Polymerische Mizellen zur Abgabe von Oleanolsäure: Erhöhte Löslichkeit und bewiesene Anti-Falten-Wirksamkeit

Zusammenfassung

Oleanolsäure wurde bisher nur als Hilfsstoff in kosmetischen Produkten verwendet. Ziel der Studie ist es, die Wirkung von Oleanolsäure als aktiven Inhaltsstoff zur Linderung von Falten beim Menschen zu zeigen und eine polymerische Mizellen-Formulierung zu entwickeln, die es ermöglicht, schlecht lösliche Oleanolsäure als Hauptbestandteil in kosmetischen Produkten zur Faltenreduktion einzusetzen. Die Löslichkeit von Oleanolsäure wurde in Lösungsvermittlern, Tensiden und Polymeren bewertet. Partikelgrößen und -formen der polymerischen Mizellen mit Oleanolsäure wurden mittels elektrophoretischer Lichtstreuungsspektroskopie und Rasterelektronen-Kryomikroskopie untersucht. Einkapselungseffizienz und Hautpermeation wurden per HPLC gemessen. Die Stabilität der polymerischen Mizellen, gelagert bei 40 °C für 3 Monate, wurde durch visuelle Beobachtung, Partikelgrößenmessung und Oleanolsäure-Gehaltsbestimmung evaluiert. Polymerische Mizellen in finaler Ampullenform wurden 8 Wochen lang im Augenbereich von 23 weiblichen Probandinnen angewendet. Fünf Hautparameter wurden alle 4 Wochen über 8 Wochen mittels optischer Profilometrie bewertet. Zusätzlich führten Fachkräfte visuelle Hautbeurteilungen durch und eine Human-Hautreizstudie wurde durchgeführt. Polymerische Mizellen von Oleanolsäure mit Partikelgröße unter 100 nm wurden unter Verwendung von Capryol 90® und Poloxamer hergestellt. Die Hautpermeationsrate der Oleanolsäure in den polymerischen Mizellen war höher als in anderen Lösungen aus Oleanolsäure, dispers in zwei verschiedenen Tensiden. Keine signifikanten Veränderungen in Partikelgröße, Farbe oder Oleanolsäure-Gehalt wurden beobachtet, und die polymerischen Mizellen, gelagert bei 40 °C für 3 Monate, durchliefen keine Phasentrennung. Nach 8-wöchiger Anwendung hatte sich keine Hautreizung entwickelt und alle fünf mittels optischer Profilometrie bewerteten Parameter sowie die visuellen Bewertungswerte waren signifikant verbessert. Diese Studie zeigte, dass die in dieser Arbeit hergestellten polymerischen Mizellen von Oleanolsäure stabil und wirksam zur Linderung von Falten beim Menschen als Hauptwirkstoff sind. Basierend auf diesen Ergebnissen wird erwartet, dass polymerische Mizellen von Oleanolsäure breit in kosmetischen Anwendungen eingesetzt werden können.

Einleitung

Hautalterung umfasst Erschlaffung (Elastizitätsverlust), Verdünnung und Faltenbildung. Sie kann durch Infektionen, Rauchen, UV-Licht, Traumata, hormonelles Ungleichgewicht, Stress und/oder Pro-Oxidantien wie Hydrolasen einschließlich Elastase oder Collagenase beschleunigt werden [1]. Reaktive Sauerstoffspezies oder freie Radikale, die durch die genannten Ursachen erzeugt werden, schädigen benachbarte Zellen und führen zu reduzierter Hautelastizität und Verdünnung [2, 3]. Besonders UV-Licht ist bekannt dafür, die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies auszulösen, die Membranlipide, zelluläre Proteine und DNA schädigen und dadurch die Entwicklung von Mimikfalten, Sommersprossen und Melasma beschleunigen [1-4]. Oleanolsäure ist ein wirksamer Bestandteil natürlichen Pflanzenursprungs, der aus verschiedenen Pflanzenarten extrahiert wird und als wichtiger medizinischer und kosmetischer Inhaltsstoff dient. Sie kommt auch in Früchten wie Äpfeln oder Birnen vor [5]. Als一种 Hydroxy-pentazyklische Terpenverbindung wurde Oleanolsäure erstmals aus Olivenblättern (Olea europaea) isoliert und ist weit verbreitet in Pflanzen wie ostasiatischer Swertia (Eugenia jambos) und Gelbem Enzian (Gentiana lutea). Sie fördert Anti-Aging-Funktionen durch Synthese nicht nur von Prokollagen, das für die Kollagensynthese wichtig ist, sondern auch von Ceramiden und Filaggrin, und durch Hemmung der Aktivität von MMP-1, einem Enzym, das Proteine wie Kollagen abbaut [5, 6]. Aufgrund dieser Befunde kann angenommen werden, dass Oleanolsäure eine doppelte Anti-Aging-Wirkung hat, indem sie nicht nur die Kollagenproduktion fördert, sondern auch den Kollagenabbau verhindert [7]. Daher ist Oleanolsäure ein sehr vielversprechender Anti-Aging-Inhaltsstoff für kosmetische Produkte. Allerdings ist der Einsatz von Oleanolsäure in kosmetischen Produkten als Hauptbestandteil durch ihre schlechte wässrige Löslichkeit begrenzt; daher wurden nur kleine Mengen Oleanolsäure als Teil einer emulgierten Formulierung als Hilfsstoff in kosmetischen Produkten verwendet [8]. Ihre physikochemischen Eigenschaften im Zusammenhang mit der Hautabsorption umfassen Schmelzpunkt, Molekulargewicht, Verteilungskoeffizient und Hydrophilie. Ihr Schmelzpunkt liegt über 300 °C, was auf ein hochkristallines Material hinweist. Hochkristalline Materialien benötigen mehr Energie zur Lösung, zeigen aufgrund ihrer begrenzten Löslichkeit schlechte Bioverfügbarkeit und werden daher schlecht absorbiert [9]. Zudem ist bekannt, dass hoch hydrophile oder lipophile Verbindungen oder Verbindungen mit hohem Molekulargewicht die Haut nicht leicht durchdringen [10, 11]. Die häufigste Methode zur Verbesserung der Hautpermeation solcher Moleküle ist die Synthese von Vorstufen oder die Verwendung kolloidaler Wirkstoffträger. In diesem Zusammenhang wurden Liposomen, Emulsionen und polymerische Mizellen aktiv untersucht [12].

