Optimierung der Nanoverkapselung bei neonatalen inselartigen Zellclustern vom Schwein unter Verwendung von Polymersomen

Einführung

Der Einsatz der Allo-Insel-Transplantation zur Behandlung des Typ-1-Diabetes ist mangels geeigneter Spender limitiert. Stattdessen nimmt die Verwendung von tierischen Inseln bei der Xeno-Insel-Transplantation allmählich zu, wobei Schweine als optimale Spenderarten auftauchen [1]. Wenn Schweine während der Transplantation als Spender verwendet werden, können je nach Alter der Schweine separate Inseln verwendet werden. Aufgrund ihrer Erschwinglichkeit und einfachen Isolierung werden neonatale porcine inselähnliche Zellcluster (NPCCs) häufig gegenüber adulten porcinen Inseln (APIs) bevorzugt. Darüber hinaus können sich NPCCs nach der Transplantation allmählich vermehren und ihre Funktion in vivo verlängern [1, 2]. Wenn NPCCs jedoch in die Pfortader von Menschen oder nicht-menschlichen Primaten (NHP) transplantiert werden, können Variationen zwischen den Spezies Immunreaktionen wie eine sofortige blutvermittelte Entzündungsreaktion (IBMIR) oder eine hyperakute Abstoßung verursachen, was zu einem frühen Transplantatverlust führt [3]. Um dieses Problem zu lösen, ist die Verkapselung von NPCCs erforderlich, die verschiedene Immunantworten hemmen können. Es gibt drei Arten der Kapselung:Makro-, Mikro- und Nanokapselung. Bei der Makroverkapselung wird ein Inselchen enthaltendes Gerät verwendet, das dann um Blutgefäße herum implantiert wird, um als Reaktion auf den Blutzuckerspiegel Insulin durch eine semipermeable Membran freizusetzen. Mikroverkapselung packt eine kleine Anzahl von Inseln in eine poröse Kapsel. Obwohl diese Verkapselungen Inseln vor Immunabstoßung schützen können, wurden in In-vivo-Studien Nebenwirkungen wie Membrankollaps oder Thrombusbildung berichtet. Die Inseln stören auch den Fluss von Hormonen, Nährstoffen oder Sauerstoff aufgrund der Vergrößerung der Diffusionsstrecke. Nanoverkapselung ist die Strategie der Zelloberflächenmodifikation, die die Anheftung zwischen Zellen und exogenen Proteinen, hauptsächlich Polyethylenglykol (PEG), bei Bluttransfusionen induziert [4].

Die Nanoverkapselung mit PEG wird häufig als Modifikationsmethode zur Verbesserung der Wirksamkeit und der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Zielproteinen oder -peptiden verwendet [5]. Insbesondere kann die Nanoverkapselung von Inseln hemmende Wirkungen als Reaktion auf den Angriff von Immunzellen und die Antikörpererkennung haben. PEG wird wegen seiner biokompatiblen Eigenschaften wie Nicht-Immunogenität, Antigen-Maskierung und Nicht-Fouling-Wirkung häufig für die Zellbeschichtung verwendet [6]. Unter den Nanopartikeln, die zur Nanoverkapselung von NPCCs verwendet werden, sind "Polymersomen" (PSomen) auf Basis von PEG-Block-Poly-Lactid (PEG-b-PLA) am besten geeignet, da sie stabil und einfach zu modifizieren sind; sie können auch sowohl hydrophile als auch hydrophobe Reagenzien in ihre Anordnung einbeziehen [7, 8]. Die Oberflächenmodifizierung von Inseln unter Verwendung von Polymeren (die PEG enthalten) wird durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung zwischen der extrazellulären Matrix (ECM) der Insel und dem mit funktionellen Gruppen konjugierten Polymer erreicht [9].

In früheren Studien wurde eine basische Hank-Salzlösung (HBSS, pH 8,0) als Reaktionspuffer für die Insel-Nanoverkapselung verwendet, da sie N-Hydroxysuccinimid (NHS)-NH₂ . fördert Bindung [10,11,12]. Um jedoch die Zellschädigung von NPCCs während der Nanoverkapselung zu minimieren, verwendeten wir F-10-Medium (NPCCs-Kulturmedium) mit physiologischem pH (pH 7,3). Da die Erhaltung der Menge an NPCCs nach der Nanoverkapselung für die Transplantation der richtigen Zellmenge wichtig ist, haben wir außerdem Rinderserumalbumin (BSA) hinzugefügt, das den Boden der Zellkulturschale mit einem langkettigen Polymer beschichtet, um die Wiederfindung zu erhöhen Preis [13]. In unserer vorherigen Studie wurde die Nanoverkapselung von NPCCs mit PSomen über einzelne funktionelle Gruppen wie NHS oder NH₂ . durchgeführt , die verwendet werden, um eine kovalente Bindung bzw. elektrostatische Wechselwirkung mit der ECM von NPCCs zu induzieren. Da die Bindungsaffinität jedoch mit der Zeit abnimmt, sind Strategien zur Steigerung der Bindungseffizienz erforderlich [14]. PSome mit bifunktionellen Gruppen können aufgrund ihrer Fähigkeit zur Aggregation als Kandidat zur Erhöhung der Beschichtungseffizienz verwendet werden. Daher haben wir eine Quervernetzung zwischen PSomen mit bifunktionellen Gruppen (NHS-/NH₂ -PSome), die nicht nur an die ECM von NPCCs binden können, sondern auch an jedes PSome durch kovalente Wechselwirkung oder elektrostatische Wechselwirkung, wodurch die Effizienz der Nanoverkapselung erhöht wird.

