Einfluss von Silica-Nanopartikeln auf Genexpression und DNA-Methylierung in Lungen- und Hodengewebe

Zusammenfassung

Die Nanotechnologie entwickelt sich rasant und wird nun in vielen hochmodernen medizinischen Therapeutika eingesetzt. Es besteht jedoch zunehmende Besorgnis, dass die Exposition gegenüber Nanopartikeln (NPs) verschiedene systemische Erkrankungen auslösen kann, da epigenetische Mechanismen mit immer mehr Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Die Rolle der NP-induzierten epigenomischen Modifikation ist wichtig für die Krankheitsentstehung. Unsere Studie zielte darauf ab, die epigenetischen Mechanismen von Schäden in Lungen- und Hodenzellen durch Exposition gegenüber SiO₂-NPs zu bestimmen. Wir verwendeten männliche C57BL/6-Mäuse, um die schädigende Wirkung von SiO₂-NPs auf Lungen- und Hodenzellen sowie den resultierenden Methylierungsstatus im imprinierten Dlk1/Dio3-Domänenbereich zu charakterisieren. A549-Zellen, die SiO₂-NPs ausgesetzt waren, zeigten Zellapoptose, und männliche Mäuse, die SiO₂-NPs ausgesetzt waren, wiesen veränderte Lungen- und Hodengewebe auf. Die Gene in den imprinierten Dlk1/Dio3-Domänen änderten sich in beiden Geweben; Dlk1, Rtl1 und Dio3 sind im Hoden hochreguliert, während Dlk1 und Dio3 auch im Lungengewebe hochreguliert sind. Bisulfit-Sequenzierungs-PCR von erwachsenen männlichen Lungen- und Hodengeweben zeigte überwiegend Hypomethylierung, mit wenigen hypermethylierten CpGs. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nanopartikel eine wichtige Rolle bei der DNA-Methylierung imprinierter Gene spielen.

Hintergrund

Siliciumdioxid ist ein Oxid von Silicium mit der chemischen Formel SiO₂, das in der Natur am häufigsten als Quarz und in verschiedenen organischen Umgebungen vorkommt [1]. Technisch hergestellte Nanopartikel sind durch das rasante Wachstum und die Anwendung der Nanotechnologie in High-Tech-Industrien weit verbreitet. Dieses spezielle Nanopartikel wird aufgrund seiner physikalisch-wissenschaftlichen Eigenschaften wie großer spezifischer Oberfläche, reichlicher reaktiver Stellen, hoher Oberflächenenergie, ungesättigter chemischer Bindungen, starker Adsorptionsfähigkeit und starker Tendenz zur Interaktion mit Metallen und organischen Stoffen, wodurch Schadstoffe und ihr Transport in der Umwelt verändert werden, in einer Vielzahl von Konsumprodukten eingesetzt, einschließlich Elektronik, Kunststoffprodukten, Medizin, Kosmetik und Beschichtungsmaterialien [2]. Das Vorhandensein von SiO₂-Nanopartikeln (NPs) in einer breiten Palette von Konsumgütern erhöht die Wahrscheinlichkeit ihrer Freisetzung in die Umwelt und des Kontakts mit der menschlichen Bevölkerung.

Frühere experimentelle Studien haben gezeigt, dass eine einmalige intratracheale Instillation oder mehrfache intraperitoneale Injektionen einer Metall- und Metalloxid-Nanopartikel-Art toxische Wirkungen von der zellulären bis zur systemischen und organismischen Ebene verursachen [3]. Die Behandlung mit SiO₂-NPs unterdrückt das Wachstum von Brustkrebszelllinien durch Erhöhung der Apoptose und Verringerung der Zellbeweglichkeit. Zudem stört die Exposition gegenüber SiO₂-NPs den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) signifikant [4]. Als Rattenmodelle mit drei verschiedenen Größen von TiO₂-NPs behandelt und mit Kontrollen verglichen wurden, induzierte die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF)-Behandlung mit großen Agglomeraten (> 100 nm) Aerosolen eine akute Entzündungsreaktion, während kleine Agglomerate (< 100 nm) Aerosole signifikanten oxidativen Stressschaden und Zytotoxizität erzeugten [5].