Polymerische Mizellen sind selbstassemblierte nano-skalige Aggregate, die in wässriger Lösung Kern-Schale-Strukturen bilden. Sie bestehen oft aus Di-Block- oder Tri-Block-Copolymeren, die einen hydrophoben inneren Kern und eine hydrophile äußere Schale bilden können [13, 14]. Polymerische Mizellen gelten als physikalisch stabiler als Tensidmizellen, da ihre Eigenschaften von der Art und dem Verhältnis der polymeren Monomere in einem Blockcopolymer abhängen und sie relativ niedrige kritische Mizellkonzentrationen aufweisen [15, 16].

In dieser Studie bereiteten wir polymerische Mizellen von Oleanolsäure zu und evaluierten deren Partikelgröße und -form, sowie die resultierende Einkapselungseffizienz und Hautpermeationsrate der Oleanolsäure. Die physikalische Stabilität von Oleanolsäure in dieser Form wurde ebenfalls für 3 Monate evaluiert. Der menschliche Anti-Falten-Effekt von Oleanolsäure in tatsächlicher kosmetischer Produktformulierung wurde ebenfalls untersucht.

Materialien und Methoden

Materialien

Oleanolsäure, Tween 80, Tween 20 und Tween 60 wurden von TCI (Tokyo, Japan) bezogen. PEG 400, Pluronic F127 und Pluronic F68 wurden von BASF (Ludwigshafen, Deutschland) erhalten. Propylenglykol, PEG 300 und PEG 200 wurden von JUNSEI (Tokyo, Japan) bezogen. TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 und Capryol™ PGMC wurden von Gattefossé (Lyon, Frankreich) gekauft. Dinatrium-EDTA (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), Allantoin (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA), Dipropylenglykol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), Propanediol (DuPont Tate & Lyle Bio Products Company, LLC, Loudon, USA), Carbomer (The Lubrizol Corporation, Ohio, USA), PEG/PPG/Polybutylenglykol-8/5/3 Glycerin (NOF Corporation, Tokyo, Japan), Natriumhyaluronat (TCI, Tokyo, Japan), Beta-Glucan (SK Bioland, Cheonan, Korea), Phenoxyethanol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), Caprylylglykol (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Korea) und Ethylhexylglycerin (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Korea) wurden zur Herstellung des kosmetischen Produkts mit Oleanolsäure verwendet. HPLC-Grad Acetonitril wurde von Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA) bezogen. Dreifach destilliertes Wasser wurde verwendet, und andere Lösungsmittel und Reagenzien waren EP- und GR-Qualität. Crlori:SKH1-hr haarlose weibliche Mäuse wurden von OrientBio (Seongnam, Korea) gekauft.

HPLC-Analyse

Oleanolsäure wurde mit einer Shimadzu LC-30 Serie HPLC (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) analysiert. Eine Kromasil 100 C18 250 mm × 4,6 mm, 5 µm, analytische Säule (Teknokroma, Barcelona, Spanien) wurde bei Raumtemperatur verwendet. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril und Wasser (85:15, v/v), die Flussrate betrug 1 mL/min, und das Injektionsvolumen 10 µL. Oleanolsäure wurde bei UV λ = 210 nm detektiert. Alle Messungen erfolgten bei Raumtemperatur [17].

