Knochenmorphogenes Protein-2 (rhBMP2)-beladene Seidenfibroingerüste zur Verbesserung der Osteoinduktivität beim Knochengewebe-Engineering

Hintergrund

Die Regenerationsfähigkeit des Knochens ermöglicht die selbstständige Reparatur kleiner Knochenbrüche. Der Knochen wird gebildet, gefolgt von der Vereinigung und schließlich der Rekonstruktion der ursprünglichen Form und Form des Knochens. Diese Kapazität ist jedoch begrenzt, wodurch Autotransplantate oder Allotransplantate für die Behandlung benötigt werden [1]. Bei der Allotransplantation wird der Knochen von einem separaten Spender entnommen, der eine immunologische Reaktion verursachen kann. Die Autotransplantation, bei der der Knochen aus dem eigenen Körper des Patienten gewonnen wird, verursacht keine immunologischen Probleme, wird jedoch durch die ausreichende Menge an verfügbaren Knochen eingeschränkt [2,3,4].

Tissue Engineering wird als potenzielle Technologie zur Überwindung der immunologischen Beschränkungen der Allo- und Autotransplantation angesehen. Beim Tissue Engineering werden spezialisierte Zellen wie humane mesenchymale Stammzellen oder Osteosarkomzellen (MG63) unter einer geeigneten Umgebung über einem vorgefertigten Gerüst kultiviert und dieses System aus Zellen und Gerüst als Transplantat verwendet [5, 6].

Das Gerüst wird verwendet, um Zellen eine Verankerung und eine biochemische Nische für das Überleben und die Vermehrung bereitzustellen. Mehrere Eigenschaften, z. mechanische Festigkeit, Osteoinduktion, Bioresorption, abgestufte Porosität und Biokompatibilität sind bei der Auswahl des Materials für die Gerüstherstellung zu berücksichtigen. Die Osteoinduktion (Induktion der Knochenbildung) ist eine der erforderlichen Materialeigenschaften für die Herstellung von Gerüsten für das Knochengewebe-Engineering (BTE) [7]. Gerüste mit osteogenen Faktoren sind wirksam zur Nachahmung des Knochengeweberegenerationsprozesses, der Angiogenese und Osteogenese koppelt, was Vorläuferzellen und deren Differenzierung rekrutieren kann. Knochenmorphogene Proteine ​​(BMPs) sind die Klasse von Wachstumsfaktoren, die die Knochenbildung induzieren und werden zusammen mit demineralisierter Knochenmatrix (DBM) und Calciumphosphat für HdO-Anwendungen vorgeschlagen [8,9,10].

Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von Metallen, Keramiken, synthetischen Polymeren und Verbundstoffen sowie Seidenfibroin als potenzielle Materialien für die Gerüstherstellung bei HdO berichtet. Seidenfibroin (SF) wurde aufgrund seiner bemerkenswerten mechanischen und biokompatiblen Eigenschaften als geeignetes Material für die Gerüstherstellung für Tissue-Engineering-Anwendungen beschrieben [5]. Bis heute wurde kein Bericht veröffentlicht, in dem die assoziativen Vorteile von BMPs mit elektrogesponnenen SF-Nanogerüsten bewertet wurden.

Hier berichten wir über die Herstellung neuartiger rekombinanter humaner knochenmorphogener Protein-2 (rhBMP2)-konjugierter SF-elektrogesponnener Nanofasergerüste. Die Gerüste wurden mit denen von reinen SF-Gerüsten verglichen, um die Wirkung der rhBMP2-Konjugation auf die Osteoinduktion aufzuklären. Die Zelllebensfähigkeit und die Zellproliferationseigenschaften wurden ebenfalls gemessen, um die Wirksamkeit des Gerüsts für neue und bessere Knochengewebe-Engineering-Anwendungen zu ermitteln.