Die Untersuchung der Nanopartikel-Toxizität auf die Reproduktion ist ein wachsendes Feld. Eine Studie hat gezeigt, dass unter der gleichen Behandlungsdosis Ni-NPs eine höhere reproduktive Toxizität in C. elegans als Ni-MPs (Mikropartikel) induzierten. Diese in C. elegans beobachteten reproduktiven Toxizitäten umfassten reduzierte Brutgröße, befruchtete Eier und Spermatiden-Aktivierung [6]. Es gibt zunehmende Beweise dafür, dass bestimmte Umwelteffekte über paternale Wege an Nachkommen weitergegeben werden können, ohne Veränderungen im Spermagenom [7, 8]. Paternale Information existiert nicht nur im Genom, sondern auch in verwandten spezifischen epigenetischen Markern, mRNA-Inhalt und nicht-codierender RNA.

Oxidativer Stress ist ein wichtiger Mechanismus der Nanopartikel-Toxizität, der DNA-Schäden, Entzündungen, Protein-Denaturierung und Lipidperoxidation auslösen kann [9]. Diese biologischen Effekte werden durch die physikochemischen Eigenschaften der Nanopartikel beeinflusst, einschließlich ihrer Größe, Oberfläche, Form, Oberflächenchemie, Funktionalisierung und Löslichkeit [10, 11]. Es gibt zunehmende Beweise, die eindeutig zeigen, dass die Exposition gegenüber Nanopartikeln epigenetische Veränderungen in Geweben und Zellen sogar bei niedrigen, nicht-zytotoxischen Dosen auslösen kann [12, 13]. Epigenetik ist die Untersuchung vererbbarer Veränderungen in der Genfunktion, die keine Änderungen der DNA-Sequenz beinhalten, einschließlich DNA-Methylierung, Gen-Imprinting, Histonmodifikationen und Regulation durch nicht-codierende RNAs [14]. Solche epigenetischen Veränderungen sind mit der Entwicklung und dem Fortschreiten zahlreicher pathologischer Zustände und Krankheiten assoziiert [15]. Daher sind epigenetische Effekte ein entscheidender Bestandteil der Patienten-Risikobewertung auf zellulärer Ebene.

Die Dlk1/Dio3-imprinte Domäne enthält drei bekannte differentiell methylierte Regionen (DMRs), die väterlich methyliert sind: intergenisches DMR (IG-DMR), mütterlich exprimiertes 3-DMR (Gtl2-DMR) und Dlk1-DMR [16]. Frühere Studien legen nahe, dass das IG-DMR den allelischen Methylierungsstatus des Gtl2-Promotor-DMR diktiert, der dann die Genexpression über den gesamten Cluster kontrolliert [17]. Das Mausgenom hat eine große Anzahl imprinierter Gene in der Dlk1/Dio3-Domäne im distalen Bereich von Chromosom 12. Das IG-DMR, gelegen zwischen den imprinierten Genen Dlk1 und Gtl2, ist spezifisch im männlichen Keimlini methyliert und reguliert die elternallel-spezifische Expression des imprinierten Genbereichs [18]. Der IG-DMR-Methylierungsstatus wird vor der Geburt etabliert und wird somit während der männlichen Keimzellen-Differenzierung im männlichen Keimlini über das gesamte Leben eines Mannes aufrechterhalten, was bedeutet, dass die IG-DMR-Methylierung in Spermatogonien und Spermatocyten des reifen Hodens aufrechterhalten wird.

