Biologisch abbaubare, tumor-responsive Nanopartikel für dual-modale Brustkrebsbildgebung

Zusammenfassung

Gasgefüllte Ultraschall (US) Kontrastmittel kollabieren leicht im Körper, und das Gas kann leicht entweichen, was die Wirksamkeit der US-Bildgebung begrenzt. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein injizierbares gaserzeugendes Multi-Modus-System entwickelt, das den MR-negativen Kontrastmittel Fe₃O₄, den fluoreszierenden Farbstoff Cy5.5 und den CO₂-freisetzenden Donator (Na₂CO₃) trägt. Die Nanopartikel können kontinuierlich Kohlendioxid (CO₂) Gas in saurem Tumorgewebe im Körper erzeugen, was dem Tumor ein starkes Echosiignal unter ultraschallbildgebung verleiht. Zusätzlich verleihen die Nanopartikel ausgezeichnete Effekte für MR- und Fluoreszenzbildgebung des Tumorgewebes. Die Ergebnisse zeigen, dass dieses pH-responsive NP-System gute Effekte in MR/US/fluoreszierender Bildgebung bietet. Diese Studie liefert eine nützliche Referenz für multimodale Tumorabbildung.

Einleitung

In der klinischen Praxis werden Mikrobläschen hauptsächlich als Ultraschallkontrastmittel für die Echtzeitbildgebung verschiedener Organe und Blutgefäße angewendet [1-3]. Traditionelle Ultraschallkontrastmittel bestehen typischerweise aus Materialien wie Lipiden oder Proteinen, die Luft oder Perfluorkohlenstoffgase einschließen. Die in den Mikrokugeln eingeschlossenen Gasarten haben eine geringe Stabilität im Blut und eine kurze Halbwertszeit wegen der schnellen Diffusion von Mikroblasendefekten [4-6]. Darüber hinaus ist es aufgrund der Partikelgröße der gasgefüllten Mikrobläschen, die normalerweise groß ist (ungefähr 1 bis 8 µm), schwierig für die Mikrobläschen, in die Tumormikroumgebung durch Gewebeextravasation einzudringen. Daher ist die aktuelle Anwendung von mikrongroßen Bläschen in der intravaskulären Bildgebung begrenzt [7]. Ideale Ultraschallkontrastmittel sollten im Allgemeinen eine optimale Größe für den Transport durch den Gewebe-Gefäß-Raum, eine angemessene Dauer des akustischen Effekts, gute Targeting-Eigenschaften und Biokompatibilität sowie einfache Ausscheidung aus dem Körper aufweisen [8, 9]. Das Konzept der "gaserzeugenden Nanopartikel" wurde in früherer Forschung vorgeschlagen, und solche Nanopartikel haben Potenzial für die Verwendung in Ultraschallkontrastbildgebung [10-12]. Diese gaserzeugenden Nanopartikel sind den aktuellen gasgefüllten Mikrobläschen in der Leistung überlegen, und das kontinuierlich erzeugte Gas ermöglicht intensive Ultraschallbildgebung. Gaserzeugende Nanopartikel können Permeation und Retention verbessern, und sie können stabil im Blut zirkulieren und effektiv im Tumorgewebe akkumulieren [13, 14].

Es bleibt eine Herausforderung, winzige und okkulte Tumoren mit traditionellen Bildgebungsmethoden wie Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT) und Ultraschall zu detektieren, die durch lange Erfassungszeiten, hohe Strahlendosis und schlechte Sensitivität begrenzt sind [15, 16]. Es ist notwendig, verschiedene Bildgebungsmethoden zu integrieren und multimodale Bildgebungstechnologie zu entwickeln, um integrierte Synergie für die Früherkennung von Krebs zu erreichen [17-19]. Superparamagnetische Eisenoxid (Fe₃O₄) Nanopartikel können als negative MRT-Kontrastmittel in T2-gewichteter Bildgebung verwendet werden [20, 21]. Fe₃O₄ hat attraktive Gesamteigenschaften, einschließlich kleiner Partikelgröße, starker Penetrationsfähigkeit, hoher Magnetisierung, gutem Metabolismus und relativ geringer Toxizität [22, 23]. Fe₃O₄-Kontrastmittel für die MRT-Diagnose von Frühstadium-Krebs wurden aufgrund ihrer hohen Relaxation und Kontrast umfassend untersucht [24-26]. Zusätzlich hat Echtzeit-Fluoreszenzbildgebung eine hervorragende Auflösung und kann eine wertvolle Methode für die Definition von Tumorstadien, die Führung von Tumorresektion und die Überwachung von Behandlungseffekten sein [27, 28].

