Schwarze Phosphor-Nanopartikel fördern die osteogene Differenzierung von EMSCs durch hochregulierte TG2-Expression

Einführung

In klinischen Situationen kann eine fehlende Knochenregeneration selbst bei häufigen Knochenbrüchen zu einer schlechten Prognose führen, und es besteht ein dringender Bedarf an knochenregenerativen Materialien [1]. Anschließend wurden viele therapeutische Strategien wie Autotransplantate, Allotransplantate und künstliche Knochengerüste als regenerative Materialien verwendet. In den letzten Jahren wurde erfolgreich nachgewiesen, dass Biomaterialien zur Knochenregeneration beitragen, was die beeindruckenden Fortschritte bei den vielfältigen Anwendungen von Biomaterialien zeigt [2]. Die Entwicklung eines künstlichen Knochenersatzes mit hervorragender Osteokonduktion, Osteoinduktion und Osteointegration ist jedoch weiterhin dringend erforderlich. Bioaktive Polymere [3,4,5] und Keramiken [6] wurden zu Gerüsten für das Knochen-Engineering verarbeitet, und Gerüste, die die Osteogenese durch Freisetzung von Ionen verbessern [7], sind von besonderer Bedeutung. Insbesondere anorganische Phosphate, die spezifisch auf Zielzellen oder -gewebe wirken, können einen vielversprechenden Weg zur Untersuchung mineralisierungsbezogener biologischer Prozesse und zur Weiterentwicklung der bioinspirierten mineralisierungsgesteuerten Medizintechnik bieten [8].

2014 berichteten Li und Mitarbeiter, dass Nanoblätter aus schwarzem Phosphor (BP) von Bulk-BP abgeblättert werden können, und demonstrierten das Potenzial von BP-Nanoblättern als neues zweidimensionales (2D) Material für Anwendungen in nanoelektronischen Geräten [9]. Aufgrund der überlegenen Eigenschaften von BP, wie ausgeprägte gefaltete Strukturen in Schichten, eine einstellbare direkte Bandlücke, hohe Trägermobilität und viele interessante Anisotropien innerhalb der Schicht, wird BP derzeit für potenzielle biomedizinische Anwendungen untersucht [10]. Aufgrund dieser Vorteile wurden BP-Nanomaterial-basierte Gerüste zur Stimulierung der Knochenregeneration in den letzten 2 Jahren intensiv untersucht. Frühere Studien haben gezeigt, dass Biomaterialien auf Phosphorbasis die Mineralisierung und Knochenregeneration durch Erhöhung der lokalen Konzentration von Phosphationen verbessern können [11]. Obwohl BP als idealer Kandidat zur Förderung der Knochenregeneration angesehen werden könnte, wird es üblicherweise in Polymere eingekapselt oder durch Eintauchen auf ein Biomaterialgerüst zur Anwendung für einen Knochengewebeingenieur eingebracht. Bislang sind die molekularen Mechanismen, die die Knochenregeneration durch BP modulieren, weitgehend unbekannt und behindern somit die Weiterentwicklung von BP-basierten Therapien zur Knochenreparatur in der Klinik.

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind multipotente Stromazellen mit der Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung nach mehreren Abstammungslinien [12]. Nach Knochenbrüchen spielen MSCs eine Schlüsselrolle im in-vivo-Knochenreparaturprozess [13,14,15]. Die Knochenmarkstammzellen (BMSCs) und ihr Potenzial zur osteogenen Differenzierung wurden im Laufe der Jahre intensiv untersucht. Der Entnahmeprozess von BMSCs könnte jedoch für die Anbieter schmerzhaft sein und mit Ansteckungsrisiken verbunden sein. Ektodermale mesenchymale Stammzellen (EMSCs) stammen aus der kranialen Neuralleiste während der Embryonalentwicklung und können bei Erwachsenen leicht aus der Atemwegsschleimhaut der Nasenhöhle gewonnen werden. Außerdem sind EMSCs selbsterneuerbar mit multidirektionalem Differenzierungspotenzial, die in unseren vorherigen Studien gründlich charakterisiert wurden [16, 17]. Wir haben bewiesen, dass sich EMSCs in mehrere Zelllinien differenzieren können, darunter Adipozyten, Neurozyten, Chondrozyten und Osteozyten [18, 19]. Diese besonderen Eigenschaften machen EMSCs zu einem vielversprechenden Werkzeug zur Erforschung potenzieller molekularer Mechanismen, die die osteogene Differenzierung von EMSCs durch chemische Signale, einschließlich BPs, modulieren. Die osteogene Differenzierung ist jedoch ein komplexer Prozess, der eine enge Koordination von Proliferation und Differenzierung verschiedener Zellen, Synthese und Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM) beinhaltet [20]. Frühere Studien haben berichtet, dass Transglutaminase 2 (TG2) in der Lage ist, die Osteoblasten-Osteogenese zu stimulieren, indem sie die Osteoblastenproliferation, Differenzierung, extrazelluläre Matrixproduktion und Mineralisierung beeinflusst [21,22,23].