Unser Ziel war es, die Veränderungen in der männlichen Keimlini-Genexpression während der Spermatogenese vor transkriptioneller und translationaler Stilllegung zu finden, um den paternalen Einfluss auf Nachkommen durch Umwelteinwirkungen zu erklären. Umweltfaktoren können spermien-transkriptionelle Modifikationen verändern, was zu Veränderungen in der Nachkommenentwicklung führen kann. Um diese Untersuchung in unserer Arbeit durchzuführen, verwendeten wir Zelllinien und Mäuse als Modelle für das Screening der toxischen Effekte von SiO₂-NPs. Meines Wissens ist dies die erste Studie, die die epigenetischen Mechanismen der Dlk1/Dio3-imprinter Regionen demonstriert, die Nanopartikel in sowohl Lungen- als auch Hodengewebe schädigen.

Methoden

Versuchstiere

Der Umgang mit Tieren erfolgte gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren unter dem entsprechenden Tierverwendungsprotokoll an der Medizinischen Universität Nanjing. Mäuse wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. bezogen. Alle Tiere wurden bei 23 °C mit einem 12-Stunden-Lichtzyklus gehalten. Sterilisiertes Wasser und Nagerfutter wurden den Mäusen ad libitum verabreicht. Die Aktivität und das Verhalten der Mäuse wurden täglich überwacht. Nach 2 Wochen wurden die Mäuse mit nano-großem SiO₂ 12,5 mg/kg injiziert.

Chemikalien

Nano-großes SiO₂ (99,5 % Spurenmetallbasis, Partikelgröße 10–20 nm) wurde von Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen. Nanopartikel wurden in RPMI 1640 Medium suspendiert, um eine Stocklösung herzustellen, 20 min durch Ultraschall dispergiert, auf geeignete Konzentrationen verdünnt und weitere 20 min dispergiert.

Eigenschaften von SiO₂-NPs

Größe und Zeta-Potenzial wurden mit einem Malvern Zetasizer Nano ZSP aufgezeichnet.

RNA-Extraktion und qRT-PCR

Lungen- und Hodenproben wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann nach etwa 4 h bei -80 °C gelagert. Wir tauteten die Proben auf, bevor wir sie extrahierten.

Die Gesamtrna wurde aus den Proben mit 1 mL TRIzol-Reagenz (Invitrogen Life Technologies Co, USA) isoliert. Das Gemisch wurde mit 80 % Leistung 5 min ultrasonisiert, 0,2 mL Chloroform hinzugefügt und anschließend bei 12.000 g/min bei 4 °C für 15 min zentrifugiert. Dann wurden drei Schritte der Phenol/Chloroform-Reinigung hinzugefügt, um Proteine zu entfernen. Dann verwendeten wir UV-Absorption, um den RNA-Gehalt und die Qualität jedes Proben bei 260 und 280 nm zu messen. Die Primersequenzen der mRNAs sind in Zusatzdatei 1: Tabelle S1 und S2 gezeigt. qRT-PCR wurde nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, wie zuvor beschrieben [19]. Echtzeit-PCR wurde mit SYBR Green (Vazyme) durchgeführt. Der PCR-Zyklus war wie folgt: initiale Denaturierung bei 95 °C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Anlagerung bei 60 °C für 15 s und Extension bei 72 °C für 30 s. Die Menge der Zielgene wurde mit der 2^-ΔCt-Methode nach Normalisierung mit β-Actin analysiert.

DNA-Extraktion, Bisulfit-Behandlung und Bisulfit-Sequenzierungs-PCR

DNA wurde aus Hoden- und Lungengewebe mit einem DNA-Kit (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. Nr. 51304; USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Bisulfit-Konvertierung von 500 ng aller genomischen DNA wurde mit einem Kit (EpiTect® Bisulfit-Kit; Qiagen. Nr. 59104; USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers erreicht. Verschiedene CpG-Methylierungs-Oligonukleotide wurden mit der Methyl Primer Express v1.0-Software entworfen und die Sequenzen sind P1-F 5'-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3', P1-R 5'-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3'; P2-F 5'-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3', P2-R 5'-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3'; P3-F 5'-TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3', P3-R 5'-ACCCATAACAAACCACAACA-3'; P4-F 5'-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3', P4-R 5'-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3'.

