Nec-1 mildert Titandioxid-Nanopartikel-induzierte Neurotoxizität in SH-SY5Y-Zellen über RIP1-Modulation

Zusammenfassung

Titandioxid-Nanomaterialien werden aufgrund ihrer hervorragenden physikochemischen Eigenschaften in zahlreichen Bereichen eingesetzt, was wiederum eine potenzielle Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellt. Jüngste In-vivo-Studien haben gezeigt, dass Titandioxid-Nanopartikel (TNPs) nach Exposition über verschiedene Wege in Tiergehirne transportiert werden können. Aufgenommene TNPs können sich im Gehirn anreichern und neuronale Zellen stören, was zu Gehirnfunktionsstörungen führt. In-vitro-Studien bestätigten die Neurotoxizität von TNPs. Die Mechanismen, die der Neurotoxizität von TNPs zugrunde liegen, sind unklar. Ob Nekroptose an der Neurotoxizität von TNPs beteiligt ist, ist unbekannt. Daher führten wir eine In-vitro-Studie durch und fanden, dass TNPs entzündliche Schäden in SH-SY5Y-Zellen dosisabhängig induzierten, die durch Necrostatin-1 (Nec-1) Vorbehandlung gemildert wurden. Da Rezeptor-interagierendes Protein-Kinase 1 (RIP1) als Ziel von Nec-1 berichtet wird, silenceten wir es mittels siRNA. Wir exponierten mutierte und Wildtyp-Zellen TNPs und bewerteten entzündliche Schäden. Das Silencing der RIP1-Expression hemmte die durch TNP-Exposition induzierten entzündlichen Schäden. Zusammenfassend mildert Nec-1 die Neurotoxizität von TNPs über RIP1. Weitere Studien sollten jedoch durchgeführt werden, um den Zusammenhang zwischen der Neurotoxizität von TNPs und RIP1 umfassend zu bewerten.

Einleitung

Aufgrund ihrer hervorragenden physikochemischen Eigenschaften werden Titandioxid-Nanomaterialien synthetisiert und für verschiedene Zwecke weit verbreitet eingesetzt, wie Kosmetik, Industrie und medizinische Bereiche. Diese weit verbreitete Nutzung kann jedoch eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen. Nach Exposition gelangen die meisten Titandioxid-Nanopartikel (TNPs) über Inhalation und Ingestion in den menschlichen Körper. Das Atmungssystem, Verdauungssystem und Herz-Kreislauf-System können alle durch aufgenommene TNPs gestört werden. Ebenso kann das Gehirn als wichtigster Teil des zentralen Nervensystems gestört werden, da TNPs im Kreislauf die Blut-Hirn-Schranke durchdringen können und inhalierte NPs über den olfaktorischen Weg in das Gehirn transportiert werden können. Einmal im Gehirn angekommen, können sie sich dort anreichern und Schäden verursachen, die zu Funktionsstörungen führen. Hirnschäden sind meist irreversibel und schwerwiegend, daher sollte jede potenzielle Schadensursache untersucht werden.

Obwohl keine epidemiologische Studie den Zusammenhang zwischen TNP-Exposition und Hirnerkrankungen untersucht hat, haben zahlreiche In-vivo- und In-vitro-Studien die Neurotoxizität von TNPs bestätigt. Der Hauptfokus lag auf der Erforschung der zugrunde liegenden Mechanismen. Zu diesem Zweck haben wir zuvor die derzeit bekannten molekularen Mechanismen der TNP-Neurotoxizität überprüft und festgestellt, dass programmierte Zelltod (PCD) Prozesse wie Apoptose und Autophagie in der Neurotoxizität von TNPs involviert sind.

