Effiziente Nano-Einkapselung neonataler porziner Insel-ähnlicher Zellcluster mittels PEG-block-PLA Polymersomen

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt eine optimierte Methode zur Nano-Einkapselung neonataler porziner Insel-ähnlicher Zellcluster (NPCCs) mit Polymersomen (PSomen) aus Polyethylenglycol-block-polylactid (PEG-b-PLA). Ziel war es, Zellschäden und Zellverlust während der Einkapselung zu minimieren. Durch den Einsatz von N-Hydroxysuccinimid (NHS) am N-Terminus der PSomen wurde die Bindung an Aminogruppen in der extrazellulären Matrix (ECM) der NPCCs vermittelt. Als Reaktionspuffer diente F-10 Kulturmedium mit 0,25 % bovinem Serumalbumin (BSA) bei physiologischem pH 7,3, was im Vergleich zu basischem HBSS-Puffer (pH 8,0) die Morphologie und Vitalität der Zellen signifikant besser erhielt. Zusätzlich wurde die Einkapselungseffizienz durch die Konjugation bifunktionaler PSomen (NHS-/NH₂-PSome) gesteigert, die sowohl an die ECM als auch untereinander kovalent bzw. elektrostatisch vernetzen können. Die Ergebnisse zeigen, dass diese optimierte Nano-Einkapselung die Zellfunktionalität bewahrt und die Ausbeute an transplantierbaren Zellclustern erhöht.

Einleitung

Die allogene Inseltransplantation zur Behandlung von Typ-1-Diabetes scheitert oft an einem Mangel an Spenderorganen. Xenotransplantationen mit Schweineinseln bieten eine Alternative, wobei neonatale porcine Insel-ähnliche Zellcluster (NPCCs) aufgrund ihrer leichteren Isolierung, geringeren Kosten und proliferativen Kapazität nach Transplantation gegenüber adulten Schweineinseln (APIs) bevorzugt werden. Nach Transplantation in menschliche oder nicht-menschliche Primatenportalsysteme führen artspezifische Unterschiede jedoch zu Immunreaktionen wie der instant blood-mediated inflammatory reaction (IBMIR) oder hyperakuten Abstoßung, was zu frühem Transplantatverlust führt.

Einkapselungsstrategien können diese Immunantworten abmildern. Man unterscheidet Makro-, Mikro- und Nano-Einkapselung. Makro-Einkapselung nutzt implantierbare Geräte mit semipermeablen Membranen, Mikro-Einkapselung verpackt kleine Inselgruppen in poröse Kapseln. Beide Ansätze zeigen in vivo Nebenwirkungen wie Membrankollaps oder Thrombusbildung sowie Diffusionsbarrieren für Nährstoffe und Hormone. Nano-Einkapselung hingegen modifiziert die Zelloberfläche durch Anlagerung exogener Proteine – primär Polyethylenglycol (PEG) – und bietet einen minimalinvasiven Schutz.

PEG-basierte Nano-Einkapselung verbessert die physikochemischen Eigenschaften und Wirksamkeit von Zielproteinen. PEG ist aufgrund seiner Biokompatibilität, Nicht-Immunogenität, Antigenmaskierung und Anti-Fouling-Eigenschaften ideal für Zelloberflächenmodifikation. Unter den Nanopartikeln erweisen sich Polymersome (PSome) auf PEG-b-PLA-Basis als besonders geeignet: Sie sind stabil, einfach funktionalisierbar und können sowohl hydrophile als auch hydrophobe Substanzen in ihre Struktur einbauen. Die Oberflächenmodifikation erfolgt über kovalente oder nicht-kovalente Bindung zwischen der ECM der Inseln und funktionalisierten Polymeren.

Bisher wurde als Reaktionspuffer basisches Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, pH 8,0) verwendet, um die NHS-NH₂-Bindung zu begünstigen. Um Zellschäden zu minimieren, ersetzten wir dies durch physiologisches F-10-Medium (pH 7,3), das Standardkulturmedium der NPCCs. Zur Erhöhung der Zellausbeute nach Einkapselung supplementierten wir das Medium mit 0,25 % BSA, das die Kulturgefäßoberfläche beschichtet und Zelladhäsion reduziert. In Vorarbeiten erfolgte die Einkapselung über monofunktionale Gruppen (NHS oder NH₂), deren Bindungsaffinität jedoch mit der Zeit abnahm. Bifunktionale PSome (NHS-/NH₂-PSome) ermöglichen eine Vernetzung untereinander und mit der ECM, was die Stabilität und Effizienz der Nano-Einkapselung erhöht.