Die oben zitierten Berichte weisen darauf hin, dass BPs ein enormes Potenzial für biomedizinische Anwendungen besitzen, die ein überlegener osteogener Differenzierungsinduktor für EMSCs sein könnten. Bisher wurde über die Auswirkungen von BPs auf die EMSC-Differenzierung nicht berichtet. Das Hauptziel der vorliegenden Studie war es, die Auswirkungen von BPs auf die EMSC-assoziierte in vitro osteogene Differenzierung und Proliferation zu untersuchen. Nach dieser Untersuchung wurde auch der potenzielle molekulare Mechanismus von BPs auf die EMSC-Proliferation und osteogene Differenzierung sorgfältig untersucht. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass BPs ein potenziell nützliches chemisches Mittel für die Tissue-Engineering-Gerüste sein könnten.

Materialien und Methoden

Schwarze Phosphor-Nanopartikel

Bulk BP wurde von Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd. bezogen. Dimethylsulfoxid (DMSO), Natriumhydroxid (NaOH) und N -Methyl-2-pyrrolidon (NMP) wurden von Aladdin Industrial Co., Ltd. bereitgestellt. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde von Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. bezogen. Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium/Nährstoffgemisch F12 (DMEM/F12; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences), Streptomycin, Penicillin, fötales Rinderserum (FBS), wurden von BI Science and Technology Co., Ltd. bezogen.

Die BP-Synthese war mit geringfügigen Modifikationen ähnlich der in früheren Berichten [24]. Zuerst wurden 20 mg BP in einer gesättigten NaOH/NMP-Lösung eingetaucht und mit einem mechanischen Mahlverfahren verfeinert. Die Mischung wurde dann 10 min bei 1500 U/min zentrifugiert, wonach der Niederschlag verworfen wurde. Danach wurde die Mischung für 6 h in einem Eis-/Wasserbad beschallt und anschließend durch einen 100 μm BD Falcon-Filter (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) filtriert. Schließlich wurde eine weitere Zentrifugation der Suspension (10 Minuten bei 13.000 U/min, 4 °C) durchgeführt und der Niederschlag wurde gesammelt.

Immunfluoreszenzfärbung der EMSCs in der Nasenschleimhaut

Um die EMSCs in vivo zu zeigen, wurde die respiratorische Schleimhaut der Nasenscheidewand seziert und dann über Nacht in 4% PFA zur Immunfluoreszenzfärbung fixiert. Die Gewebe wurden mit PBS gewaschen und dann mit Saccharose-Gradientenlösungen entwässert. Die Gewebe wurden für die Kryosektion in OCT (Sakura Finetek, Japan) eingebettet und mit einem Leica Kryomikrotom in koronale serielle Schnitte mit einer Dicke von 25 mm geschnitten. Diese Schnitte wurden 10 min in PBS gewaschen und mit 1 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Triton-X 100 in PBS permeabilisiert. EMSCs in der Nasenschleimhaut wurden mit dem primären Antikörper von Anti-Nestin und dem Cy3-konjμgierten sekundären Antikörper immunfluoreszenzgefärbt. Die parallelen Negativkontrollen wurden den gleichen Verfahren ohne Primärantikörper unterzogen. Die gefärbten Gewebe wurden unter einem Immunfluoreszenzmikroskop (AxioObserver, ZEISS, Deutschland) betrachtet.

Zellkultur

Alle Tierverfahren wurden von der Tierpflege- und Ethikkommission der Jiangnan University genehmigt, und die Internationalen Richtlinien für Tierforschung wurden in dieser Studie strikt befolgt. Primäre ekto-mesenchymale Stammzellen wurden gemäß unseren früheren Studien aus der Atemwegsschleimhaut der Ratte isoliert [17, 25]. Kurz gesagt, 100 g erwachsene Sprague Dawley (SD)-Ratten wurden mit intraperitonealen Injektionen von Pentobarbital-Natrium (0,05 g/kg) anästhesiert. Das mittlere Drittel der Nasenscheidewand wurde zerkleinert und dann in einer 0,25%igen Trypsinlösung (Hyclone; GE Healthcare Life Sciences) bei 37 °C für 25 Minuten inkubiert, wonach die Nasenscheidewandschleimhaut vorsichtig abgezogen wurde. Schließlich wurde das Schleimhautgewebe der Nasenscheidewand in Stücke geschnitten. Die resultierende Suspension der Gewebe wurde durch ein 100-um-Nylon-Mesh-Sieb passiert, 5 Minuten bei 1000 g zentrifugiert und dann zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Gewebesuspension wurde in Wachstumsmedium (DMEM/12 enthalten 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) in eine Zellkulturflasche gegeben und bei 37 °C in 5 % CO_{2<. kultiviert /sub> und 95 % Luft mit gesättigter Luftfeuchtigkeit. Das Medium wurde alle drei Tage ersetzt und die Zellen wurden jede Woche passagiert. Zellen in ihrer dritten Passage wurden für alle Charakterisierungsstudien verwendet. Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um die kultivierten Zellen mit Antikörpern gegen Stammzellmarker einschließlich Vimentin und Nestin zu charakterisieren [26].}

