therapeutic effect while minimizing cytotoxicity [48, 49]. In future work, we will conduct in vivo research on DZP-CHP nanoparticles, such as evaluation of drug metabolism and side effects. These studies supplied a new strategy for brain drug delivery, and it is advantageous to clinical application of nanodrug with AD treatment.

Conclusion

DZP-CHP nanoparticles showed an optimal drug to nanomaterials dosing ratio of 1:5, which led to higher PS coverage and drug loading. DZP-CHP nanoparticles with PS adsorption exhibited slow release and significant brain targeting. Nanoparticle surface modification with PS can promote adsorption of Apo E and thus is vital for brain targeting. DZP-CHP nanoparticles had a protective effect on neurotoxicity and were superior to free donepezil.

Availability of Data and Materials

Not applicable.