Verbesserte Antitumorwirksamkeit und Pharmakokinetik von Bufalin durch PEGylierte Liposomen

Hintergrund

Krebserkrankungen sind von enormer globaler Bedeutung, da die jährlich ansteigende Population von Krebspatienten bis 2020 um die Hälfte wachsen könnte [1]. Aufgrund der Existenz der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und der Multidrug-Resistenz ist der Gliomtumor eine der lebensbedrohlichsten Erkrankungen ohne klinisch wirksame Therapeutika [2]. Bufalin wurde aus Venenum Bufonis . isoliert und identifiziert , das sind die Sekrete der Haut und der Ohrspeicheldrüsen der Kröte Bufo bufo gargarizans Cantor oder Bufo melanostictus Schneider [3]. Es wurde über starke pharmakologische Wirkungen berichtet, einschließlich kardiotonischer, antiviraler, immunregulierender und insbesondere antitumoraler Wirkungen [4,5,6,7]. Die schlechte Löslichkeit erschwert jedoch die Dispergierung in der wässrigen Lösung und schränkt die Anwendung ein [8].

Liposomen wurden als ein neues Wirkstoffabgabesystem angesehen, um die schlechte Löslichkeit von Wirkstoffen in wässriger Lösung zu verbessern, die Bioverfügbarkeit zu erhöhen, die therapeutische Effizienz zu erhöhen und die Nebenwirkungen zu reduzieren [9]. Vor allem kann es hilfreich sein, wenn Wirkstoffe die BBB passieren und zum Gehirn gelangen [10]. Einer der Hauptnachteile der liposomalen Formulierung ist jedoch ihre schnelle Clearance aus dem Blut aufgrund der Absorption von Plasmaprotein an die Phospholipidmembran der Liposomen, die anschließend die Erkennung und Aufnahme in die Liposomen durch das mononukleäre phagozytäre System auslöst. Glücklicherweise kann diese Art von Phagozytose träge sein, wenn Polyethylenglycol (PEG) auf der Oberfläche von Liposomen modifiziert wird. Daher ist es notwendig, mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen als lang zirkulierende Liposomen zu untersuchen, um ihre Wasserlöslichkeit zu erhöhen und ihre Pharmakokinetik zu verbessern [11].

Studien zur Pharmakokinetik von Bufalin wurden bisher noch wenig beachtet. Einige Berichte konzentrieren sich nur auf die Pharmakokinetik von freiem Bufalin in wässriger Lösung per os-Verabreichung. In der vorliegenden Studie haben wir PEGylierte Liposomen als Abgabesystem für Bufalin entwickelt und den pharmakokinetischen Unterschied zwischen bufalinbeladenen PEGylierten Liposomen, bufalinbeladenen Liposomen und Bufalin-Einheit in wässriger Lösung durch intravenöse Verabreichung an Ratten verglichen.

Methoden

Chemikalien und Reagenzien

Bufalin (≥ 98 % Reinheit) wurde von BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (Baoji, Shaanxi, China) bezogen. L-α-Phosphatidylcholin, Cholesterin und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz; DSPE-PEG₂₀₀₀ ) wurden von Sigma Chemical Co., Ltd. (St. Louis, MO, USA) erworben (die Summenformeln dieser Substanzen sind in Zusatzdatei 1:Abbildung S1) dargestellt. Das verwendete Acetonitril war von spektroskopischer Qualität und wurde von Honeywell (Amerika) bezogen. Chloroform und Alkohol (analytische Qualität) wurden von Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (China) bezogen. Alle Chemikalien waren von analytischer oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Qualität. Und das Wasser wurde mit einem Millipore-Wasserreinigungssystem (Milford, MA, USA) entionisiert und mit einer 0,22-μm-Membran gefiltert.

Tiere und Zellen

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Fourth Military Medical University (Shaanxi, China) genehmigt (Zulassung 2015-1013-R). Alle Operationen wurden unter Natriumpentobarbital-Narkose durchgeführt, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden zu minimieren. Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem anfänglichen Gewicht von 250 ± 20 g wurden von der Fourth Military Medical University (Xi'an, China) bezogen. Die Zelllinien SW620, PC-3, MDA-MB-231, A549, U251, U87 und HepG2 wurden jeweils von der Shanghai Cell Bank oder dem Experimental Animal Center der Fourth Military Medical University bezogen, kultiviert in RPMI 1640, ergänzt mit 10 % ( v /v ) fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Antibiotika (100 E/ml Penicillin G und 0,1 mg/ml Streptomycin). Die Zellen wurden in ihrer exponentiellen Wachstumsphase in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ . gehalten und 90 % relative Luftfeuchtigkeit bei 37 °C.