Identifizierung der multidirektionalen Differenzierungsfähigkeit von EMSCs

Die EMSCs wurden in die 6-Well-Platten ausgesät und mit DEME/F12-Medium für 24 h bis 70 % Konfluenz kultiviert. Das Medium wurde dann mit osteogenem Differenzierungsmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS, 0,1 mM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat-Dinatrium und 0,2 mM 1-Ascorbinsäure) ausgetauscht, um die Osteogenese zu induzieren. Das Medium wurde alle sieben Tage gewechselt und die Färbung mit Alizarin Red S wurde mit 0,5 % Alizarin Red S (Sigma-Aldrich) am Tag 28 durchgeführt. EMSCs, die zu einer Konfluenz von 90 % gewachsen waren, wurden in adipogenem Differenzierungsmedium kultiviert, um 21 Tage lang Adipogenese zu induzieren. Die Ölrotfärbung wurde mit dem Ölrotfärbungskit (Solarbio) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Charakterisierung von BPs

Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurde verwendet, um BP-Morphologie und -Größe zu charakterisieren. Proben wurden hergestellt, indem ein Tropfen der BP-Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml in entionisiertem Wasser auf ein formvarbeschichtetes Kupfergitter gegeben und dann an der Luft getrocknet wurde. Proben wurden durch Rasterelektronenmikroskopie (H-7500; Hitachi, Tokio, Japan) fotografiert. Die mittlere Größe der BPs wurde mit der Software Image Pro Plus (Media Cybernetics Inc., MD, USA) analysiert. Die Bewertung des Zetapotentials wurde durch Malvern Zeta Sizer (ZEN3600) bestätigt. Röntgenbeugung (XRD) wurde mit einem Bruker D8 Discover Diffraktometer in einer Bragg-Brentano para-fokussierten Geometrie und Cu Kα-Strahlung durchgeführt. Beugungsmuster wurden zwischen 10° und 80° von 2θ . gesammelt mit einem Schritt von 0,01° 2θ und Erfassungszeit von 0,2 s pro Schritt. Die resultierenden Daten wurden mit der Software HighScore Plus 3.0e ausgewertet. Das Raman-Spektrometer (LabRam HR800) mit 514 nm Laseranregung wurde verwendet, um die Raman-Spektren der Probe zu messen. Die Oberflächenzusammensetzung der Probe wurde durch Röntgen-Photoelektronenspektroskopie ([XPS] Omicron NanoTechnology GmbH, Deutschland) gemessen.

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay

Die Wirkung von BPs auf die Zellproliferation wurde unter Verwendung des Zellzählkits (CCK-8)-Assay bewertet. Kurz gesagt, EMSCs (3000 Zellen/Well) wurden in 96-Well-Platten ausplattiert und mit BPs (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 und 512 μg/ml) 24 h bei 37 °C behandelt °C. Für den CCK8-Nachweis wurden 4 h vor der Analyse 10 μl CCK8-Reagenz zum Kulturmedium gegeben. Die optische Dichte (OD) bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Thermo Fisher Scientific, Madrid, Spanien) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die für die weitere Untersuchung verwendete BP-Konzentration wurde basierend auf den Ergebnissen des CCK-8-Assays ausgewählt. Bei der Ki-67-Färbung sind EMSCs (1 × 10 ⁴ ) wurden in 24-Well-Platten kultiviert und durch Immunfluoreszenz für Ki-67 (Kaninchen polyklonal; Kat.-Nr. ab15580; abcam; 1:300) gefärbt. DAPI wurde verwendet, um die Kerne zu färben. Die Bilder wurden durch Fluoreszenzmikroskopie (Vergrößerung, 200-fach; Eclipse Ti; Nikon Corporation) aufgenommen und mit der Software Image Pro Plus analysiert.

Osteogene Differenzierung

Zur osteogenen Differenzierung wurden EMSCs mit einer Dichte von 3.000 Zellen/cm ² . ausgesät und in Wachstumsmedium bis 70 % Konfluenz kultiviert. Die Zellen wurden dann mit Osteogenese-Differenzierungsmedium für 2 Wochen induziert. Um den Einfluss von β-Natriumglycerophosphat zu vermeiden, wurde das Osteogenese-Differenzierungsmedium insbesondere mit 10 % FBS, 0,1 mM Dexamethason und 0,2 mM l-Ascorbinsäure (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) ergänzt nicht mit β-Natriumglycerophosphat. Nach Induktion der Differenzierung wurden alkalische Phosphatase (ALP) und Alizarinrot-Färbung und RT-qPCR verwendet, um die Auswirkungen von BPs auf die osteogene Differenzierung von EMSCs zu untersuchen. EMSCs wurden mit einer Dichte von 2 × 10<. ausgesät sup> 5 Zellen/Well in 6-Well-Platten und inkubiert mit osteogenem Medium. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde die ALP-Färbung unter Verwendung eines ALP-Färbekits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) am 14. Tag bewertet. Alizarinrot S-Färbung wurde angewendet, um die Ablagerung von Calciumphosphat sichtbar zu machen. Kurz gesagt, die fixierten Zellen wurden erneut mit entionisiertem Wasser gewaschen und mit 1 ml/Vertiefung Alizarin-Rot-Färbelösung (0,5% (Gew./Vol.) Alizarin Rot S (Sigma-Aldrich) in PBS für 10 Minuten bei 37 °C inkubiert die Lösung wurde entfernt, die Probe wurde erneut mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der positive Färbebereich, der die verkalkten Knötchen pro Feld anzeigte, wurde mit der Image-Pro plus-Software gezählt und auf die jeweilige Kontrolle normalisiert.