Hierin werden diese Nanopartikel hauptsächlich von Poly(lactid-co-glycolide) Säure (PLGA) eingekapselt, das von der Food and Drug Administration (FDA) für die Verwendung als biosicheres Material zugelassen wurde [29, 30]. Die PLGA-Partikel werden mit RGD-Peptid modifiziert, um die Bindung an αvβ3-Integrin auf der Oberfläche von Brustkrebszellen zu ermöglichen, und mit Cy5.5 als fluoreszierendem Farbstoff für in-vivo-Bildgebung, und sie werden mit Fe₃O₄ eingekapselt, um als T2-negatives Kontrastmittel in der MRT zu wirken (Schema 1a). Aufgrund der hochregulierten Glykolyse im Tumorgewebe, die mehr Milchsäure und Protonen in der extrazellulären Umgebung produzieren könnte, ist der pH-Wert von Tumorgeweben (6,8-7,2) niedriger als der von normalen Geweben (pH 7,4) [31-33]. Daher entwarfen wir Natriumcarbonat (Na₂CO₃) in der PLGA, um CO₂-Blasen bei dem niedrigeren pH-Wert von Tumorgeweben für die Ultraschallbildgebung zu produzieren. Um ihre vielversprechende Anwendung in der Tumorabbildung zu verifizieren, wurden die umfassenden Eigenschaften dieser multimodalen Nanopartikel für die in-vitro-Bildgebung systematisch charakterisiert, einschließlich ihrer Zytotoxizität, Targeting-Spezifität und Biodistribution im Tumorgewebe, durch drei Bildgebungsmodi.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs wurden als RGD-gezielte Multi-Modus-Kontrastmittel entworfen, indem ein biokompatibles Polymer PLGA mit Fe₃O₄ und Na₂CO₃ und einem Integrin-gezielten Agenten über eine biologisch abbaubare chemische Bindung eingekapselt wurde (Schema 1b).

Transmissionselektronenmikroskopie-Bilder zeigten, dass Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs klare Kugeln mit gleichmäßig dispergierten Eisenoxidpartikeln in der Schale waren (Abb. 1a). Die durchschnittliche hydrodynamische Größe der NPs wurde durch dynamische Lichtstreuung als 117,6 nm gemessen, und der durchschnittliche Polydispersitätsindex betrug 0,234 (Abb. 1b). Die Oberflächenladung der NPs wurde durch Zeta-Potenzial-Messungen zu -21,7 mV bestätigt (Abb. 1c). Fluoreszenzspektrum-Messung ergab, dass Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD die maximale Emissionswellenlänge bei 685 nm hatte, was anzeigte, dass Cy5.5 erfolgreich im PLGA-Kern eingekapselt war (Abb. 1d). Die Sättigungsmagnetisierungs-Werte für Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD und freies Fe₃O₄ NPs betrugen 32,6 und 42,5 emu/g (Abb. 1e). Diese Ergebnisse wiesen auf die superparamagnetische Eigenschaft der Nanopartikel bei Raumtemperatur hin. Das FTIR-Spektrum von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD zeigte, dass N-H-Streckschwingung und -OH-Absorptionspeak bei etwa 3432 cm⁻¹ erschien. Zusätzlich fanden wir eine Verstärkung (1628 cm⁻¹) der C=O-Streckschwingung. Im Vergleich zu den nicht-gezielten NPs war der charakteristische Peak (das Carboxyl) bei 1735 cm⁻¹ der gezielten NPs signifikant reduziert. Die Ergebnisse zeigten die Bindung zwischen der Carboxylgruppe auf der Mikrokugeloberfläche und der Aminogruppe am RGD-Peptid. Die in-vitro-Bindung von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs ist in Abb. 1f gezeigt.