In dieser Studie haben wir die mögliche Anwendung der Nanoverkapselung auf NPCCs durch eine optimierte Methode im Bereich der Xenotransplantation von Schweineinseln untersucht.

Materialien und Methoden

Tiere

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Institute of MGENPLUS co. GmbH. (#2019-1) und alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des Ausschusses durchgeführt. Die Operation wurde unter Vollnarkose durchgeführt, und es wurden Anstrengungen unternommen, um sicherzustellen, dass die Tiere minimale Schmerzen verspürten. Schweine wurden vor der Pankreatektomie getötet.

Isolierung neonataler porciner islet-like cell clusters (NPCCs)

NPCCs wurden aus 3 bis 5 Tage alten Ferkeln isoliert. Kurz gesagt, Ferkel wurden mit Ketamin (10 mg/kg, Yuhan, Seoul, Korea) und Xylazinhydrochlorid (1 mg/kg, Rompun; Bayer Korea, Seoul, Korea) in den Oberschenkelmuskel anästhesiert und dann durch Injektion von Kaliumchlorid getötet ( Sigma-Aldrich, MO, USA) ins Herz. Die Bauchspeicheldrüse wurde durch einen Bauchschnitt freigelegt, geerntet und in Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS, Biosesang, Gyeonggi-do, Korea) mit 8,3 mM Natriumbicarbonat, 10 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N′-( 2-Ethansulfonsäure) (HEPES) (Sigma-Aldrich, MO, USA) und 0,5 % Antibiotikum-Antimykotikum (Biowest, MO, USA). Die Bauchspeicheldrüse wurde in 1–2 mm ³ . zerkleinert Fragmente und verdaut in Kollagenase Typ V (1 mg/ml, Sigma-Aldrich, MO, USA) in HBSS für 10 Minuten. Kaltes HBSS, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) (Biowest, MO, USA) enthielt, wurde dem verdauten Pankreasgewebe zugesetzt, um die Enzymaktivität zu stoppen. Verdaute Bauchspeicheldrüsengewebe wurden in HBSS gewaschen und nach der Resuspension wurden die Gewebe durch einen pluriStrainer 500 μm (pluriSelect, Leipzig, Deutschland) filtriert und in HBSS gewaschen. Schließlich wurden NPCCs ausgesät und in 5 % CO₂ . kultiviert bei 37 °C in F-10-Medium (Gibco, CA, USA), ergänzt mit 0,25 % Rinderserumalbumin (BSA) (genDepot, TX, USA), 10 mM Nicotinamid, 10 mM D-Glucose, 2 mM L-Glutamin, 2 mM Calciumchlorid-Dihydrat, 50 μM Isobutylmethylxanthin (IBMX), 20 μg/ml Ciprofloxacin (Sigma-Aldrich, MO, USA) und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum. NPCCs wurden 5 Tage lang kultiviert [15], wobei dem Kulturmedium täglich 10 nM Exendin-4 (Prospec, Ness-Ziona, Israel) zugesetzt wurden.

In-vitro-Bewertung von NPCCs und nanoverkapselten NPCCs

Nach der Kultur wurde die Anzahl der NPCCs als Inseläquivalent (IEQ) unter Verwendung der Okularstrichplatte im Okular gezählt. Die Lebensfähigkeit wurde mit Acridinorange (AO, 0,67 μM, Sigma-Aldrich, MO, USA) und Propidiumjodid (PI, 75 μM, Sigma-Aldrich, MO, USA) bewertet. Um den Glucose-stimulierten Insulinsekretions-(GSIS)-Assay durchzuführen, wurden 20–30 NPCCs gepickt und mit einer niedrigen D-Glucose-Konzentration (2,8 mM) in Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer (KRBB) 1 h vorinkubiert. NPCCs wurden dann 1 h lang mit niedriger D-Glukose (2,8 mM) in KRBB-Puffer inkubiert, gefolgt von einer Lösung mit hohem D-Glucosegehalt (28,0 mM) in KRBB für 1 h. Überstände wurden gesammelt, um die Insulinsekretion bei niedrigen und hohen Glukosekonzentrationen zu messen [11]. Die von jeder Probe sezernierte Insulinmenge wurde unter Verwendung eines Human-/Hunde-/Schweineinsulin-Quantikine-ELISA-Kits (R&D Systems, MN, USA) gemessen. Der Stimulationsindex (SI) wurde berechnet, indem die Insulinmengen bei hohen Glukosekonzentrationen (28,0 mM) durch die bei niedrigen Glukosekonzentrationen (2,8 mM) geteilt wurden.