Synthese von Bufalin-beladenen Liposomen

Liposomen wurden in einer Chargengröße von 10 ml unter Verwendung von Hochdruckhomogenisierung hergestellt. Die verwendete Menge an Bufalin war in allen Liposomen gleich. Kurz gesagt wurden mit Bufalin beladene gewöhnliche Liposomen mit einer Zusammensetzung aus Bufalin, Cholesterin und L-α-Phosphatidylcholin in einem Molverhältnis von 10:30:60 hergestellt; Mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen wurden mit einer Zusammensetzung aus Bufalin, Cholesterin, L-α-Phosphatidylcholin und DSPE-PEG₂₀₀₀ . synthetisiert in einem Molverhältnis von 10:30:55:5.

Die obigen Phospholipidmischungen wurden in 3 ml Chloroform vollständig dispergiert und dann wurde das Chloroform durch einen Rotationsverdampfer bei 50 °C unter Dekompressionsbedingungen vollständig verdampft. Anschließend wurde das restliche Lösungsmittel (falls vorhanden) getrocknet, indem es über Nacht in einen Vakuumexsikkator gegeben wurde, und dann wurde der hergestellte trockene dünne Film unter Verwendung von Vortex in 10 ml vorgewärmtem 50 °C entionisiertem Wasser mit 10 mmol/ml Phospholipid 15 min lang rehydratisiert. Die so entstandene Mischung wurde unter Hochdruckhomogenisierung weiterverarbeitet. Der Homogenisierungsdruck und die Homogenisierungszeit wurden optimiert und betrugen 500 bar bei 35 °C, und der Prozess wurde 10 Mal recycelt. Die resultierende Liposomensuspension wurde sofort mit einem Lipex-Extruder (ATS, Kanada) zweimal unter Verwendung von Polycarbonatmembranen (0,2 &mgr;m Porengröße, Whatman, Maidstone, UK) extrudiert, um unilamellare Liposomen zu bilden. Eine leere liposomale Suspension wurde auch nach dem gleichen Verfahren wie zuvor beschrieben hergestellt, indem der Schritt der Zugabe von Bufalin weggelassen wurde.

Charakterisierung von Bufalin-beladenen Liposomen

Partikelgröße und Zeta-Potenzial

Die Partikelgröße und Zeta Potenzial der Liposomen wurden durch dynamische Lichtstreuungstechnik unter Verwendung des Zeta . bestimmt Potentialanalysator (Delsa™ Nano, Beckman Coulter, Kalifornien, USA). Alle Bufalin-Liposomen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine geeignete Konzentration verdünnt, bevor die Größenverteilung und Zeta . bestimmt wurden Potenzial. Die Messungen wurden im vollautomatischen Modus durchgeführt.

Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie

Die Bufalin-Liposomen wurden weiter mit hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopie (HR-TEM)-Studien charakterisiert. Die auf einem 300-Mesh-Kupfergitter getragene Liposomensuspension von Bufalin wurde mit 1% (w /v ) Phosphorwolframsäure. Die direkte Abbildung der Morphologie wurde bei 200-kV-Beschleunigungsspannungen unter Verwendung eines TEM (Hitachi H-7650, Tokio, Japan) durchgeführt.

Einschlusseffizienz

Der Bufalin-Gehalt wurde durch das HPLC-Verfahren analysiert. Das Shimadzu HPLC-System (Kyoto, Japan) war mit einer LC-20AT-Pumpe, einem SPO-M20A-Diodenarray-Detektor, einem CTO-10AS VP-Säulenofen und einem SIL-10AF-Autosampler ausgestattet. Alle Trennungen wurden auf einer SinoChrom ODS-BP C18-Säule (250 mm × 4,6 mm, 5 μm, Yillite) (Yillite, Dalian, China) durchgeführt. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl und der Säulenausfluss wurde bei 296 nm überwacht. Die Daten wurden mit der ClassVP-Software erfasst und verarbeitet. Die mobile Phase bestand aus einer Mischung aus Acetonitril:0.1% Kaliumdihydrogenphosphat (mit Phosphorsäure zur Einstellung des pH-Wertes von 3.8) mit Gradientenelution (50:50, v /v ). Die Chromatographie wurde mit einer Flussrate von 1,0 ml/min durchgeführt. Zur Bestimmung der Einschlusseffizienz wurde 1,0 ml Liposomensuspension von Bufalin auf die Sephadex G50-Säule gegeben und mit PBS eluiert. Der bläuliche Teil des Abwassers wurde gesammelt und durch Zugabe von PBS auf 10,0 ml (das Endvolumen) aufgefüllt. Der Betrag (W ₁ ) von Bufalin in der liposomalen Suspension wurde durch HPLC-Methode bestimmt. PBS wurde in die andere Portion der 1,0 ml Liposomensuspension von Bufalin gegeben, um das Endvolumen von bis zu 10,0 ml zu erreichen, und die Menge (W ₂ ) des enthaltenen Bufalins wurde auf die gleiche Weise bestimmt. Der Prozentsatz an in den Bufalin-Liposomen eingeschlossenem Bufalin wurde nach der Formel berechnet:

In-vitro-Stabilitätsstudie

Die Einschlusseffizienz, die mit der Sephadex-Chromatographiemethode getestet wurde, und die Partikelgröße, die mit Zeta . bestimmt wurde Potenzialanalysatoren wurden angewendet, um das Stabilitätsprofil nach Lagerung bei 4 °C an den Tagen 0, 7, 15, 30 und 90 zu bewerten. Zu den fünf Zeitpunkten wurden 200 μl Liposomensuspension zur Bestimmung des liposomalen Leckageverhältnisses angesaugt. Sofort wurde freies Bufalin von 200 μl Liposomensuspension mittels Sephadex G50-Säulenchromatographie aufgetrennt und die Menge an freiem Bufalin wurde durch die HPLC-Methode bestimmt. Das liposomale Leckageverhältnis wurde nach der Formel berechnet:

In-vitro-Freisetzung von Bufalin

Das in-vitro-Freisetzungsverhalten von Bufalin aus Liposomen wurde unter Verwendung der Dialysebeuteltechnik bei 37 °C durchgeführt, wie zuvor mit einigen Modifikationen beschrieben. Als Freisetzungsmedium wurde PBS (pH = 7,4) mit 10 % fötalem Kälberserum verwendet. Der freie Wirkstoff wurde aus den Bufalin-Liposomen durch erschöpfende Dialyse für 4 h gegen PBS-Puffer bei 4 °C entfernt. Kurz gesagt wurde 1,0 ml einer Liposomensuspension von Bufalin in ein Dialyseröhrchen (Spectrumlabs, USA; MWCO 30 kDa) unter leichtem horizontalem Schütteln (120 U/min/min) bei Raumtemperatur pipettiert. Das Dialyseröhrchen wurde in 50 ml PBS (pH = 7,4) aufbewahrt, das 10 % fötales Kälberserum enthielt, und die Temperatur wurde bei 37 °C gehalten. Das Dialysat wurde aus dem Medium abgezogen und durch ein gleiches Volumen an frischem PBS zu unterschiedlichen Zeitdauern ersetzt, d.h. Stunden 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 und 48. Die Konzentration des freigesetzten Bufalins wurde wie zuvor beschrieben durch HPLC gemessen.

Zytotoxizität

In-vitro-Zytotoxizitätsstudien wurden mit dem MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay an verschiedenen Arten von Tumorzelllinien durchgeführt, darunter SW620, PC-3, MDA-MB- 231, A549, U251, U87 und HepG2. Darüber hinaus wurden U87- und U251-Zellen ausgewählt, um zytotoxische Wirkungen von bufalinbeladenen Liposomen und bufalinbeladenen PEGylierten Liposomen auf Gliomtumorzellen zu messen. U87- und U251-Zellen wurden jeweils in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 1,0 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Vertiefung und haften lassen (37 °C, 5 % CO₂ .) ) für 24 h, wonach das Medium abgesaugt und durch 0,1 ml frisches Medium ersetzt wurde. Bufalin-Einheit, leere Liposomen, leere PEGylierte Liposomen, mit Bufalin beladene Liposomen und mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen wurden zu einem vollständigen Medium verdünnt und den Zellen in einem Gesamtvolumen von 0,1 ml zugegeben, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen; zur Kontrolle wurde keine Testlösung zugegeben. Die leeren Liposomen und die leeren PEGylierten Liposomen wurden bewertet, um die Toxizität von Exzipienten zu testen, die bei der Herstellung von Bufalin-Liposomen verwendet wurden. Nach 24 h wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Inkubation in einem Wachstumsmedium mit 5 mg/ml MTT für 4 h bei 37 °C bewertet. Nach dem Absaugen des Kulturmediums wurden die gebildeten Formazan-Kristalle mit 200 μl organischem Lösungsmittel solubilisiert. Die Extinktion wurde auf einem Mikroplatten-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen.

Pharmakokinetische In-vivo-Studie von Bufalin-Liposomen mit HPLC-Methode

Die pharmakokinetische Studie wurde durchgeführt, um die Absorption, Verteilung, den Metabolismus und die Ausscheidung von Bufalin aus gewöhnlichen Liposomen oder lang zirkulierenden Liposomen zu bewerten und die Unterschiede in der Bioverfügbarkeit von Bufalin mithilfe der HPLC-Technik herauszufinden.

In diesem Experiment wurden junge, gesunde erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250 ± 20 g von der Fourth Military Medical University (Xi'an, China) gekauft. Die Ratten wurden in gut belüfteten Käfigen bei Raumtemperatur (24 ± 2 °C) und 40–60 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem regelmäßigen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Tiere wurden vor dem Experiment mindestens 3 Tage akklimatisiert. Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierethikkommission der Vierten Militärmedizinischen Universität durchgeführt.