In vitro-Bindung von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs

αvβ3-Integrin ist allgemein hoch auf Brustkrebs-Tumor-Endothelzellen exprimiert und kann Tumor-Metastasen fördern [33-36]. Zelluläre Immunfluoreszenz für die Expression von αv-Integrin in MDA-MB-231-Zellen war viel höher als in MCF-7-Zellen; A549-Zellen dienten als Positive Controls (Abb. 2a). Die zelluläre Aufnahme von NPs wurde durch CLSM untersucht (Abb. 2b). Die Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs zeigten eine viel höhere Binderate an MD-MB-231-Zellen als nicht-gezielte NPs. Die Fluoreszenzbilder zeigten auch, dass Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs an das Zellplasma banden, und überlagerte Bilder zeigten die gleichen Orte wie die Expression von αv-Integrin [37, 38].

Zytotoxizitäts-Assay

Die in-vitro-Zytotoxizität von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs wurde in MDA-MB-231-Zellen mittels CCK8-Assay geschätzt, während A549 und MCF-7 Zellen, die mit NPs behandelt wurden, als Kontrollen verwendet wurden (Abb. 2c). Im Bereich von Fe-Konzentrationen von 5-80 µg/ml wurde die Zelllebensfähigkeit von A549 und MB231 Zellen nicht signifikant reduziert, und beide lagen über 70 %. Im Gegensatz dazu zeigten MCF-7 Zellen einen signifikanten Rückgang der Zelllebensfähigkeit auf ungefähr 50 % bei Fe-Konzentrationen höher als 40 µg/ml. Die CCK8-Ergebnisse demonstrierten, dass Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs eine signifikant niedrigere Zytotoxizität in MDA-MB-231-Zellen über einen gegebenen Konzentrationsbereich aufwiesen.

In vitro-Kontrastbildgebung

Wir verwendeten ein Agar-Gel-Phantom, um die Leistung von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs in vitro bei verschiedenen pH-Werten zu untersuchen (Abb. 3a). Die Ultraschallkontrastbilder von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs wurden bei schwach saurem pH (pH 6,8) im Vergleich zu pH 7,2 signifikant verstärkt, wahrscheinlich weil pH 7,2 nicht genug CO₂-Blasen für die Ultraschallbildgebung produziert. Im Gegensatz dazu konnten bei schwach saurer Umgebung genug Blasen für die Ultraschallbildgebung erzeugt werden. Diese Eigenschaft ist relevant für Tumoren, die eine hohe Gewebeheterogenität und diverse pH-Werte (pH 6,8-7,2) in vivo aufweisen [32, 39, 40]. Die Signalintensität des Ultraschallbildes wurde dann analysiert (Abb. 3b). Die Signalintensitätsverhältnisse der nicht-gezielten NP (pH = 7), nicht-gezielten NP (pH = 5), gezielten NP (pH = 7) und gezielten NP (pH = 5) Gruppen relativ zur Signalintensität der Blankogruppe betrugen 112 %, 145 %, 167 % und 178 ± 4 %, was klar anzeigt, dass die gezielte NP-Gruppe (pH = 5) das stärkste US-Signal hatte.

Für die MRT-Studie in vitro nahm die T2-gewichtete Signalintensität mit zunehmender Fe-Konzentration in den Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs signifikant ab, was die Möglichkeit dieser NPs für die Verwendung als T2 MR-Kontrastmittel anzeigte (Abb. 3c). Die transversale Relaxationsrate (r2) von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs wurde auf 19,597 mM⁻¹ s⁻¹ berechnet. Obwohl die transversale Relaxationsrate (r2) von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs niedriger ist als die vieler anderer MRT-superparamagnetischer Agenten, kann die Zusammensetzung von Fe₃O₄ die r2 erhöhen, die 2,94-mal höher war als die r2 von klinisch verwendeten SPIO-Partikeln.