RT-qPCR

Die RT-qPCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, Gesamt-RNA wurde aus Monokulturen isoliert oder unter Verwendung des RNA-Reinigungskits (TaKaRa, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers sortiert. Zwei Mikrogramm mRNA wurden unter Verwendung eines cDNA-Synthesekits (Fermentas) in cDNA revers transkribiert. Die für die RT-PCR verwendeten Primer wurden von Nanjing GenScript Bioengineering Technology and Services Co., Ltd (Nanjing, China) entwickelt und konstruiert, gezeigt in Tabelle 1. RT-PCR wurde mit einem SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix Kit (Fermentas) manipuliert. mit dem ABI Prism 7500-System. Die Daten wurden auf Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) normalisiert, um die relativen Expressionsniveaus anzuzeigen. Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt.

Western Blot

Die kultivierten Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann 30 Minuten lang mit RIPA-Lysepuffer, der einen Phosphatase- und Protease-Inhibitor-Cocktail enthielt, auf Eis lysiert. Um das gesamte TG2 zu sammeln, wurden die Zelllysate und ECM in den 6-Well-Platten mit einem Zellschaber gesammelt. Die Platten wurden mit PBS gewaschen und die Zellwaschflüssigkeiten wurden ebenfalls gesammelt. Die Lysate wurden aus dem Überstand durch Zentrifugation bei 12.000 × g . geerntet 5 Minuten lang gemischt, mit einem gleichen Volumen SDS-Ladepuffer gemischt und dann 5 Minuten lang gekocht. Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kits (Beyotime, Shanghai, China, P0012) bestimmt. Proteine ​​wurden in RIPA-Lysepuffer extrahiert, auf Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und elektrophoretisch auf Nitrozellulosemembranen (Millipore, LA, USA) übertragen. Die Membranen wurden mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 0,01 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 0,5% Tween 20 (Suolaibao, Peking, China) blockiert und mit den angegebenen Antikörpern, einschließlich Anti-TG2 (1:200; sc-48387, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), Anti-FN (1:500; Kat.-Nr. BA1772; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.) und Anti-LN (1:500; Kat.-Nr. BM4921; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), Anti-OCN (1:200; sc-390877, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), Anti-OPN (1:200; sc-73631, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), Anti- COL I (1:500; Kat.-Nr. BA0325; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), bei 4 °C für 12 h. Die Membranen wurden dann mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (1:5000; Boster, Wuhan, China) 2 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Proteinbanden wurden unter Verwendung eines Pierce ECL Plus-Substrats (Thermo Fisher Scientific) sichtbar gemacht und dann mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem (Clinx Science Instruments, Shanghai, China) gescannt.

Inhibitionsexperimente

Um die Beteiligung von TG2 zu bestätigen, wurden TG2-Inhibitionsexperimente an EMSCs durchgeführt. Neutralisierungsexperimente wurden mit einem neutralisierenden Anti-TG2-Antikörper (von BD Biosciences, San Diego, CA) durchgeführt. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten mit normalem Kulturmedium für 24 Stunden ausgesät, um zu haften, und wurden mit Anti-TG2-Antikörper (10 μg/ml) behandelt. Gleichzeitig wurde die Kontrollgruppe eingestellt. Nach der Aussaat in 6-Well-Platten für 24 Stunden wurde die EMSC-Osteogenese 14 Tage lang unter Verwendung von osteogenem Medium mit BPs (2 μg/ml) induziert, und das Inhibitoren enthaltende Kulturmedium wurde alle 7 Tage durch frisches osteogenes Medium ausgetauscht. Alizarinrot S-Färbung wurde angewendet, um die Ablagerung von Calciumphosphat sichtbar zu machen. Western Blotting wurde verwendet, um die Konzentrationen von Osteocalcin, Osteopontin und Kollagen Typ 1 (OCN-, OPN- bzw. COL I-Expression) zu bestimmen.

Immunfluoreszenzfärbung

Die kultivierten Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd 8 h bei 4°C fixiert. Die fixierten Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und 30 Minuten in PBS mit 0,2 % Triton X-100 und 1 % BSA (Suolaibao, Peking, China) permeabilisiert. Nach der Permeabilisierung wurden diese fixierten Zellen mit PBS gewaschen und dann mit primären Antikörpern bei 4 °C für 8 h inkubiert, gefolgt von der Entfernung aller primären Antikörper. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und 2 h bei Raumtemperatur mit Sekundärantikörpern Alexa Fluor-594 (1:800, Life Technologies Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA) bei 37 °C für 2 h inkubiert. Die Kerne wurden mit 4'6-Diamidino-2-phenylindol ([DAPI]; Sigma-Aldrich) gegengefärbt. Alle getesteten Gruppen wurden unter einem Immunfluoreszenzmikroskop beobachtet.

