Kohlenstoff-Quantenpunkt-Platin-Porphyrin-Komposit: Dual-funktionales Theranostikum für verbesserte photodynamische Krebstherapie

Zusammenfassung

Photosensibilisatoren (PS) sind notorisch hydrophob, was ihre klinische Nützlichkeit in der photodynamischen Therapie (PDT) limitiert. Um dies zu überwinden, entwickelten wir einen neuartigen theranostischen Nanoagenten, CQDs@PtPor, durch elektrostatische Bindung eines tetraplatinierten Porphyrin-Komplexes (PtPor) an negativ geladene Kohlenstoff-Quantenpunkte (CQDs). Umfassende Charakterisierung (XRD, TEM, XPS, FTIR) bestätigte die erfolgreiche Assemblierung von CQDs und PtPor zu einer einzelnen Nanostruktur. Spektroskopische Analysen enthüllten effizienten Resonanzenergietransfer von CQDs zu PtPor, was in deutlich verbesserter Singulettsauerstoff (¹O₂) Produktion resultierte. In-vitro-Studien an HeLa-Zellen demonstrierten, dass CQDs@PtPor überlegene Phototoxizität im Vergleich zu freiem PtPor erreichte, während vernachlässigbare Dunkelzytotoxizität auftrat, was sein Potenzial als sichere und effektive Krebs-Therapieplattform unterstreicht.

Hintergrund

PDT hat sich als nicht-invasive Strategie zur Behandlung von Hauterkrankungen, Makuladegeneration und verschiedenen Krebsarten etabliert ^[1]. Die Therapie basiert auf lichtaktivierten PS, die bei Bestrahlung reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugen und Tumorzellen selektiv abtöten, während gesundes Gewebe verschont wird ^[2-6]. Obwohl aktivierbare PS wie Porphyrin- und Phthalocyanin-Derivate duale Rollen in Bildgebung und Therapie spielen können, wird ihre klinische Translation durch schlechte wässrige Löslichkeit, lang anhaltende kutane Photosensitivität, begrenzte Gewebedurchdringung und suboptimale Absorption jenseits von 700 nm behindert ^[7-11]. Verschiedene Nanoträger – Liposomen, polymere Nanopartikel, Gold-Nanopartikel, Kohlenstoffnanoröhren, Graphen und Kohlenstoff-Quantenpunkte (CQDs) – wurden erforscht, um PS-Verabreichung und -Leistung zu verbessern ^[12-22].

CQDs, eine vielseitige Klasse von Kohlenstoff-Nanomaterialien, zeigen außergewöhnliche optische Eigenschaften, hohe Wasserlöslichkeit, niedrige Toxizität, ausgezeichnete Biokompatibilität und einfache Oberflächenfunktionalisierung ^[23-27]. Ihre reichlichen Oberflächengruppen ermöglichen die kovalente oder nicht-kovalente Anbindung von Medikamenten, Proteinen oder Targeting-Liganden, was sie zu attraktiven Trägern für theranostische Anwendungen macht ^[31-33]. Vorherige Studien demonstrierten, dass CQDs, konjugiert mit PS (z. B. Ce6, ZnPc, TMPyP), Fluoreszenzbildgebung und photodynamische Wirksamkeit durch Energietransfermechanismen verbessern können ^[34-36].

Kürzlich zeigte ein tetraplatinierter Porphyrin-Komplex niedrige Dunkelzytotoxizität, aber IC₅₀-Werte von nur 19 nM bei 420-nm-Bestrahlung, was potente antikrebsaktive Wirkung anzeigt ^[37]. Seine Hydrophobie und begrenzte Biokompatibilität schließen jedoch klinische Anwendung aus. Wir entwarfen daher CQDs@PtPor, um CQDs' Löslichkeit und Oberflächenchemie zu nutzen, während PtPor's therapeutische Potenz beibehalten wird. Die elektrostatische Assemblierung zwischen dem positiv geladenen PtPor und negativ geladenen CQDs verbessert nicht nur die Wasserdispergierbarkeit, sondern fördert auch Energietransfer, wodurch ¹O₂-Generierung und Phototoxizität amplifiziert werden.

Methoden

Materialien
Trans-Platin-Diammin-Dichlorid (trans-Platin) (Aladdin®), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) (Sigma-Aldrich) und alle Lösungsmittel wurden von Tianjin Fu Chen Chemical Reagents oder Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. bezogen. Alle Reagenzien wurden unverändert verwendet.