Methoden

Herstellung wässriger Lösungen von SF/BMP2

Zuerst wurde SF aus den Kokons der Seidenraupe Bombyx mori . isoliert , als wässrige Lösung. Das etablierte Protokoll wurde mit leichten Modifikationen befolgt [11]. Kokons wurden in 100 ml 0,02 M Na₂ . gekocht CO₃ 20 min lang gewaschen und anschließend gründlich mit destilliertem Wasser gespült, um überschüssiges wasserlösliches Sericin und Wachs zu entfernen. Extrahiertes Fibroin wurde dann 4 h bei 60 °C in 9 M Lithiumbromidlösung gelöst und weitere 4 Tage gegen Wasser dialysiert. Die Endkonzentration wurde durch Wiegen der Trockenmasse nach dem Trocknen bestimmt und betrug 7% w /v . Diese Lösung wurde dann verwendet, nachdem sie durch Dialyse auf verschiedene Konzentrationen gegen 1 L 25 % Polyethylenglycol (PEG, 10.000 g mol ⁻¹ ) Lösung bei Raumtemperatur. Verdünnte wässrige SF-Lösungen wurden durch Verdünnen mit destilliertem Wasser hergestellt, und alle Lösungen wurden bei 10 °C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Lyophilisiertes Pulver von rekombinantem humanem knochenmorphogenem Protein-2 (rhBMP2) wurde in PBS (pH 3,8) gelöst. Die Proteinlösung wurde mit 0,22 µm Spritzenfiltern sterilisiert und als wässrige Lösung unter ständigem Rühren zu jeder Fibroinlösung gegeben. Glutaraldehyd-vermittelte Vernetzung wurde verwendet, um BMP mit Fibroin zu assoziieren. Kurz gesagt wurden für 10 ml Reaktionsmischung jeweils 5 ml 6% Seidenfibroin und 1% rhBMP2 unter Verwendung von 200 &mgr;l Glutaraldehyd und 40 &mgr;l 12 N HCl als Gruppenaktivierungsmittel vernetzt. Mit diesem Verfahren wurden drei Lösungen hergestellt:(i) 3% Seidenfibroin ohne rhBMP2 (SF), (ii) 3% Seidenfibroin mit 0,5% rhBMP2 (SF+rhBMP2) und (iii) 12% Seidenfibroin mit 0,125% rhBMP2 wie in (ii) (4SF + rhBMP2). Diese Lösungen wurden in Elektrospinnverfahren zur Herstellung von Gerüsten verwendet.

Gerüstherstellung durch Elektrospinnen

Für die Gerüstherstellung wurde jede Lösung in eine 5-ml-Glasspritze mit einer Edelstahlnadel (25 G, ID 0,26 mm, Sigma Aldrich) gefüllt, die an eine 5,5-kV-Gleichstromversorgung angeschlossen ist. Für die Vorbereitung der Fasern wurde die Durchflussrate am Auslass bei 0,4 ml h ⁻¹ . gehalten unter Verwendung einer Spritzenpumpe, und elektrogesponnene Fasern wurden auf einer Aluminiumfolie gesammelt, die in einem Abstand von 15 cm von der Kapillarspitze gehalten wurde. Die Proben wurden jeweils 4 Stunden lang gesammelt.

Rasterelektronenmikroskopie

Zur morphologischen Untersuchung präparierter Gerüste wurde REM mit Zeiss EVO40SEM durchgeführt. Proben wurden mit Gold sputterbeschichtet, bevor die Scanbilder weiterverarbeitet wurden. Die Bestimmung des Faserdurchmessers erfolgt durch Mittelung der Durchmesser von 10 zufälligen Fasern im Bildrahmen.

Mechanische Eigenschaften des Gerüsts

Druckversuche wurden durchgeführt, um die mechanischen Eigenschaften der entwickelten Gerüste unter Verwendung eines elektromechanischen Einsäulen-Tischprüfgeräts von Instron (Modell 3345, Instron, Canton, MA) zu bewerten. Fasern mit 0,2 mm Durchmesser, die durch Elektrospinnen bei längerer Dauer erhalten wurden, wurden verwendet, um die Zugfestigkeit und Bruchdehnung aus den Spannungs-Dehnungs-Kurven bei 25 °C und 50 % Luftfeuchtigkeit zu bestimmen.

Schwellungsstudie

Zur Messung des Quellverhältnisses wurde jede Formulierung in PBS (pH 7,4) bei 37 °C gelöst. Proben wurden in vorbestimmten Zeitintervallen entnommen und das Trockengewicht wurde unter Verwendung einer elektronischen Waage gemessen. Der Test wurde fortgesetzt, bis das Gleichgewichtsgewicht erreicht war. Das Quellverhältnis wurde wie folgt ausgedrückt:

wo, W _o =anfängliches Trockengewicht der Nanofaser-Matrizen und W _s =Gewicht der gequollenen Nanofaser-Matrizen zu jedem Zeitpunkt.

Zellkultur

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) wurden in der vorliegenden Studie verwendet, um das osteoinduktive Potenzial der hergestellten Nanogerüste zu bewerten. hMSCs wurden kultiviert und in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin bei 37 °C in 5 % CO₂ . gehalten befeuchtete Atmosphäre, bis 90% Konfluenz erreicht wurde. Die Zellen wurden dann trypsiniert, zentrifugiert und zur Quantifizierung in Medium resuspendiert.