Löslichkeits- und Formulierungsoptimierungsstudie

Eine abgewogene Menge Oleanolsäure wurde zu einem Lösungsvermittler gegeben, bei 60 °C 48 h gerührt und 5 min mit einem Ultraschallreiniger soniziert. Die Suspension wurde bei 2000 U/min mit einer Universal 320R Zentrifuge (Hettich, Tuttlingen, Deutschland) zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt. Anschließend wurde der Überstand durch einen 0,45 µm PVDF-Membranfilter (Whatman, Kent, UK) filtriert. Die Löslichkeit von Oleanolsäure im entsprechenden Lösungsvermittler wurde durch Subtraktion des Gewichts der verbleibenden Feststoffe von der Summe der Anfangsgewichte von Oleanolsäure und Lösungsvermittler geschätzt (Tabelle 1).

Die Formulierungsoptimierungsstudie wurde mit Poloxamer 188, Poloxamer 407, Tween 60 und Tween 80 durchgeführt. Verschiedene Verhältnisse amphiphiler Polymere und Tenside wurden wie in Tabelle 2 zusammengefasst ausprobiert. Jeweils Oleanolsäure und Capryol® 90 wurden abgewogen, über 60 °C erhitzt und gerührt, bis klare Lösungen beobachtet wurden. Die in Tabelle 2 gezeigten Polymere/Tenside wurden dann zur klaren Lösung gegeben und über 60 °C gerührt, bis klare Lösungen beobachtet wurden. Die Lösungen wurden dann in destilliertem Wasser dispersiert (Abb. 1). Die resultierende Lösung wurde etwa 48 h belassen, und dann wurde eine visuelle Inspektion durchgeführt, um die optimale Formulierung auszuwählen. Die Ergebnisse der visuellen Inspektionen jeder Formulierung in Tabelle 2, einschließlich Beobachtungen von Ausfällung, Phasentrennung, Transparenz und Gelierung, sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Herstellung der polymerischen Mizellen von Oleanolsäure

Polymerische Mizellen von Oleanolsäure (PMO) wurden mit den Formulierungen G und H aus Tabelle 2 unter Verwendung der in Abb. 1 gezeigten Methode hergestellt. PMO-G und PMO-H wurden für nachfolgende Experimente verwendet und PMO-H in den kosmetischen Produkten für die klinischen Studien.

Färbetest

Die polymerische Mizellbildung bei Dispersion der Formulierung G oder H in Wasser wurde durch visuelle Beobachtung, d. h. Transparenz, bestätigt. Die PMO-Bildung (PMO-G oder PMO-H) wurde auch durch einen Färbetest bestätigt. Methylenblau wurde den Gemischen aus Wasser und Capryol® 90, Wasser, Capryol® 90, PMO-G und PMO-H zugesetzt und die Farbe der Lösungen visuell beobachtet und fotografiert.

Partikelgrößenmessung

Die ELS-Technik (elektrophoretische Lichtstreuung) misst Schwankungen der Streuintensität von den Partikeln als Funktion der Zeit, wenn die Partikel sowohl zufällige Brownsche Bewegung als auch orientierte elektrophoretische Bewegung in einem gut definierten elektrischen Feld zeigen. Die partikuläre elektrophoretische Mobilität wird mit der ELS-Technik gemessen [18] und erlaubte die Bewertung der Partikelgröße sowohl von PMO-G als auch PMO-H mittels eines elektrophoretischen Lichtstreuungsspektrophotometers (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Japan).

Rasterelektronen-Kryomikroskopie (Cryo-SEM) Analyse

Kryogene Rasterelektronenmikroskopie oder Rasterelektronen-Kryomikroskopie (Cryo-SEM) ist eine leistungsstarke Technik zur Visualisierung des Zustands der Mikro- oder Nanostruktur kolloidaler Polymer-Suspensionen oder -Dispersionen nach deren Immobilisierung durch Schockgefrieren und Frakturierung für die Bildgebung. Der Bruch wird bei −196 °C, dem normalen Siedepunkt von flüssigem Stickstoff und weit unter der Glastemperatur sowohl von Volumen- als auch vollständig koaleszierten Partikeln, hergestellt und untersucht. Cryo-SEM-Bilder offenbaren eine Reihe von Reaktionen der Partikel auf Brüche, die an ihnen vorbeilaufen durch Eis [19]. Rasterelektronen-Kryomikroskopie (Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Probenvorbereitungssystem) wurde verwendet, um die Form der PMOs zu beobachten.