Nekroptose, auch regulierte Nekrose genannt, ist ein weiterer PCD-Typ. Im Gegensatz zur Apoptose, die caspase-abhängig ist, ist Nekroptose rezeptor-interagierendes Protein-Kinase 1/3 (RIP1/RIP3)-abhängig. Aktiviertes RIP1 rekrutiert RIP3 zur Bildung eines Nekrosoms, das Mixed Lineage Kinase Domain-like Protein (MLKL) aktiviert, um Nekroptose zu initiieren. Nekroptose kann Zelltod und Neuroinflammation regulieren, die beide in der Neurotoxizität von TNPs involviert sind. Daher hypothesierten wir, dass Nekroptose an der durch TNPs verursachten Neurotoxizität beteiligt ist.

Um unsere Hypothese zu testen, führten wir eine In-vitro-Studie durch, um die Rolle der Nekroptose in der Neurotoxizität von TNPs zu erforschen. In dieser Studie wurden Zellviabilität, LDH-Leckage und entzündliche Zytokine (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) nach TNP-Exposition gemessen. Zunächst wurden SH-SY5Y-Zellen mit verschiedenen TNP-Konzentrationen kultiviert. Zweitens wurden Zellen TNPs mit oder ohne Nec-1, einem potenten Nekroptose-Inhibitor, ausgesetzt. Drittens wurde die RIP1-Genexpression, die durch Nec-1 unterdrückt werden kann, mittels siRNA gesilenced, wonach mutierte und Wildtyp-Zellen mit TNPs behandelt wurden. Diese Studie wirft Licht auf das umfassende Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Neurotoxizität von TNPs zugrunde liegen.

Ergebnisse

TNPs hemmen Zellviabilität

Um die Zytotoxizität von TNPs auf SH-SY5Y-Zellen zu verifizieren, bewerteten wir zunächst die Zellviabilität mittels CCK8-Assay. Zellen wurden mit TNP-Konzentrationen von 5 bis 160 µg/mL für 24, 48 und 72 h kultiviert. Wie in Abb. 1 gezeigt, blieb die Zellviabilität in Zellen, die mit 5, 10, 20 und 40 µg/mL nach 24 h Exposition behandelt wurden, unverändert. Bei 48 und 72 h Behandlung blieb die Zellviabilität nur in der 5 µg/mL-Gruppe unverändert (p = 0,4507 bei 48 h und p = 0,1002 bei 72 h). Zudem war die Zellviabilität in Zellen, die mit 80 µg/mL TNPs nach 48 h (p = 0,0007) und 72 h (p = 0,0008) behandelt wurden, dramatisch niedriger. Basierend auf diesen Ergebnissen schlussfolgerten wir, dass TNPs die Zellviabilität dosis- und zeitabhängig verringern (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass langfristige Exposition toxischer ist.

TNPs schädigen Membranintegrität

Als Nächstes analysierten wir die toxischen Effekte von TNPs auf die Membranintegrität nach 72 h Exposition. Die Membranintegrität wurde durch Messung der LDH-Leckage bewertet. Wie in Abb. 1b gezeigt, waren LDH-Werte in Zellen, die mit TNPs in Dosen über 5 µg/mL behandelt wurden, signifikant erhöht. Eine erhöhte LDH-Produktion wurde in Zellen beobachtet, die mit 40, 80 und 160 µg/mL behandelt wurden (p < 0,0001). Diese Ergebnisse legten nahe, dass TNPs die LDH-Werte dosisabhängig erhöhten, was dem CCK8-Assay ähnelte.

TNP-Exposition fördert Entzündung

Die Entzündungsreaktion nach TNP-Exposition wurde mittels ELISA analysiert. Nach Behandlung der Zellen mit verschiedenen TNP-Konzentrationen für 72 h wurden die Spiegel von TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-8 gemessen. Wie in Abb. 2 gezeigt, war die IL-8-Sekretion in allen TNP-behandelten Zellen upreguliert; die Spiegel von TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-8 waren in Zellen, die mit Dosen über 5 µg/mL behandelt wurden, einheitlich erhöht (p < 0,01). Zudem war die Entzündung in der Gruppe mit Dosen über 10 µg/mL signifikant höher (p < 0,0001). Insgesamt verstärkten TNPs Entzündungen dosisabhängig.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass TNPs entzündliche Schäden dosisabhängig induzierten. Wir verwendeten eine TNP-Konzentration von 80 µg/mL und eine Expositionsdauer von 72 h in den folgenden Experimenten, um die Rolle der Nekroptose in der Neurotoxizität von TNPs zu erforschen.

