Gezielte pH-responsive liposomale Morin-Abgabe über Aptamer-Gold-Nanopartikel-Konjugate zur Krebstherapie

Zusammenfassung

Diese Studie stellt die Synthese eines neuartigen Antikrebs-Nanopartikels vor: Aptamer- und Gold-Nanopartikel-modifizierte, pH-sensible Morin-Liposome (Apt-Au@MSL) mit zielgerichteten Eigenschaften. Tumore sind schwer zu heilen, da ihre Mikroumgebung von normalem Gewebe abweicht – insbesondere ist der pH-Wert niedriger, was die Wirksamkeit von Medikamenten allgemein beeinträchtigt. Daher haben pH-responsive Wirkstoffe große Aufmerksamkeit erfahren. Gold-Nanopartikel (AuNPs) zeigen als Drug-Carrier großes Potenzial aufgrund ihrer geringen Größe, guten Biokompatibilität, leichten Oberflächenmodifizierbarkeit und starken Zellpenetration. Apt-Au@MSL weist hervorragende Monodispersität und Tumortargeting-Eigenschaften auf und kann in leicht saurer Umgebung über Dialyse freigesetzt werden. Durch MTT-Assay wurde das Modell-Krebszelllinie SGC-7901 identifiziert, deren Proliferation effektiv unterdrückt wird. In-vivo-Ergebnisse zeigen, dass die Verabreichung von Apt-Au@MSL das Tumorwachstum in Xenotransplantat-Mausmodellen hemmt. H&E-Färbung und TUNEL-Assay bestätigen weiter, dass Apt-Au@MSL Tumorapoptose fördert. Der Mechanismus könnte über die Auslösung einer Überproduktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und die Regulation mehrerer Signalübertragungswege erfolgen. Sowohl Blutbiochemie-Tests als auch H&E-Färbung deuten auf vernachlässigbare Akuttoxizität und gute Biokompatibilität in vivo hin. Mit seiner leistungsstarken Funktion kann Apt-Au@MSL als zielgerichtetes Antikrebs-Material für zukünftige klinische Krebstherapien dienen.

Einleitung

Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen und verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste sowie menschliches Leid. Enorme Anstrengungen wurden in die Entwicklung intelligenter Medikamente zur Krebstherapie investiert. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Medikamente bis zum Erreichen des Zielorts zu schützen, können Polymer-Nanopartikel die Abgabe therapeutischer Wirkstoffe potenziell verbessern. Um sicherzustellen, dass der therapeutische Wirkstoff den aktiven Ort erreicht, werden hochreaktive Nanopartikel eingesetzt. Diese können so designed werden, dass sie ihre Materialeigenschaften unter verschiedenen biologischen Reizen verändern. Reaktive Nanopartikel werden mittels verschiedener Stimuli entworfen, darunter externe Reize (z. B. Temperatur, Licht) und biologische Reize (z. B. pH- oder Redoxbedingungen). pH-responsive Nanopartikel haben Forschungsinteresse geweckt, da sich der pH-Wert nach der Endozytose von Nanopartikeln ändert. Materialien, die auf pH reagieren, ziehen ebenfalls Aufmerksamkeit auf sich, da die pH-responsive Funktion leicht in verschiedene Polymerstrukturen integriert werden kann, um ein Set von pH-responsiven Nanopartikeln zu entwerfen. Nanopartikel können auf pH durch Änderung der Oberflächenchemie, Änderung der Partikelgröße oder -form sowie Abbau oder Freisetzung von Substanzen reagieren. Diese Änderung der Nanopartikeleigenschaften kann genutzt werden, um die zelluläre Aufnahme und kontrollierte Freisetzung zu regulieren. Daher bieten pH-responsive Nanopartikel eine leistungsstarke Strategie für das Design therapeutischer Abgabesysteme.

Morin-Hydrat (3,5,7,2′,4′-Pentahydroxyflavon) ist ein natürlicher Wirkstoff, der aus chinesischen Kräutermedizinen oder Pflanzen isoliert wird. Es handelt sich um eine Progesteron-Verbindung und ein sekundäres Phenol-Metabolit in Pflanzen. Morin ist in der Natur weit verbreitet und zeigt gute antioxidative, antikarzinogene und signifikant entzündungshemmende Wirkungen. Das Potenzial von Morin für verschiedene Anwendungen hat großes Interesse geweckt, wird jedoch erheblich durch die geringe Wasserlöslichkeit und Bioverfügbarkeit der Substanz limitiert.

Liposome (hohl) aus Lecithin und Ceramiden besitzen eine Doppelschichtstruktur aus amphiphilen Lipidmolekülen. Sie bieten wünschenswerte Eigenschaften wie Biokompatibilität, Funktionalität, reduzierte Nebenwirkungen und die Fähigkeit, große Mengen an Medikamenten einzukapseln. Sie können hydrophile und hydrophobe Wirkstoffe effizient transportieren und vor äußeren Bedingungen schützen, wodurch sie erfolgreich in gezielte Geweberegionen gelangen. Verbesserte Wirksamkeit wird in das Design integriert, um die pH-getriggerte Freisetzung des Antikrebs-Wirkstoffs im Tumorinterstitium über pH-sensible Liposomen zu ermöglichen. Diese speziellen Liposomen geben das Medikament in Gewebemilieus ab und destabilisieren sich rasch in sauren Umgebungen, wie den Endosomen von Krebsgewebe.