Einkapselungseffizienz

Die Einkapselungseffizienz der Oleanolsäure-polymeren Mizellen wurde evaluiert. PMO wurde 15 min bei 2000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt und per HPLC analysiert. Die Einkapselungseffizienz wurde berechnet als die Menge an Oleanolsäure in den polymerischen Mizellen geteilt durch die Menge an Oleanolsäure, die initial während der PMO-Herstellung zugegeben wurde (mg).

$$ \mathrm{Einkapselungseffizienz}\ (\%) = \frac{\mathrm{Menge\ an\ Oleanolsäure\ in\ polymeren\ Mizellen\ (mg)}}{\mathrm{Menge\ an\ Oleanolsäure\ initial\ zugegeben\ (mg)}} \times 100 $$

Stabilität von PMO-H

Die physikalische Stabilität von PMO-H wurde durch Lagerung bei 40 °C für 3 Monate evaluiert. Farbveränderungen, Phasentrennung, Vorhandensein von Ausfällungen und Trübungsveränderungen wurden visuell bewertet. PMO-H-Proben, die in regelmäßigen Zeitintervallen entnommen wurden, wurden per HPLC analysiert, um die verbleibenden Mengen an Oleanolsäure zu bestimmen, und mit einem ELS-Z, um die PMO-H-Partikelgröße zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Abb. 9 dargestellt.

In-vitro-Hautpermeationstest

Eine In-vitro-Hautpermeationsstudie wurde mit einer Franz-Diffusionszelle durchgeführt, um die Verbesserung der Hautpermeation von Oleanolsäure zu untersuchen. Der Test wurde an PMO-G, PMO-H, dem Gemisch aus Oleanolsäure und Tween 80 dispers in destilliertem Wasser, und dem Gemisch aus Oleanolsäure und Propylenglykol dispers in destilliertem Wasser durchgeführt. Die Haut einer 6 Wochen alten weiblichen haarlosen Maus wurde in Stücke der erforderlichen Größe geschnitten. Vertikale Franz-Zellen wurden verwendet, und die Haut wurde zwischen den beiden Kammern mit dem Stratum corneum nach oben fixiert. 330 µL der ausgewählten Formulierung wurde auf die Haut aufgebracht und die Franz-Zellen mit Parafilm abgedeckt. Der Rezeptor wurde mit PBS-Lösung (pH 7,4) und Ethanol im Verhältnis 9:1 (v/v) gefüllt. Die Rezeptorlösung wurde bei jedem Probenahmezeitpunkt mit frischer PBS-Lösung nachgefüllt. Proben wurden nach 2, 4, 6, 8, 10, 20 und 24 h entnommen und per HPLC analysiert. Nach 24 h wurde die überschüssige Formulierung auf der Haut mit Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Australien) entfernt. Die in der Permeationsstudie verwendete Haut wurde mit PBS-Lösung gereinigt und die in der Haut verbleibende Oleanolsäure per HPLC gemessen. Alle Permeationsexperimente wurden in Triplicate durchgeführt.

Statistik der Studie

Die Experimente wurden in drei unabhängigen Wiederholungen durchgeführt, und die Ergebnisse dieser Studie wurden als Mittelwert ± SD angegeben. Die statistische Analyse wurde durch unabhängigen t-Test verifiziert, und der Wert p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ampullenherstellung mit PMO-H

Für den klinischen Test wurde PMO-H als Testprodukt verwendet. PMO-H, gereinigtes Wasser, Dinatrium-EDTA, Allantoin, Dipropylenglykol, Propanediol, Carbomer und PEG/PPG/Polybutylenglykol-8/5/3 Glycerin wurden hinzugefügt und 10–15 min mit einem Magnetrührer gerührt, dann wurde Kaliumhydroxid hinzugefügt und die Mischung weitere 5–10 min gerührt. Nachdem die Inhaltsstoffe homogen gemischt waren, wurden Natriumhyaluronat und Beta-Glucan hinzugefügt und weitere 2–5 min gerührt, und dann Phenoxyethanol, Propanediol, Caprylylglykol und Ethylhexylglycerin hinzugefügt und 2–5 min gerührt. Die finale Formulierung wurde als Testprodukt in eine Ampulle gefüllt. Die Ampullen-Luftblasen wurden vor Testverwendung mit einem Vakuumtrockenschrank entfernt. Ein Kontrollprodukt wurde nach derselben Methode für das Testprodukt hergestellt, außer dass Oleanolsäure weggelassen wurde.

Humananwendungstests

Human-Hautreizstudie

Ein Hautpflastertest des kosmetischen Produkts, das PMO-H in einer Ampulle enthielt, wurde an 25 männlichen und weiblichen Probanden im Alter von 22 bis 56 Jahren durchgeführt, die einer menschlichen Hautreizstudie zugestimmt hatten. Jede Testsubstanz wurde auf den Oberarm getropft und mit einem Pflaster fixiert. Das Pflaster wurde 24 h angebracht und der Reizgrad wurde von 2 Fachkräften 30 min, 24 h und 48 h nach Pflasterentfernung gemäß den Kriterien der International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG) beobachtet.