Jede DNA-Probe wurde durch PCR wie folgt amplifiziert: 2,5 µl 10× PCR-Puffer PCR-Reaktionsmischung mit 500 ng der bisulfit-behandelten DNA, 0,5 µl jeweils Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 0,5 µl dNTP-Mix, 0,5 µl rTaq (500 U, dNTP, Mg²⁺) (Takara Bio, Tokyo, Japan), Zugabe von ddH₂O bis zu einem Volumen von 25 µl. Nach Aktivierung der Polymerase bei 94 °C für 10 min folgten 40 Zyklen der folgenden Sequenz: 30 s bei 94 °C, 30 s bei 58 °C, 1 min bei 72 °C und finale Extension bei 72 °C für 10 min.

Zellkultur und Behandlung

A549-Zellen wurden von ATCC (Manassas, VA, USA) gekauft und in RPMI 1640 mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) bei 37 °C und 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator kultiviert. Die Zellen wurden auf 96-Well-Platten plattiert, mit verschiedenen Konzentrationen von SiO₂-NPs inkubiert: 62,5, 125, 250, 500, 1000 und 2000 µg/ml für 24 h.

Zelllebensfähigkeitsassay

Die zelluläre Lebensfähigkeit wurde durch den CCK8-Proliferationsassay bewertet. Zellen wurden mit einer Dichte von 1,5 × 10⁴ pro Well in einer 96-Well-Platte plattiert und über Nacht inkubiert. Nach Exposition gegenüber SiO₂-NPs bei verschiedenen Konzentrationen wurden 100 µl CCK8 zu jedem Well hinzugefügt, und die Zellen wurden 30 min bei 37 °C inkubiert, um den CCK8-Stoffwechsel zu ermöglichen. Schließlich wurde die Absorption bei 450 nm bestimmt. Die zellhemmenden Raten wurden berechnet und in den IC₅₀ mit SPSS 15.0 transformiert.

Statistische Analyse

Alle Berechnungen wurden mit der SPSS 15.0-Software durchgeführt. Vergleiche zwischen Gruppen wurden mit unverwandten t-Tests und einem Pearson-Chi-Quadrat-Test für BSP durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. In allen Fällen wurde ein Wert von p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Charakterisierung von SiO₂-NPs

Wir charakterisierten SiO₂-NPs unter experimentellen Bedingungen. Der durchschnittliche hydrodynamische Radius und das Zeta-Potenzial von SiO₂-NPs in Kulturmedium betrugen 371,77 ± 18,46 nm bzw. 18,83 ± 2,12 mV (Abb. 1).

Charakterisierung von SiO₂-NPs in Suspension. Partikel waren in Zellkulturmedium mit 10 % FBS suspendiert. a, b Größe und Zeta-Potenzial von SiO₂-NPs wurde mit Zetasizer Nano ZSP bewertet. c Zelllebensfähigkeit wurde durch CCK8-Assay nach Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von SiO₂-NPs für 24 h bestimmt. Durchschnitte ± SD von duplizierten Experimenten, jedes bestehend aus drei technischen Replikaten. *** p < 0,001

Auswirkung von SiO₂-NPs auf die A549-Zelllinie

Um die Toxizität von SiO₂-NPs zu bestimmen, führten wir einen Proliferationstest mit A549-Zellen durch, um den IC₅₀ von SiO₂-NPs auf A549-Zellen zu bestimmen. Wie in Abb. 1c dargestellt, verringern SiO₂-NPs die A549-Zelllebensfähigkeit in einer konzentrationsabhängigen Weise. Die Reduktion der Zelllebensfähigkeit ist bei SiO₂-NP-Konzentrationen über 62,5 µg/ml signifikant (p < 0,001). Der IC₅₀ 24 h eines Chemikals ist definiert als eine Konzentration, die 50 % der Zellen nach 24 h Exposition beeinflusst. Der bestimmte IC₅₀ 24 h für SiO₂-NPs betrug 4942 µg/ml.