Für eine verbesserte Selektivität und Wirksamkeit der Tumorbehandlung sollten pH-sensible Liposomen modifiziert werden, um tumorzielgerichtete Nanopartikel zu bilden. DNA-Aptamere wurden kürzlich als hochselektive und sensitive Biosensoren und Bildgebungssensoren sowie als potenzielle Wirkstoffe für zielgerichtete Krebstherapeutika entwickelt. Der einzelsträngige DNA-Aptamer AS1411 funktioniert aufgrund seiner hohen Bindungsaffinität zu Krebszellkernen als chemotherapeutisches Mittel. Dieser Aptamer (Apt) wurde mit AuNPs kombiniert, um ein zweikomponentiges Nanokonstrukt aus Aptamer-beladenen AuNPs herzustellen, das mit Krebszellkernen interagieren kann. Studien haben zudem gezeigt, dass das Design von Liposom-Nanopartikel-Hybriden einen reichen Werkzeugkasten für die Herstellung solcher multifunktionaler Modalitäten bietet. Ein hybrides Liposom-AuNP-Vesikelsystem aus kationischen Liposomen und AuNPs wurde entwickelt, um die Medikamentenpenetration im Tumorinterstitium zu verbessern und die antikarzinogene Aktivität zu erhöhen.

Gold-Nanopartikel (AuNPs) gelten als gute Drug-Carrier und können mit bioverwandten Molekülen modifiziert werden, um die Krebszielspezifität zu erhöhen. Durch die Oberflächenmodifikation von AuNPs kann der Aptamer der Sulfhydrylgruppe verwendet werden, um die Oberfläche von AuNPs zu modifizieren, was durch die Au-S-Kovalenzbindung gezielt werden kann, und die entsprechende Sulfhydrylgruppe auf der Nanogoldoberfläche kann an die Nanogoldoberfläche gebunden werden. Aus ingenieurtechnischer und anwendungsorientierter Perspektive bieten ligandgebundene Goldnanomaterialien eine leistungsstarke Plattform zur Erleichterung zielgerichteter Identifikation, Detektion und Behandlung.

In der vorliegenden Studie verwendeten wir pH-sensitive Liposome, die Morin einkapseln, und assemblierten Au-Apt, das auf der Liposomenoberfläche modifiziert wurde (Apt-Au@MSL, Abb. 3a). Morin, das durch geringe Wasserlöslichkeit und Bioverfügbarkeit gekennzeichnet ist, wurde transformiert. Morphologie, Größe und weitere Eigenschaften des hergestellten Apt-Au@MSL wurden charakterisiert. Das neue Nanopartikel zeigte tumorzielgerichtete Eigenschaften und hohe antikarzinogene Aktivität. Die antikarzinogene Aktivität von Apt-Au@MSL wurde in vitro und in vivo untersucht (Abb. 2).

Materialien und Methoden

Materialien

L-α-Phosphatidylcholin (PC), Cholesterin (Chol), Cholesterylhemisuccinat (CHEMS), Morin (≥ 99,99 %), Natriumcitrat (99,9 %), HAuCl₄·3H₂O (≥ 99,9 %), Polyvinylpyrrolidon (PVP, MW 40.000), NaOH (≥ 98,0 %) und HCl (37 %) wurden von Sigma-Aldrich Chemical Co. (USA) bezogen. Der AS1411-Aptamer mit Disulfid-Modifikation wurde von TaKaRa (Dalian, China) mit der Sequenz 5′-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3′ synthetisiert. Thiazolylblau-Tetrazoliumbromid (MTT), Propidiumiodid (PI), Calcein und Alexa Fluor 488 Annexin V wurden von Sigma-Aldrich Chemical bezogen. Alle wässrigen Lösungen wurden in doppelt destilliertem Wasser hergestellt. Alle anderen Reagenzien waren von bester kommerzieller Qualität.

Synthese von AuNPs

Bis zu 1 mL HAuCl₄·4H₂O (1 %) wurde in 25 mL Milli-Q-Wasser (pH = 5,5) gelöst, und 50 mg PVP wurden zur Lösung gegeben. Die erhaltene Lösung wurde in einen dreihalsigen Kolben (150 mL) gegossen und 5 min unter mechanischem Rühren mit Mikrowellen (MW) bestrahlt. Anschließend wurden 1,5 mL Natriumcitratlösung (1 %) schnell hinzugefügt und 3 min MW-bestrahlt. Die Lösung wurde durch Zentrifugation bei 10.000 U/min für 5 min gesammelt.

Synthese von Apt-AuNPs

Die Disulfidbindung der Aptamere wurde mit Tris(2-carboxyethyl)phosphin gespalten. Nach 30 min wurde die Aptamerlösung (100 µL, 100 µM) zu 10 mL einer 5 nM AuNP-Lösung gegeben und 24 h inkubiert, um Au-Apt-NPs zu bilden. Nach einem Tag wurde die Mischungslösung zweimal mit 2,5 mL einer 500 mM NaCl-Lösung gesalzen, getrennt durch 4 h.