Klinische Studie zur Faltenverbesserung

Polymerische Mizellen mit Oleanolsäure in Ampullenform als finales Produkt wurden 8 Wochen lang im Augenbereich von 23 weiblichen Probandinnen im Alter von 30 bis 65 Jahren angewendet, die einer Faltenverbesserungsstudie zugestimmt hatten. Die Probandinnen erfüllten die Einschlusskriterien und keine der Ausschlusskriterien und stimmten der Humananwendungstudie zu. Das Doppelblindverfahren wurde von sowohl Forschern als auch Testprobanden befolgt. Der Test wurde 8 Wochen durchgeführt, und die Evaluation erfolgte alle 4 Wochen. Das Doppelblindverfahren und die Randomisierung wurden verwendet. Testprodukt und Kontrolle wurden getrennt zufällig entweder auf die linke oder rechte Gesichtshälfte desselben Probanden aufgetragen. Fünf Parameter wurden alle 4 Wochen über 8 Wochen mittels optischer Profilometrie mit Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Köln, Deutschland) bewertet—mittlere Rauheit (R3) war der primäre Endpunkt, und die vier Parameter Hautrauheit (R1), maximale Rauheit (R2), Glättetiefe (R4) und arithmetisches Mittel der Rauheit (R5) waren die sekundären Endpunkte. Zu- oder Abnahmen der fünf Parameter im gleichen Bereich des Probanden wurden über die Zeit gemessen, und die Mittelwerte der Zu- oder Abnahmen der fünf Parameter wurden berechnet und zwischen Kontroll- und Testproduktbehandlung verglichen. Zusätzlich wurde eine visuelle Beobachtung der Haut durch Fachkräfte durchgeführt. Fotografien der Augenfalten wurden mit Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Suwon, Korea) aufgenommen. Die Kriterien zur Bestimmung der visuellen Bewertungswerte sind in Abb. S1 gezeigt, und die visuellen Ergebnisse werden in Abb. 13 präsentiert. Die Parameter wurden mit gepaartem t-Test bei 95 % Vertrauenswürdigkeit verglichen und analysiert [20-25].

Ergebnisse und Diskussion

Bestimmung von Lösungsvermittler, Tensid und Polymer

Die Löslichkeit von Oleanolsäure in biokompatiblen Lösungsvermittlern, speziell Tensiden und Polymeren, ist in Tabelle 1 dargestellt. Oleanolsäure neigt dazu, in hydrophoben Ölen mit niedrigem hydrophil-lipophilem Gleichgewicht (HLB) löslich zu sein. Capryol® 90 hat einen etwas höheren HLB-Wert im Vergleich zu allgemeinen Ölen [26]. Dennoch zeigt Oleanolsäure relativ hohe Löslichkeit in Capryol® 90. Zudem kann Capryol® 90 leicht als innerer Kern von Mizellen stabilisiert werden [27]. Nach Auswahl von Capryol® 90 wurden verschiedene Arten von Tensiden oder Poloxameren für den Schalenanteil der Oleanolsäure-Mizellen gescreent [27-30]. Die in Tabelle 2 gezeigten Oleanolsäure-Mizellenzusammensetzungen sind jene, die unmittelbar nach Verdünnung mit destilliertem Wasser transparent waren. Allerdings waren einige Zusammensetzungen instabil und durchliefen innerhalb von 24 h Ausfällung, Phasentrennung oder Gelierung. Repräsentative Bilder von ausgefällten, phasentrennten, transparenten Flüssigkeits- und Gelzuständen sind in Abb. 2 gezeigt. Der Endzustand jeder Formel ist in Tabelle 3 zusammengefasst. Zusammensetzungen G und H blieben auch nach 24 h transparent. Obwohl Zusammensetzung I klar blieb, war es ein Gel statt einer Flüssigkeit. Zusammensetzungen A bis D wurden nach 24 h trüb mit Ausfällung. Angesichts dieser Ergebnisse wurden Zusammensetzungen G und H für die weitere Entwicklung ausgewählt.

Eigenschaften der polymerischen Mizellen von Oleanolsäure

Die Strukturen der polymerischen Mizellen von Oleanolsäure wurden durch Färbetest untersucht. Abb. 3 zeigt die Bilder des Gemischs aus Capryol® 90 und destilliertem Wasser, Capryol® 90, destilliertem Wasser, und den polymerischen Mizellen der Zusammensetzung G (PMO-G) und Zusammensetzung H (PMO-H), nach Zugabe von Methylenblau zur Lösung. Für das Gemisch aus Capryol® 90 und destilliertem Wasser trat klare Phasentrennung auf. Ausfällung von Methylenblau wurde im Fall von Capryol® 90 beobachtet. Destilliertes Wasser wurde nach Zugabe von Methylenblau dunkelblau. PMO-G und PMO-H wurden ebenfalls blau, was anzeigt, dass die polymerischen Mizellen aus einem öligem inneren Kern und einer wässrigen äußeren Schale bestanden. Mit anderen Worten, ein amphiphiles Polymer, Poloxamer 407 in den Zusammensetzungen G und H, dient als äußere Schale und hilft, die polymerischen Mizellen von Oleanolsäure erfolgreich zu bilden, indem der innere Kern aus Capryol® 90 mit Oleanolsäure eingekapselt wird [31].