Statistische Analyse

Die Daten wurden aus den drei oben beschriebenen separaten Experimenten erhalten und als mittlere ± ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die Analyse der Datenverteilung wurde mit dem t . des Schülers durchgeführt -Test zur Analyse der Signifikanz von Unterschieden zwischen der behandelten und der Kontrollgruppe. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von dem Tukey-Post-hoc-Test wurde durchgeführt, um die signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zu beurteilen. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Charakterisierung von BPs

Die durch dynamische Lichtstreuung (DLS) gemessene BP-Größenverteilung war im Bereich von 100 bis 200 nm relativ schmal mit einem Spitzenwert bei 132 nm. Das Ergebnis ist in Abb. 1A dargestellt. Das Zetapotential von BPs wurde zu − 23,7 ± 0,65 mV bestimmt (Abb. 1B), was die Stabilität der BPs bestätigt. Die Größe der Partikel wurde durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) weiter untersucht (Abb. 1C). Die Ergebnisse stimmen gut mit der Messung der Partikelgrößenverteilung durch DLS überein.

Charakterisierung von BPs. A Größenverteilung von schwarzen Phosphor-Nanopartikeln (BPs); B Zetapotentialbericht von BPs mit einem Zetapotential von − 23,7 ± 0,65 mV; C Rasterelektronenmikroskopie(REM)-Bilder der BP-Nanoblätter (BPNs). D Raman-Spektren von BPs; E Röntgendiffraktogramm und F P 2p hochauflösende Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS)-Spektren von BPs; G XPS-Spektren von BPs

Die Raman-Streuung (Abb. 1D) zeigte drei markante Peaks bei 362,3, 438,5 und 466,9 cm ⁻¹ verbunden mit dem Out-of-plane-Phonon-Modus (A ¹ _g ) und zwei In-Plane-Modi (B ² _g und A ² _g ) von BP, [17, 18]. XRD (Abb. 1E) zeigt die Phasenreinheit des hergestellten Materials mit einer durchschnittlichen Kristallgröße von 102,7 nm. Die Verbreiterung des Beugungsmusters zeigt die Nanometergröße einzelner Kristallite an. Hochauflösende XPS-Spektren von P 2 p (Abb. 1F) zeigen den Hauptpeak bei 130 eV, der der P-P-Bindung von schwarzem Phosphor entspricht, zusätzlich zu einem zusätzlichen Peak bei 135 eV, der von P-O-Bindungen stammt, die durch Oberflächenoxidation verursacht werden der BPs. BP-Oberflächen wurden mit Wide-Scan-Röntgen untersucht (Abb. 1G).

Charakterisierung von EMSCs

Die Immunfluoreszenzfärbung der Nasenschleimhaut zeigte, dass sich die Nestin-positiven EMSCs in der Lamina propria unter dem respiratorischen Epithel der Nasenscheidewand befanden (Abb. 2A). Die kultivierten EMSCs bei der dritten Passage erschienen als fibroblastenähnliche Zellen und vermehrten sich schnell auf Plastikplatten (Abb. 2B). Wir bewerteten die osteogene Differenzierung in osteogenem Medium durch Alizarinrot-Färbung am 28. Tag (Fig. 2C). Die adipogene Differenzierung in adipogenem Induktionsmedium wurde am Tag 21 durch Anfärben mit Öl-Rot-O-Lösung bewertet (Fig. 2D). Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass fast alle EMSCs Neuralleistenzellmarker exprimierten, wie Nestin (> 95 %) wie in Fig. 2E gezeigt und Vimentin (> 95 %) wie in Fig. 2F gezeigt. Die Ergebnisse der Koexpression von Stammzellmarkern weisen darauf hin, dass diese EMSCs eine Art mesenchymaler Stammzelle sind.

Identifizierung der ektodermalen mesenchymalen Stammzellen (EMSCs). A Die Nestin-positiven EMSCs (cy3, rot) befanden sich in der Lamina propria unter dem respiratorischen Epithel der Nasenscheidewand; B Ein Phasenkontrastbild zeigte, dass die kultivierten EMSCs bei der dritten Passage als fibroblastenähnliche Zellen erschienen und sich schnell auf Plastikplatten vermehrten; C Die osteogenen differenzierten EMSCs in osteogenem Medium wurden mit Alizarinrot gefärbt; D Die adipogen differenzierten EMSCs in adipogenem Induktionsmedium wurden mit Ölrot-O gefärbt; E , F Immunfluoreszenzfärbung der Neuralleistenzellmarker zeigte, dass fast alle EMSCs Nestin und Vimentin exprimierten. Der IgG-Cy3 (rot) wurde als zweiter Antikörper für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet und die Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau) gegengefärbt

Zytotoxizität

Als Vorversuch wurde ein CCK-8-Assay durchgeführt, um die Zytotoxizität von BPs zu beurteilen. Die Lebensfähigkeit von EMSCs nach 24 Stunden Exposition gegenüber den BPs ist in Abb. 3 dargestellt. Es wurde keine signifikante Zytotoxizität nach Exposition gegenüber bis zu 32 μg/ml BPs festgestellt. Die Exposition gegenüber BPs verursacht jedoch bei höheren Dosen (> 32 μg/ml) eine signifikante Zytotoxizität. Ki-67-Expression im Nukleolus und in den Chromosomen wurde in der Gruppe mit niedriger Dosis beobachtet (Abb. 4A–C). Das Verhältnis zwischen den Ki-67-positiven Kernen und der Gesamtpopulation der Kerne zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied bei niedrig dosierten BP-behandelten EMSCs im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (Abb. 4D). Daher wählen wir in der vorliegenden Studie Konzentrationen von 2 und 4 μg/ml BP in den folgenden Experimenten, bei denen keine signifikante Zytotoxizität beobachtet wurde.