Herstellung pH-sensitiver Liposome

Liposome aus Eik PC zu CHEMS zu Chol im molaren Verhältnis 33:13:5 und 5 % Morin wurden durch Filmerhydrierung hergestellt. Eik PC, CHEMS, Chol und 2 mg Morin wurden in 8 mL CHCl₃ gelöst, und die organischen Lösungsmittel wurden bei 40 °C mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Für Morin-Liposome wurde der resultierende dünne Lipidfilm mit 2 % (w/v) PBS hydratisiert und anschließend 15 min mit einem Eisbad-Sondenultraschall behandelt. Das finale Liposom wurde im kolloidalen System synthetisiert und stabilisiert. Für Apt-Au@Morin pH-sensitive Liposome (Apt-Au@MSL) wurde der Lipidfilm mit 475 µg/mL Au-Apt-NPs in 5 % Dextrose hydratisiert, gefolgt von Sonikation.

Charakterisierung

Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie (UV-Vis, S-3100 Photodiodenarray, Scinco Co., Ltd., Korea) und Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) wurden durchgeführt (Nicolet iS50, USA, Thermo Fisher Scientific). Die Morphologie von Apt-Au@MSL wurde durch Transmissionelektronenmikroskopie (TEM, HT7700, Tokyo Japan, Hitachi) untersucht. Der Freisetzungsprozentsatz von Morin wurde durch UV-Vis-Spektroskopie detektiert. Die Morphologie der Morin-Liposome und Apt-Au@MSL wurde zudem durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM, S-4800, Hitachi, Japan) beobachtet. Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zeta-Potenzial-Messungen dienten zur Charakterisierung der optischen Eigenschaften und Größen von Morin-Liposomen und Apt-Au@MSL auf einem Brookhaven ZetaPALS-Potenzialanalysator.

Zellkultur

Menschliche Krebszelllinien SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 und Hs68 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen und in RPMI mit 10 % fetalem Kälberserum bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.

In-vitro-Antikrebs-Aktivitätsstudie

SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 und Hs68 wurden in 96-Well-Platten (2,0 × 10³ Zellen/Well) ausgesät und anschließend mit Apt-Au@MSL in variierenden Konzentrationen (0, 5, 10, 15, 20 und 30 µg/mL) kultiviert. AuNPs und Morin dienten als Kontrollgruppen. Die Blankogruppe bestand aus unbehandelten Zellen. Die 96-Well-Platten wurden in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurden 9,6 mL MTT-Lösung (5 mg/mL) in jeden Well gegeben und weitere 2 h inkubiert. Jede Gruppe wurde in Triplicate getestet, und IC₅₀-Werte wurden aus den mittleren OD-Werten der Triplicattests versus Wirkstoffkonzentrationskurven abgeleitet. Die Helligkeit jeder Gruppe wurde durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie ermittelt.

Zelladhäsion wurde mit einem Echtzeit-Zell-elektronischen Sensorsystem (RT-CES; ACEA Biosciences, Inc.) alle 10 min für 75 h überwacht. Zur Bestimmung der Zelladhäsion wurde jeder Well mit Zellen (1,0 × 10⁴ Zellen/Well) mit frischem Medium auf ein Endvolumen von 200 µL besät und anschließend in einer Apt-Au@MSL-Lösung bei variierenden Konzentrationen (10, 20 und 30 µg/mL) bei 10 h für 12 h inkubiert. Die Blankogruppe bestand aus unbehandelten Zellen, die Kontrollgruppen aus Morin- und Morin-Liposom-Gruppen.

Fluoreszenzmikroskopie

SGC-7901-Zellen wurden über Nacht in 48-Well-Platten bei 37 °C, 5 % CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden dann mit Apt-Au@MSL-Lösungen (10 und 30 µg/mL) bei unterschiedlichen Konzentrationen für 12 h behandelt. Die Kontrollgruppen bestanden aus Morin- und Morin-Liposom-Gruppen. Anschließend wurde das Medium entfernt. Die Blankogruppe bestand aus unbehandelten Zellen. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden gefärbt und anschließend durch Co-Färbung von lebenden und toten Zellen (LIVE/DEAD-Assay) gemessen. Nach Co-Färbung mit Calcein-AM/PI für 30 min wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und Fluoreszenzbilder wurden durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) aufgenommen (für Calcein-AM, Ex = 488 nm und Em = 515 nm; PI Ex = 535 nm und Em = 615 nm).

Apoptotischer Zelltod-Analyse

Zur Messung der antikarzinogenen Effekte von Apt-Au@MSL wurde jeder Well einer 6-Well-Platte mit SGC-7901-Zellen (1,0 × 10⁵ Zellen/Well) besät und anschließend in Apt-Au@MSL-Lösungen bei variierenden Konzentrationen (5, 10, 20 und 30 µg/mL) für 12 h inkubiert. Die Blankogruppe bestand aus unbehandelten Zellen, die Kontrollgruppen aus Morin- und Morin-Liposom-Gruppen. Nach der Behandlung wurden die Zellen gesammelt und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit PI und Annexin V-FITC gefärbt und anschließend mit einem CytoFLEX-Analysator (Beckman Coulter) analysiert (für PI, Ex = 535 nm und Em = 615 nm; Annexin V-FITC, Ex = 488 nm und Em = 525 nm).