Nec-1-Co-Behandlung hemmt Neurotoxizität von TNPs

Um die Rolle der Nekroptose bei entzündlichen Schäden zu analysieren, co-behandelten wir Zellen mit Nec-1 (einem Nekroptose-Inhibitor) und TNPs. Wie in Abb. 3a gezeigt, wurden SH-SY5Y-Zellen TNPs oder TNPs+Nec-1 (1, 5, 10, 15 oder 20 µM) ausgesetzt, und wir fanden, dass Nec-1 die durch TNPs induzierte Verringerung der Zellviabilität dramatisch linderte (10, 15, 20 µM) (p < 0,0001). Da die Zellviabilität in den 15 µM- und 20 µM-behandelten Gruppen nicht höher war als in der mit 10 µM behandelten Gruppe (p = 0,6643 und p = 0,6292), co-behandelten wir Zellen mit 10 µM Nec-1, um den Effekt auf die Membranintegrität zu analysieren.

Nach Kultivierung der Zellen mit TNPs oder TNPs + Nec-1 fanden wir, dass die LDH-Werte in der TNPs + Nec-1-Gruppe viel niedriger waren als in der TNPs-alone-Gruppe (p = 0,0005). Außerdem erhöhte die Behandlung mit Nec-1 allein die LDH-Leckage nicht (p = 0,9878).

Zusammenfassend konnte 10 µM Nec-1 die Zytotoxizität von TNPs effektiv hemmen und war nicht toxisch für Zellen.

Um die entzündungshemmende Fähigkeit von Nec-1 zu analysieren, wurden Zellen mit TNPs oder TNPs + Nec-1 kultiviert. Wie in Abb. 4 gezeigt, war die Produktion von TNF-α (p = 0,003), IL-1β (p = 0,0013), IL-6 (p < 0,0001) und IL-8 (p = 0,0004) in der TNPs + Nec-1-Gruppe signifikant niedriger als in der TNPs-Gruppe.

Diese Ergebnisse implizieren, dass Nec-1 entzündliche Reaktionen, die durch TNP-Exposition induziert werden, mildern kann.

Silencing von RIP1 mildert durch TNPs induzierte entzündliche Schäden

Um zu bestimmen, ob Nec-1 die durch TNPs induzierten entzündlichen Schäden über RIP1 aufhob, silenceten wir die RIP1-Expression der Zellen effektiv mittels siRNA (Abb. 5, p < 0,0001). Anschließend wurde der entzündliche Schaden nach TNP-Exposition auf mutierten und Wildtyp-Zellen gemessen. Abb. 6a zeigt, dass die Zellviabilität in der TNPs + si-RIP1-Gruppe bemerkenswert höher war als in der TNPs + si-NC-Gruppe (p = 0,0002). LDH-Produktion (Abb. 6b, p < 0,0001) und Spiegel von TNF-α (p < 0,0001), IL-1β (p = 0,0001), IL-6 (p < 0,0001) und IL-8 (p = 0,0001) (Abb. 7) in der TNPs + si-RIP1-Gruppe waren dramatisch niedriger als in der TNPs + si-NC-Gruppe. Diese Ergebnisse zeigten, dass TNPs entzündliche Schäden über RIP1 förderten.