Diese Arbeit untersucht die Anwendung der optimierten Nano-Einkapselung für porcine Inselxenotransplantationen.

Material und Methoden

Tiere

Alle Tierexperimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der MGENPLUS Co. Ltd. (#2019–1) genehmigt und entsprechend den Richtlinien durchgeführt. Operationen erfolgten unter Vollnarkose mit minimaler Schmerzentwicklung. Schweine wurden vor der Pankreatektomie getötet.

Isolation neonataler porziner Insel-ähnlicher Zellcluster (NPCCs)

NPCCs wurden von 3- bis 5-tägigen Ferkeln isoliert. Nach Anästhesie (Ketamin 10 mg/kg, Xylazin 1 mg/kg) und Tötung (KCl-Injektion ins Herz) wurde das Pankreas entnommen, in HBSS mit Natriumbicarbonat, HEPES und Antibiotika überführt, in 1–2 mm³ Fragmente zerteilt und 10 min mit Kollagenase Typ V (1 mg/ml) verdaut. Die Verdauung wurde durch kaltes HBSS mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) gestoppt. Nach Filtration (500 µm) und Waschung wurden NPCCs in F-10 Medium mit 0,25 % BSA, Nikotinamid, Glucose, L-Glutamin, CaCl₂, IBMX, Ciprofloxacin und Antibiotika bei 37 °C, 5 % CO₂ für 5 Tage kultiviert, täglich mit 10 nM Exendin-4 supplementiert.

In-vitro-Beurteilung von NPCCs und nano-einkapselten NPCCs

Nach Kultur wurden NPCCs als Inseläquivalente (IEQ) mittels Okularemikrometer gezählt. Vitalität wurde durch Acridinorange/Propidiumiodid-Färbung bestimmt. Für den Glukose-stimulierten Insulinsekretionstest (GSIS) wurden 20–30 NPCCs bei niedriger Glukose (2,8 mM) in KRBB präinkubiert, dann 1 h bei 2,8 mM und 1 h bei 28,0 mM Glukose inkubiert. Überstände wurden auf Insulin per Human/Canine/Porcine Insulin Quantikine ELISA Kit analysiert. Der Stimulationsindex (SI) ergibt sich aus dem Verhältnis der Insulinmengen bei hoher zu niedriger Glukose.

Herstellung von Polymersomen (PSomen)

NHS-PEG-b-PLA oder NH₂-PEG-b-PLA (je 10 mg/ml) wurden in DMSO gelöst. Für bifunktionale PSome wurden beide Copolymeren im gewünschten Verhältnis in DMSO gemischt. Durch Zugabe von destilliertem Wasser auf 1 mg/ml Endkonzentration und 5-minütiger Sonikation bildeten sich PSome. DiD-Farbstoff wurde während der Sonikation zugegeben. Anschließend 3-tägige Dialyse gegen Wasser.

Nano-Einkapselung

PSome wurden in verschiedenen Reaktionspuffern verdünnt: HBSS (pH 7,3 oder 8,0) oder reines F-10 Medium (pH 7,3 oder 8,0), mit/ohne 0,25 % BSA. 10.000 IEQ NPCCs wurden in 6-Well-Platten gegeben, verdünnte PSome zugefügt und 1 h bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubiert. Negative Kontrollen (NC) ohne PSome wurden parallel behandelt. Nach Inkubation wurden nano-einkapselte NPCCs geerntet und in F-10 Medium weiterkultiviert.

Effizienz der Nano-Einkapselung

DiD-markierte PSome an NPCCs wurden per Fluoreszenz- und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) visualisiert. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde mittels ImageJ quantifiziert. Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt.

Polymersom-Permeabilitätsassay

NHS-PSome-einkapselte NPCCs in F-10 oder F-10/0,25 % BSA wurden 2 h mit FITC-dextran verschiedener Molmassen (10, 20, 70, 250 kDa) inkubiert. Penetration wurde per CLSM für jede Molmasse geprüft.

Zellvitalitätstest mit Polymersomen

NHS-PSome-einkapselte THP-1-Zellen (humane monozytäre Zelllinie) in RPMI 1640 wurden 1 h inkubiert. Vitalität wurde per MTT-Assay (iNtRon Biotechnology) bestimmt.

Statistische Analyse

Ungepaarter t-Test mit GraphPad Prism 6.0. Signifikanz: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001.