Studien zur Zellwandzerstörung

Zur Untersuchung der Zellwandzerstörung im Antikrebs-Assay wurden SGC-7901-Zellen in 6-Well-Platten bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert. Zellen, die ohne das Material kultiviert wurden, dienten als Blankogruppe. Nach der Kultivierung mit Apt-Au@MSL bei variierenden Konzentrationen (5, 10, 20 und 30 µg/mL) für 12 h wurden sie mit Trypsin-EDTA-Lösung 0,25 % behandelt. Alle Zellen (einschließlich der schwimmenden Zellen im Medium) wurden mit 2000 U/min für 5 min gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden anschließend in 2,5 % Glutaraldehyd-Lösung für 4 h postfixiert. Die fixierten Zellen wurden in einer Aceton-Gradientenreihe für 20 min dehydriert. Die Zellen wurden schließlich einer Reihe von Verfahren unterzogen, auf Kupfergittern montiert und mit TEM (HT-7700, Hitachi, Japan) beobachtet.

Western-Blot-Assay

Die Proteinexpression von SGC-7901-Zellen wurde durch Western-Blot-Analyse detektiert. SGC-7901-Zellen (4,0 × 10⁵ Zellen/Well) wurden auf einer 9-cm-Kulturplatte inkubiert und mit 20 µg/mL Apt-Au@MSL für 1, 6, 12 und 24 h behandelt. Zellen wurden nach der Behandlung geerntet und in einem Zelllysepuffer auf Eis für 1 h suspendiert. Das Gemisch wurde in einer Zentrifuge bei 11.000 g bei 4 °C für 10 min zentrifugiert, und der Überstand mit dem gesamten zellulären Protein wurde gesammelt. Die Gesamtproteinkonzentration im Überstand wurde mit der BCA-Methode bestimmt. Das Protein wurde dann in Ladepuffer resuspendiert und bei 100 °C für 10 min gekocht. Proben mit gleichen Proteinmengen (40 µg/Lane) wurden einer SDS-PAGE (10 % Tricin-Gele) unterzogen. Anschließend wurden sie auf Nitrocellulose (NC)-Membranen bei 100 V für 1,5 h transferiert und mit 5 % fettfreier Milch in Tris-gepuffertem Salin mit 0,1 % Tween-20 (TBST) für 1 h blockiert. Dann wurde die NC-Membran mit den Primär- und Sekundärantikörpern inkubiert. Zielproteinbänder wurden auf der Membran mit ECL-Western-Blot-Detektionsreagenzien visualisiert. β-Actin diente als interner Kontrolle für gleichmäßige Proteinbeladung und -transfer. Die Proteinexpression wurde mit Quantity-One-Software quantifiziert, und die Expressionsrate wurde unter dem Band gekennzeichnet.

Tiermodell

BALB/c männliche Nacktmäuse (~ 17 g) wurden vom Model Animal Research Center der Nanjing University bezogen und in einer axenischen Umgebung (spezifisch pathogenfreie Tiere) gezüchtet. Tumormodelle wurden durch subkutane Injektion von Zellsuspension (SGC-7901-Zellen, 100 µL, 1 × 10⁶/mL) in die Schulter der Nacktmäuse etabliert. Helle Bilder des Tumors wurden 15 Tage nach der subkutanen Injektion der Tumorzellen erzeugt. Alle Tierversuche wurden gemäß den von der Anhui Agricultural University Laboratory Animal Center genehmigten Protokollen durchgeführt (Genehmigungsnummer: SYXK 2016-007). Ein Schieblehre wurde verwendet, um den maximalen Längsdurchmesser (Länge) und den maximalen Querdurchmesser (Breite) jedes Tumors zu bestimmen. Das Tumorvolumen wurde dann mit der Formel Länge × Breite² × 0,5 berechnet.

In-vivo-Antikrebs-Studie

Folgetests wurden durchgeführt, als das Tumorvolumen 50 mm³ erreichte. Mäuse wurden zufällig in fünf Gruppen aufgeteilt und folgenden intravenösen Behandlungen unterzogen: PBS (100 µL), Morin, Morin-Liposome, Au-Apt und Apt-Au@MSL. Die Mäuse wurden intravenös in den Schwanz mit einer Dosis von 2 mg/kg des Materials injiziert. Die Tumormaße der Mäuse wurden nach 24 Tagen gemessen. Körpergewicht und Überleben der Mäuse wurden ebenfalls bestimmt. Die Mäuse wurden euthanasiert, und Tumor- und Organgewebe der Mäuse wurden für H&E-Färbung gesammelt.

Nach Blockierung und Permeabilisierung wurden die Tumorschnitte mit PBS gewaschen, mit TUNEL-Assay gefärbt und einer DAPI-Gegenfärbung unterzogen. Fluoreszenzbilder wurden durch CLSM aufgenommen. Für DAPI-Imaging: Ex = 358 nm und Em = 461 nm, und für TUNEL-Assay: Ex = 450–500 nm und Em = 515–565 nm.