Vorbereitung von Polymersomen (PSome)

Zur Herstellung von PSomen, entweder N-Hydroxysuccinimid-Poly (Ethylenglykol)-Block-Poly (Lactid)-Copolymere (10 mg/ml, NHS-PEG-b-PLA) oder Amin-Poly (Ethylenglykol)-Block-Poly (Lactid .) ) Copolymere (10 mg/ml, NH₂ -PEG-b-PLA; Nanosoft Polymers, NC, USA) wurden in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, USA) gelöst. Jedes Copolymer (NHS oder NH₂ .) -PEG-b-PLA), gelöst in DMSO, wurde anteilig gemischt. Der Polymerlösung wurde destilliertes Wasser (DH2O) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu erreichen. Die Polymerlösung wurde in einem Ultraschallgerät (Sea han Ultraschall, Seoul, Korea) 5 Minuten lang beschallt. 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanin, 4-Chlorbenzolsulfonatsalz (DiD; Biotium, CA, USA) wurde während der Beschallung zu der Polymerlösung gegeben, um eine Visualisierung zu ermöglichen. Schließlich wurde die Mischung 3 Tage lang in DH2O dialysiert.

Nano-Verkapselung

Das Psome wurde in Nanoverkapselungs-Reaktionspuffer (entweder HBSS (pH 7,3 oder pH 8,0) oder einfaches F-10-Medium ohne Zusätze (pH 7,3 oder pH 8,0) mit oder ohne 0,25% BSA) verdünnt. Die Nanoverkapselung wurde durch Zugabe der PSome zu NPCCs in Kulturmedien durchgeführt. Dazu wurden 10.000 IEQs von NPCCs in eine 6-Well-Zellkulturschale (SPL, Gyeonggi-do, Korea) ausgesät und verdünnte Psome zu den NPCCs gegeben und in 5 % CO₂ . inkubiert bei 37 °C für 1 h. Eine Negativkontrollgruppe (NC) (nicht beschichtete NPCCs ohne Psomes) wurde unter den gleichen Bedingungen wie die experimentelle Gruppe inkubiert. Nach der Inkubation wurden die nanoverkapselten NPCCs geerntet und in F-10-Kulturmedien kultiviert.

Effizienz nanoverkapselter NPCCs

Die DiD-konjugierten Psome nano-eingekapselten NPCCs wurden entweder mit Fluoreszenzmikroskopie (Leica, Wetzlar, Deutschland) oder konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM; Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) sichtbar gemacht. Die Intensität von DiD-konjugierten Psome-gebundenen NPCCs wurde durch Berechnung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) unter Verwendung der ImageJ-Software (NIH, Bethesda, USA) quantifiziert. Zellkerne wurden mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gegengefärbt.

Polymersome Permeability Assay

Die nanoverkapselten NHS-PSome-NPCCs in F-10 oder F-10 (0,25% BSA) wurden mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugiertem Dextran mit unterschiedlichen Molekulargewichten (10, 20, 70 und 250 kDa) 2 h lang inkubiert . Die Penetration von FITC-konjugiertem Dextran in nanoverkapselte NHS-PSome-NPCCs wurde für jedes Molekulargewicht mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop bestätigt.

Polymersome Cell Viability Assay

Das NHS-PSome nano-encapsulated THP-1 (human monocytic cell line) in RPMI 1640 (Biowest, MO, USA) wurde 1 h lang inkubiert. Die Lebensfähigkeit von NHS-PSome nano-eingekapseltem THP-1 wurde gemäß dem Protokoll gemessen, das im MTT-Zellproliferations-Assay-Kit (iNtRon Biotechnology, Seongnamsi, Korea) enthalten ist.

Statistische Analyse

Der ungepaarte t-Test wurde in GraphPad Prism 6.0 durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde als *, ** *** und **** ausgedrückt, was den P angibt Wert von  ≤  0,05,  ≤  0,01, 0,001 und  ≤  0,0001.

