Entwicklung polymerer Oleanolsäuremizellen und Bewertung ihrer klinischen Wirksamkeit

Einführung

Die Hautalterung umfasst Erschlaffung (Laxheit), Ausdünnung und Falten. Sie kann durch Infektionen, Rauchen, UV-Licht, Traumata, hormonelles Ungleichgewicht, Stress und/oder Prooxidantien wie Hydrolasen einschließlich Elastinase oder Kollagenase beschleunigt werden [1]. Reaktive Sauerstoffspezies oder freie Radikale, die durch die oben genannten Ursachen erzeugt werden, schädigen benachbarte Zellen und führen zu einer verringerten Hautelastizität und Ausdünnung [2, 3]. Insbesondere UV-Licht ist dafür bekannt, die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies auszulösen, die Membranlipide, zelluläre Proteine ​​und DNA schädigen und dadurch die Entwicklung von Ausdrucksfalten, Sommersprossen und Melasmen beschleunigen [1,2,3,4]. Oleanolsäure ist ein wirksamer Bestandteil natürlichen pflanzlichen Ursprungs, der aus mehreren Pflanzenarten gewonnen und als wichtiger medizinischer und kosmetischer Inhaltsstoff verwendet wird. Es kommt auch in Früchten wie Äpfeln oder Birnen vor [5]. Als eine Art hydroxypentazyklisches Terpen wurde Oleanolsäure erstmals aus Oliven (Olea europaea ) Blätter und kommt häufig in Pflanzen vor, darunter ostasiatische Swertia (Eugenia jambos ) und gelber Enzian (Gentiana lutea ). Es fördert Anti-Aging-Funktionen durch die Synthese von nicht nur Pro-Kollagen, das für die Kollagensynthese wichtig ist, sondern auch von Ceramiden und Filaggrin, sowie durch Hemmung der Aktivität von MMP-1, einem Enzym, das Proteine ​​wie Kollagen abbaut [ 5, 6]. Aufgrund dieser Erkenntnisse ist davon auszugehen, dass Oleanolsäure eine doppelte Anti-Aging-Wirkung besitzt, indem sie nicht nur die Kollagenproduktion fördert, sondern auch den Kollagenabbau verhindert [7]. Daher ist Oleanolsäure ein vielversprechender Anti-Aging-Wirkstoff für kosmetische Produkte. Die Verwendung von Oleanolsäure in kosmetischen Mitteln als Hauptbestandteil ist jedoch durch ihre schlechte Wasserlöslichkeit eingeschränkt; daher wurden nur geringe Mengen an Oleanolsäure als Teil einer emulgierten Formulierung als Nebeninhaltsstoff in kosmetischen Mitteln verwendet [8]. Seine physikalisch-chemischen Eigenschaften in Bezug auf die Hautabsorption umfassen seinen Schmelzpunkt, sein Molekulargewicht, seinen Verteilungskoeffizienten und seine Hydrophilie. Sein Schmelzpunkt liegt über 300°C, was darauf hindeutet, dass es sich um ein hochkristallines Material handelt. Hochkristalline Materialien benötigen eine höhere Auflösungsenergie, weisen aufgrund ihrer begrenzten Löslichkeit eine schlechte Bioverfügbarkeit auf und werden daher schlecht resorbiert [9]. Darüber hinaus ist bekannt, dass stark hydrophile oder lipophile Verbindungen oder Verbindungen mit hohem Molekulargewicht die Haut nicht leicht durchdringen [10, 11]. Die am häufigsten verwendete Methode zur Verbesserung der Hautpermeation solcher Moleküle ist die Synthese von Vorstufen oder die Verwendung kolloidaler Wirkstoffträger. In dieser Hinsicht wurden Liposomen, Emulsionen und polymere Mizellen aktiv untersucht [12].

Polymere Micellen sind selbstorganisierte Aggregate im Nanomaßstab, die in wässriger Lösung Kern-Schale-Strukturen bilden. Polymere Micellen bestehen häufig aus Diblock- oder Triblockcopolymeren, die einen hydrophoben inneren Kern und eine hydrophile äußere Hülle bilden können [13, 14]. Polymermizellen gelten als physikalisch stabiler als Tensidmizellen, da die Eigenschaften von Polymermizellen je nach Typ und Verhältnis der polymeren Monomere in einem Blockcopolymer variieren und relativ niedrige kritische Micellenkonzentrationen aufweisen [15, 16].

In dieser Studie stellten wir polymere Micellen aus Oleanolsäure her und bewerteten ihre Partikelgröße und -form sowie die resultierende Einkapselungseffizienz und Hautpermeationsrate von Oleanolsäure. Die physikalische Stabilität von Oleanolsäure in dieser Form wurde auch 3 Monate lang bewertet. Die menschliche Anti-Falten-Wirkung von Oleanolsäure in der tatsächlichen kosmetischen Produktformulierung wurde ebenfalls untersucht.