Toxizitätsbewertungs-Assay

Zur Bewertung der Toxizität der Apt-Au@MSL-Behandlung auf lebenswichtige Organe wurden die Mäuse in den vier Behandlungsgruppen nach 30 Tagen geopfert. Die wichtigen Organe (Leber, Milz, Nieren, Herz, Lunge und Tumor) der Mäuse aller Gruppen wurden gesammelt und mit H&E gefärbt. Blutproben wurden ebenfalls gesammelt, und Blutzucker wurde gemessen. Zudem wurden die Gewichte der Mäuse bestimmt.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung

Die vorliegende Studie zielte darauf ab, ein neuartiges Liposom zu entwickeln, das die Vorteile von Nanopartikeln (Aptamer-beladene AuNPs) besitzt und effektiv als Antikrebsmittel eingesetzt werden kann. Die grundlegenden Eigenschaften der neuen Liposome sind wichtig für weitere Studien. Apt-Au@MSL wurde wie in einer vorherigen Studie beschrieben mit geringfügigen Modifikationen synthetisiert und anschließend mit verschiedenen Methoden charakterisiert (Abb. 3). Abbildung 3b zeigt die Ergebnisse der UV-Vis-Spektroskopie, die den charakteristischen Peak aufweist und die Bildung von AuNPs überwachen kann. Charakteristische Peaks wurden im UV-Vis-Spektrum der AuNPs bei etwa 530 nm beobachtet. Speziell zeigte die UV-Vis-Spektralanalyse eine starke UV-Absorption, die durch die Oberflächen-Apt-Modifikation beeinflusst wurde. Die gleichen Ergebnisse wurden beobachtet. Charakteristische Peaks wurden verschoben, nachdem pH-sensitive Liposome mit Morin beschichtet wurden. Der charakteristische Peak des hergestellten Apt-Au@MSL lag bei 362 und 550 nm. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Synthese erfolgreich abgeschlossen war. Zur weiteren Charakterisierung wurde FT-IR-Spektroskopie durchgeführt, um die Syntheseergebnisse zu verifizieren. Der charakteristische Peak-Rotverschiebung von Morin-Liposomen und Apt-Au@MSL deutete weiter auf die erfolgreiche Modifikation von Morin hin (Abb. 3c). Wir führten einen Morin-Freisetzungsassay in PBS bei unterschiedlichen pH-Werten durch, um die pH-Sensitivität von Apt-Au@MSL zu bestimmen. Diese drei pH-Werte simulieren die neutrale Umgebung der Blutkreislauf, die leicht saure Umgebung des Tumors und die saure Umgebung des intrazellulären Körpers. Der Freisetzungsprozentsatz von Morin wurde durch UV-Vis-Spektroskopie detektiert. Bei pH 5,0 wurden etwa 54 % des Morins innerhalb von 24 h freigesetzt, und eine kontinuierliche Freisetzung wurde in den folgenden 96 h beobachtet; dagegen wurden bei pH 7,4 nur etwa 10 % des Morins innerhalb von 24 h freigesetzt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Apt-Au@MSL unter normalen physiologischen Bedingungen gute Stabilität aufweist und Medikamentenleckage verhindert; das Medikament wird jedoch schnell im Kernkörper freigesetzt. Dieses Freisetzungsverhalten kann die Behandlungseffektivität effektiv verbessern (Abb. 3d). TEM und SEM wurden durchgeführt, um die Strukturen des Liposoms und Apt-Au@MSL zu elucidieren (Abb. 3f). TEM wurde durchgeführt, um die Strukturen der AuNPs zu elucidieren. Wie in Abb. 3g gezeigt, haben die AuNPs eine Partikelgröße von etwa 10 nm, was mit der Größe der Modifikation auf den Liposomen konsistent ist (Abb. 3g). Die SEM-Ergebnisse in Abb. 3e zeigen, dass rohe Liposome ausschließlich unilamelläre Vesikel mit einem nicht einheitlichen Durchmesser von etwa 120 nm bilden, was mit der durch DLS bestimmten Größe konsistent ist. Im Gegensatz dazu zeigt Apt-Au@MSL, dass die Morphologie der Hybridvesikel auf die Au-Apt-Modifikation zurückzuführen ist. Der Durchmesser von 150 nm war ebenfalls mit der durch DLS bestimmten Größe konsistent (Abb. 3i). Bemerkenswerterweise zeigte die TEM-Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den pH-sensitiven Liposomen und Au-Apt, dass die AuNPs fast ausschließlich mit der vesikulären Lipiddoppelschicht assoziiert waren und am Peripheriebereich der Vesikel lokalisiert waren (Abb. 3h). Die ζ-Potenzial-Messungen sind in Abb. 3j dargestellt, und die Zeta-Potenziale von AuNPs und Au-Apt sind negativ. Das Ergebnis zeigt, dass sowohl AuNPs (−57,1 ± 0,3 mV) als auch Au-Apt negativ geladen sind (−31,7 ± 0,2 mV). Apt-Au@MSL wurde mit positiv geladenen Morin-Liposomen modifiziert, und das Potenzial änderte sich zu 36,4 ± 0,3 mV. Die Adsorption positiver und negativer Ladungen ist der Mechanismus, durch den Au-Apt und Morin-Liposome binden. Zusätzlich stellt Abb. 3k die Änderung der Einkapselungsrate des Partikels über die Zeit dar, was die Stabilität des Partikels über einen Zeitraum anzeigt. Wie in Abb. 3k gezeigt, ändert sich die Einkapselungsrate des Partikels innerhalb von 24 h kaum, was darauf hindeutet, dass das Partikel über einen Zeitraum gute Stabilität aufweist. Die Standardkurve der Morin-Konzentration versus der UV-Vis-Absorption von Morin wurde erstellt, um die Einkapselungsrate von Morin-Liposome und Apt-Au@MSL zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Einkapselungseffizienz von Morin-Liposom und Apt-Au@MSL 90,2 % bzw. 89,6 % erreichen kann, wie in Tabelle S1 und Abb. S1 dargestellt.