Bufalin-beladene Liposomen, Bufalin-beladene PEGylierte Liposomen und Bufalin in wässriger Suspension unterstützte Solubilisierung durch Ethanol wurden wie zuvor beschrieben hergestellt und dann in einer äquivalenten Dosis von 0,5 mg/kg intravenös verabreicht. Blutproben wurden aus der Fossa orbitalis wein von Ratten unter leichter Ethernarkose in Mikrozentrifugenröhrchen entnommen, die Heparin als Antikoagulans enthielten, 2, 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 600 min nach dosiert und dann bei 3500 U/min für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das abgetrennte Plasma wurde vor dem Assay bei -20 °C gefroren gelagert.

Probenvorbehandlung

Zur Extraktion von Bufalin und internem Standard aus Rattenblut wurde ein einfaches Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren befolgt. Zu 200 μl wurde eine interne Standardlösung (20 μl 100 μg/ml Cinobufagin-Arbeitsbestand) entsprechend 10,0 μg zugegeben und 10 s lang auf einem Cyclomixer gemischt, gefolgt von einer Extraktion mit 3,0 ml Ethylacetat:Petrolether, 1:1(v /v ) und Mischung. Die Mischung wurde 5 Minuten lang gevortext, gefolgt von einer Zentrifugation für 15 Minuten bei 4000 U/min auf Sigma 3-16k (Frankfurt, Deutschland). Ein Aliquot von 3,0 ml der organischen Schicht wurde abgetrennt und unter Stickstoff zur Trockne eingedampft, und dann wurde der Rückstand in 200 μl Acetonitril wieder aufgelöst. Zwanzig Mikroliter der überstehenden Flüssigkeit wurden zur Analyse nach 15-minütiger Zentrifugation bei 12.000 U/min auf eine analytische Säule injiziert.

Pharmakokinetische Analyse

Die beobachtete maximale Blutkonzentration (C _max ) und die Halbwertszeit (T _1/2 ) wurden durch visuelle Untersuchung der experimentellen Daten erhalten. Die Daten wurden einer nicht-kompartimentellen Pharmakokinetik-Analyse unter Verwendung von Drug and Statistics (DAS 2.1.1) unterzogen, die vom mathematisch-pharmakologischen Fachausschuss der Chinesischen Pharmakologischen Gesellschaft für die klinische Bewertung von Arzneimitteln herausgegeben wurde. Die Daten wurden nach einem offenen Zwei-Kompartiment-Modell analysiert.

Statistische Analyse

Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert  ± SD (n = 3), und die Unterschiede zwischen den Formulierungen wurden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit der Software GraphPad Prism 5 verglichen. P < 0,05 bedeutet in allen Fällen Signifikanz.

Ergebnisse

Physikochemische Eigenschaften

Zur Herstellung von bufalinbeladenen Liposomen und bufalinbeladenen PEGylierten Liposomen wurde Filmrehydratation kombiniert mit Hochdruckhomogenisierungstechnologie verwendet. Die Filmrehydratisierung ist eines der herkömmlichen Verfahren zur Synthese von Liposomen mit ausgereiften und kontrollierten Verfahren, um lipophile Arzneimittel einzuschließen. Außerdem spielt die Anzahl der Homogenisierungszyklen eine Schlüsselrolle, um eine einheitliche und stabile liposomale Suspension zu erreichen.

Die Morphologien von Bufalin-beladenen Liposomen und Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen sind entweder fast kugelförmig oder oval, wie durch TEM beobachtet, wie in Abb. 1 gezeigt. Gemäß dem TEM-Bild sind die mittleren Partikelgrößen von Bufalin-beladenen Liposomen und Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen lagen beide unter 200 nm. Die mittleren Partikelgrößen der mit Bufalin beladenen Liposomen und der mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen betrugen 127,6 ± 3,64 nm bzw. 155,0 ± 8,46 nm (Abb. 1c), gemessen mit Zeta Potentialanalysator (Delsa™ Nano, Beckman Coulter, Kalifornien, USA). Im Vergleich zu mit Bufalin beladenen Liposomen wiesen mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen eine negative Oberflächenladung auf, was auf eine ausgezeichnete Stabilität hindeutet (mit Bufalin beladene Liposomen 2,24 mV; mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen -18,05 mV, Zusatzdatei 2:Tabelle S1). Darüber hinaus sind die Verteilungen von Zeta Potenzial ist in Abb. 1b zu sehen. Die Einschlusseffizienz von Bufalin in bufalinbeladenen Liposomen und in bufalinbeladenen PEGylierten Liposomen, bestimmt durch HPLC, beträgt jedoch 76,31 ± 3,40 % bzw. 78,40 ± 1,62 %.