Materialien und Methoden

Materialien

Oleanolsäure, Tween 80, Tween 20 und Tween 60 wurden von TCI (Tokyo, Japan) bezogen. PEG 400, Pluronic F127 und Pluronic F68 wurden von BASF (Ludwigshafen, Deutschland) bezogen. Propylenglykol, PEG 300 und PEG 200 wurden von JUNSEI (Tokio, Japan) bezogen. TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 und Capryol™ PGMC wurden von Gattefossé (Lyon, Frankreich) bezogen. Dinatrium EDTA (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), Allantoin (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA), Dipropylenglykol (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), Propandiol (DuPont Tate &Lyle Bio Products Company, LLC, Loudon, USA), Carbomer (The Lubrizol Corporation, Ohio, USA) PEG/PPG/Polybutylenglycol-8/5/3 Glycerin (NOF Corporation, Tokio, Japan), Natrium Hyaluronat (TCI, Tokio, Japan), Beta-Glucan (SK Bioland, Cheonan, Korea), Phenoxyethanol (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), Caprylylglycol (J TWO K BIO CO., Ltd. , Cheongju, Korea) und Ethylhexylglycerin (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Korea) zur Herstellung des Oleanolsäure enthaltenden kosmetischen Produkts verwendet. Acetonitril von HPLC-Qualität wurde von Burdick &Jackson (Muskegon, MI, USA) erhalten. Es wurde dreifach destilliertes Wasser verwendet und andere Lösungsmittel und Reagenzien hatten EP- und GR-Qualität. Crlori:SKH1-hr haarlose weibliche Mäuse wurden von OrientBio (Seongnam, Korea) gekauft.

HPLC-Analyse

Oleanolsäure wurde unter Verwendung von Shimadzu LC-30 Serie HPLC (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) analysiert. Eine Kromasil 100 C18 250 mm × 4,6 mm, 5 &mgr;m analytische Säule (Teknokroma, Barcelona, ​​Spanien) wurde bei Umgebungstemperatur verwendet. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril und Wasser (85:15, v/v), die Flussrate betrug 1 µl/min und das Injektionsvolumen 10 µl. Oleanolsäure wurde bei UV λ . analysiert =210 nm. Alle Messungen wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt [17].

Studie zur Löslichkeits- und Formulierungsoptimierung

Eine abgemessene Menge Oleanolsäure wurde einem Lösungsvermittler zugesetzt, 48 h bei 60 °C gerührt und 5 min unter Verwendung eines Ultraschallreinigers beschallt. Die Suspension wurde mit einer Universal 320R Zentrifuge (Hettich, Tuttlingen, Deutschland) bei 2000 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde dann gesammelt. Dann wurde der Überstand durch einen 0,45 µm PVDF-Membranfilter (Whatman, Kent, UK) filtriert. Die Löslichkeit von Oleanolsäure im entsprechenden Lösungsvermittler wurde durch Subtrahieren des Gewichts der verbleibenden Feststoffe von der Summe der Anfangsgewichte der Oleanolsäure und des Lösungsvermittlers (Tabelle 1) abgeschätzt.

Die Studie zur Optimierung der Formulierung wurde unter Verwendung von Poloxamer 188, Poloxamer 407, Tween 60 und Tween 80 durchgeführt. Es wurden verschiedene Verhältnisse von amphiphilen Polymeren und Tensiden getestet, wie in Tabelle 2 zusammengefasst. Oleanolsäure und Capryol® 90 wurden jeweils gewogen, erhitzt und gerührt bei über 60 °C, bis klare Lösungen beobachtet wurden. Die in Tabelle 2 gezeigten Polymere/Tenside wurden dann zu der klaren Lösung gegeben und bei über 60 °C gerührt, bis klare Lösungen beobachtet wurden. Die Lösungen wurden dann in destilliertem Wasser dispergiert (Abb. 1). Die resultierende Lösung wurde ungefähr 48 h lang stehengelassen, und dann wurde eine visuelle Inspektion durchgeführt, um die optimale Formulierung auszuwählen. Die Ergebnisse der visuellen Inspektionen jeder Formulierung in Tabelle 2, einschließlich der Beobachtungen von Ausfällung, Phasentrennung, Transparenz und Gelierung, sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Schematische Darstellung der Herstellung von Oleanolsäuremicellen

Herstellung polymerer Mizellen aus Oleanolsäure

Polymere Micellen der Oleanolsäure (PMO) wurden unter Verwendung der Formulierungen G und H in Tabelle 2 nach dem in Abb. 1 gezeigten Verfahren hergestellt. PMO-G und PMO-H wurden für nachfolgende Experimente und PMO-H in den kosmetischen Produkten für die klinische Studien.