Ergebnisse

Kultur und funktionelle Beurteilung der NPCCs

Nach 5-tägiger Kultur betrug die Gesamtausbeute 21.014,0 IEQ/g Pankreas. Vitalität (AO/PI) lag bei 89,9 %. GSIS ergab einen durchschnittlichen Stimulationsindex (SI) von 2,3 (Tabelle 1, Zusatzdatei 1: Abb. S1).

Optimale PSome-Konzentration für effiziente Nano-Einkapselung

Zur Bestimmung der optimalen PSome-Konzentration wurden NPCCs mit NHS-PSome (Stock 1 mg/ml) in Verdünnungen 1:5 bis 1:40 (Endkonzentrationen 0,2–0,025 mg/ml) inkubiert. Die MFI von DiD-beladenen PSomen an NPCCs war bei 0,1 mg/ml (1:10) nach 2 Tagen am höchsten (Abb. 1a,b). Alle weiteren Experimente erfolgten mit dieser Konzentration.

Verbesserte Einkapselungseffizienz in F-10 Medium bei physiologischem pH

Standardmäßig erfolgt Nano-Einkapselung in basischem HBSS (pH 8,0) zur Förderung der NHS-NH₂-Bindung. Dies schädigt jedoch NPCCs. Wir verglichen HBSS (pH 7,3/8,0) mit F-10 (pH 7,3/8,0). In F-10 blieb die normale NPCC-Morphologie erhalten (Abb. 2a), und die Einkapselungseffizienz (MFI) war an Tag 0 und 6 signifikant höher als in HBSS, unabhängig vom pH. Obwohl HBSS pH 8,0 am Tag 6 höhere MFI als pH 7,3 zeigte, lag beide weit unter F-10. Daher wurde physiologisches F-10 (pH 7,3) als Standardpuffer für weitere Experimente gewählt.

Erhöhte Ausbeute an NPCCs nach Nano-Einkapselung

Trotz verbesserter Morphologie in F-10 war die Anzahl gewonnener NPCCs nach Einkapselung stark reduziert. Zugabe von 0,25 % BSA zu F-10 während Kultur und Einkapselung steigerte die Ausbeute signifikant. Zunächst prüften wir, ob BSA die Beschichtungseffizienz und selektive Permeabilität (Passage von 10/20 kDa FITC-Dextran, Blockade von 70/250 kDa) beeinträchtigt. CLSM-Bilder zeigten konforme Beschichtung (Abb. 3a, Mitte), selektive Permeabilität blieb erhalten (Abb. 3b, FITC-Dextran), MFI war leicht reduziert (Abb. 3b). Die Ausbeute stieg von 42,3 % (F-10) auf 71,9 % (F-10/0,25 % BSA) (Abb. 3c). Vitalität (NC: 89,5 %, NHS-PSome: 90,3 %) und GSIS (NC: SI 2,1, NHS-PSome: SI 1,6) blieben erhalten (Abb. 4a,b, Zusatzdatei 1: Abb. S2). BSA erhöht also die Zellausbeute ohne Beeinträchtigung von Beschichtung oder Funktion.

Erhöhte Stabilität der Nano-Einkapselung durch Vernetzung von PSomen

Für stabilere Einkapselung wurden bifunktionale PSome (NHS-/NH₂-PSome) eingesetzt. Unterschiedliche Verhältnisse (9:1, 5:5, 1:9) wurden simultan zugegeben. Fluoreszenzmikroskopie zeigte am Tag 0 und 1 keine signifikanten MFI-Unterschiede (Abb. 5a). CLSM offenbarte jedoch: 5:5 überbeschichtet, 1:9 unzureichend, 9:1 konforme Beschichtung (Abb. 5b). Das optimale Verhältnis beträgt somit 9:1. Funktionsprüfungen: Vitalität der 9:1-Gruppe (87,8 %) war signifikant niedriger als NC (92,1 %), aber im Normbereich. SI war normal (3,0 vs. NC 3,7) (Abb. 5c,d).

Diskussion

Typ-1-Diabetes resultiert aus Versagen der pankreatischen β-Zellen. Inseltransplantation ist vielversprechend, aber Spendermangel limitiert allogene Transplantationen. Xenotransplantationen mit Schweineinseln sind Alternative; Schweine sind aufgrund physiologischer Ähnlichkeit, Zuchtbarkeit und pathogenfreier Haltung optimale Spender. NPCCs bieten Vorteile gegenüber APIs: einfachere Isolation, Hypoxieresistenz, in vivo-Proliferation.