Diskussion

In dieser Studie fanden wir, dass TNP-Exposition Zytotoxizität auf SH-SY5Y-Zellen dosisabhängig induzierte und dass Nekroptose an der Neurotoxizität von TNPs beteiligt war. Um die Rolle der Nekroptose zu erforschen, exponierten wir Zellen TNPs mit oder ohne Nec-1 (einem potenten Nekroptose-Inhibitor) und maßen Zellviabilität, LDH-Leckage und Spiegel entzündlicher Zytokine. Unsere Daten deuten darauf hin, dass Nec-1-Co-Behandlung entzündliche Schäden, die durch TNPs induziert werden, mildern kann. Da Studien gezeigt haben, dass Nec-1 seine Wirkung durch Unterdrückung der RIP1-Aktivität entfaltet, transfektierten wir Zellen mit si-RIP1, um zu bestimmen, ob RIP1 an den schützenden Effekten von Nec-1 beteiligt war. Mutierte und Wildtyp-Zellen wurden mit TNPs behandelt, und der entzündliche Schaden wurde bewertet. Dies zeigte, dass die Zellviabilität in der si-RIP1-Gruppe höher war als in der si-NC-Gruppe, und die Spiegel von LDH-Leckage und entzündlichen Zytokinen waren in der si-RIP1-Gruppe niedriger als in der si-NC-Gruppe nach Exposition gegenüber TNPs. Zusammenfassend enthüllte die vorliegende Studie erstmals, dass Nekroptose an den durch TNPs induzierten entzündlichen Schäden an Zellen beteiligt ist.

Wir bestätigten die Neurotoxizität von TNPs in unserer In-vitro-Studie erneut. Nach Exposition von SH-SY5Y-Zellen gegenüber verschiedenen TNP-Konzentrationen für verschiedene Inkubationszeiten wurde die Zellviabilität mittels CCK8-Assay bewertet. Wie in Abb. 1a gezeigt, verringerte TNP-Exposition die Zellviabilität dosisabhängig; nach 48 h und 72 h Exposition war die Zellviabilität in den 80 und 160 TNP-Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe dramatisch gesunken (p < 0,001). Um die Zytotoxizität weiter zu bestätigen, maßen wir auch die LDH-Leckage. Die Daten in Abb. 1b zeigten, dass die LDH-Produktion nach 72 h Exposition dosisabhängig zunahm, und die LDH-Werte in den 40, 80 und 160 Gruppen waren bemerkenswert höher als in der Kontrollgruppe (p < 0,0001). Da frühere Studien gezeigt haben, dass Neuroinflammation durch Exposition gegenüber TNPs gefördert werden kann, wurden auch die Spiegel von TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-8 gemessen. Abb. 2 illustriert, dass die Spiegel dieser vier entzündlichen Zytokine im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant upreguliert waren und in den mit 20 bis 160 µg/mL behandelten Gruppen dramatisch höher waren (p < 0,0001). Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse, dass TNPs Neurotoxizität dosisabhängig induzieren können, was mit früheren Studien konsistent ist. TNPs können von neuronalen Zellen absorbiert werden und die Proliferation hemmen. Darüber hinaus kann TNP-Exposition die Zellviabilität verringern und LDH-Leckage dosisabhängig fördern.

Wir co-behandelten Zellen mit Nec-1, um zu klären, ob Nekroptose an der durch TNPs verursachten Neurotoxizität beteiligt war. Nach Behandlung der Zellen mit den angegebenen TNP-Konzentrationen mit oder ohne Nec-1 wurden Zellviabilität, LDH-Leckage und Entzündung bewertet. Abb. 3a zeigt, dass die Verringerung der Zellviabilität nach TNP-Exposition durch Co-Behandlung mit 10 µM Nec-1 signifikant inhibiert wurde. Gleichzeitig zeigte Abb. 3b, dass die Behandlung mit 10 µM Nec-1 die LDH-Werte nicht erhöhte, und die LDH-Werte in der TNPs + Nec-1-Gruppe waren dramatisch niedriger als in der TNPs-alone-Gruppe. Als Nächstes maßen wir die Effekte der Co-Behandlung mit Nec-1 auf die durch TNPs induzierte Entzündung. Abb. 4 illustriert, dass die Spiegel von TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-8 in den mit TNPs + Nec-1 behandelten Zellen bemerkenswert niedriger waren. Diese Ergebnisse bestätigten erneut, dass Nec-1 Zellen vor Tod und entzündlichen Prozessen schützen kann.