Färbungstest

Die polymere Micellisierung, wenn Formulierung G oder Formulierung H in Wasser dispergiert wurde, wurde durch visuelle Beobachtung, d. h. Transparenz, bestätigt. Die PMO-Bildung (PMO-G oder PMO-H) wurde auch durch einen Fleckentest bestätigt. Methylenblau wurde zu den Mischungen aus Wasser und Capryol® 90, Wasser, Capryol® 90, PMO-G und PMO-H gegeben und die Farbe der Lösungen wurde visuell beobachtet und fotografiert.

Partikelgrößenmessung

Die ELS-Technik (elektrophoretische Lichtstreuung) misst die Streuungsintensitätsfluktuation von den Partikeln als Funktion der Zeit, wenn die Partikel sowohl eine zufällige Brownsche Bewegung als auch eine orientierte elektrophoretische Bewegung in einem wohldefinierten elektrischen Feld aufweisen. Die elektrophoretische Partikelmobilität wird mit der ELS-Technik [18] gemessen und ermöglicht die Bewertung der Partikelgröße sowohl von PMO-G als auch von PMO-H unter Verwendung eines elektrophoretischen Lichtstreuungsspektrophotometers (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Japan).

Rasterelektronen-Kryomikroskopie (Kryo-REM)-Analyse

Die kryogene Rasterelektronenmikroskopie oder Rasterelektronenkryomikroskopie (Kryo-REM) ist eine leistungsstarke Technik zur Visualisierung des Zustands der Mikrostruktur oder Nanostruktur von kolloidalen Polymersuspensionen oder -dispersionen, nachdem sie durch schnelles Einfrieren immobilisiert und für die Bildgebung gebrochen wurden. Der Bruch wird bei − 196 °C, dem normalen Siedepunkt von flüssigem Stickstoff und weit unterhalb der Glasübergangstemperatur sowohl der Masse als auch der vollständig koaleszierten Partikel hergestellt und untersucht. Kryo-REM-Bilder zeigen eine Reihe von Reaktionen von Partikeln auf Brüche, die sich durch Eis an ihnen vorbei ausbreiten [19]. Rasterelektronen-Kryomikroskopie (Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Sample Preparation System) wurde verwendet, um die Form der PMOs zu beobachten.

Effizienz der Kapselung

Die Einkapselungseffizienz der Oleanolsäure-Polymermicellen wurde bewertet. PMO wurde 15 min bei 2000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt und durch HPLC analysiert. Die Einkapselungseffizienz wurde als die Menge an Oleanolsäure in den polymeren Micellen dividiert durch die Menge an ursprünglich zugegebener Oleanolsäure (mg) während der PMO-Herstellung berechnet.

Stabilität von PMO-H

Die physikalische Stabilität von PMO-H wurde durch Lagerung bei 40 °C für 3 Monate bewertet. Farbänderungen, Phasentrennung, das Vorhandensein von Niederschlägen und Trübungsänderungen wurden visuell bewertet. In regelmäßigen Zeitabständen entnommene PMO-H-Proben wurden durch HPLC analysiert, um die verbleibenden Mengen an Oleanolsäure zu bestimmen, und durch ein ELS-Z, um die PMO-H-Partikelgröße zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Abb. 9 dargestellt.

In-vitro-Hautpermeationstest

Eine In-vitro-Hautpermeationsstudie wurde unter Verwendung einer Franz-Diffusionszelle durchgeführt, um die Verbesserung der Hautpermeation von Oleanolsäure zu untersuchen. Der Test wurde mit PMO-G, PMO-H, der Mischung aus Oleanolsäure und Tween 80, dispergiert in destilliertem Wasser, und der Mischung aus Oleanolsäure und Propylenglykol, dispergiert in destilliertem Wasser, durchgeführt. Die Haut einer 6 Wochen alten weiblichen haarlosen Maus wurde in Stücke der erforderlichen Größe geschnitten. Es wurden vertikale Franz-Zellen verwendet und die Haut zwischen den beiden Kammern mit dem Stratum corneum nach oben fixiert. 330 µl der ausgewählten Formulierung wurden auf die Haut aufgetragen und die Franz-Zellen mit Parafilm bedeckt. Der Rezeptor wurde mit PBS-Lösung (pH 7,4) und Ethanol in einem Verhältnis von 9:1 (Vol./Vol.) gefüllt. Die Rezeptorlösung wurde zu jeder Probenahmezeit mit frischer PBS-Lösung aufgefüllt. Proben wurden nach 2, 4, 6, 8, 10, 20 und 24 h entnommen und mittels HPLC analysiert. Nach 24 h wurde die auf der Haut verbliebene überschüssige Formulierung mit Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Australien) entfernt. Die in der Permeationsstudie verwendete Haut wurde mit PBS-Lösung gereinigt und die in der Haut verbleibende Oleanolsäure wurde mittels HPLC gemessen. Alle Permeationsexperimente wurden dreifach durchgeführt.