Antikrebs-Aktivitätstest von Apt-Au@MSL

In Vitro

Morin zeigt überlegene antitumorale Aktivität, weist jedoch aufgrund seiner geringen Wasserlöslichkeit eine niedrige Bioverfügbarkeit auf. Nachdem Morin durch pH-sensitive Liposome eingekapselt und in ein wasserlösliches Material transformiert wurde, wurde die Liposomenoberfläche mit Au-Apt modifiziert, um den zielgerichteten antitumoralen Effekt zu erzielen. Abbildung 4a zeigt die antikarzinogene Aktivität von Apt-Au@MSL durch MTT-Assay in vitro. Die Medikamentenkonzentration wird durch die Morin-Konzentration definiert. Die Morin-behandelte Gruppe zeigte keine offensichtliche antikarzinogene Aktivität im Vergleich zur Blankogruppe. Die Gruppe, die mit Morin behandelt wurde, das durch pH-sensitive Liposome eingekapselt war, zeigte jedoch eine verstärkte antikarzinogene Aktivität. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass die antitumorale Aktivität von Morin-Liposomen der von rohem Morin überlegen war. Gleichzeitig stellten wir fest, dass die antitumorale Aktivität des durch Apt modifizierten Liposoms (Apt-Au@MSL) verbessert wurde. Tabelle 1 listet die IC₅₀-Werte von Morin, Morin-Liposomen, Apt-Au@MSL und Cisplatin auf. Morin, Morin-Liposome und Apt-Au@MSL zeigten ein breites Spektrum an antikarzinogener Aktivität auf Tumorzellen. Sie zeigten eine deutliche Präferenz für SGC-7901-Zellen mit hoher Potenz und geringer Toxizität gegenüber normalen menschlichen Zellen. Der IC₅₀-Wert von Apt-Au@MSL betrug 15,6 ± 1,5 µg/mL für SGC-7901-Zellen. Diese Ergebnisse wurden durch RTCA-Tests weiter bestätigt. SGC-7901-Zellen wurden mit Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen kultiviert; die Blankogruppe wurde mit PBS behandelt, und die Kontrollgruppe bestand aus Morin und Morin-Liposomen. Adhäsion und Ausbreitung wurden mit iCELLigence überwacht (Abb. 4b). Die Ergebnisse waren weitgehend ähnlich denen des MTT-Tests. Die antitumorale Aktivität von Apt-Au@MSL war signifikant höher als die von Morin und Morin-Liposomen. Apt-Au@MSL konnte die Proliferation von SGC-7901-Zellen mit zunehmender Konzentration hemmen. Veränderungen der Zellmorphologie nach Apt-Au@MSL-Behandlung wurden ebenfalls durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Wie in Abb. 4c gezeigt, behalten SGC-7901-Zellen ohne Apt-Au@MSL die strukturelle Integrität der Zelle bei. Im Gegensatz dazu ist die Zellintegrität nach der Behandlung mit Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen beeinträchtigt.

Apoptotische Zelltod-Analyse

Die quantitative Analyse der Apoptose wurde durch Durchflusszytometrie mit Annexin-FITC-Färbung durchgeführt. Die Zellen wurden mit PI und Annexin V-FITC gefärbt und anschließend mit einem CytoFLEX-Durchflusszytometer (Beckman Coulter) analysiert. Annexin V wurde verwendet, um frühe apoptotische Zellen zu detektieren, die an exponiertes Phosphatidylserin binden, und PI-Färbung wurde verwendet, um späte apoptotische Zellen zu färben. Das Apoptoseratio betrug 1,57 % für die Blankogruppen. Die mit Morin behandelten Zellen zeigten ein Apoptoseratio von 3,51 %. Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen zeigte eine höhere Induktionsfähigkeit mit Apoptoseratios von 7,44 %, 10,75 %, 15,53 % und 40,77 % (Abb. 5). Die verstärkte Apoptose bestätigte auch die herausragende antikarzinogene Aktivität, die durch Apt-Au@MSL induziert wird. Das Apoptoseratio der SGC-7901-Zellen stieg mit zunehmender Apt-Au@MSL-Konzentration.

Antikrebs-Aktivitätsstudie durch Fluoreszenz-Assay

Der antitumorale Effekt auf SGC-7901-Zellen, der durch Apt-Au@MSL induziert wurde, wurde intuitiv durch LIVE/DEAD-Fluoreszenzassays bewertet. Nach der Inkubation der Zellen mit Morin, Morin-Liposomen und Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen wurden sie 30 min unter dunklen Bedingungen mit dem LIVE/DEAD-Kit co-gefärbt. In Abb. 6 zeigen die Zellen der Blankogruppe, dass alle grün fluoreszierenden Zellen lebende Zellen darstellen. Die Kontrollgruppen, einschließlich Morin und Morin-Liposome, zeigen die Anzahl der rot fluoreszierenden Zellen. Die Zellen, die mit Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt wurden, wiesen jedoch eindeutig eine große Anzahl apoptotischer Zellen auf. Mit zunehmender Konzentration nahmen die lebenden Zellen allmählich ab. Der Prozentsatz toter Zellen nahm überwiegend zu, und die Zelldichte nahm ab. Das Ergebnis bestätigte, dass Apt-Au@MSL Tumorapoptose effektiv fördern kann.