Synthese von [Trans-PtCl(NH₃)₂]₄-5,10,15,20-Tetra(4-pyridyl)-Porphyrin-Nitrat

Trans-Platin (0,193 mmol, 58 mg) und AgNO₃ (0,193 mmol, 33 mg) wurden in 5 ml DMF gelöst und 24 h gerührt. Der resultierende weiße AgCl-Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt, was eine klare Lösung ergab. Diese wurde zu einer Suspension von 5,10,15,20-Tetra(4-pyridyl)porphyrin (0,487 mmol, 30 mg) in 3 ml DMF gegeben, gefolgt von Rühren bei 50 °C für 48 h. Nach Abkühlung wurden 10 ml Diethylether zur Fällung des roten Produkts hinzugefügt, das mit Methanol, Dichlormethan und Ether gewaschen wurde. Vakuumtrocknung ergab 81 mg Produkt (86 % Ausbeute). Die Struktur wurde durch ¹H NMR und ESI-MS bestätigt.

Herstellung von CQDs

Zitronensäure (0,45 g) und Ethylendiamin (500 µl) wurden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und hydrothermal bei 200 °C für 5 h in einem PTFE-ausgekleideten Autoklaven behandelt. Die resultierende braun-schwarze Lösung wurde durch Zentrifugation und Dialyse gegen destilliertes Wasser gereinigt, um CQDs zu erhalten.

Herstellung des CQDs@PtPor-Komposits

PtPor (20 mg in 3 ml DMSO) wurde in 12 ml Wasser dispergiert und langsam zu einer CQDs-Suspension (5 mg in 15 ml H₂O) unter Sonikation zugegeben. Das Gemisch wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt, dann durch Zentrifugation gereinigt und 2 Tage dialysiert. Die finale wässrige Lösung wurde bei 4 °C lyophilisiert, um das Komposit zu erhalten.

Quantenausbeutemessung

Die CQD-Quantenausbeute (Φ) wurde relativ zu Chinin-Sulfat (Φ_st ≈ 54 %) mit der Standard-Vergleichsmethode berechnet. Die Absorption wurde bei 360 nm unter 0,1 gehalten, um Reabsorptions-Effekte zu vermeiden.

Singulettsauerstoff-Generierung

Proben (5 mg ml⁻¹) wurden mit 10 mM DPBF in einer 3 ml Küvette gemischt und mit einer 50 W Xenonlampe (500 nm Langpassfilter, 6 mW cm⁻²) bis zu 30 min bestrahlt. Der Abfall der DPBF-Absorption bei 415 nm wurde alle 3 min überwacht, um ¹O₂-Produktion zu quantifizieren. DCFH-Fluoreszenz (λ_em = 525 nm) wurde auch als qualitativer Test verwendet.

Zytotoxizitätsassays

HeLa-Zellen wurden in DMEM mit 5 % FCS, 100 U ml⁻¹ Penicillin und 100 µg ml⁻¹ Streptomycin bei 37 °C, 6 % CO₂ kultiviert. Für Dunkelzytotoxizität wurden Zellen mit variierenden Konzentrationen von CQDs, PtPor oder CQDs@PtPor für 24 h inkubiert, dann durch MTT-Assay bewertet. Für Phototoxizität wurden Zellen nach 24 h Inkubation bestrahlt, und Vitalität wurde erneut durch MTT bestimmt.

Zelluläre Bildgebung

HeLa-Zellen (5 × 10⁴ Zellen ml⁻¹) wurden mit 0,25 mg ml⁻¹ CQDs@PtPor für 1 h inkubiert, gewaschen und per Confokalmikroskopie (Zeiss LSM7 DUO) mit 405 nm Laser abgebildet.