Schließlich bewerteten wir, da RIP1 das Ziel von Nec-1 ist, ob RIP1 die Neurotoxizität von TNPs regulieren konnte. Wir konstruierten mutierte Zellen durch Silencing der RIP1-Expression (Abb. 5). Daten aus Abb. 6 und Abb. 7 zeigten, dass nach TNP-Exposition die Zellviabilität höher war und LDH, TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-8-Werte in der si-RIP1-Gruppe niedriger waren als in der si-NC-Gruppe, was darauf hindeutet, dass TNPs Zytotoxizität über RIP1 fördern. Ebenso haben mehrere Studien aufgedeckt, dass RIP1 sowohl Zelltod als auch entzündliche Prozesse regulieren kann.

Obwohl wir erstmals berichten, dass Nec-1 die Neurotoxizität von TNPs durch Unterdrückung des Nekroptose-Signalwegs mildern kann, hat unsere Studie einige Limitationen. Erstens unterscheidet sich die Zytotoxizität nano-großer Materialien von ihren Bulk-Gegenstücken und könnte weitgehend durch Oberflächeneigenschaften beeinflusst werden, was das gegenteilige Ergebnis erhöhter Zellviabilität erklären könnte, das von Sebastián et al. gefunden wurde. Daher ist es essenziell, Nanotoxizität auf Probanden aus mehreren Aspekten umfassend zu bewerten, wie Zellproliferation, Membranintegrität, oxidativer Stress, Entzündung, Mitochondrienfunktion, Zellzyklus, Zytoskelett und Epigenetik. Zweitens kann RIP1 RIP3 rekrutieren, um ein funktionales Nekrosom zu bilden, einen lebenswichtigen Aktivator von MLKL, um Nekroptose zu initiieren. Wir hypothesieren, dass RIP3/MLKL an der Neurotoxizität von TNPs beteiligt sein könnten, was in zukünftigen Arbeiten erforscht werden sollte. Darüber hinaus sollten die Assoziationen von RIP3/MLKL mit der Neurotoxizität von TNPs bewertet werden. Drittens wurden reaktive Sauerstoffspezies (ROS) als Hauptmechanismen der Neurotoxizität von TNPs berichtet und als upstream Signal von RIP1 beschrieben. Daher sollte weiter diskutiert werden, ob ROS upstream von RIP1 in der Neurotoxizität von TNPs sind. Viertens sollten Zellen nicht-toxischen Konzentrationen (TNPs < 5 µg/mL) für einen langfristigen Zeitraum (mehr als 72 h) ausgesetzt werden, um chronische Zytotoxizität zu bewerten. Fünftens sollten wir die Rolle der Nekroptose in der Neurotoxizität von TNPs in weiteren neuronalen Zelllinien und primären menschlichen und tierischen neuronalen Zellen evaluieren.

Schlussfolgerungen

Unsere Studie enthüllte Nekroptose als einen weiteren programmierten Zelltod-Mechanismus, der an der durch TNPs verursachten Neurotoxizität beteiligt ist. In dieser Studie fanden wir, dass TNPs entzündliche Schäden in SH-SY5Y-Zellen dosisabhängig induzieren konnten und dass Nec-1 (ein potentieller Nekroptose-Inhibitor) Co-Behandlung diese schädlichen Effekte lindern konnte. RIP1, das Ziel von Nec-1, wurde durch si-RNA gesilenced, was entzündliche Schäden, die durch TNP-Exposition induziert wurden, effektiv milderte. Zusammenfassend hemmte Nec-1 die entzündlichen Schäden von SH-SY5Y-Zellen, die durch TNP-Exposition induziert wurden, indem es den RIP1-Signalweg ansprach. Die upstream- und downstream-Signalwege von RIP1, die an der Neurotoxizität von TNPs beteiligt sind, sollten weiter bewertet werden.