Ultraschallkontrastbildgebung von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs

Um das Potenzial der Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs für die Ultraschallbildgebung in Tumoren zu demonstrieren, verabreichten wir eine Schwanzveneninjektion von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs an Brustkrebs-Xenotransplantat-Nacktmäuse und überwachten die Ultraschallbilder als Funktion der Zeit (Abb. 4a). Vor der Injektion wurden Bilder des Tumors, der Leber und des subkutanen Bereichs aufgenommen. Unmittelbar nach der Injektion zeigte der Bereich des Tumorgewebes keine Kontrastverstärkung. Eine Verstärkung des Tumorareals wurde ab 30 Minuten nach Injektion beobachtet und dauerte 90 Minuten an. Die in-vivo-Ultraschallergebnisse zeigten, dass Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs genug Blasen in sauren Tumorgeweben erzeugten, um echogene Reflektivität für die Ultraschallbildgebung zu produzieren. Als Kontrolle erhielten wir auch Bilder der Leber und des subkutanen Gewebes zu verschiedenen Zeiten nach Injektion der gezielten NPs. Während des gesamten Beobachtungszeitraums wurde keine signifikante Verstärkung im subkutanen Injektionsbereich gefunden, und die Verstärkung in der Leber, die mit der Zeit abnahm, war signifikant niedriger als in den Tumoren (Abb. 4b). Dieses Ergebnis zeigt, dass Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs, die im Körper bei physiologischem pH zirkulieren, keine substantielle Menge an CO₂-Blasen für Ultraschallkontrastverstärkung produzieren.

MRT von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs

Für in-vivo MRT, um zu demonstrieren, dass NPs für tumor-spezifische Bildgebung verwendet werden können, wurden Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs direkt in Tumoren und Muskeln injiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass der Tumorareal eine signifikante Abnahme des T2-MR-Kontrasts nach Injektion der gezielten NPs aufwies, und die Signalintensität nahm signifikant von 8875 bei 0 min auf 5972 bei 120 min nach Injektion ab (Abb. 5a, b). Bei Injektion der gleichen Menge an Nanopartikeln zeigte der subkutane Muskelbereich eine viel geringere T2-Signalabnahme. Dieses Ergebnis demonstriert die Wirksamkeit von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs mit hypersensitiven Integrin-gezielten T2-MR-Kontrastmitteln für die Verwendung in tumor-gezielter Bildgebung. In der Schwanzveneninjektions-Gruppe zeigte T2-MR-Bildgebung auch eine offensichtliche Kontrastabnahme im Tumor bei 24 h post-Injektion, was die hohe Tumorakkumulation von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs demonstrierte (Abb. 5c, d). Darüber hinaus wurden verringerte T2-Signale in Leber und Nieren beobachtet, was anzeigt, dass die Eisenionen in den NPs schnell aus dem Körper beseitigt werden könnten. Daher zeigte die MRT, dass die PLGA-umhüllten Fe₃O₄-Nanopartikel effizientes passives Tumor-Targeting über den Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effekt aufwiesen, besonders RGD-vermitteltes Targeting, aber in vivo abgebaut und schnell ausgeschieden werden konnten.

Fluoreszenzbildgebung und Histologie

Zweihundert Mikroliter NPs wurden intravenös in Mäuse für in-vivo Fluoreszenzbildgebung injiziert. In der Gruppe, die mit RGD-gezielten NPs injiziert wurde, nahm das Fluoreszenzsignal von Cy5.5 im Tumorareal allmählich zu und erreichte einen Peak bei 4 Stunden nach Injektion, was anzeigte, dass Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs effektiv im Tumor akkumulieren können. In der nicht-gezielten Gruppe wurden NPs nach Injektion im ganzen Körper verteilt und schnell beseitigt, und sie akkumulierten nicht für einen langen Zeitraum im Tumor (Abb. 6a). Die Mäuse wurden dann seziert, und die Hauptorgane und Tumoren wurden für in-vitro Fluoreszenzbildgebung gesammelt, was eine hohe Tumoraufnahme der gezielten NPs zeigte (Abb. 6b, c). Die Fluoreszenzintensität von Cy5.5 in den Tumoren von Mäusen, die mit gezielten NPs injiziert wurden, war 1,5-mal so hoch wie in Mäusen, die mit nicht-gezielten NPs injiziert wurden.