Ergebnisse

Kultur- und Funktionsbewertung von NPCCs

NPCCs wurden 5 Tage lang kultiviert und Qualitätskontrollen, einschließlich Lebensfähigkeit und GSIS, wurden durchgeführt. Die Gesamtzahl der NPCC betrug 21.014,0 IEQ/g/Pankreas. Die Lebensfähigkeit betrug bei Verwendung von AO/PI-Färbung 89,9 %. GSIS, das durchgeführt wurde, um das Ansprechen von NPCCs auf die Glukosekonzentration zu bestätigen, ergab einen durchschnittlichen Stimulationsindex (SI) von 2,3 (Tabelle 1, Zusatzdatei 1:Abb. S1).

PEinige Konzentration erforderlich für eine effiziente Nanoverkapselung von NPCCs

Um die Konzentration von PSome zu bestimmen, die für eine effiziente Nanoverkapselung erforderlich ist, haben wir unterschiedliche Konzentrationen von NHS-PSomen zu den NPCCs hinzugefügt. NHS-PSome wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml in DH₂ . gelagert O und verdünnt bei 1:5, 1:10, 1:20 und 1:40, um Endkonzentrationen im Bereich von 0,2 bis 0,025 mg/ml zu erhalten. Die Effizienz der Nanoverkapselung wurde durch MFI von DiD-beladenen, nanoverkapselten NPCCs mit PSome gemessen. Die Endkonzentration von 0,1 mg/ml (1:10-Verdünnung) zeigte die höchste Fluoreszenzintensität 2 Tage nach der Nanoverkapselung (Abb. 1a und b) und die anschließende Nanoverkapselung von NPCCs wurde bei dieser Konzentration durchgeführt.

Optimierung der PSome-Konzentration für eine effektive Nanoverkapselung bei 0 und 2 Tagen. Optimierung der PSome-Konzentration für eine effektive Nanoverkapselung. a DiD-beladene NHS-PSome wurden in NPCCs bei verschiedenen Konzentrationen (BF; Hellfeld) behandelt. Die Maßstabsbalken repräsentieren 200 μm. b MFI von DiD-beladenen Psome nano-verkapselten NPCCs (n = 3) und NC-Steuerung (n = 1)

Verbesserte Effizienz der Nanoverkapselung in F-10-Medien mit physiologischem pH

Die Nanoverkapselung von Pankreasinseln (die NPCCs enthalten) wird oft in basischem HBSS-Puffer (pH 8,0 oder höher) durchgeführt, um die Bindungsaffinität zwischen NH2 in ECM von Inseln und NHS, das in Polymer konjugiert ist, zu erhöhen. Die Nanoverkapselung in basischem HBSS-Puffer kann jedoch NPCCs potenziell schädigen. Um den Schaden von NPCCs zu minimieren und die Wirkung des pH-Werts auf NHS-NH₂ . zu bestimmen Bindung wurden NPCCs durch NHS-PSome in HBSS-Puffer oder einfaches F-10-Kulturmedium (in dieser Studie verwendet, um NPCCs zu kultivieren) mit pH 7,3 (physiologisch) bzw. pH 8,0 (basisch) nanoverkapselt. Wenn NPCCs in F-10 nanoverkapselt wurden, wurde die normale Morphologie der NPCCs beibehalten (Abb. 2a), und die Effizienz der Nanoverkapselung basierend auf MFI war im Vergleich zu der in der HBSS-Gruppe unabhängig vom pH-Wert an den Tagen 0 . signifikant erhöht und 6 (Abb. 2b). Obwohl die HBSS-Gruppen an Tag 6 einen signifikanten Unterschied zwischen pH 7,3 und 8,0 zeigten, war die Intensität der Nanoverkapselung im Vergleich zu der in der F-10-Gruppe signifikant verringert. Daher verwendeten wir in nachfolgenden Experimenten physiologisches F-10-Kulturmedium (pH 7,3) als Reaktionspuffer für die Nanoverkapselung, um die potenzielle Schädigung von NPCCs zu minimieren.

Vergleiche der Beschichtungseffizienz der Nanoverkapselung in verschiedenen Reaktionspuffern nach 1 und 6 Tagen. Vergleiche der Beschichtungseffizienz der Nanoverkapselung in verschiedenen Reaktionspuffern. a Nanoverkapselte NPCCs in HBSS (pH 7,3 und pH 8,0) oder F-10 (pH 7,3 und pH 8,0) mit DiD-konjugiertem NHS-Psome (BF; Hellfeld). Die Skalenbalken repräsentieren 200 µm; b MFI nanoverkapselter NPCCs in HBSS (pH 7,3 und pH 8,0) oder F-10 (pH 7,3 und pH 8,0) mit DiD-konjugiertem NHS-PSom (alle Gruppen; n = 3). Die Daten repräsentieren den Mittelwert  ± S.D. *p < 0.05, ***p <0,001 und ****p < 0,0001 im Vergleich zu anderen Gruppen