Die Zytotoxizität von BPs. Die Zellen wurden mit BPs (0, 2, 4, 8, 16, 32, 64.128, 256 und 512 µg/ml) für 24 Stunden behandelt und die Lebensfähigkeit der EMSC wurde mit dem Zellzählkit (CCK-8) Proliferationsassay (n = 9). Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. **p < 0.01.

Die Bewertung der Zellproliferation der mit BPs behandelten Gruppe. EMSCs wurden 24 Stunden lang mit BP (0, 2 und 4 μg/ml) behandelt. Die Zellproliferation wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-Ki67-Antikörper (rot) und DAPI (blau) gemessen und zusammengeführte Bilder wurden gezeigt (A –C ). Ki67-positive Zellen unter 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-positiven Zellen wurden in zwei Hochleistungsfeldern auf jeder der drei Platten gezählt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (D ).

Alizarin Red S-Färbung

Wie in Abb. 5A gezeigt, wurde die Mineralisierung in den Zellen durch Alizarin-Rot-S-Färbung bewertet, nachdem sie 14 Tage lang mit dem konditionierten Medium behandelt worden war. In drei Gruppen wurden alle Kalziumknötchen beobachtet, während in der Kontrollgruppe ungeformte Kalziumknötchen vorhanden waren. Im Vergleich zur Kontrollgruppe waren die in den Gruppen mit 2 und 4 μg/ml abgelagerten Kalziumknötchen größer (p < 0,05), aber es wurden keine offensichtlichen Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen beobachtet (p> 0,05) wie in Abb. 5C gezeigt.

Alkalische Phosphatase (ALP) und Alizarin Red Färbeassays. A Osteogen-differenzierte EMSCs, gefärbt mit Alizarin Red-Lösung am Tag 14; B Die ALP-Färbung wurde unter dem Mikroskop sichtbar gemacht; C die Grafik zeigt die Quantifizierung der Ablagerungsbereiche von Alizarinrot; D eine signifikant höhere ALP-Aktivität wurde in der BP-behandelten EMSC-Gruppe gezeigt als in der Kontrollgruppe. Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD ausgedrückt. **p < 0.01

ALP-Tests

Die ALP-Färbung wurde durchgeführt, um die osteogene Differenzierung von EMSCs zu untersuchen. Im Vergleich zu denen in der Kontrollgruppe hatten die EMSCs in den 2 und 4 μg/ml BP-Gruppen eine dunklere Farbe (Abb. 5B), was darauf hindeutet, dass die Zugabe von BPs eine Verstärkung der ALP-Expression in EMSCs verursachte. Die mit BPs behandelten Zellen hatten am Tag 7 eine höhere ALP-Aktivität als die Kontrollgruppe (p> 0,05), aber es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen 2 und 4 μg/ml beobachtet (p> 0,05) wie in Abb. 5D gezeigt.

RT-qPCR

Die wichtigsten Differenzierungsmarker, einschließlich des Runt-related Transcription Factor 2 (RUNX 2), ALP, COL 1, OCN, OPN und des knochenmorphogenen Proteins 2 (BMP-2), wurden an Tag 14 analysiert, wie in Abb. 6 gezeigt aller dieser Genmarker wurde am Tag 7 in den drei Zellgruppen gefunden. Es wurden keine offensichtlichen Unterschiede in der Genexpression zwischen 2 und 4 μg/ml-Gruppen gefunden. Im Vergleich zu Kontrollzellen war jedoch die Expression der oben beschriebenen Gene in BP-behandelten Zellen signifikant erhöht.

BPs potenzieren die Osteogenese von EMSCs. EMSCs wurden in osteogenem Medium mit 0 μg/ml, 2 μg/ml, 4 μg/ml BPs 14 Tage lang gezüchtet. Die Expression von Genen, die an der Osteogenese von EMSCs beteiligt sind, wurde durch quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) quantifiziert. **p < 0.01, *p < 0.05.