Darüber hinaus wurde das tumor-spezifische Targeting von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs durch Gewebe-Fluoreszenzbildgebung von gefrorenen Tumorschnitten verifiziert (Abb. 7a). Immunfluoreszenzfärbung von Tumorschnitten mit Antikörpern gegen αv und β3 Integrin zeigte signifikante Expression von αvβ3 Integrin in Tumorgeweben. Die Fluoreszenz von αv und β3 Integrin wurde mit der Cy5.5 Fluoreszenz von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs überlagert, um ein Immunfärbungsbild zu erhalten, das Kolokalisierung aufzeigt. Die Immunfluoreszenzergebnisse in den Tumorgeweben zeigten an, dass Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs spezifisch an αvβ3 Integrin in MB231 malignem Brustkrebs binden. Zudem zeigte H&E-Färbung von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs im Vergleich zur nicht-gezielten Gruppe, dass alle Organ-Gewebeschnitte normale pathologische Morphologie aufwiesen und keine histopathologische Schadensreaktion (Abb. 7b). Alle Ergebnisse der obigen Zytotoxizitäts- und Histologieanalyse zeigten an, dass Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs keine signifikante Toxizität für Hauptorgan-Gewebe in vivo induzierten, und ihre gute Biokompatibilität kann vernünftigerweise auf PLGA zurückgeführt werden.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend demonstrieren die obigen Ergebnisse einen kreativen und erfolgreichen Ansatz für die MRT von Brustkrebs durch ein magnetisches Targeting und ein gaserzeugendes System, das in der Tumormikroumgebung aktiviert wird. Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs zeigen hervorragende Bildgebungsleistung und gute Biokompatibilität in MR/Ultraschall/Fluoreszenz-Bildgebungsmodi. Unsere Arbeit zeigt das starke Potenzial für Tumordiagnose mit verbesserter multimodaler Bildgebung.

Materialien und Methoden

Materialien

Poly(lactid-co-glycolide) Säure (PLGA) (Lactid:Glycolid = 75:25, Mw = 20.000), Cyanin5.5 Farbstoff und Polyvinylalkohol (PVA) wurden von Sigma-Aldrich Company (Shanghai, China) gekauft. Das RGD-Peptid wurde von GenicBio BioTech Co. Ltd. (Shanghai, China) kundenspezifisch synthetisiert. Fe₃O₄-Nanopartikel und Natriumcarbonat (Na₂CO₃) wurden von Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, China) gekauft. Dichlormethan (CH₂Cl₂) und Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden von Solarbio Company (Beijing, China) bezogen. Alle Chemikalien waren analytischer Grade.

Synthese von Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD Nanopartikeln

Zunächst wurden 12,5 mg PLGA und 0,25 ml Chloroform zusammen gemischt. Dann wurden 5 µl Cy5.5, 15 µl oleinsäure-modifizierte magnetische Nanopartikel in Chloroform dispergiert (OA@Fe₃O₄, 10 mg/ml), 5 µl Natriumcarbonat (Na₂CO₃) und 1,5 ml 1 % PVA-Lösung nacheinander hinzugefügt und 2 Minuten mit einem Ultraschallprozessor emulgiert. Dann wurden 12,5 ml 0,3 % PVA-Lösung hinzugefügt und 3-4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und 12,5 ml 0,4 % PVA-Lösung wurden zum Rühren (500 rpm/min) über Nacht hinzugefügt, um residuale organische Lösungsmittel zu entfernen. Die obige Lösung wurde mehreren Ultrafiltrationswaschungen mit ddH₂O unterzogen und dann mit PB-Puffer (pH = 7,4) auf ein Endvolumen von 1,25 ml verdünnt. Als Nächstes wurden 0,25 mg EDC und 1,25 mg NHS zur obigen gemischten Lösung hinzugefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 25 °C gerührt und dann dreimal mit Ultrafiltration gewaschen und in PB-Pufferlösung (pH = 7,4) resuspendiert. Als Nächstes wurden 1,25 mg cRGD zur Lösung hinzugefügt und über Nacht bei 4 °C gerührt. Um EDC, NHS und eventuelle residuale cRGD zu entfernen, wurde die transparente Lösung durch ein Ultrafiltrationsröhrchen gefiltert. Schließlich wurden Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs in 1,25 ml deionisiertem Wasser resuspendiert und bei 4 °C gelagert.

Nanopartikel-Charakterisierung

Die dynamischen Durchmesser und das Zeta-Potenzial der Nanopartikel wurden mit einem Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK) gemessen. Die Morphologie der Nanopartikel wurde mit einem FEI Tecnai F20 Transmissionselektronenmikroskop erhalten. Die Cy5.5-Beladung wurde mit einem Hitachi F-7000 Fluoreszenzspektrometer aufgezeichnet. FTIR wurde mit einem Fourier-Transform-Infrarotspektrometer (Alpha II, Bruker, Schweiz) durchgeführt. Ein Vibrationsproben-Magnetometer (VSM, Lake Shore 7410) wurde angewendet, um die Hysteresekurve der Nanopartikel und freien Fe₃O₄ zu bestimmen.