Statistik der Studie

Die Experimente wurden unabhängig voneinander in drei Wiederholungen durchgeführt, und die Ergebnisse dieser Studie wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die statistische Analyse wurde von einem unabhängigen t . verifiziert test, und der Wert von p <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ampullenvorbereitung mit PMO-H

Für den klinischen Test wurde PMO-H als Testprodukt verwendet. PMO-H, gereinigtes Wasser, Dinatrium-EDTA, Allantoin, Dipropylenglykol, Propandiol, Carbomer und PEG/PPG/Polybutylenglykol-8/5/3 Glycerin wurden zugegeben und 10~15 min mit einem Magnetrührer gerührt und dann Kalium Hydroxid wurde zugegeben und die Mischung 5 bis 10 Minuten lang weiter gerührt. Sobald die Bestandteile homogen vermischt waren, wurden Natriumhyaluronat und Beta-Glucan zugegeben und weitere 2-5 Min. gerührt, und dann wurden Phenoxyethanol, Propandiol, Caprylylglycol und Ethylhexylglycerin zugegeben und 2-5 Min. gerührt. Die endgültige Rezeptur wurde als Testprodukt in eine Ampulle gegeben. Die Ampullenluftblasen wurden vor der Testverwendung unter Verwendung eines Vakuumtrockenofens entfernt. Eine Kontrolle wurde nach dem gleichen Verfahren für das Testprodukt hergestellt, außer dass Oleanolsäure ausgeschlossen wurde.

Menschliche Anwendungstests

Studie zu Hautirritationen beim Menschen

Ein Hautpatchtest des kosmetischen Mittels, das PMO-H in einer Ampulle enthielt, wurde an 25 männlichen und weiblichen Probanden im Alter von 22 bis 56  Jahren durchgeführt, die sich bereit erklärt hatten, an einem Test auf Hautirritationen beim Menschen teilzunehmen. Jede Testsubstanz wurde auf den Oberarm getropft und mit einem Pflaster fixiert. Das Pflaster wurde 24 Stunden lang angebracht und der Stimulationsgrad wurde von 2 Fachleuten 30 Minuten, 24 Stunden und 48 Stunden nach Entfernung des Pflasters gemäß den Kriterien der International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG) beobachtet.

Klinische Studie zur Faltenverbesserung

Polymere Micellen, die Oleanolsäure in einer Ampulle als Endproduktform enthielten, wurden um die Augen von 23 weiblichen Probanden im Alter von 30 bis 65 Jahren, die sich bereit erklärt hatten, an einem Faltenverbesserungstest teilzunehmen, aufgetragen. Die Probanden erfüllten die Einschlusskriterien und keines der Ausschlusskriterien und stimmten der Teilnahme am Humananwendungstest zu. Die doppelblinde Methode wurde sowohl von Forschern als auch von Testpersonen verfolgt. Der Test wurde 8 Wochen lang durchgeführt, und die Auswertung wurde alle 4 Wochen durchgeführt. Es wurden die Doppelblindmethode und die zufällige Zuteilung verwendet. Das Testprodukt und die Kontrolle wurden getrennt nach dem Zufallsprinzip entweder auf die linke oder rechte Seite des Gesichts derselben Person aufgetragen. Fünf Parameter wurden durch optische Profilometrie mit dem Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Köln, Deutschland) alle 4 Wochen für 8 Wochen bewertet – die durchschnittliche Rauheit (R3) war der primäre Endpunkt und die vier Parameter der Hautrauheit (R1) , maximale Rauheit (R2), Glättetiefe (R4) und arithmetische mittlere Rauheit (R5) waren die sekundären Endpunkte. Zunahmen oder Abnahmen der fünf Parameter auf derselben Fläche des Subjekts wurden über die Zeit gemessen und die Durchschnittswerte der Zunahme oder Abnahme der fünf Parameter wurden berechnet und zwischen Kontroll- und Testproduktbehandlungen verglichen. Darüber hinaus wurde eine visuelle Beobachtung der Haut durch Fachleute vorgenommen. Fotografien von Augenfalten wurden unter Verwendung von Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Suwon, Korea) aufgenommen. Die zur Bestimmung der visuellen Bewertungspunkte verwendeten Kriterien sind in Abb. S1 dargestellt, und die visuellen Ergebnisse sind in Abb. 13 dargestellt. Die Parameter wurden verglichen und unter Verwendung einer gepaarten Stichprobe t . analysiert Test mit einer Zuverlässigkeit von 95 % [20,21,22,23,24,25].