Physikochemische Eigenschaften von Bufalin-beladenen Liposomen und Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen. a TEM-Bilder von bufalinbeladenen Liposomen und bufalinbeladenen PEGylierten Liposomen mit nahezu kugelförmiger oder ovaler Form. b Die typische Partikelgröße und Verteilung von Bufalin-beladenen Liposomen und Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen, gemessen durch dynamische Lichtstreuung. c Die typische Oberfläche Zeta Potenzial von bufalinbeladenen Liposomen und bufalinbeladenen PEGylierten Liposomen

In-vitro-Stabilitätsstudie

Die Stabilitätsprofile der mit Bufalin beladenen Liposomen und der mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Darüber hinaus wurde auch das liposomale Leckageverhältnis berechnet. Für mit Bufalin beladene Liposomen waren die Ergebnisse 0,0, 16,7, 25,2, 27,9 bzw. 30,6 % bei 4 °C an den Tagen 0, 7, 15, 30 und 90. Für mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen waren die Ergebnisse jeweils 0,0 , 5,0, 8,8, 14,5 und 18,0 % bei 4 °C an den Tagen 0, 7, 15, 30 und 90.

In-vitro-Freisetzungsprofil

Das Freisetzungsprofil von Bufalin aus mit Bufalin beladenen Liposomen oder mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen ist in Abb. 2 zusammengefasst. Aus den experimentellen Daten konnte Bufalin in denselben Auflösungsmedien schnell ohne Einschränkungen in PBS diffundieren, die 10 % fötales Kälberserum enthielt, gefolgt von Bufalin -beladene Liposomen und zuletzt mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen.

In-vitro-Freisetzung von Bufalin aus mit Bufalin beladenen gewöhnlichen Liposomen und mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen in einem Lösungsmedium Phosphatpuffer, pH 7,4. Daten sind Mittelwerte ± SD, n = 3

Zytotoxizität

Die Zelllebensfähigkeit verschiedener Arten von Tumorzelllinien, die von der Bufalin-Einheit betroffen sind, sind in Abb. 3a gezeigt, wenn sie durch den MTT-Assay getestet wurden, und ihre halbmaximale Hemmkonzentration (IC₅₀ ) werden auch in Zusatzdatei 2 berechnet:Tabelle S2. Bufalin verursachte dosisabhängig die Wachstumshemmung mehrerer Tumorzellen, während die Ergebnisse von IC₅₀ zeigten, dass Bufalin empfindlicher auf U251- und U87-Gliom-Krebszellen reagierte als die anderen getesteten Krebszellen. Bei Anwendung mit Bufalin-Einheit, mit Bufalin beladenen Liposomen und mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen sind die Zelllebensfähigkeiten von U251, die durch den MTT-Assay durchgeführt wurden, in Abb. 3b gezeigt. Bei einer Kultivierung für 12 Stunden zeigten sich die Zelllebensfähigkeiten der Bufalin-Einheit, der mit Bufalin beladenen Liposomen und der mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen unterschiedlich, während sich die der leeren Liposomen und der leeren PEGylierten Liposomen nicht änderten. Wie beschrieben, waren die Zelllebensfähigkeiten von U251 in der Gruppe mit den mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen bei der gleichen Konzentration immer niedriger als die in der Gruppe mit den mit Bufalin beladenen Liposomen; Inzwischen waren die Auswirkungen der Bufalin-Einheit auf die Lebensfähigkeit der Zellen minimal.

In-vitro-Zytotoxizität von leeren Liposomen, leeren PEGylierten Liposomen, Bufalin-Einheit, Bufalin-beladenen Liposomen und Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen gegen Tumorzellen. a Zelllebensfähigkeit verschiedener Arten von Tumorzelllinien bei verschiedenen Konzentrationen der Bufalin-Einheit. b Zelllebensfähigkeit von U251-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen von leeren Liposomen, leeren PEGylierten Liposomen, Bufalin-Einheit, mit Bufalin beladenen Liposomen und mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen

Pharmakokinetische In-vivo-Studie

Methodenvalidierung

Die Kalibrierungskurve wurde basierend auf einer linearen Regressionsanalyse der Einwände gegen das Peak-Flächen-Verhältnis des internen Standards (y ) versus Konzentrationen (x , μg/ml) Bufalin in der Standardlösung in sieben verschiedenen Konzentrationen. Regressionsgleichung war y = 0.4238 x + 0,2429 (linearer Bereich 0,05–10,0 μg/ml) und Korrelationskoeffizienten (R ² ) waren 0,9965. Die Nachweisgrenze (LOD) betrug 0,01 μg/ml, die als Menge der injizierten Probe berechnet wurde, die ein Signal-Rausch-Verhältnis von 3 (S/N .) ergab = 3).