BPs verbessern die Osteogenese von EMSCs durch Hochregulieren der TG2-Expression

Da für eine Vielzahl von Zellen ein signifikanter Einfluss von TG2 auf die Integrin-vermittelte Differenzierung und ECM-Ablagerung nachgewiesen wurde, untersuchten wir, ob BPs die osteogene Differenzierung von EMSCs durch Hochregulierung der TG2-Expression fördern würden. Wie in Abb. 7 gezeigt, haben wir in den mit BP behandelten Gruppen eine offensichtliche Hochregulierung des intrazellulären und extrazellulären TG2 festgestellt. Laminin (LN) und Fibronectin (FN) in den mit 2 und 4 μg/ml BP behandelten Zellen waren höher als in der Kontrollgruppe (Fig. 7A). EMSCs, die BPs ausgesetzt waren, zeigten einen ungefähr zweifachen Anstieg der TG2-Spiegel im Vergleich zur Kontrollgruppe, aber es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den BP-behandelten Gruppen beobachtet (Fig. 7B). Als makromolekulares Protein konnte der Anti-TG2-Antikörper die Zellmembranen nicht durchdringen. Somit wurde das extrazelluläre TG2 durch den Antikörper blockiert und konnte verschiedene Wachstumsfaktoren und ECM-Proteine ​​nicht quervernetzen. Die Ergebnisse von Alizarin Red S (Abb. 8A, C) zeigten, dass Anti-TG2 den BP-vermittelten Anstieg der Calcium- und ECM-Ablagerung deutlich unterdrückte. Wie in 8D gezeigt, hemmte Anti-TG2 unterdessen signifikant die Zunahme der ALP-Aktivität der BP-behandelten Zellen. Moreover, anti-TG2 effectively abolished the effects of BPs on the bone matrix proteins expression, including OCN, OPN, and COL I (Fig. 9).

Transglutaminase 2 (TG2) was involved in the osteogenic differentiation of EMSCs. EMSCs were incubated with BPs (2 and 4 μg/ml) for 14 days, and fibronectin (FN), LN, and TG2 levels were assessed by immunoblotting. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05.

Osteogenic differentiation of EMSCs with TG2 neutralizing antibody. A ALP staining. B ARS staining performed to examine extracellular mineralization. C Quantitative ALP analysis. D Quantitative Alizarin red staining analysis. **p  < 0.01

Anti-TG2 inhibited BP-induced EMSC osteogenic differentiation. A Representative western blots of osteoponin, osteocalcin, and collagen 1 (OPN, OCN, LN, FN, and COL I, respectively) in differentiated EMSCs following treatment with 2 μg/ml BPs and 2 μg/ml anti-TG2 or 2 μg/ml BPs alone. B Quantification of OPN, OCN, and COL I protein expression. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05

Discussion

To the best of our knowledge, modification of phosphorus was first exhaustively studied as early as 1914; unfortunately, these studies did not receive much attention for an entire century [27]. Phosphorus is one of the essential elements making up about 1% of the total body weight as a bone component in the human body [28], while most of the other materials cannot warrant such a natural biocompatibility. In 2014, BP was introduced as a new member of the 2D layered materials.

In this study, the BP nanoparticles were prepared on a large scale from bulk BP crystals by using an improved mechanical grinding and continuous ultrasound method. Compared with other methods, this ultrasound and mechanical grinding synthesis is facile and efficient and enables production of BPs on a large scale. For characterization of BPs, SEM was carried out to examine the morphology of BPs. SEM images illustrated that BPs were successfully synthesized, and the typical sizes of BPs are about 100 to 150 nm. The size of particles was further investigated using DLS in the relatively narrow range around 133 nm. The result of SEM corresponded well with the measurement of particle size measurements based on DLS. Interestingly, previous studies demonstrated that BP with larger lateral size has higher cytotoxicity than small BP, while ultra-small BPs were even considered nontoxic up to the high concentration of 1000 μg/ml [29, 30]. Thus, for biomedical applications, the BP nanomaterials still need further study. In addition, Raman scattering revealed the presence of three prominent peaks at 361.5, 437.1, and 465.2 cm ⁻¹ that were associated with the out-of-plane phonon mode (A ¹ _g ) and two in-plane modes (B ² _g and A ² _g ) of BPs. These results were consistent with previous reports [31] in which showed that the BPs had been prepared successfully from bulk BP. XRD shows the phase purity of the prepared BPs. Broadening of the diffraction pattern indicates the nanometer size of individual crystallites.

To evaluate the stability and degradation rate of BPs, Wang and co-workers performed an experiment in which normalized absorption spectra of the BP nanosheets were dispersed in water and exposed to air. After 6 days, they found that the absorbance of the BP nanosheets at 450 nm decreased by 43% compared to the initial value, indicating that BP is easily degraded in the physiological environment [32]. Also, it is well-known that BP is sensitive to water and oxygen, but this shortcoming is considered a merit for biomedical applications. Because of these special characteristics compared with other biomaterials, BPs could potentially avoid material accumulation in human body and then reduce cytotoxicity caused by such material noumenon.

Since MSCs play key roles in bone formation, there is no doubt that transplanting MSCs in animal models of bone defects enhance bone regeneration and promotes functional recovery via BMSC acquisition [33]. Unfortunately, BMSC acquisition procedures are painful for the donor and frequently cause surgical site infection, and the number of harvested BMSCs is low [34]. Previous studies from our laboratory and other reports have shown that EMSCs could be isolated from several adult tissues, such as dental pulp and the nasal mucosa, without causing invasive injury. Moreover, EMSCs were easily induced into osteoblasts, rendering those cells as promising seed cells for bone tissue engineering. Therefore, EMSCs were used in this study. We attempted to obtain the maximum safety BP concentration for EMSCs. As shown in the results, we achieved the maximum safe concentration of BPs (less than 64 μg/ml). The concentrations of 2 and 4 μg/ml of BPs were chosen for further study to avoid any possible potential toxic. The Ki-67 assay was also used to quantify and evaluate EMSC proliferation in these samples after treating these cells with BPs (2 and 4 μg/ml) for 24 h. We did not observe any statistically significant suppression of EMSCs growth in the case of BPs. Meanwhile, our results indicate that during treatment with safe concentrations of BPs, promotion of EMSCs proliferation also occurred.