Ergebnisse und Diskussion

Bestimmung von Lösungsvermittler, Tensid und Polymer

Die Löslichkeit von Oleanolsäure in biokompatiblen Lösungsvermittlern, insbesondere Tensiden und Polymeren, ist in Tabelle 1 gezeigt. Oleanolsäure neigt dazu, in hydrophoben Ölen mit niedrigem hydrophil-lipophilem Gleichgewicht (HLB) löslich zu sein. Capryol® 90 hat im Vergleich zu allgemeinen Ölen einen etwas höheren HLB-Wert [26]. Oleanolsäure zeigt jedoch eine relativ hohe Löslichkeit in Capryol® 90. Darüber hinaus lässt sich Capryol® 90 als innerer Kern von Micellen leicht stabilisieren [27]. Nach Auswahl von Capryol® 90 wurden verschiedene Arten von Tensiden oder Poloxameren auf den Schalenteil der Oleanolsäure-Micellen untersucht [27,28,29,30]. Die in Tabelle 2 gezeigten Oleanolsäuremicellenzusammensetzungen waren diejenigen, die unmittelbar nach dem Verdünnen mit destilliertem Wasser transparent waren. Einige Zusammensetzungen waren jedoch instabil und durchliefen innerhalb von 24 h eine Ausfällung, Phasentrennung oder Gelierung. Repräsentative Bilder von ausgefällten, phasenseparierten, transparenten Flüssigkeits- und Gelzuständen sind in Fig. 2 gezeigt. Der Endzustand jeder Formel ist in Tabelle 3 zusammengefasst. Die Zusammensetzungen G und H blieben auch nach 24 Stunden transparent. Obwohl die Zusammensetzung I klar blieb, war es eher ein Gel als eine Flüssigkeit. Die Zusammensetzungen A bis D wurden nach 24 Stunden durch Ausfällung undurchsichtig. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Zusammensetzungen G und H für die weitere Entwicklung ausgewählt.

Repräsentative Bilder von a Niederschlag, b Phasentrennung, c transparente Flüssigkeit und d Gelierung von Oleanolsäuremicellen

Eigenschaften der polymeren Micellen der Oleanolsäure

Die Strukturen der polymeren Micellen der Oleanolsäure wurden im Färbetest untersucht. Abbildung 3 zeigt die Bilder der Mischung aus Capryol® 90 und destilliertem Wasser, Capryol® 90, destilliertem Wasser und den polymeren Micellen der Zusammensetzung G (PMO-G) und der Zusammensetzung H (PMO-H) nach Zugabe von Methylenblau zu die Lösung. Für die Mischung aus Capryol® 90 und destilliertem Wasser trat eine klare Phasentrennung auf. Bei Capryol® 90 wurde eine Ausfällung von Methylenblau beobachtet. Destilliertes Wasser verfärbte sich nach Zugabe von Methylenblau dunkelblau. PMO-G und PMO-H wurden ebenfalls blau, was anzeigt, dass die polymeren Micellen aus einem inneren Kern der Ölphase und einer äußeren Hülle der wässrigen Phase bestanden. Mit anderen Worten, ein amphiphiles Polymer, Poloxamer 407 in den Zusammensetzungen G und H, dient als äußere Hülle und hilft bei der erfolgreichen Bildung polymerer Micellen von Oleanolsäure durch Einkapseln des inneren Kerns von Capryol® 90, das Oleanolsäure enthält [31].

Färbetest mit Methylenblau:(a ) Mischung aus Capryol® 90 und destilliertem Wasser, (b ) Capryol® 90, (c ) destilliertes Wasser, (d ) PMO-G und (e ) PMO-H

Partikelgröße, Größenverteilung und Form können gute Indikatoren für die Vorhersage der physikalischen Stabilität von Micellenformulierungen sein. Die durchschnittliche Partikelgröße von PMO-G betrug 80,4 nm und die von PMO-H 57 nm (Fig. 4). Die Histogramme von PMO-A, G und H sind in Fig. 5 gezeigt, um die vom Phasenzustand beeinflussten Größenverteilungen zu vergleichen. Wie in Tabelle 3 gezeigt, ist PMO-A aufgrund von Ausfällung opak und PMO-G und H sind transparent. Die Partikelgröße von PMO-A beträgt mehr als 100 nm, und PMO-A zeigt eine breitere Größenverteilung als PMO-G und H (Abb. 5). PMO-H weist eine engere Partikelgrößenverteilung als PMO-G auf und weist eine für kosmetische Produkte geeignete Fließfähigkeit auf.