Erhöhte Wiederfindungsrate von NPCCs nach Nanoverkapselung

Obwohl die Zellschädigung von NPCCs in F-10 minimiert wurde, wurde die Menge an NPCCs, die nach der Nanoverkapselung gesammelt wurde, deutlich reduziert. Um dieses Problem zu lösen, haben wir während der Kultur und Nanoverkapselung von NPCCs mit NHS-PSome 0,25% BSA zu F-10-Medium hinzugefügt. Wir haben zunächst bestätigt, ob die Zugabe von 0,25 % BSA zu F-10-Medium die Beschichtungseffizienz und die selektive Permeabilität beeinflusst, was den Durchgang kleiner Moleküle (10 und 20 kDa FITC-konjugiertes Dextran) ermöglicht, während größere Moleküle (70 und 250 kDa FITC-konjugiert) blockiert werden Dextran), als eine wesentliche Funktion von PSome. Als Ergebnis wurde die konforme Beschichtung in Bildern von CLSM (Abb. 3a, Mitte) gezeigt und die selektive Permeabilität wurde normal beibehalten (Abb. 3b, FITC-konjugiertes Dextran) in NHS-PSome nano-eingekapselten NPCCs mit F-10 mit 0,25 % BSA im Vergleich zu F-10, obwohl der MFI leicht reduziert war (Abb. 3b). Die nach der Nanoverkapselung gesammelten Mengen an NPCCs zeigten eine signifikant höhere Wiederfindungsrate (71,9 %) in F-10 mit 0,25 % BSA als in F-10 ohne BSA (42,3 %) (Abb. 3c). Die Lebensfähigkeit (NC:89,5%, NHS-PSome:90,3%) und die Glucose-stimulierte Insulinsekretion (NC:2,1, NHS-PSome:1,6) von NPCCs in F-10 mit 0,25% BSA blieben auch nach der Nanoverkapselung erhalten (Abb . 4a, b, Zusatzdatei 1:Abb. S2). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von 0,25 % BSA die Wiederfindungsrate von NPCCs nach der Nanoverkapselung signifikant verbessern kann und die Beschichtungseffizienz oder -funktion von Psome nicht beeinflusst hat.

Vergleiche der Beschichtungseffizienz nach 0,25% BSA-Zugabe in Nanoverkapselungs-Reaktionspuffern zur Erhöhung der Wiederfindungsrate. Vergleiche der Beschichtungseffizienz nach 0,25% BSA-Zugabe in Nanoverkapselungs-Reaktionspuffern zur Erhöhung der Wiederfindungsrate. a Beschichtungseffizienz und selektive Permeabilität von nanoverkapselten NPCCs mit NHS-PSom in F-10 oder F-10 mit 0,25% BSA (BF; Hellfeld, Mitte; mittleres Bild mit CLSM von DiD-konjugierten NHS-PSomen nanoverkapselten NPCCs, FITC-konjugiertes Dextran; mittleres Bild mit CLSM von FITC-konjugiertem Dextran in NHS-Psome nano-eingekapselten NPCCs). Blau in der Mitte repräsentiert die Zelle durch DAPI-Färbung. Maßstabsbalken sind 200 (BF und DiD) und 100 (Mid und FITC-konjugiertes Dextran) µm; b MFI von nanoverkapselten NPCCs unter Verwendung von DiD-konjugierten NHS-PSomen; c Wiederfindungsrate von NPCCs nach Nanoverkapselung in F-10 (n = 12) oder F-10 mit 0,25% BSA (n = 12). Die Daten repräsentieren den Mittelwert  ± S.D. *p < 0,05 gegen F-10

Lebensfähigkeit und Funktionalität von NHS-Psome nano-eingekapselten NPCCs unter Verwendung von F-10 mit 0,25% BSA. Lebensfähigkeit und Funktionalität von NHS-Psome nano-eingekapselten NPCCs unter Verwendung von F-10 mit 0,25% BSA. a Lebensfähigkeit von NHS-Psome nano-verkapselten NPCCs (n = 6) und NC-Steuerung (n = 6); b SI von NHS-Psome nano-eingekapselten NPCCs (n = 5) und NC-Steuerung (n = 5). Daten repräsentieren den Mittelwert ± S.D