Auswirkungen von SiO₂-NPs auf murine Lunge und Hoden

Wir untersuchten, ob die Exposition gegenüber SiO₂-NPs bei einer Dosis von 12,5 mg/kg Körpergewicht zu Lungenschäden und sogar Hodenschäden in unserem Mausmodell führen würde. Wie in den Abbildungen gezeigt, führte SiO₂-NP-Exposition zu gestörten lamellären Körpern in histologischen Schnitten der Lunge (Abb. 2a, b) und zu Mitochondrienkristae-Schäden im Vergleich zur Kontrollgruppe im Hoden (Abb. 2c, d). Wir untersuchten dann die Auswirkungen von SiO₂-NPs auf die Aktivierung des Imprintings in der Dlk1/Dio3-imprinter Region.

TEM-Bilder von Lungen- und Hodengeweben von Ratten, die SiO₂-NPs ausgesetzt waren. a Morphologie wurde in Lungengeweben durch REM in Kontrollen bewertet. b Morphologie wurde in Lungengeweben durch REM in behandelter Gruppe bewertet. c Morphologie wurde in Hodengeweben durch REM in Kontrollen bewertet. d Morphologie wurde in Hodengeweben durch REM in behandelter Gruppe bewertet. Maßstäbe entsprechen 2,0 µm

Expression der imprinierten Gene in muriner Lunge und Hoden

Um die Veränderungen in Lunge und Hoden zu veranschaulichen, detektierten wir die imprinierten Gene in diesen Geweben. Wir wählten 24 imprinierte Gene aus; sie waren Dio3, Ddc, Dlk1, Gpr1, Gtl2, H19, Igf2, Igf2as, Igf2r, Inpp5f, Magel2, Magi2, Mest, Mir296, Mir298, Ndn, Nnat, Peg10, Plagl1, Pwcr1, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn und Snurf. Dreizehn dieser Gene werden in sowohl Lunge als auch Hoden exprimiert: Dio3, Dlk1, Gpr1, Gtl2, Igf2r, Igf2, Inpp5f, Peg10, Ndn, Nnat, Rasgrf1, Rtl1 und Snrpn (Abb. 3a, b). Die differenziell exprimierten Gene des primären Fokus lagen in der Dlk1/Dio3-imprinter Region, die Dlk1, Gtl2, Rtl1 und Dio3 enthält.

Expression imprinierter Gene in Lunge und Hoden. a Expression imprinierter Gene in der Lunge. b Expression imprinierter Gene im Hoden. *P < 0,05. **P < 0,01. Student'scher t-Test

Expression der Dlk1/Dio3-imprinter Region

Die imprinierte Dlk1/Dio3-Region enthält drei protein-kodierende Gene (Dlk1, Gtl2, Rtl1 und Dio3) auf dem vererbten Allel [20] (Abb. 4c). Um die Rolle der Dlk1/Dio3-Region in der Reaktion von Lungen- und Hodengewebe auf SiO₂-NP-Behandlung zu klären, analysierten wir das Methylierungsmuster von DMR im Vergleich zu den Kontrollen. Unterschiedliche Gene werden durch Methylierung in der Lunge und im Hoden angezielt. Die Expression von Dlk1 und Dio3 war in sowohl Lunge als auch Hoden hochreguliert, während Rtl1 nur im Hoden hochreguliert war (Abb. 4a, b).