Partikelgröße, Größenverteilung und Form können gute Indikatoren für die Vorhersage der physikalischen Stabilität von Mizellformulierungen sein. Die durchschnittliche Partikelgröße von PMO-G betrug 80,4 nm, und die von PMO-H 57 nm (Abb. 4). Die Histogramme von PMO-A, G und H sind in Abb. 5 dargestellt, um die durch den Phasenzustand beeinflussten Größenverteilungen zu vergleichen. Wie in Tabelle 3 gezeigt, ist PMO-A aufgrund von Ausfällung trüb, und PMO-G und H sind transparent. Die Partikelgröße von PMO-A beträgt mehr als 100 nm, und PMO-A zeigt eine breitere Größenverteilung als PMO-G und H (Abb. 5). PMO-H zeigt eine schmalere Partikelgrößenverteilung als PMO-G und weist eine für kosmetische Produkte geeignete Fließfähigkeit auf.

Die Einkapselungseffizienz für sowohl PMO-G als auch PMO-H lag bei 99 bis 100 %, was anzeigt, dass fast 100 % der Oleanolsäure im inneren Kern der PMO eingekapselt war (Abb. 6).

Die Form von PMO-G und PMO-H wurde mittels Rasterelektronen-Kryomikroskopie (Cryo-SEM) untersucht. Cryo-SEM zeigte, dass sowohl PMO-G als auch PMO-H kugelförmige polymerische Mizellen waren. Allerdings waren PMO-H polymerische Mizellen in Größe und Form konsistenter als PMO-G polymerische Mizellen (Abb. 7).

In-vitro-Hautpermeationsstudie von PMO

Die Gesamtmenge an Oleanolsäure, die in der Haut verblieb, und die Gesamtmenge an Oleanolsäure, die als Funktion der Zeit durch die Haut permeierte, wurden mit der Haut einer 6 Wochen alten weiblichen haarlosen Maus gemessen. Vier verschiedene Formulierungen, PMO-G, PMO-H, das Gemisch aus Oleanolsäure und Tween 80 dispers in destilliertem Wasser (OTw), und das Gemisch aus Oleanolsäure und Propylenglykol dispers in destilliertem Wasser (OPG) wurden hinsichtlich der Hautpermeationseffizienz von Oleanolsäure verglichen. Die Gesamtmengen an Oleanolsäure, die nach 24 h durch die Haut permeierten, betrugen 29,49 ± 4,00 % für PMO-H, 21,39 ± 5,91 % für PMO-G, 13,66 ± 0,81 % für OTw und 5,90 ± 2,47 % für OPG. Wie in Abb. 7 gezeigt, war die erste Detektion von Oleanolsäure sowohl bei PMO-G als auch PMO-H nach 8 h möglich, während die erste Detektion bei OTw nach 10 h und bei OPG nach 20 h möglich war. Die Anteile an Oleanolsäure, die in der Haut verblieben, betrugen 56,22 ± 13,50 % für PMO-H, 36,74 ± 0,72 % für PMO-G, 27,44 ± 7,02 % für OTw und 26,28 ± 5,42 % für OPG. PMO-H zeigte die größte Menge sowohl an durch die Haut permeierter Oleanolsäure als auch an in der Haut verbliebener Oleanolsäure (Abb. 8). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PMOs schneller und mehr permeieren können als Formulierungen, die keine Mizellen bilden.

Stabilität flüssiger Oleanolsäure-polymerer Mizellen

Basierend auf den Charakterisierungs- und In-vitro-Permeationsstudien wurde PMO-H schließlich für die Ampullenherstellung ausgewählt. Vor der Ampullenherstellung wurde die Stabilität von PMO-H evaluiert. Für die Stabilitätsstudie wurde PMO-H in Fläschchen unter beschleunigten Stabilitätsbedingungen bei 40 °C/75 % r.F. für 3 Monate gelagert. Ausfällung, Phasentrennung, Farbveränderungen und Transparenz wurden dann visuell evaluiert. Der Anteil an Oleanolsäure wurde dann per HPLC gemessen, und Änderungen der Partikelgröße wurden ebenfalls überprüft. Die Stabilität wurde über die Zeit kontrolliert. PMO-H blieb transparent ohne Ausfällung oder Phasentrennung, und seine Farbe änderte sich 3 Monate lang unter den beschleunigten Stabilitätsbedingungen nicht. Der Anteil an Oleanolsäure gemessen per HPLC und die Partikelgrößenänderungen über die Zeit sind in Abb. 9 dargestellt. Der Oleanolsäure-Anteil blieb über 98 %, und die Partikelgröße von 49,6 ± 5 nm blieb während des 3-monatigen Stabilitätsstudienzeitraums fast konstant. Diese Ergebnisse zeigen, dass PMO-H physikalisch und chemisch 3 Monate lang unter beschleunigten Stabilitätsbedingungen stabil ist.