Erhöhte Stabilität der Nanoverkapselung durch Vernetzung von Psomes

Um eine stabilere Nanoverkapselung von NPCCs zu induzieren, haben wir versucht, PSomen mit zwei unterschiedlichen funktionellen Gruppen zu konjugieren. Zuerst führten wir eine Nanoverkapselung der NPCCs durch, indem wir gleichzeitig verschiedene Anteile von PSomen, die NHS und NH₂ . enthielten, hinzufügten bifunktionelle Gruppen (NHS-/ NH₂ -PSom) in einem PSom (Schema 1). Die Effizienz der Nanoverkapselung wurde durch das MFI von DiD, das in Psome-nanoverkapselten NPCCs konjugiert war, bestätigt. Die resultierenden Bilder aus der Fluoreszenzmikroskopie zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen 9:1, 5:5 und 1:9 Gruppen von NHS-/NH2-PSome nano-verkapselten NPCCs (9:1, 5:5, 1:9) am Tag 0 und Tag (Abb. 5a). In den CLSM-Ergebnissen schien die 5:5-Gruppe jedoch überzogen zu sein und 1:9 zeigte eine unzureichende Beschichtung, während die 9:1-Gruppe am Tag 1 eine konforme Beschichtung bildete (Abb. 5b). Daher haben wir das optimale Verhältnis von NHS-/NH2 in Psome zu 9:1 bestimmt. Als funktionelle Assays für die 9:1-Gruppe durchgeführt wurden, zeigten unsere Ergebnisse, dass die Lebensfähigkeit der 9:1-Gruppe im Vergleich zu der der NC-Kontrolle (92,1%) signifikant verringert war, aber die Lebensfähigkeit wurde auf einem normalen Niveau gehalten (87,8 .). %). Die SI-Funktion der 9:1-Gruppe war im Vergleich zu der der NC-Kontrolle (3.7) normal (3.0) (Abb. 5c,d).

Die Veranschaulichung der verbesserten Stabilität der Nanoverkapselung durch die Vernetzung von Psomes

Beschichtungseffizienz und Funktionalität von NHS-/NH₂ -PEinige nanoverkapselte NPCCs. Beschichtungseffizienz und Funktionalität von NHS-/NH₂ -PEinige nanoverkapselte NPCCs. a DiD konjugiert 9:1, 5:5, 1:9 von NHS-/NH₂ -PEinige nanoverkapselte NPCCs (9:1, 5:5, 1:9) (NC; nicht beschichtete NPCCs). MFI zeigt die Intensität von DiD-konjugierten Psome nano-eingekapselten NPCCs (n = 3) und NC-Steuerung (n = 3). Die Skalenbalken repräsentieren 200 µm; b CLSM von DiD-konjugiertem NHS-/NH₂ -Psome nano-eingekapselte NPCCs (Mitte; mittleres Bild mit CLSM von DiD-konjugiertem NHS-/NH₂ -PEinige nanoverkapselte NPCCs). Blau in der Mitte repräsentiert die Zelle durch DAPI-Färbung. Die Skalenbalken stellen 100 µm dar; C. Lebensfähigkeit von 9:1 (n = 9) und NC-Steuerung (n = 3). Die Daten repräsentieren den Mittelwert  ± S.D. **p <  0,01 gegenüber NC; D. SI von 9:1 (n = 9) und NC-Steuerung (n = 3). Daten repräsentieren den Mittelwert ± S.D

Diskussion

Diabetes mellitus, allgemein bekannt als Diabetes, ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch einen hohen Blutzuckerspiegel gekennzeichnet ist. Typ-1-Diabetes resultiert aus dem Versagen der Betazellen in der Bauchspeicheldrüse, genügend Insulin zu produzieren [16]. Die Transplantation von Pankreasinseln, die insulinproduzierende β-Zellen enthalten, wurde kürzlich verwendet, um Typ-1-Diabetes zu heilen. Die Transplantation von Allo-Inselzellen ist jedoch aufgrund des Mangels an Spendern begrenzt; stattdessen hat sich die Xenotransplantation mit Inseln von nicht-menschlichen Tieren als alternative Quelle für Spendergewebe herausgestellt. Aufgrund ihrer physiologischen Ähnlichkeit mit dem Menschen, der einfachen Massenzüchtung und der Verfügbarkeit der Zucht in pathogenfreien Einrichtungen gelten Schweine als optimales Tiermodell für die Xeno-Insel-Transplantation [1]. Insbesondere die NPCCs wurden ebenso wertvoll wie die APIs verwendet. Obwohl die Reife von NPCCs geringer ist als die von APIs, haben NPCCs einige Vorteile gegenüber APIs, darunter ein relativ einfaches und kostengünstiges Inselisolationsverfahren, die Fähigkeit, eine Resistenz gegen hypoxische Umgebungen und eine Proliferation in vivo nach der Transplantation zu entwickeln [1,2,3] . Aus diesen Gründen haben wir in dieser Studie 3–5 Tage alte neugeborene Schweine als Inselquelle verwendet.