Zellen und Tiere

Menschliche Brustkrebs MDA-MB-231 Zellen wurden freundlicherweise von der Stammzellbank, Chinesische Akademie der Wissenschaften, bereitgestellt. Zellen wurden bei 37 °C in 95 % Luft und 5 % CO₂ gehalten. Weibliche BALB/c Mäuse (4 Wochen) wurden von Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. gekauft und gemäß Protokollen gehalten, die vom Guangxi Medical University Laboratory Animal Center genehmigt wurden. Tierexperimente folgten dem Leitfaden für Pflege und Verwendung von Labortieren, veröffentlicht vom Tierschutzkomitee des Laboratory Animal Center, Guangxi Medical University. MDA-MB-231 Brustkrebszellen wurden in die rechte Flanke von BALB/c Mäusen transplantiert (2 × 10⁶ in 200 µl Zellen pro Maus) und 10-14 Tage wachsen gelassen (mittlerer Durchmesser 5 mm) vor der Bildgebung.

Zelluläre Expression von αv Integrin

Zelluläre Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um die hohe Expression von αv Integrin in MDA-MB-231 Zellen zu bestätigen. A549 und MCF-7 Zellen wurden als Kontrollen verwendet. Zellen wurden auf 35 mm Glasboden-Kulturschalen (MatTek, USA) bei 2 × 10⁴ Zellen ml⁻¹ für 24 Stunden ausgesät. Nach Inkubation wurden Zellen 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Dann wurden sie über Nacht bei 4 °C mit kaninchen monoklonalem Anti-Integrin αv Antikörper (ab179475, Abcam) inkubiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Anti-Rabbit IgG Antikörper. Schließlich wurden die Zellen mit DAPI gefärbt. Bilder wurden mit konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (TCS SP8, Leica, Deutschland) aufgenommen.

Um die Targeting-Wirksamkeit der Nanopartikel zu bewerten, wurde eine zelluläre Aufnahmestudie mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) durchgeführt. Zellen wurden auf 35 mm Glasboden-Kulturschalen (MatTek, USA) bei 2 × 10⁴ Zellen ml⁻¹ für 24 Stunden ausgesät. Dann wurden die Zellen mit RGD-gezielten NPs (30 µg ml⁻¹, 0,5 ml) bei pH 7,4 für 2 Stunden inkubiert, und nicht-gezielte NPs wurden als Kontrollen verwendet. Nach Inkubation wurden die Zellen 20 Minuten mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann mit αv Antikörper inkubiert. Mittels Kolokalisierung verifizierten wir die gezielte Bindung der Nanopartikel an das Integrin auf den Zellen.

CCK8 Assay

Die Biokompatibilität von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD Nanopartikeln wurde durch eine Zytotoxizitätsstudie bewertet. MDA-MB-231, A549 und MCF-7 Zellen wurden auf 96-Well-Platten bei 5 × 10³ Zellen ml⁻¹ für 24 Stunden ausgesät. Dann wurden 0,1 ml Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP Suspension bei Fe-Konzentrationen von 5, 10, 20, 40 und 80 µg/ml zu jedem Well hinzugefügt und 24 Stunden inkubiert. Schließlich wurden 10 µl CCK8 Lösung hinzugefügt, und die Suspension wurde weitere 1 Stunde inkubiert. Die Ergebnisse wurden mit einem Mikroplattenleser (Thermo Scientific, USA) bei 450 nm bestimmt.

Kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung

Ultraschallbildgebung von Nanopartikeln wurde mit einem Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Kanada) Ultraschallsystem durchgeführt. Die RGD-gezielten und nicht-gezielten NPs wurden dem Agarose-Modell hinzugefügt, und PBS wurde als Kontrolle verwendet. Bilder wurden im B-Modus und CEUS-Modus mit verschiedenen pH-Puffern von 7,2 und 6,8 aufgenommen. Der Interessensbereich wurde gezeichnet, und der durchschnittliche Grauwert wurde in B-Modus-Bildern gemessen.