Nach Transplantation in Primaten treten IBMIR (durch Gewebefaktoren der Schweineinseln ausgelöst) und hyperakute Abstoßung (durch α-Gal/Nicht-Gal-Antigene) auf, was zu Transplantatverlust führt. Einkapselung schützt vor Antikörper- und Komplementattacken. Makro- und Mikro-Einkapselung haben Nachteile (Fibrose, Diffusionsbarrieren). Nano-Einkapselung nutzt PEGs "Stealth-Effekt", der Interaktion mit Immunzellen blockiert. Unsere Strategie verwendet PEG-b-PLA-PSome, die sowohl hydrophile als auch hydrophobe Substanzen (z. B. Immunsuppressiva, Wachstumsfaktoren) aufnehmen können.

Bisher erfolgte Nano-Einkapselung in basischem HBSS (pH ≥ 8,0) für optimale NHS-NH₂-Bindung. Da dies die Zellen schädigt, testeten wir F-10 Medium (pH 7,3) als puffer, das die NPCC-Kulturbedingungen nachahmt. F-10 bei physiologischem pH zeigte vergleichbare Beschichtungseffizienz und erhielt normale Morphologie (Abb. 2–3). Damit liegt eine Plattform vor, die NPCC-Schäden während Einkapselung minimiert.

Trotz verbesserter Zellmorphologie sank die NPCC-Ausbeute nach Einkapselung in Petrischalen. Literatur zeigt, dass BSA bei Mausinsel-Isolierung und Ratten-Hepatomzellkulturen die Ausbeute steigert. Zugabe von 0,25 % BSA (entsprechend Kulturkonzentration) zum F-10-Puffer erhöhte die Ausbeute signifikant (Abb. 4). Dies ermöglicht Vorhersage und Transplantation der korrekten Zellzahl nach Einkapselung. Zusammenfassend bewirkt F-10 mit 0,25 % BSA: (i) Erhalt normaler Morphologie, (ii) keine Störung der NHS-PSome/ECM-Bindung, (iii) erhöhte Zellausbeute.

Schließlich wurde Stabilität durch Vernetzung bifunktionaler PSome (NHS-/NH₂-PEG-b-PLA) erhöht. Die Konjugation innerhalb eines PSoms vermeidet Störungen durch Homo-Bindung (NHS-NHS, NH₂-NH₂). Konforme Beschichtung bei 9:1-Verhältnis mit erhaltener Vitalität und Funktion (Abb. 5). Weitere Studien zur Quantifizierung der Bindungsstärke und zum Nachweis überlegener Stabilität gegenüber monofunktionalen PSomen sind nötig. Die vorgestellten Bedingungen können für Nano-Einkapselung von NPCC-haltigen Inseln genutzt werden (Zusatzdatei 1).

Fazit

Diese Studie ermittelte eine optimale Nano-Einkapselungsmethode für pankreatische Inseln (NPCCs) mit PEG-basierten Polymersomen (PSomen). Erstens erhält F-10 Kulturmedium (pH 7,3) im Vergleich zu basischem HBSS (pH 8,0) die normale NPCC-Morphologie und minimiert Einkapselungsschäden. Zweitens steigert 0,25 % BSA in F-10 die NPCC-Ausbeute um ca. 1,7-fach. Drittens ermöglicht die Konjugation bifunktionaler PSome (NHS-/NH₂-PSome) stabilere Nano-Einkapselung. Die Methode ist auf PEG-basierte Nanopartikel-inkapselung pankreatischer Inseln übertragbar.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend.

Abkürzungen

DiD:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanin, 4-chlorbenzol-sulfonat-Salz

AO:

Acridinorange

APIs:

Adulte porcine Inseln

BSA:

Bovines Serumalbumin

BF:

Hellfeld

CLSM:

Konfokale Laserscanning-Mikroskopie

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindol

DMSO:

Dimethylsulfoxid

DH₂O:

Destilliertes Wasser

ELISA:

Enzymgebundener Immunabsorptionsassay

FBS:

Fötales Kälberserum

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

GSIS:

Glukose-stimulierte Insulinsekretion

HBSS:

Hanks Balanced Salt Solution

IBMIR:

Instant blood-mediated inflammatory reaction

IEQ:

Inseläquivalent

IBMX:

Isobutylmethylxanthin

KRBB:

Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer

MFI:

Mittlere Fluoreszenzintensität

HEPES:

N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)

NC:

Negative Kontrolle

NPCCs:

Neonatale porcine Insel-ähnliche Zellcluster

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

NHP:

Nicht-menschlicher Primat

PLA:

Polylactid

PEG:

Polyethylenglycol

PSome:

Polymersom

PI:

Propidiumiodid

SI:

Stimulationsindex

TF:

Gewebefaktor