Klinischer Test

Humanreiztest

Vor der klinischen Studie wurde ein Humanreiztest an 25 gesunden weiblichen und männlichen Freiwilligen im Alter von 22–56 Jahren durchgeführt. Das Testprodukt wurde 24 h auf den Oberarm der Probanden aufgepflastert, und der Hautreizindex wurde 30 min, 24 h und 48 h nach Pflasterentfernung gemessen. Reizungen wurden mit der kosmetischen Ampullenformulierung mit PMO-H nach 1 h oder 48 h nach Pflasterentfernung nicht beobachtet.

Klinische Studie

Die klinische Studie wurde an 23 weiblichen Probandinnen im Alter von 30–65 Jahren mit Falten um die Augen durchgeführt; abzüglich 3 Aussteiger schlossen 20 Probandinnen die Studie ab, indem sie sowohl das Testprodukt, die PMO-H-Ampulle, als auch die Kontrolle getrennt auf die linke oder rechte Gesichtshälfte für 8 Wochen auftrugen. Hautveränderungen wurden gemäß fünf Parametern bewertet—mittlere Rauheit (R3) als primärer Endpunkt, und vier zusätzliche Parameter als sekundäre Endpunkte, nämlich Hautrauheit (R1), maximale Rauheit (R2), Glättetiefe (R4) und arithmetisches Mittel der Rauheit (R5). Der visuelle Bewertungswert fügte einen weiteren sekundären Endpunkt hinzu. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Der primäre Endpunkt R3 hatte nach 4 Wochen Testproduktanwendung um 0,673 % abgenommen und nach 8 Wochen Anwendung statistisch signifikant um 7,835 % abgenommen (p = 0,006). Bei Kontrollanwendung hatte R3 nach 4 Wochen um 5,127 % zugenommen und nach 8 Wochen statistisch signifikant um 9,971 % zugenommen (p = 0,010). Der Unterschied im R3-Wert zwischen den mit Testprodukt behandelten Bereichen und denen mit Kontrolle war nach 8 Wochen Anwendung statistisch signifikant (p = 0,000), aber nicht nach 4 Wochen, vielleicht aufgrund von Interindividueller Variation (Abb. 10).

Die Analyse des sekundären Endpunkts R1 zeigte, dass der Wert nach 4 Wochen Testproduktanwendung um 4,629 % abgenommen und nach 8 Wochen statistisch signifikant um 9,973 % abgenommen hatte (p = 0,017). Bei Kontrollanwendung hatte R1 nach 4 Wochen um 8,037 % und nach 8 Wochen um 4,799 % zugenommen. Der Unterschied in den R1-Werten zwischen den Bereichen mit Testprodukt und Kontrolle war nach 4 Wochen nicht statistisch signifikant, aber nach 8 Wochen (p = 0,024). Der sekundäre Endpunkt R2 hatte nach 4 Wochen Testproduktanwendung um 1,048 % und nach 8 Wochen um 5,803 % abgenommen. Bei Kontrollanwendung hatte er nach 4 Wochen um 7,261 % und nach 8 Wochen um 9,536 % zugenommen. Der Unterschied im R2-Wert zwischen den mit Testprodukt behandelten Bereichen und denen mit Kontrolle war nach 8 Wochen statistisch signifikant (p = 0,016), aber nicht nach 4 Wochen. Der sekundäre Endpunkt R4 hatte nach 4 Wochen Testproduktanwendung signifikant um 8,594 % (p = 0,039) und nach 8 Wochen um 9,747 % abgenommen. Bei der Kontrolle hatte R4 nach 4 Wochen um 10,764 % und nach 8 Wochen um 3,491 % zugenommen. Interessanterweise war der Unterschied im R4-Wert zwischen den Bereichen mit Testprodukt und Kontrolle nach 4 Wochen statistisch signifikant (p = 0,008), aber nicht nach 8 Wochen. Der sekundäre Endpunkt R5 hatte nach 4 Wochen Testproduktanwendung um 6,333 % und nach 8 Wochen um 8,556 % abgenommen. Der Unterschied im R5-Wert zwischen den Bereichen mit Testprodukt und Kontrolle war weder nach 4 noch nach 8 Wochen statistisch signifikant.