Gerüste wurden durch Waschen mit Ethanol und Bestrahlen mit UV-Licht für 30 Minuten sterilisiert und danach mit PBS (pH 7,4) gewaschen. Gerüste werden vor der Zellaussaat mit DMEM behandelt. 20 µl Zellsuspension wurden tropfenweise zu jedem Gerüst gegeben und eine Plastikfolie diente als Kontrolle. Gerüste wurden in befeuchteter Atmosphäre (37 °C, 5 % CO₂ .) in Ruhe gehalten ) für 30 Minuten. Dann wurden die Gerüste 21 Tage lang in DMEM inkubiert, wobei jeden zweiten Tag das Medium regelmäßig nachgefüllt wurde.

Zelladhäsionstest

Um die Adhäsionskapazität von Zellen mit dem Scaffold zu beurteilen, wurden die Zahlen der nicht adhärierten Zellen nach 1, 3 und 6 h anfänglicher Aussaat gemäß der Methode in der Literatur mit leichten Modifikationen [6] gezählt. Das Zellmedium wurde gesammelt und die Zellzählung wurde mit einem Hämozytometer durchgeführt. Die Differenz zwischen der anfänglichen Aussaatzahl und der Anzahl der nicht anhaftenden Zellen wurde als die Anzahl der anhaftenden Zellen betrachtet. Die Ergebnisse wurden in Prozent der Adhäsion gemäß der folgenden Gleichung ausgedrückt:

Zytotoxizitäts-Assay

Um die toxische Wirkung von Nanofaser-Matrizen zu messen, wurde ein MTT-Assay durchgeführt. Nach dem jeweiligen Zeitrahmen wurden die Konstrukte in MTT-Lösung (1 mg mL ⁻¹ .) inkubiert Stammlösung in PBS (pH 7,4) im Verhältnis 1:10) verdünnt und 4 h inkubiert. Während dieser Inkubationszeit wandeln lebensfähige Zellen MTT in Formazansalz um. Das Formazansalz wurde durch Zugabe von DMSO gelöst und 20 min beiseite gehalten. Die vom Formazansalz stammende Absorption wurde quantitativ gemessen, indem die Änderungen der Absorption bei 570 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts aufgezeichnet wurden.

Zellproliferationsassay

Ein Alamarblau (AB)-Farbstoffreduktionsassay wurde durchgeführt, um die Proliferation von Zellen innerhalb des Gerüsts zu bestimmen. Die Gerüste wurden in mit DMEM verdünntem Farbstoff 4 h inkubiert und die Farbstoffreduktion wurde spektrophotometrisch gemessen. Die prozentuale AB-Reduktion wurde wie folgt berechnet:

wo, ελ ₁ =molarer Extinktionskoeffizient von Alamarblau bei 570 nm und ελ ₂ =der molare Extinktionskoeffizient von Alamarblau bei 600 nm im oxidierten (ε _Ochse ) und reduziert (ε _rot ) Formen. Aλ ₁ und Aλ ₂ bezeichnet die Extinktion der Testvertiefungen.

A’λ ₁ =Extinktion der Negativkontrolle bei 570 nm.

A’λ ₂ =Extinktion der Negativkontrolle bei 600 nm.

ALP-Assay

Die Produktion von alkalischer Phosphatase (ALP) durch kultivierte hMSC innerhalb des Gerüsts wurde gemäß dem Herstellerprotokoll im Kit gemessen [12]. Kurz gesagt, steriles PBS (pH 7,4) wurde beim Waschen und Inkubieren von Gerüsten verwendet, gefolgt von Homogenisierung mit 1 ml Tris-Puffer (1 M, pH 8,0) und Beschallung für 3 Minuten auf Eis. 25 µl des Lysats wurden dann mit 1 ml p-Nitrophenylphosphat-Lösung (16 mM) 5 min bei 30 °C inkubiert. Spektrophotometrische Messungen wurden bei 405 nm durchgeführt, um die Produktion von p-Nitrophenol in Gegenwart von ALP zu überwachen.

In-vivo-ALP-Aktivität

Neun männliche athymische Nacktratten mit einem Gewicht von jeweils 100–120 g wurden entnommen und beidseitig an den Bauchmuskeln präpariert, um Beutel zu erzeugen. Ein Nacktmausmodell wurde verwendet, um das osteoinduktive Potenzial des Gerüsts in vivo zu demonstrieren. Einer der drei Gerüsttypen (5 mm × 5 mm) wurde geschnitten und separat in die Muskeltaschen gepackt. Der Beutel wurde dann mit einem nicht resorbierbaren Nahtmaterial verschlossen. Nach 14 Tagen Operation wurden die Implantate durch Exzision der rektalen Bauchmuskeln entnommen und in PBS aufbewahrt. Muskellappen wurden herausgeschnitten, und es wurde Explantatgewebe erhalten, das in Extraktionspuffer homogenisiert wurde, um alkalische Phosphatase freizusetzen. Für die Messung der ALP-Aktivität wurden 50 µl Aliquot der Lösung verwendet.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und die präsentierten Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) der Proben formatiert, sofern nicht anders angegeben. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde unter Verwendung der Statistiksoftware Origin 6.0 durchgeführt, um unsichere Unterschiede und signifikante Unterschiede zu bewerten. P ein Wert von 0,05 oder weniger bedeutet signifikante Unterschiede zwischen den Studiengruppen.