Ergebnisse

Herstellung und Charakterisierung von CQDs@PtPor

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) offenbarte uniforme, monodisperse Partikel: CQDs im Durchschnitt 2,5 nm, während CQDs@PtPor im Durchschnitt 7,6 nm betrug, was PtPor-Absorption widerspiegelt (Abb. 1). XRD-Muster zeigten einen breiten Peak bei ~23°, indikativ für amorphe Kohlenstoffstruktur. FTIR-Spektren bestätigten das Vorhandensein von Hydroxyl-, Amino- und Amidgruppen (Abb. 2b). Dynamische Lichtstreuung (DLS) maß einen mittleren hydrodynamischen Durchmesser von 9,2 nm für CQDs@PtPor, was TEM-Daten bestätigte. Zeta-Potenzial verschob sich von -15,6 mV (freie CQDs) auf +4,5 mV nach PtPor-Konjugation, was elektrostatische Bindung bestätigt (Abb. 3d).

Kohlenstoff-Quantenpunkt-Platin-Porphyrin-Komposit: Dual-funktionales Theranostikum für verbesserte photodynamische Krebstherapie — Abbildung 1. TEM-Bilder (links) und Größenverteilungshistogramme (rechts) von a) CQDs und b) CQDs@PtPor.

Photophysikalische Eigenschaften

UV-Vis-Spektren zeigten charakteristische CQD-Absorption (~360 nm) und Porphyrin-Soret/Q-Banden (~425, 520, 580 nm). CQDs zeigten anregungsabhängige Photolumineszenz (PL) mit Emissionsverschiebung von 460 auf 552 nm über 280-500 nm Anregung und einer Quantenausbeute von 36 %. Im Komposit nahm die PL-Intensität bei 500 nm ab, während die Emission bei 660 nm zunahm, was effizienten Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) belegt. Fluoreszenzlebensdauermessungen bestätigten eine verkürzte Donor-Lebensdauer in CQDs@PtPor, was den Energietransfer weiter unterstützt (Abb. 4).

Verbesserte Singulettsauerstoff-Produktion

DPBF-Abbau-Experimente zeigten, dass CQDs@PtPor signifikant mehr ¹O₂ produzierte als freies PtPor, während CQDs allein vernachlässigbare Aktivität zeigten (Abb. 5a). DCFH-Fluoreszenz bestätigte diese Befunde, wobei CQDs@PtPor das stärkste Signal lieferte (Abb. 5b).

Phototoxizität in HeLa-Zellen

Dunkelzytotoxizitätsassays zeigten >90 % Vitalität bei 50 µg ml⁻¹ für alle Proben (Abb. 6a). Phototoxizitätsassays demonstrierten jedoch eine dosisabhängige Vitalitätsreduktion: CQDs@PtPor bei 50 µg ml⁻¹ erreichte nur 8 % Überleben, überlegen zu PtPor (18 %) und CQDs (90 %) (Abb. 6b). Diese überlegene Wirksamkeit wird auf die durch CQDs vermittelte verbesserte ¹O₂-Generierung zurückgeführt.

Zelluläre Aufnahme und Stabilität

Confokalbildgebung offenbarte, dass CQDs@PtPor vorwiegend im Zytoplasma von HeLa-Zellen lokalisiert war, mit blauer CQD-Fluoreszenz, die rote PtPor-Emission überlagerte, was stabile Komplexbildung nach Aufnahme anzeigte (Abb. 7).

Diskussion

Der ausgeprägte FRET von CQDs zu PtPor, belegt durch reduzierte Donor-Emission und verkürzte Lebensdauer, übersetzt sich direkt in höhere ¹O₂-Produktion und verbesserte Phototoxizität. Die kleine Größe (~10 nm) von CQDs@PtPor erleichtert Tumorakkumulation durch den Enhanced Permeability and Retention (EPR)-Effekt, während verbesserte Wasserdispergierbarkeit und Biokompatibilität systemische Toxizität reduzieren. Die modulare Natur der elektrostatischen Assemblierung ermöglicht einfache Substitution verschiedener PS oder Targeting-Liganden, was CQDs@PtPor als vielseitige Plattform für personalisierte PDT positioniert.

Schlussfolgerungen

Wir haben erfolgreich einen CQDs@PtPor-Nanoagenten hergestellt, der die überlegenen optischen Eigenschaften von CQDs mit der potenten antikrebsaktiven Wirkung eines tetraplatinierten Porphyrins kombiniert. Das Komposit zeigt hohe wässrige Stabilität, niedrige Dunkeltoxizität, effizienten Energietransfer und deutlich verbesserte photodynamische Wirksamkeit in vitro. Diese Attribute machen CQDs@PtPor zu einem vielversprechenden Kandidaten für zukünftige klinische Translation in der Krebstherapie.