Some reports have shown that the concurrent binding of BP and calcium ions may benefit osteogenic differentiation, thereby leading to enhanced bone regeneration [35, 36]. To investigate these effects, in vitro EMSCs exposed to BPs were used in osteogenic differentiation experiments. Interestingly, the results of the ALP test and Alizarin Red S staining show that exposure to BPs could promote rather than compromise osteogenetic differentiation of EMSCs compared to the control group. Similar findings have been reported in which phosphorus-rich materials can stimulate mineralization and bone regeneration. Co-expression of osteogenesis-related genes, including ALP, OPN, OCN, COL1, and RUNX2, in differentiated EMSCs was detected at days 7 and 14 by RT-qPCR. Indeed, the expression levels of these osteogenic genes significantly increased in differentiated EMSCs treated with BPs, also providing confirmation of the osteogenic potential of the BPs. Similar results were reported in which BP could induce both the proliferation and osteogenic differentiation of human pre-osteoblast cells. Together these results indicate that the BPs were able to induce osteogenic differentiation of EMSCs.

It can be asked, “How do BPs promote osteogenetic differentiation of EMSCs?” It is well accepted that phosphorus can capture Ca ²⁺ in vivo to form calcium phosphate deposits that accelerate bone regeneration, while BP can be the resource of phosphorus ions [36]. Tong et al. believes that BP generate mild heat (40–42 °C), which causes up-regulation of heat shock protein (HSPs) expression and stimulates bone regeneration [37, 38]. Moreover, in this study, the upregulated activation of TG2 levels was also observed in BPs treatment groups. To the best of our knowledge, TG2 has important enzymatic and non-enzymatic functions at these locations in which it crosslinks various ECM proteins and modulates the interactions of cells with the ECM and soluble growth factors by non-covalent interactions with and regulation of integrins [39,40,41]. Obviously, the BPs can react strongly with oxygen and water and finally degrade to non-toxic phosphate in aqueous solutions, which is a crucial component of ATP. Nakano Y et al. reported that ATP can act as a significant phosphate (Pi) source for mineralization in MC3T3-E1 osteoblast cultures, indicating that ATP-hydrolyzing enzymes could induce mineral deposition [42]. They also found that TG2 could not only act as a phosphatase but could be involved in ATP hydrolysis in the osteoblast cultures thus further contributing to the elevation in Pi levels required for mineral deposition, which may be beneficial to EMSC energy metabolism. This process may be part of the contribution that BPs makes toward enhancement of EMSC osteogenic differentiation. On the other hand, thanks to TG2 bio-functions, a wide variety of ECM adhesion proteins, including LN, COL I, and FN, could maintain a stable state. Indeed, in the present study, we observed that ECM (FN, COL I, and LN) were significant higher in BP-treated EMSC groups. BPs provide a favorable ECM microenvironment for promoting greater osteogenic EMSC differentiation and proliferation.

Until now, no secretory signal sequences and hydrophobic or transmembrane domains have been clearly identified in TG2 because the protein is not localized in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi compartments [39, 43], and only few studies reported about these factors that control TG2’s secretion. Therefore, it remains unclear as to the exact mechanism of BP regulation of expression patterns of TG2 in the progress of EMSC osteogenic differentiation.

Conclusion

In the present study, BPs were successfully fabricated using mechanical grinding and continuous ultrasound method. At bio-safe concentrations, BPs activated TG2, and promoted the expression of ECM, which further promoted osteogenic differentiation of EMSCs. From these results, we can conclude that BPs would be suitable for incorporation into tissue-engineered scaffolds that utilize EMSCs to repair bone defects. Although our research highlights the great potential of BPs in nano-biomedicine, large-scale preclinical and clinical studies concerning its safety are needed before any clinical applications are established.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The datasets generated during and/or analyzed during the study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abkürzungen

BPs:

Black phosphorus nanoparticles

EMSCs:

Ectodermal mesenchymal stem cells

TG2:

Transglutaminase 2

2D:

Two-dimensional

ECM:

Extracellular matrix

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

NMP:

N -Methyl-2pyrrolidone

PBS:

Phosphate-buffered saline

DMEM/F12:

Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F12

FBS:

Fetal bovine serum

SD:

Sprague Dawley

SEM:

Scanning electron microscopy

XPS:

X-ray photoelectron spectroscopy

CCK-8:

Cell counting kit

OD:

Optical density

RT-qPCR:

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

GAPDH:

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

BSA:

Bovine serum albumin

TBS:

Tris-buffered saline

DAPI:

4′6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamic light scattering