Die durchschnittliche Partikelgröße von PMO-G und PMO-H aus Tabelle 2:80,4 ± 11,1 nm (PMO-G) und 57 ± 5,24 nm (PMO-H)

Partikelanalyse-Histogramm von drei verschiedenen PMO-Proben. a PMO-A, 121,28 nm; b PMO-G, 80,4 nm; und (c ) PMO-H, 57 nm

Die Einkapselungseffizienz für PMO-G und PMO-H betrug 99 bis 100 %, was darauf hindeutet, dass fast 100 % der Oleanolsäure im inneren Kern von PMO eingekapselt waren (Abb. 6).

Verkapselungseffizienz von PMO-G und PMO-H mit fast 100 % Verkapselungseffizienz:98,26 ± 0,17 % (PMO-G) und 99,18 ± 1,06 % (PMO-H)

Die Form von PMO-G und PMO-H wurde durch Rasterelektronen-Kryomikroskopie (Cryo-REM) untersucht. Kryo-SEM zeigte, dass sowohl PMO-G als auch PMO-H polymere Mizellen in Kugelform waren. Polymere PMO-H-Mizellen waren jedoch in Größe und Form konsistenter als polymere PMO-G-Mizellen (Abb. 7).

Rasterelektronenkryomikroskopische Aufnahmen von a PMO-G und b PMO-H

In-vitro-Hautpermeationsstudie von PMO

Die Gesamtmenge der in der Haut verbleibenden Oleanolsäure und die Gesamtmenge der durch die Haut permeierten Oleanolsäure als Funktion der Zeit wurden an der Haut einer 6 Wochen alten weiblichen haarlosen Maus gemessen. Vier verschiedene Formulierungen, PMO-G, PMO-H, die Mischung aus Oleanolsäure und Tween 80 dispergiert in destilliertem Wasser (OTw) und die Mischung aus Oleanolsäure und Propylenglykol dispergiert in destilliertem Wasser (OPG) wurden hinsichtlich der Haut verglichen Permeationseffizienz von Oleanolsäure. Die Gesamtmenge an Oleanolsäure, die nach 24 Stunden durch die Haut permeiert wurde, betrug 29,49 ± 4,00 % für PMO-H, 21,39 ± 5,91 % für PMO-G, 13,66 ± 0,81% für OTw und 5,90 ± 2,47 % für OPG. Wie in Abb. 7 gezeigt, war der erste Nachweis von Oleanolsäure sowohl im Fall von PMO-G als auch PMO-H nach 8 h möglich, während der erste Nachweis von Oleanolsäure in OTw nach 10 h und OPG nach 20 h möglich war h. Die in der Haut verbliebenen Anteile an Oleanolsäure betrugen 56,22 ± 13,50 % für PMO-H, 36,74 ± 0,72 % für PMO-G, 27,44 ± 7,02 % für OTw und 26,28 ± 5,42 % für OPG. PMO-H zeigte die größte Menge sowohl von Oleanolsäure, die durch die Haut permeiert wurde, als auch von Oleanolsäure, die in der Haut zurückblieb (Abb. 8). Diese Ergebnisse zeigen, dass PMOs schneller und stärker durchdringen können als Formulierungen, die keine Micellen bilden.

Gesamtmenge an Oleanolsäure in PMO-G-, PMO-H-, Oleanolsäure- und Tween 80-Mischung, dispergiert in destilliertem Wasser (Otw) und Oleanolsäure- und Propylenglykol-Mischung, dispergiert in destilliertem Wasser (OPG), die durch die Haut gedrungen ist und die Menge an Oleanolsäure Säure in jeder Formulierung als Funktion der Zeit. Menge an Oleanolsäure, die nach 24 Stunden in der Haut verblieb:36,74 ± 0,72% (PMO-G), 56,22 ± 13,50% (PMO-H), 27,44 ± 7,02% (Otw) und 26,28 ± 5,42% (OPG). Permeierte Oleanolsäuremenge nach 24 h:21,39 ± 5,91 % (PMO-G), 29,49 ± 4,00 % (PMO-H), 13,66 ± 0,81 % (Otw) und 5,90 ± 2,67 % (OPG)