Spezifität, Präzision und Wiederfindung

Der Grad der Interferenz durch körpereigene Substanzen wurde durch Inspektion von Chromatogrammen aus aufbereiteten Plasmablindproben beurteilt. Zusätzliche Datei 3:Abbildung S2 zeigt typische Chromatogramme von Blindplasma, Blindplasma mit Bufalin, Blindplasma mit Bufalin und Resibufogenin (als interner Standard), Plasmaproben mit Resibufogenin 30 Minuten nach intravenöser Verabreichung der Bufalin-Einheit, Plasmaproben mit Resibufogenin 30 Minuten nach intravenöser Verabreichung von Bufalin-beladenen Liposomen und Plasmaproben, die 30 Minuten nach intravenöser Verabreichung von Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen mit Resibufogenin versetzt wurden. Bufalin und Resibufogenin wurden bei ungefähr 7,191 bzw. 10,131 min eluiert. Bei der Retentionszeit von Bufalin oder internem Standard wurden keine Peaks von störenden und Liposomenmembranmaterialien gefunden. Die Ergebnisse der Präzisions- und Wiederherstellungstests sind in Tabelle 2 dargestellt.

Pharmakokinetik

Die Blutkonzentrations-Zeit-Profile von Bufalin-beladenen Liposomen, Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen und ihr Vergleich mit der Bufalin-Einheit in wässriger Suspension sind in Abb. 4 dargestellt. Die mittleren pharmakokinetischen Parameter sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass signifikante Unterschiede in den meisten dieser Parameter unter ihnen, und die C _max der mit Bufalin beladenen Liposomen war geringer als die der Bufalin-Einheit, während die der mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen am geringsten war. Außerdem ist das T _1/2z Das Verhältnis von Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen zu Bufalin-Einheiten und Bufalin-beladenen Liposomen zu Bufalin-Einheiten betrug etwa das 2,15-Fache (87,84 min/40,52 min) (P < 0,01) und 1,34-fach (54,40 min/40,52 min) (P <0,05) bzw. Die AUC_{(0–t )} Das Verhältnis von Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen zu Bufalin-Einheit und Bufalin-beladenen Liposomen zu Bufalin-Einheit betrug etwa das 5,49-fache (139.157,83 ng/(ml min)/25.334,27 ng/(ml min)) (P < 0,01) und 2,28-fach (57.751,88 ng/(ml min)/25.334,27 ng/(ml min)) (P < 0,01) bzw. Es zeigte sich, dass die Bufalin-Einheit schnell im Blutkreislauf eliminiert wurde und die Liposomenpräparation die Wirkstoffkonzentration im Plasma erhöhte und der Clearance standhielt. Darüber hinaus könnte eine Modifikation von PEG diesen Effekt unterstützen.

Konzentrations-Zeit-Kurve von Bufalin im Plasma bei Ratten

Diskussion

In dieser Studie wurden mit Bufalin beladene Liposomen und mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen erfolgreich durch das Homogenisierungsfilm-Rehydratationsverfahren hergestellt, die beide einen optimalen Größenbereich und eine geringe Polydispersität aufwiesen und leicht in einer großen Chargengröße reproduziert werden konnten. Diese Studie ergab, dass die liposomale Formulierung die Löslichkeit von Bufalin stark verbessert.

Mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen zeigten eine negative Oberflächenladung mit einem größeren Absolutwert als die mit Bufalin beladenen Liposomen mit einer positiven Oberflächenladung. Die Zeta Das Potenzial wird hauptsächlich durch die Oberflächeneigenschaften bestimmt. Die unmodifizierten mit Bufalin beladenen Liposomen waren neutral und ihre Potenziale lagen im Allgemeinen innerhalb von ± 5 mV. Allerdings wird DSPE unter neutralen Bedingungen nicht geladen, aber der Herstellungsprozess kann nicht vollständig neutral sein, daher ist DSPE negativ geladen. Inzwischen ist die Zeta Das Potenzial des Makromoleküls PEG ist für einige Millivolt ungefähr negativ, nahe dem neutralen negativen Potenzial. Daher nach der Oberflächenmodifizierung von DSPE-PEG₂₀₀₀ auf mit Bufalin beladenen Liposomen die Zeta Potenzial von Bufalin-beladenen PEGylierten Liposomen ist negativ. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Oberflächenmodifikation von DSPE-PEG₂₀₀₀ verändert die elektrischen Oberflächenpotentiale von Liposomen, was ihre Stabilität erhöht. Es wurde durch in-vitro-Stabilitätstests bestätigt. Liet al. [12] verwendeten ein Liposomen-Co-Delivery-System, das Anti-CD40-mAbs an die Oberfläche von mit Bufalin umhüllten PEGylierten Liposomen koppelte. Die Liposomen wurden mit einer Zusammensetzung aus Bufalin, Cholesterin, EPC, DSPE-PEG₂₀₀₀ . synthetisiert , und DSPE-PEG₂₀₀₀ -Mal in einem Molverhältnis von 20:55:5:5:15. Dann wurde der monoklonale Anti-CD40-Antikörper an die Liposomen durch die Maleimid-Thiol-Reaktion zur Herstellung von an Bufalin-Liposomen verankertem Anti-CD40 konjugiert. Bezüglich des Stabilitätsprofils sei nur erwähnt, dass die negative Oberflächenladung ohne klare und eindeutige Datenbeschreibung eine ausgezeichnete Stabilität suggeriert.