Zellintegritätsstudie

Um den Einfluss der Aufnahme und des Transports von Apt-Au@MSL auf SGC-7901-Zellen zu bestätigen, führten wir einen TEM-Assay durch. Die Veränderung der Zellmorphologie wurde durch TEM beobachtet. TEM-Bilder wurden aufgenommen, um die innere Struktur der Zellen zu beobachten und eine Referenz für antikarzinogene Mechanismen zu liefern. Wie in Abb. 7 gezeigt, zeigten die Blankbilder der SGC-7901-Zellen ohne Behandlung signifikante Veränderungen in der Morphologie und dem Erscheinungsbild klarer Zellwände. In der Kontrollgruppe (Morin und Morin-Liposome) zeigte die Zellmorphologie partielle Schäden, und der Kernbereich zog sich zusammen. Nach Exposition gegenüber Apt-Au@MSL wurden jedoch signifikante Veränderungen in der Zellwand und der inneren Struktur beobachtet. Das Zytoplasma trat aus, und die Kernstruktur wurde unklar. Viele Zellfragmente bildeten sich um hohle Zellen. Zusätzlich disintegrierten oder wurden die Zellwände zerstört. Ganze Profile wurden unklar, Zellen wurden beschädigt, und das Zytoplasma trat aus. Die roten Pfeile repräsentierten den AuNP-Bereich. Mit zunehmender Konzentration von Apt-Au@MSL erschienen mehr AuNP-Regionen im Kern. Dies deutete auf die Freisetzung von Morin hin, nachdem Apt-Au@MSL in das Zellinnere eingedrungen war, daher das Auftreten einer großen Menge an AuNPs. Diese oben genannten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die antitumorale Aktivität mit beeinträchtigter Zellintegrität und Kernstruktur assoziiert war.

Molekularer Mechanismus, induziert durch Apt-Au@MSL

Um den molekularen Mechanismus der durch Apt-Au@MSL induzierten Apoptose zu erforschen, detektierten wir die Expressionsniveaus von Caspasen und PARP. Die Aktivierung von Caspase-3, -8 und -9 wurde zunächst mit spezifischen Substraten detektiert. Wie in Abb. 8a gezeigt, induziert Apt-Au@MSL-Behandlung eine dosisabhängige Aktivierung von Caspase-3, -8 und -9. Caspase-9 fördert die mitochondrienvermittelte Apoptose mehr als Caspase-8, was darauf hindeutet, dass der mitochondrienvermittelte Apoptose-Signalweg dominant ist. Western-Blot-Analyse bestätigte die Existenz der durch Apt-Au@MSL induzierten Apoptose auf Proteinebene weiter. Abbildungen 8b und c zeigen, dass nach der Behandlung der Zellen mit Apt-Au@MSL die Aktivierung von Caspasen und die Spaltung von PARP zeit- und dosisabhängig sind (Abb. 8b, c). In Abb. 8d, e bestätigte die Western-Blot-Analyse unsere Ergebnisse. Zusammenfassend hemmt Apt-Au@MSL das Wachstum von SGC-7901-Zellen hauptsächlich durch Induktion von Apoptose.

Apt-Au@MSL hemmt Tumorwachstum

In Vivo

Die in-vivo-antitumorale Aktivität von Apt-Au@MSL wurde mit einem SGC-7901-Tumor-Xenotransplantatmodell bewertet. Ein Vergleich der Tumorbilder mit denen der Kontrollgruppe (Morin und Morin-Liposome) zeigte, dass Mäuse, die mit Apt-Au@MSL behandelt wurden, das Gewicht und die Größe des Tumors deutlich reduzierten (Abb. 9a). Die relativen Tumorvolumenkurven und die Mäusegewichtskurven deuten darauf hin, dass Apt-Au@MSL in vivo eine höhere antikarzinogene Effizienz aufweist (Abb. 9b) als die anderen Behandlungsgruppen. Kein signifikanter Unterschied im durchschnittlichen Tumorvolumen wurde zwischen der Kontrollgruppe (Morin und Morin-Liposome) und der Blankogruppe festgestellt. Das Tumorvolumen der Apt-Au@MSL-Gruppe betrug nur fast ein Zehntel der Blankogruppe und fast ein Sechstel der Kontrollgruppe. Das Ergebnis zeigte, dass rohes Morin und Morin-Liposome bei 40 mg/kg keinen Einfluss auf das Tumorwachstum hatten. Apt-Au@MSL konnte jedoch das Tumorwachstum hemmen. Das Körpergewicht der Mäuse in den verschiedenen Gruppen (PBS, Morin, Morin-Liposome und Au-Apt-Gruppen) zeigte während des Behandlungszeitraums keine deutliche Schwankung (Abb. 9c). Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass die Behandlung verträglich war und keine akuten Nebenwirkungen verursachte. Bemerkenswert war, dass Mäuse mit Apt-Au@MSL-Behandlung eine deutlich verlängerte Überlebenszeit aufwiesen (Abb. 9d). Die überlebenden Mäuse in dieser Gruppe verhielten sich normal und zeigten keine offensichtlichen Anzeichen eines ungesunden Zustands. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Verabreichung von Apt-Au@MSL das Tumorwachstum in Xenotransplantat-Mausmodellen hemmen konnte.