Unglücklicherweise treten nach der Implantation von Schweineinseln in menschliche oder nichtmenschliche Primatenblutgefäße häufig schwere Immunreaktionen wie IBMIR oder hyperakute Abstoßung auf. IBMIR tritt normalerweise aufgrund mehrerer Gewebefaktoren (TF) auf, die in Schweineinseln exprimiert werden und die Gerinnung in menschlichen Blutgefäßen über die Aktivierung eines extrinsischen Signalwegs vermitteln. Auf der Oberfläche von Schweinezellen exprimierte Alpha-Galactose- oder Nicht-Gal-Antigene können auch Ziele von natürlichen menschlichen Antikörpern sein, gefolgt von einer komplementären Kaskadenaktivierung, die als hyperakute Abstoßung bezeichnet wird. Infolgedessen gehen Transplantate nach Hypoxie durch Gerinnselbildung aus dem Gerinnungsweg und Zelltod durch Komplementaktivierung im Wirt verloren [3]. Um diese Probleme zu lösen, wurde die Verkapselung versucht, ein Verfahren zum Beschichten von Pankreasinseln mit biokompatiblen Materialien, um sie vor Angriffen durch Antikörper- oder Komplementreaktionen zu schützen. Erstens verwendet die Makroverkapselung ein Gerät mit einer semipermeablen Membran, die die Insel enthält, und wird neben Blutgefäßen implantiert, wo es als Reaktion auf den Blutzuckerspiegel Insulin in den Blutkreislauf freisetzt [4]. Zweitens hat die Mikroverkapselung, hauptsächlich unter Verwendung von Alginat, eine selektive Permeabilität und kann Sauerstoff und Nährstoffe durch ihre poröse Oberfläche passieren lassen, während sie mehrere Zytokine und die Infiltration von Immunzellen blockiert. Da sie jedoch unabhängig von der Größe der Inseln die gleiche Kapselgröße verwenden, ist es schwierig, die Inseln konform zu beschichten. Darüber hinaus kann eine Fibrose auftreten, die das Transplantat nach der Transplantation umschließt [17]. Schließlich wird bei der Oberflächenmodifizierung von Inseln (Nanoverkapselung) hauptsächlich Polyethylenglycol (PEG) verwendet, das eine „Stealth-Effekt“-Eigenschaft besitzt, die die Interaktion von mit „Stealth“-Polymer (PEG) beschichteten Materialien und Bestandteilen im Blut (Immunzellen) blockiert vivo [11, 18]. Unsere Nanoverkapselungsstrategie für NPCC verwendet die modifizierten PEG-Copolymere (PEG-b-PLA, Polymersome, Psome). Außerdem hat Psome sowohl hydrophile als auch hydrophobe Eigenschaften und kann Immunsuppressiva oder Faktoren enthalten, die an der Zelldifferenzierung oder dem Zellwachstum beteiligt sind [8].

Die Nanoverkapselung von Inseln mit PEG wurde in basischem HBSS-Puffer (pH 8,0 oder höher) durchgeführt, um die Bindungsaffinität zwischen NHS auf PEG und NH₂ . zu erhöhen auf ECM der Insel [10,11,12]. Da diese Bedingungen jedoch keine geeignete Zellkulturumgebung bereitstellen können, versuchten wir die Nanoverkapselung in einer Umgebung, die die NPCC-Kulturbedingungen nachahmt. Um die oben genannten Probleme anzugehen, haben wir einfaches F-10-Medium, NPCCs-Kulturbasismedium, mit physiologischem pH (ohne Zusätze) als Nanoverkapselungs-Reaktionspuffer getestet. Die Nanoverkapselung in F-10 mit physiologischem pH zeigte eine ähnliche Beschichtungseffizienz und behielt die normale Morphologie von NPCCs bei, verglichen mit den Kulturbedingungen unter Verwendung von basischem HBSS-Puffer (Abb. 3). Daher können wir eine Plattform vorschlagen, die NPCC-Schäden während der Nanoverkapselung in einer NPCC-Kultur nachahmenden Umgebung minimiert.