Expression der Dlk1/Dio3-imprinter Region. a Die Dlk1/Dio3-Regionsgene exprimiert in der Lunge. b Die Dlk1/Dio3-Regionsgene exprimiert im Hoden. c Schema der Dlk1/Dio3-Region. *P < 0,05. **P < 0,01. Student'scher t-Test

Die Methylierung der Dlk1/Dio3-DMR-Regionen

Um weiter zu untersuchen, ob die Expression von Genen als Reaktion auf DNA-Methylierung verändert wird, untersuchten wir den Methylierungsstatus dieser Region in der Mauslunge und im Hoden. In der DNA-Methylierungsanalyse bestimmten wir die Sequenzen der drei Abschnitte der CpG-Inseln. Im Hoden sind sie hypomethyliert; jedoch sind sie in CpG-Insel 1 signifikant hypermethyliert (Abb. 5). In der Lunge ist die gesamte Methylierung dieselbe wie im Hoden, während CpG-Insel 2 Hypermethylierung zeigte (Abb. 6).

Die Methylierung der Dlk1/Dio3-DMR-Regionen im Hoden. a Die Methylierung der CpG-Insel 1 in Kontroll- und behandelten Geweben. b Die Methylierung der CpG-Insel 2 in Kontroll- und behandelten Geweben. c Die Methylierung der CpG-Insel 3 in Kontroll- und behandelten Geweben

Die Methylierung der Dlk1/Dio3-DMR-Regionen in der Lunge. a Die Methylierung der CpG-Insel 1 in Kontroll- und behandelten Geweben. b Die Methylierung der CpG-Insel 2 in Kontroll- und behandelten Geweben. c Die Methylierung der CpG-Insel 3 in Kontroll- und behandelten Geweben

Diskussion

Die zunehmende Verwendung von Nanomaterialien hat Bedenken hinsichtlich potenzieller Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und Umweltauswirkungen aufgeworfen. Frühere Studien haben gezeigt, dass SiO₂-NPs Lungen- und Herz-Kreislauf-Schäden verursachen können, wie Lungenentzündung und myokardiale ischämische Schäden bei alten Ratten [21]. Darüber hinaus können Nanopartikel Auswirkungen auf Keimbahnen haben, da solche Zellen empfindlicher auf die toxischen Effekte von Ag-NPs zu reagieren schienen und nach Exposition gegenüber niedrigeren Dosen nachteilige Effekte zeigten. Ag-NP-Exposition erhöhte die Anzahl der in Ratten-Spermazellen beobachteten Anomalien und verringerte die Integrität sowohl des Akrosoms als auch der Plasmamembran zusätzlich zur Verringerung der mitochondrialen Aktivität [22]. Unsere Untersuchung ist Teil einer Reihe von Studien, die eine experimentelle Plattform verwenden, um das Potenzial von Nanopartikeln zu bewerten, männliche Organismen und sogar ihre nicht-exponierten Nachkommen anzugreifen.

In unserer früheren In-vitro-Studie berichteten wir, dass kurzzeitige Exposition gegenüber einigen Nanopartikeln zu Zellapoptose und aberranter Expression imprinierter Gene in TM-4-Sertoli-Zellen führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass abnormale Expression imprinierter Gene ein zugrundeliegender Mechanismus für Nanopartikel sein könnte, um Reproduktionstoxizität zu induzieren [23]. Darüber hinaus förderten in unserer früheren In-vivo-Studie einige Umweltfaktoren, wie endokrine Disruptoren, einen Phänotyp oder Krankheitszustand nicht nur im exponierten Individuum, sondern auch in aufeinanderfolgenden Generationen von Nachkommen. Epimutationen in der Keimbahn, die dauerhaft programmiert werden, können die Übertragung epigenetischer transgenerationaler Phänotypen ermöglichen [19]. Das Ziel dieser Studie war es, Veränderungen des epigenetischen Zustands durch SiO₂-NP-Behandlung in einem murinen Modell zu untersuchen, um die mechanistische Grundlage männlicher transgenerationaler Effekte zu legen.