Stabilität von flüssigen Oleanolsäure-Polymermizellen

Auf Basis der Charakterisierung und In-vitro-Permeationsstudien wurde schließlich PMO-H für die Ampullenherstellung ausgewählt. Vor der Ampullenherstellung wurde die Stabilität von ONM-H bewertet. Für die Stabilitätsstudie wurde PMO-H in Fläschchen unter beschleunigten Stabilitätsstudienbedingungen bei 40 °C/75 % RH für 3 Monate gelagert. Niederschlag, Phasentrennung, Farbänderungen und Transparenz wurden dann visuell bewertet. Anschließend wurde der Anteil an Oleanolsäure mittels HPLC gemessen und es wurden auch Veränderungen der Partikelgröße überprüft. Die Stabilität wurde im Laufe der Zeit überprüft. PMO-H blieb ohne Ausfällung oder Phasentrennung transparent und seine Farbe änderte sich unter den beschleunigten Stabilitätsbedingungen 3 Monate lang nicht. Der durch HPLC gemessene Anteil an Oleanolsäure und die zeitliche Änderung der Partikelgröße sind in Abb. 9 dargestellt. Der Anteil der Oleanolsäure blieb über 98% und die Partikelgröße von 49,6 ± 5 nm blieb während der 3 Monate der Stabilität nahezu konstant Studiendauer. Diese Ergebnisse zeigen, dass PMO-H unter den beschleunigten Stabilitätsbedingungen 3  Monate lang physikalisch und chemisch stabil ist.

Der Gehalt und die Partikelgröße ändert sich von PMO-H während eines 3-monatigen Stabilitätstests unter Beschleunigungsbedingungen bei 40 °C/75 % RH. Anteil von Oleanolsäure in PMO-H:100 ± 1,6 % (0 Monat), 99,9 ± 0,2 % (1 Monat), 99,5 ± 0,2 % (2 Monat) und 99,3 ± 0,2 % (3 Monat). Partikelgröße von PMO-H:55,3 ± 6,5 nm (0 Monate), 54,6 ± 7 nm (1 Monat), 51,0 ± 5,56 nm (2 Monate) und 49,6 ± 5 nm (3 Monate)

Klinischer Test

Test auf menschliche Reizung

Vor der klinischen Studie wurde ein menschlicher Reizungstest an 25 gesunden weiblichen und männlichen Freiwilligen im Alter von 22 bis 56 Jahren durchgeführt. Das Testprodukt wurde 24 h lang auf den Oberarm der Probanden gepatcht und der Hautreizungsindex wurde 30 min, 24 h und 48 h nach Entfernung des Pflasters gemessen. Bei der kosmetischen Ampullenformel, die PMO-H enthielt, wurde 1 h oder 48 h nach Entfernung des Pflasters keine Reizung beobachtet.

Klinische Studie

Die klinische Studie wurde an 23 weiblichen Probanden im Alter von 30 bis 65 Jahren mit Falten um die Augen durchgeführt; ohne die 3 Studienabbrecher beendeten 20 Probanden die Studie, indem sie sowohl das Testprodukt, die PMO-H-Ampulle als auch die Kontrolle für 8  Wochen getrennt entweder auf die linke oder die rechte Seite ihres Gesichts auftrugen. Hautveränderungen wurden anhand von fünf Parametern bewertet – durchschnittliche Rauheit (R3) als primärer Endpunkt und vier weitere Parameter als sekundäre Endpunkte, nämlich Hautrauheit (R1), maximale Rauheit (R2), Glättetiefe (R4) und arithmetische mittlere Rauheit (R5). Der visuelle Bewertungsscore fügte einen weiteren sekundären Endpunkt hinzu. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Der primäre Endpunkt R3 war nach 4 wöchiger Anwendung des Testprodukts um 0,673 % und nach 8 wöchiger Anwendung statistisch signifikant um 7,835% gesunken (p =0,006). Bei der Kontrollanwendung war R3 nach 4 wöchiger Anwendung um 5,127% und nach 8 wöchiger Anwendung statistisch signifikant um 9,971% gestiegen (p =0,010). The difference in R3 value between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.000) but not statistically significant after 4 weeks of use, perhaps due to inter-subject variation (Fig. 10).

Changes in primary endpoint value, R3, before, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of an ampoule containing polymeric micelles of oleanolic acid and the control during clinical trial. R3 value of test product use:0.094 ± 0.023 before use, 0.093 ± 0.023 after 4 weeks use, 0.086 ± 0.020 after 8 weeks use. R3 value of control product:0.087 ± 0.023 before use, 0.091 ± 0.025 after 4 weeks use, 0.095 ± 0.024 after 8 weeks use (A.U. for arbitrary unit). * ¹ The wrinkle analysis of R3 value decreased statistically significantly. * ² The wrinkle analysis of R3 value increased statistically significantly