Obwohl die Nanoverkapselungsmethode zur Minimierung von NPCC-Schäden etabliert wurde, nahm die nach der Nanoverkapselung gesammelte Restmenge an NPCCs ab, wenn die Nanoverkapselung in Petrischalen durchgeführt wurde. Dies bedeutet, dass Sie für die Transplantation mehr NPCCs für die Nanoverkapselung benötigen. Nach früheren Berichten wurden die Inselausbeuten bei einigen Mausstämmen durch die Verwendung von BSA während der Isolierung verbessert [19]. Außerdem wurde BSA als Suspensionskultur verwendet, indem die Oberfläche von Zellkulturschalen in Rattenhepatomzellkulturen vorbeschichtet wurde [13]. Um die Menge an NPCCs nach der Nanoverkapselung zu erhöhen, wurden daher 0,25% BSA in F-10-Nanoverkapselungs-Reaktionspuffer hinzugefügt, gleich der Konzentration an BSA, die zum Kultivieren von NPCCs verwendet wurde. Infolgedessen erhöhte sich die NPCC-Wiederfindungsrate nach der Nanoverkapselung signifikant (Abb. 4). Dies bedeutet, dass die korrekte Anzahl von Inseln (die NPCCs enthalten) nach der Nanoverkapselung vorhergesagt und durch Minimierung des Verlusts von Inseln (die NPCCs enthalten) verpflanzt werden können. Zusammenfassend zeigte diese Studie unter Verwendung von F-10 mit 0,25% BSA für die Nanoverkapselung, dass (i) die normale Morphologie von NPCCs beibehalten wurde, (ii) die Bindung zwischen NHS-konjugiertem PSome und NH2 in der ECM von NPCCs nicht gestört wurde und (iii) die Wiederfindungsrate von NPCCs nach Nanoverkapselung stieg.

Schließlich haben wir versucht, die Stabilität der Nanoverkapselung durch (i) Konjugation zwischen PSomen und (ii) Bindung zwischen den PSomen und der ECM von NPCCs zu erhöhen. Zunächst wurden NHS- und NH2-PEG-b-PLA-Polymere proportional gemischt, um das bifunktionelle PSom (NHS-/NH2-PSom) zu bilden, das sowohl an Psome als auch an ECM von NPCCs binden kann. Wir postulierten, dass die Konjugation durch bifunktionelle Gruppen innerhalb eines PSoms effizient erreicht werden könnte, anstatt zwei PSomen mit monofunktionellen Gruppen zu konjugieren, da die Bindung zwischen PSomen mit derselben funktionellen Gruppe (NHS-NHS und NH2-NH2) möglicherweise unterbrochen wird. Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, wurde die konforme Beschichtung von NPCCs in einem Verhältnis von 9:1 von NHS-/NH2-Psome-nanoverkapselten NPCCs erreicht, und die Lebensfähigkeit und Funktionalität blieben erhalten (Abb. 5). Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die Stärke der PSom-Bindung zu quantifizieren, um zu beweisen, dass die Nanoverkapselung mit bifunktionellen PSomen zu einer stabileren Verkapselung führte als die mit monofunktionellen PSomen. Daher schlagen wir vor, dass unsere effektiven Nanoverkapselungsbedingungen, die die NPCC-Kulturumgebung nachahmen, in der Nanoverkapselungsstrategie unter Verwendung von Inseln mit NPCCs verwendet werden können (zusätzliche Datei 1).

Schlussfolgerung

Diese Studie wurde durchgeführt, um eine optimale Methode zur Nanoverkapselung von Pankreasinseln (NPCCs) unter Verwendung von PEG-basierten Polymersomen (PSomen) zu bestimmen. Erstens kann die Verwendung von F-10-Kulturmedium mit einem pH-Wert von 7,3 die normale Morphologie von NPCCs nach der Nanoverkapselung im Vergleich zur Verwendung von basischem HBSS-Puffer (pH 8,0) aufrechterhalten, wodurch eine Beschädigung der NPCCs während der Verkapselung minimiert wird. Zweitens verbesserte die Zugabe von 0,25% BSA zu F-10-Medium die Ausbeute an NPCCs nach der Nanoverkapselung um ungefähr das 1,7-fache. Schließlich haben wir durch die Konjugation von bifunktionellen PSomen (NHS-/NH2-PSomen) eine stabilere Nanoverkapselung induziert. Die in diesem Papier vorgestellten Methoden der Nanoverkapselung können bei der Nanoverkapselung von Pankreasinseln unter Verwendung von PEG-basierten Nanopartikeln angewendet werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend.

Abkürzungen

DiD:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt

AO:

Acridine orange

APIs:

Adult porcine islets

BSA:

Rinderserumalbumin

BF:

Hellfeld

CLSM:

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

DAPI:

4′,6-Diamidino-2- phenylindole

DMSO:

Dimethylsulfoxid

DH2O:

Distilled water

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FBS:

Fötales Rinderserum

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

GSIS:

Glucose-stimulated insulin secretion

HBSS:

Hank’s balanced salt solution

IBMIR:

Instant blood-mediated inflammatory reaction

IEQ:

Islet equivalent

IBMX:

Isobutylmethylxanthine

KRBB:

Krebs–Ringer bicarbonate buffer

MFI:

Mean fluorescence intensity

HEPES:

N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)

NC:

Negative control

NPCCs:

Neonatal porcine islet like cell clusters

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

NHP:

Non-human primate

PLA:

Poly lactide

PEG:

Polyethylenglykol

PSomes:

Polymersomes

PI:

Propidium iodide

SI:

Stimulation index

TF:

Tissue factor