Epigenetischer Zustand ist ein Begriff, der chemische Modifikationen definiert, die innerhalb eines Genoms auftreten, ohne die DNA-Sequenz zu verändern [24]. Epigenetische Mechanismen, einschließlich DNA-Methylierung, imprinierte Gene, Histonmodifikationen und nicht-codierende RNA-Expression, können die genomische Funktion in einer exogenen Umgebung beeinflussen [25]. Meines Wissens ist unsere Studie die erste, die SiO₂-NPs untersucht, die Lungen- und Hodentoxizität auf epigenetischer Ebene induzieren.

Wir untersuchten zunächst die akute Toxizität der SiO₂-NPs in A549-Zellen, einer menschlichen Lungenepithelzelllinie. Unsere Ergebnisse an Versuchsmäusen zeigten jedoch Verletzungen in laminaren Lungen-Typ-II-Epithelzellen und Hoden-Mitochondrienkamm-Verletzungen nach Kontakt mit SiO₂-NPs bei Umweltkonzentrationen [26]. Um den Mechanismus der Lungen- und Hodenschädigung besser zu verstehen, exprimierten wir imprinierte Gene. Genomisches Imprinting bezieht sich auf das Stilllegen eines elterlichen Allels in Zygoten von Gameten je nach Elternherkunft; dieses Stilllegen erfolgt über epigenetische Prozesse wie DNA-Methylierung und/oder Histonmodifikation [27]. Frühere Studien haben gezeigt, dass die imprinierte Genexpression in der Dlk1/Dio3-Domäne wichtig für fötales Wachstum [28], den Zeitpunkt der menschlichen Pubertät [29] und die Anfälligkeit für Stoffwechselerkrankungen [30] ist. Studien haben vorgeschlagen, dass das IG-DMR den allelischen Methylierungsstatus des Gtl2-Promotor-DMR diktiert, der dann die Genexpression über den gesamten Dlk1/Dio3-Bereich kontrolliert [17]. Die Hauptfunktion dieser imprinierten Kontrollregion ist es, keimzellengetriebene DNA-Methylierung als gametisches Signal zu erben und später die nachfolgenden allel-spezifischen DNA-Methylierungsmuster in somatischen Zellen aufrechtzuerhalten [31]. Unsere Studie zeigte, dass SiO₂-NPs Veränderungen in der Expression der Dlk1/Dio3-Region sowohl in Lungen- als auch in Hodengeweben induzieren. In der Dlk1/Dio3-Region sind die väterlich exprimierten Gene (Dlk1, Rtl1 und Dio3) nach NP-Behandlung besonders abnormal im Vergleich zu den Kontrollen. Bisulfit-Sequenzierungsergebnisse zeigen unterschiedliche Grade der Hypomethylierung in Lunge und Hoden. Der Methylierungsstatus des IG-DMR ist in behandelten Geweben generell niedriger, und diese Hypomethylierung könnte den Mechanismus der differentiellen Expression imprinierter Gene darstellen.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass SiO₂-NP-Exposition wichtige DNA-Methylierungsveränderungen induzieren kann, die zelluläre Schäden auslösen, und dass diese Veränderungen für die Expression des Dlk1/Dio3-imprinter Genclusters von hoher Bedeutung sind. Wichtig ist, dass die Veränderungen in der DNA-Methylierung sowohl das Lungen- als auch das Hodengewebe betreffen. Diese Ergebnisse spielen eine wichtige Rolle in unserer zukünftigen Forschung, die die epigenomischen Effekte der Nanopartikel untersucht, die von Nachkommen exponierter Modelle vererbt werden, und die Klärung der molekularen Mechanismen, die solche epigenetischen Veränderungen vermitteln.

Abkürzungen

BALF:

Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeiten

CCK-8:

Zellzählkit-8

DMRs:

Differentiell methylierte Regionen

EGFR:

Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor

IG-DMR:

Intergenisches DMR

MPs:

Mikropartikel

NPs:

Nanopartikel