Liet al. [13] stellten ein Bufadienolid-beladenes Liposom (BU-Lipo) her, das aus Lipoid E-80® 1,25% und Cholesterin 0,06 % bestand. Die Einschlusseffizienzen von Bufalin, Cinobufagin und Resibufogenin betrugen 86,5, 90,0 bzw. 92,1 %. In Anbetracht der Stabilität der Phospholipide wurde pH 6,5 für die BU-Lipo-Formulierung gewählt. Die Eigenschaften von BU-Lipo, wie pH, PSD, Zeta Potenzial und Einschlusseffizienz änderten sich mindestens 3 Monate lang bei 2–8 °C nicht. Die Lagerbedingungen mussten jedoch streng kontrolliert werden. Eine stabilere Zubereitung bei neutralem pH-Wert muss untersucht werden, um die Transport- und Lagerkosten zu reduzieren, die für die zukünftige klinische Anwendung berücksichtigt werden sollten.

Entsprechend der Zubereitungsformulierung der vorherigen Studien haben wir die Experimente mit Bufalin-beladenen Liposomen repliziert. Die Stabilität der Liposomen konnte jedoch die Produktionsanforderungen nicht erfüllen.

In der vorliegenden Studie wurden mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen mit einer Zusammensetzung aus Bufalin, Cholesterin, L-α-Phosphatidylcholin und DSPE-PEG₂₀₀₀ . synthetisiert in einem Molverhältnis von jeweils 10:30:55:5. Insbesondere vor der Extrusion mit einem Lipex-Extruder unter Verwendung von Polycarbonat-Membranen wurde die so entstandene Mischung mit Hochdruckhomogenisierung weiterverarbeitet.

Bei Lagerung in neutralem pH bei 4 °C für 3 Monate nahmen die Partikelgrößen beider Liposomen leicht zu und die Einschlusseffizienz nahm insgesamt leicht ab, was für die klinische Anwendung geeignet ist. Ein TEM-Foto zeigte, dass eine dicke dreidimensionale wolkenartige Struktur die Oberfläche der mit Bufalin beladenen Liposomen bedeckte, was darauf hindeutet, dass DSPE-PEG₂₀₀₀ spielt aufgrund seiner amphiphilen linearen Polymerstruktur eine Rolle bei der sterischen Stabilisierung.

Eine In-vitro-Freisetzungsstudie ergab, dass die Freisetzung von Bufalin aus mit Bufalin beladenen Liposomen und mit Bufalin beladenen PEGylierten Liposomen in denselben Auflösungsmedien verzögert war, während die Bufalin-Einheit schnell und ohne Einschränkungen in PBS diffundierte. Die Oberflächenmodifikation von DSPE-PEG₂₀₀₀ veränderten die Barriereeigenschaften der wässrigen Grenzschicht und die Permeabilität der Membran, was zu einer geringen Freisetzungsgeschwindigkeit von Bufalin aus Liposomen führte.

Regarding cytotoxicity study, bufalin caused an obvious inhibition of growth in multiple tumor cells in a dose-dependent manner, while the results of IC₅₀ indicated that bufalin was more sensitive to U251 and U87 glioma cancer cells than the other kinds of cancer cells, respectively. Moreover, we found that the blank liposome and blank PEGylated liposome were not toxic to cells, revealing the safety of excipients to some degree, whereas the bufalin-loaded liposomes and bufalin-loaded PEGylated liposomes showed concentration-dependent toxicity to U251 glioma cells. In addition, bufalin-loaded PEGylated liposomes showed slightly weaker cytotoxicities compared with bufalin-loaded liposomes and free bufalin. It is assumed that free bufalin was slowly released from bufalin-loaded PEGylated liposomes during incubation. And the release rate of bufalin was slower in bufalin-loaded PEGylated liposomes than bufalin-loaded liposomes. All the results might suggest that after internalization in the cells, free bufalin could be released from bufalin-loaded PEGylated liposomes and induce the apoptosis of U251 glioma cells.