Materialien und Methoden

TNP-Herstellung und Zellkultur

Wir charakterisierten TNPs zuvor und bereiteten sie gemäß unserem zuvor veröffentlichten Verfahren vor. Kurz gesagt, TNPs wurden in RPMI 1640 zu verschiedenen Konzentrationen von 5, 10, 20, 40, 80 und 160 µg/mL gelöst. Die TNP-Lösung wurde sterilisiert und soniziert (300 W, 10 min) bei Raumtemperatur, um die Partikel vor Aggregation vor der Behandlung zu bewahren. Zellen in Kulturmedium ohne TNP-Exposition dienten als Kontrollgruppe. SH-SY5Y-Zellen, bezogen von der Cell Bank des Shanghai Institute of Life Sciences, Chinese Academy of Sciences, wurden in RPMI 1640 Medium (HyClone, Logan, UT, USA) mit 10 % fötalem Kälberserum (Gibco, eine Produktlinie von Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ kultiviert.

Zellviabilitäts- und LDH-Leckage-Assay

Die Zellviabilität wurde mittels Cell Counting Kit-8 (CCK8, Dojindo, Kat.-Nr. CK04) gemessen. Kurz gesagt, 1 × 10⁴ SH-SY5Y-Zellen wurden in eine 96-Well-Platte gegeben und 24 h vor TNP-Exposition bei 37 °C (5 % CO₂) inkubiert. Zellen wurden dann mit TNPs in verschiedenen Konzentrationen (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 und 80 µg/mL) für weitere 24 h inkubiert. Nach der Behandlung wurden Zellen weitere 2 h mit CCK-8 inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte (OD) bei 450 nm gemessen, indem die 96-Well-Platte in einen Mikroplatten-Reader (BioTek, Winooski, VT, USA) gegeben wurde. Die Zellviabilität jeder Gruppe, ausgedrückt als Prozentsatz, wurde als (OD_behandelt - OD_blank) / (OD_kontrolle - OD_blank) × 100 % berechnet.

Die Membranintegrität wurde mit einem kommerziellen Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China) gemessen. Nach Exposition von SH-SY5Y-Zellen gegenüber verschiedenen TNP-Konzentrationen für 72 h wurde die LDH-Sekretion gemäß den Herstelleranweisungen analysiert.

Entzündungsreaktion

ELISA wurde angewendet, um die Spiegel von TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-8 zu messen, die von SH-SY5Y-Zellen produziert werden. Kurz gesagt, SH-SY5Y-Zellen wurden 72 h lang TNPs ausgesetzt, und der Überstand wurde zur Analyse gemäß den Herstelleranweisungen (Elabscience Biotechnology Co., Ltd.) gesammelt.

siRNA-Transfektion

Gemäß dem Herstellerprotokoll wurde eine 100 nM Konzentration von si-RIP1 oder negativer Kontroll-siRNA (si-NC) mittels Lipofectamine 2000 in Zellen transfiziert. Die Effizienz des Gen-Silencing durch siRNA wurde mit Echtzeit-PCR geschätzt.

Echtzeit-PCR

RNA von Zellen, die verschiedenen TNP-Konzentrationen ausgesetzt waren, wurde mit dem RNAqueous Kit (Ambion Inc., Austin, TX, USA) gemäß den Herstelleranweisungen isoliert. Die relative Expression von RIP1 wurde mittels Echtzeit-PCR gemessen. Die relativen mRNA-Spiegel von RIP1 wurden auf β-Actin-Expression normalisiert.

Statistische Analyse

SPSS 11.0 Software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) wurde zur Datenanalyse verwendet. Einfaktorielle Varianzanalyse wurde zum Vergleich der Gruppenmittelwerte verwendet. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.