The analysis of the secondary endpoint R1 showed that the value had decreased by 4.629% after 4 weeks of test product use and statistically significantly by 9.973% after 8 weeks of use (p =0.017). With control application, R1 had increased by 8.037% after 4 weeks of use and 4.799% after 8 weeks of use. The difference in R1 values between the areas using the test product and the control was not statistically significant after 4 weeks of use but was after 8 weeks of use (p =0.024). The secondary endpoint R2 had decreased by 1.048% after 4 weeks of test product use and 5.803% after 8 weeks. With control application, it had increased by 7.261% after 4 weeks and 9.536% after 8 weeks. The difference in R2 value between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.016) but not after 4 weeks of use. The secondary endpoint R4 had significantly decreased by 8.594% (p =0.039) after 4 weeks of test product use and by 9.747% after 8 weeks of use. With the control, R4 had increased by 10.764% after 4 weeks of use and 3.491% after 8 weeks of use. Interestingly, the difference in R4 value between the areas using the test product and the control was statistically significant after 4 weeks of use (p =0.008) but not after 8 weeks. The secondary endpoint R5 had decreased by 6.333% after 4 weeks of test product use and 8.556% after 8 weeks of use. The difference in R5 value between the areas of using the test product and the control was not statistically significant following 4 weeks or even 8 weeks of use.

The analysis of the further secondary endpoint, the visual evaluation of wrinkles, showed that the visual evaluation score had decreased by 2.917% after 4 weeks of test product use and statistically significantly decreased by 8.333% after 8 weeks of use (p =0.034). With application of the control, the visual evaluation score had increased by 1.667% after 4 weeks and 4.167% after 8 weeks. The difference of the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.046) but not after 4.

In summary, the analysis of the wrinkled area around the eyes showed that the difference in the primary endpoint value R3 between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use. In terms of the secondary endpoints, all values had decreased after test product use and increased after control use. The difference in R4 values between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 4 weeks of use, but the difference of the R1 and R2 values were statistically significant only after 8 weeks of use (Fig. 11). The visual evaluation score by professionals showed that all the average visual evaluation scores for wrinkles had decreased after 4 weeks and 8 weeks of test product treatment compared to the control (Table 5). The difference in the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (Fig. 12). Overall, according to all endpoints, the cosmetics formula containing PMO-H as a primary ingredient was found to help improve wrinkles after 8 weeks of use (Fig. 13).

Results of secondary endpoint R1, R2, R4, and R5 for skin wrinkle measurement—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Please refer to Table 4 for the exact values (A.U. for arbitrary unit)

Results of visual evaluation of skin—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Test product:3.050 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.999 after 4 weeks use, and 2.75 ± 0.851 after 8 weeks. Control product:2.900 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.945 after 4 weeks use, and 3.000 ± 0.918 after 8 weeks use. * ¹ The visual evaluation grade of wrinkles by professionals decreased significantly. * ² The visual evaluation grade of wrinkles by professionals increased significantly

Pictures of the tested areas

Conclusions

Surfactants are commonly used excipients in cosmetic products to improve solubility of poorly soluble materials. One caveat would be the amount included in the product. Surfactants should be added in sufficient amount to dissolve poorly soluble materials without precipitation. Only a minimal amount should be added for safety reasons. Micelle formulation could be the solution to this problem. Polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study improve the solubility of oleanolic acid with a minimum amount of surfactants and enhance the permeation of oleanolic acid through the skin. Stable polymeric micelles of oleanolic acid were developed using Capryol 90 and poloxamer. The polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study were stable, that is, they did not show any precipitation, phase separation, or degradation at 40 °C after 3 months. The clinical trial showed that, as a main active ingredient, the oleanolic acid in the polymeric micelle formulation is effective for alleviating human wrinkles. Based on these findings, it can be concluded that oleanolic acid, which is poorly soluble in water and therefore, unusable in a native form as a principal ingredient for alleviating skin wrinkles, can be formulated into applicable polymeric micelles. Furthermore, it is expected that the polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study will prove very useful for alleviating human wrinkles and will prove widely applicable to cosmetic applications.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Not applicable

Abkürzungen

PMO:

Polymeric micelles of oleanolic acid

PEG:

Polyethylenglykol

TRANSCUTOL P:

Highly purified diethylene glycol monoethyl ether

LABRASOL:

PEG-8 Caprylic/Capric Glycerides

LAUROGLYCOL FCC:

Propylene glycol monolaurate (type I, monoesters>45%)

LABRAFAC:

Caprylic/Capric Triglyceride

Capryol® 90:

Propylene glycol monocaprylate (type II, monoesters>90%)

Capryol™ PGMC:

Propylene glycol monocaprylate (type I, monoesters>55%)

EDTA:

Ethylenediaminetetraacetic Acid

ELS:

Electrophoretic light scattering