The pharmacokinetic study found that significant differences of pharmacokinetic parameters among bufalin-loaded PEGylated liposomes, bufalin-loaded liposomes, and free bufalin entity did exist. After intravenous administration, free bufalin entity was swiftly cleared in the bloodstream with the highest peak concentration, whereas liposome preparation did obviously increase the drug concentration in plasma and withstood the clearance. Moreover, the surface modification of PEG could facilitate this effect. These results had provided us some information for understanding the properties of bufalin on pharmacokinetics and pharmacodynamics.

As common primary intracranial tumors, 70% of glioma tumors were malignant, including astrocytoma and glioblastoma. The micro environment of the network of glioma was composed of tumor cells, immune cells and various cytokines secreted by them, which was complex and made glioma cells intracranial metastatic easily [2]. Therefore, operations are difficult to perform, and the incomplete surgery excision commonly resulted in the poor prognosis. To these patients, radiotherapy and chemotherapy play key roles in their treatments. Nowadays, the applications of three-dimensional conformal radiation therapy and intensity-modulated radiation therapy technology can not only increase precision, dosage and efficacy, but also reduce damage in cancer therapy, so as to improve their living quality. However, the accurate radiotherapy has great risk because of the particularity of brain tissues and brain functions. Hence, medication of chemotherapeutics is relatively instrumental in glioma cancer treatment, whereas most malignant and highly aggressive glioma tumors have high relapse rates due to BBB and drug resistance [14].

Consequently, selecting a highly sensitive drug to brain glioma and making it penetrate the BBB are becoming emerging scientific subjects to resolve.

In recent years, the researches concerning bufalin have been studied in various aspects, including pharmacology, pharmacodynamics, and pharmaceutics [12, 15,16,17,18,19,20]. Fortunately, some studies found that bufalin had a broad antitumor spectrum. It was sensitive to several kinds of tumor cell lines, including lung cancer, liver cancer, melanoma, and glioma cancer. However, low solubility, heavy toxicity, and short half-life led to a narrow therapeutic index by intravenous administration and easy decomposition by oral administration, which restricted clinical application of bufalin [6]. In addition, bufalin had been reported to be hydrophobic and could only dissolve in some suspending agent or auxiliary solvent including ethanol and tween 80, which might result in some toxic effects [21].

Nevertheless, as a new drug delivery system, the liposomal formulation was considered to be a low-toxic technology with considerable potential for encapsulating lipophilic drugs [12, 22]. Some studies showed that liposome could be easier to enter tumor focus by the process of phagocytosis. Meanwhile, the vascular endothelial cell gaps in the tumor lesion was enlarged, which enhanced this process (enhanced permeability and retention effect, EPR effect) [23, 24]. Moreover, the liposome could sustain releasing antitumor agents so as to extend action time, improve drug efficacy, and decrease adverse reaction [25]. Thus, liposome formulation has a wide prospect to encapsulate antitumor agents [9].

In the previous experiments, we found that the combination chemoimmunotherapy of anti-CD40 plus bufalin by liposomal carriers could enhance anticancer therapeutic efficacy while reducing systemic toxicity, due to the confined biodistribution and prolonged release of cargo [12]. In the present study, we found that bufalin entity has a broad spectrum of anticancer activity. It could inhibit the proliferation of several kinds of tumor cells, such as lung, liver, breast, and glioma cancer cells. As an active traditional Chinese monomer, bufalin is a promising anticancer drug. It was expected to be applied to further clinical study. However, anti-CD40 mAbs has not been approved as a pharmaceutical excipient by the FDA. The toxicity and side effect of anti-CD40 mAbs is still unclear to this day.

Nevertheless, the shortcomings of conventional liposome were obvious in the meantime. Lack of membrane stability, easy oxidation of phospholipid materials, and opsonification of plasma proteins limited its application [26, 27]. By surface-modifying DSPE-PEG₂₀₀₀ on bufalin-loaded liposomes, bufalin-loaded PEGylated liposomes extended its blood circulation, prolonged half-life, and expanded the therapeutic window for glioma.

Therefore, we adjusted the formulation of bufalin-loaded PEGylated liposomes. On this basis, we evaluated the physicochemical properties and comprehensive characterizations both in vitro and in vivo. We characterized pharmacokinetic properties of bufalin-loaded PEGylated liposomes and compared this type of liposome with raw bufalin and non-PEGylated liposomes. Our results revealed the unknown PK properties of this type of liposomes, which will be useful to recommend dosage in a further clinical study.

Our subjects lack some tissue distribution experiments in animals, so it is not known how the liposome formulation altered the distribution of bufalin in the body. Further studies with more experiments are needed.

Conclusions

The present study demonstrated that the solubility, antitumor efficacy, and pharmacokinetics of bufalin-loaded PEGylated liposomes are improved compared with those of bufalin entity. The results suggested that PEGylated liposomal bufalin has the potential to be a good drug delivery system for glioma cancer.