Die Analyse des weiteren sekundären Endpunkts, der visuellen Faltenbewertung, zeigte, dass der visuelle Bewertungswert nach 4 Wochen Testproduktanwendung um 2,917 % abgenommen und nach 8 Wochen statistisch signifikant um 8,333 % abgenommen hatte (p = 0,034). Bei Kontrollanwendung hatte der visuelle Bewertungswert nach 4 Wochen um 1,667 % und nach 8 Wochen um 4,167 % zugenommen. Der Unterschied des visuellen Bewertungswerts zwischen den mit Testprodukt behandelten Bereichen und denen mit Kontrolle war nach 8 Wochen statistisch signifikant (p = 0,046), aber nicht nach 4 Wochen.

Zusammenfassend zeigte die Analyse des gefalteten Augenbereichs, dass der Unterschied im primären Endpunktwert R3 zwischen den mit Testprodukt und Kontrolle behandelten Bereichen nach 8 Wochen Anwendung statistisch signifikant war. In Bezug auf die sekundären Endpunkte hatten alle Werte nach Testproduktanwendung abgenommen und nach Kontrollanwendung zugenommen. Der Unterschied in den R4-Werten zwischen den mit Testprodukt und Kontrolle behandelten Bereichen war nach 4 Wochen statistisch signifikant, aber die Unterschiede der R1- und R2-Werte nur nach 8 Wochen (Abb. 11). Der visuelle Bewertungswert durch Fachkräfte zeigte, dass alle durchschnittlichen visuellen Bewertungswerte für Falten nach 4 und 8 Wochen Testproduktbehandlung im Vergleich zur Kontrolle abgenommen hatten (Tabelle 5). Der Unterschied im visuellen Bewertungswert zwischen den mit Testprodukt und Kontrolle behandelten Bereichen war nach 8 Wochen statistisch signifikant (Abb. 12). Insgesamt zeigte sich laut allen Endpunkten, dass die kosmetische Formulierung mit PMO-H als Hauptbestandteil nach 8-wöchiger Anwendung zur Faltenverbesserung beitrug (Abb. 13).

Schlussfolgerungen

Tenside sind häufig verwendete Hilfsstoffe in kosmetischen Produkten zur Verbesserung der Löslichkeit schlecht löslicher Materialien. Ein Vorbehalt wäre die in das Produkt eingebrachte Menge. Tenside sollten in ausreichender Menge zugesetzt werden, um schlecht lösliche Materialien ohne Ausfällung zu lösen. Aus Sicherheitsgründen sollte nur eine minimale Menge zugesetzt werden. Mizellenformulierungen könnten die Lösung für dieses Problem sein. Die in dieser Studie entwickelten polymerischen Mizellen von Oleanolsäure verbessern die Löslichkeit von Oleanolsäure mit minimaler Tensidmenge und erhöhen die Permeation von Oleanolsäure durch die Haut. Stabile polymerische Mizellen von Oleanolsäure wurden mit Capryol 90 und Poloxamer entwickelt. Die in dieser Studie entwickelten polymerischen Mizellen von Oleanolsäure waren stabil, d. h., sie zeigten keine Ausfällung, Phasentrennung oder Degradation bei 40 °C nach 3 Monaten. Die klinische Studie zeigte, dass die Oleanolsäure in der polymeren Mizellenformulierung als Hauptwirkstoff wirksam zur Linderung menschlicher Falten ist. Basierend auf diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass Oleanolsäure, die in Wasser schlecht löslich ist und daher in nativer Form nicht als Hauptbestandteil zur Linderung von Hautfalten verwendbar ist, in anwendbare polymerische Mizellen formuliert werden kann. Darüber hinaus wird erwartet, dass die in dieser Studie entwickelten polymerischen Mizellen von Oleanolsäure sich als sehr nützlich zur Linderung menschlicher Falten erweisen und breit in kosmetischen Anwendungen einsetzbar sein werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht anwendbar

Abkürzungen

PMO:

Polymerische Mizellen von Oleanolsäure

PEG:

Polyethylenglykol

TRANSCUTOL P:

Hochgereinigtes Diethylenglykolmonoethylether

LABRASOL:

PEG-8 Capryl/Caprinsäure-Glyceride

LAUROGLYCOL FCC:

Propylenglykolmonolaurat (Typ I, Monoester >45 %)

LABRAFAC:

Capryl/Caprinsäure-Triglycerid

Capryol® 90:

Propylenglykolmonocaprylat (Typ II, Monoester >90 %)

Capryol™ PGMC:

Propylenglykolmonocaprylat (Typ I, Monoester >55 %)

EDTA:

Ethylendiamintetraessigsäure

ELS:

Elektrophoretische Lichtstreuung