Für in-vivo Ultraschallbildgebung wurden Mäuse mit 2 % Isofluran (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China) narkotisiert, und die Körpertemperatur wurde mit einer Heizmatte bei 37 °C gehalten. Insgesamt 200 µl RGD-gezielte NPs wurden über die Schwanzvene injiziert. Kontrolltiere erhielten eine subkutane Injektion mit der gleichen Menge an NPs. Ultraschallbilder wurden mit einem 7-MHz-Schallkopf aufgenommen, um kontinuierlich Ultraschallbilder der Tumoren, Lebern und subkutanen Bereiche zu erfassen. Der akustische Fokusbereich wurde in die Mitte des Tumors mit dem größten Querschnitt gelegt, und ein Sichtfeld, das den Tumor und sein angrenzendes Gewebe enthielt, wurde erhalten.

Magnetresonanztomographie

MRT-Untersuchungen von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs wurden mit einem 3,0 T MR (GE Healthcare, USA) und einer Tierspule (RF TECH LIMITED, China) durchgeführt. NPs mit verschiedenen Fe-Konzentrationen von 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 und 1 mM wurden in 1 ml Eppendorf-Röhrchen gescannt, und PBS wurde als Kontrolle verwendet. T2 MRT wurde für jedes Röhrchen mit einer T2-gewichteten FSE-Sequenz durchgeführt (Schichtdicke 3 mm, TR/TE 2000/74,4 ms, 8 × 8 cm FOV und 320 × 256 Matrix). Die Relaxivitäten (r2) wurden durch lineare Anpassung der inversen Relaxationszeit als Funktion der Fe-Konzentration berechnet.

Für in-vivo MRT wurden Mäuse zufällig in zwei Gruppen (n = 3) für MR-Scanning eingeteilt, die entweder (1) lokale Injektion von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs in subkutanes Muskel- und Tumorgewebe oder (2) Schwanzveneninjektion von Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs erhielten. Basislinienbilder der Mäuse wurden vor Injektion der Nanopartikel aufgenommen. Für Gruppe eins wurde die gleiche Menge an NPs in subkutanes und Tumorgewebe injiziert, und MRT-Scanning wurde alle 30 Minuten durchgeführt, um den Signalübergang der Gewebe aufzuzeichnen. Für Gruppe zwei wurde Tumor-Bildgebung in axialer und koronaler Position durchgeführt, und die MR-Parameter waren die gleichen wie für in-vitro-Bildgebung. Die Signalintensität (SI) im Region of Interest (ROI) wurde gemessen und mit Gewebesignalen zu verschiedenen Zeiten vor und nach Injektion verglichen.

Tumor-Fluoreszenzbildgebung

Für Fluoreszenzbildgebung in vivo wurde ein In-vivo-Fluoreszenzbildgebungssystem (FX PRO, Bruker, Schweiz) zum Scannen verwendet, und die Mäuse wurden zufällig in zwei Gruppen (n = 3) eingeteilt: (1) RGD-gezielte NPs und (2) nicht-gezielte NPs. Bilder wurden alle 30 Minuten für einen Zeitraum von 4 Stunden nach der Injektion aufgenommen. Anschließend wurden wichtige Organe und Tumoren entnommen und bildgebend erfasst, und die Verteilung der Fluoreszenz in den Organen des Körpers wurde beobachtet. Quantitative Analyse der Fluoreszenzintensität wurde mit molekularer Bildgebungssoftware (Bruker, Schweiz) durchgeführt. Diese wichtigen Organe wurden dann H&E-Färbung unterzogen, um die Gewebetoxizität zu bewerten. Gefrorene Tumorschnitte wurden auch Fluoreszenz-Immunfärbung mit Antikörpern gegen αv-Integrin und β3-Integrin unterzogen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in diesem Manuskript gezogenen Schlussfolgerungen basieren auf den Daten, die alle in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

Cy5.5:

Sulfo-Cyanine5.5 NHS ester

DAPI:

4′,6-diamidino-2-phenylindole

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

FSE:

Fast spin echo

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PB:

Phosphate buffer

PBS:

Phosphate buffered saline

PEG:

Polyethylene glycol

PVA:

Polyvinyl alcohol

RGD:

Arginine–glycine–aspartate

TE:

Echo time

TR:

Repetition time