Histologische Analyse der Antikrebs-Aktivität

H&E-Färbung von Tumorgewebe und Organproben wurde nach Fixierung und Behandlung durchgeführt. Die Behandlungseffizienz bezüglich Tumorszelltod wurde ebenfalls durch H&E-Färbung von Tumorgewebe aus verschiedenen Gruppen bewertet. In Abb. 10a zeigen die mit Au-Apt, Morin und Morin-Liposomen behandelten Mäuse das gleiche Ausmaß an thermischem Schaden wie die Mäuse der Blankogruppe. Keine offensichtliche Apoptose wurde in der Blankogruppe beobachtet. Die Tumorgewebsschnitte bestanden aus dicht gepackten Tumorzellen. Die Apt-Au@MSL-Behandlung zeigte jedoch den signifikantesten Schaden am Tumorgewebe mit mäßiger Zellapoptose im Tumor. Das Ergebnis deutete auf antikarzinogene Aktivität in den Mausmodellen hin, die mit Apt-Au@MSL behandelt wurden. Um den Anteil apoptotischer Zellen im Tumorgewebe in vivo weiter zu untersuchen, wurde ein TUNEL-Assay zur Detektion apoptotischer Zellen durchgeführt. Wie in Abb. 10b gezeigt, können apoptotische Zellen in Tumoren mit grüner Fluoreszenz gefärbt werden, um Apoptose anzuzeigen. Die überlagerten Bilder zeigen weniger grüne Fluoreszenzregionen in der Blankogruppe und der Kontrollgruppe (Morin und Au-Apt), was auf das Vorhandensein weniger apoptotischer Zellen hinweist. Die Zellen der mit Morin-Liposomen behandelten Mäuse erscheinen teilweise apoptotisch. Zudem wurden in der mit Apt-Au@MSL behandelten Gruppe große grüne Fluoreszenzregionen beobachtet, was auf eine große Anzahl apoptotischer Zellen hinweist. Die Ergebnisse waren konsistent mit denen der H&E-Färbung und bestätigten, dass Apt-Au@MSL Tumorapoptose in vivo fördern kann.

In-vivo-Toxizitätsbewertung

Die potenzielle in-vivo-Toxizität ist oft ein bedeutendes Anliegen für die klinische Anwendung von Antikrebsmedikamenten. Um die Anwendbarkeit von Apt-Au@MSL in vivo zu verifizieren, wurden die Mäuse unter verschiedenen Behandlungen (Morin, Morin-Liposome, Au-Apt und Apt-Au@MSL) evaluiert. Blutbiochemische Assays wurden ebenfalls durchgeführt, um mögliche Veränderungen in der Biochemie der Mäuse nach der Behandlung zu untersuchen. Wie in Abb. 11a gezeigt, war der Blutzuckerindex für die Blutfunktion der Apt-Au@MSL-Gruppen ähnlich denen der Blanko- und Kontrollgruppen. Kein Unterschied im Körpergewicht wurde in jeder Gruppe gefunden. Ein stetiger Anstieg wurde beobachtet, was darauf hindeutete, dass das Medikament keine Toxizität aufwies (Abb. 11b). H&E-Färbung von Organschnitten (Abb. 11c) zeigte keine Anzeichen von Schädigung oder Entzündung in der mit Apt-Au@MSL behandelten Gruppe im Vergleich zur Blanko- und Kontrollgruppe. Dieser Befund zeigte an, dass PBS, Morin, Morin-Liposome, Au-Apt und Apt-Au@MSL vernachlässigbare Nebenwirkungen in vivo aufwiesen. Diese Ergebnisse sowie die der H&E-Färbung deuten weiter auf die Sicherheit der Verwendung von Apt-Au@MSL für die Tumorbehandlung hin.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend stellt diese Studie die Synthese eines Antitumor-Nanomaterials, Apt-Au@MSL, vor. Apt-Au@MSL wies hervorragende Monodispersität und Tumortargeting-Eigenschaften auf. Die Polarität von Morin wurde modifiziert, und die antitumorale Aktivität wurde verstärkt. Der pH-Wert der Lösung betrug 5,0, und die Freisetzungsrate von Morin aus Apt-Au@MSL war in den Charakterisierungsexperimenten maximal. Apt-Au@MSL zeigte, dass die Morphologie der Hybridvesikel auf die Au-Apt-Modifikation zurückzuführen war. Der Durchmesser von 150 nm war konsistent mit der durch DLS bestimmten Größe. Wir screeneten unsere Modellkrebszelle durch MTT-Assay und fanden, dass SGC-7901-Zellen die Proliferation effektiv unterdrücken konnten. Der IC₅₀ von Apt-Au@MSL betrug 15,6 ± 1,5 µg/mL für SGC-7901-Zellen. Fluoreszente Durchflusszytometrie-Assays bestätigten, dass Apt-Au@MSL als effektives Antikrebsmaterial verwendet werden kann und in vitro Apoptose induzierte. Das in der Zelle gefundene Apt-Au@MSL, wie in den TEM-Bildern gezeigt, deutete darauf hin, dass Apt-Au@MSL die Krebszelle targetieren konnte. Die Verabreichung von Apt-Au@MSL konnte das Tumorwachstum in Xenotransplantat-Mausmodellen hemmen, wie durch Tumorgewichtstests bestimmt. H&E-Färbung und TUNEL-Assay bestätigten weiter, dass Apt-Au@MSL Tumorapoptose in vivo fördern konnte. Sowohl Blutbiochemietests als auch H&E-Färbung legten nahe, dass diese Materialien vernachlässigbare Akuttoxizität und gute Biokompatibilität in vivo aufwiesen.