Ergebnisse

Morphologie des Gerüsts

SEM-Bilder (Abb. 1) des hergestellten Gerüsts zeigten eine fein gesponnene Nanofaserstruktur. Die durchschnittlichen Faserdurchmesser in SF- und SF+BMP2-Gerüsten scheinen bei allen Konzentrationen im Bereich von 100 bis 900 nm ähnlich zu sein, da der Durchmesser eine Funktion der Zeit ist, in der das Elektrospinnen durchgeführt wurde [13], während SF Nanofasern erwiesen sich als einheitlich, und die BMP2-Konjugation führte zu uneinheitlichen Faserdurchmessern. Die Porengröße der Gerüste scheint in den hergestellten Gerüsten homogen und unabhängig von der Fibroinkonzentration zu sein. Die Konzentration von SF beeinflusst die Porengröße nicht wesentlich [11].

REM-Aufnahmen von präparierten Gerüsten. a SF. b SF+rhBMP2. c 4SF+rhBMP2

Mechanische Eigenschaften des Gerüsts

Spannungs-Dehnungs-Kurven von Nanofasergerüsten sind in Abb. 2 dargestellt. Es wurde beobachtet, dass die Zugabe von BMP die mechanischen Eigenschaften des SF-Gerüsts nicht verändert, aber mit der Erhöhung der Konzentration des Fertigungsmaterials (SF) wurde die Zugeigenschaft der Matrizen verbessert . Dies kann auf die Bildung von Bindungen zwischen den Fasern während der Vernetzung zurückzuführen sein. SF-Fasern mit niedriger Konzentration zeigten daher keine bessere mechanische Festigkeit im Vergleich zu höheren.

Spannungs-Dehnungs-Beziehung von elektrogesponnenen Nanofasern. Die Spannungs-Dehnungs-Beziehung wurde zwischen (a) SF, (b) SF+rhBMP2 und (c) 4SF+rhBMP2 Gerüst verglichen

Schwellungsstudie

Die Quellverhältnisse der Gerüste als Funktion der Zeit wurden in Abb. 3 dargestellt. Die Gerüste quollen anfangs gleichmäßig mit der Zeit an und erreichten nach etwa 380 min das Gleichgewicht. rhBMP2-verknüpfte Fasern absorbierten im Vergleich zu reinen SF-Gerüsten mehr Wasser, was auf die Zunahme hydrophiler Taschen aufgrund der BMP2-Assoziation hindeutet. SF-Fasern wurden auf ∼ 70 % äquilibriert, während BMP2-haltige Fasern auf ∼ 81 % Wasser äquilibriert wurden.

Quellvermögen des hergestellten Gerüsts. Nach der Modifizierung mit SF+rhBMP2 und 4SF+rhBMP2 wurden Veränderungen der Quelleigenschaft des SF-Gerüsts beobachtet

Zelladhäsionstest

Die Anhaftung der Zellen an das Gerüst ist für das Zellwachstum und die Induktion der Differenzierung erforderlich. In dieser Studie beobachteten wir, dass hMSCs gut an den Gerüsten hafteten, und die Haftung von hMSC an den 4SF-BMP2-, SF-BMP2- und SF-Gerüsten wurde in Abb. 4 dargestellt.

Histogramm, das die prozentuale Adhäsion gegen die Zeit für drei Zeitpunkte darstellt. Änderungen des Adhäsionsniveaus in (a) SF, (b) SF+rhBMP2 und (c) 4SF+rhBMP2 Gerüst

Es gab Bedenken hinsichtlich eines Haftungsverlusts im gemischten Gerüst, der mit den beobachteten Ergebnissen ausgeschlossen wurde. Die Mischung mit BMP2 verringert die Haftfähigkeit des Gerüsts nicht. Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, wurde gut verstanden, dass mit einer Zunahme der Porengröße (Abnahme der SF-Konzentration) die Anhaftung der Zelle an das Gerüst zunimmt. ANOVA zwischen den drei Formulierungen unterscheidet signifikant Variationen in der 3. und 6. Stunde. In der ersten Stunde wurde jedoch kein signifikanter Unterschied beobachtet.

Zytotoxizitätsassay und Zellproliferationsassay

Die Lebensfähigkeit der Zellen war in den rhBMP2-konjugierten Gerüsten signifikant erhöht, und die konstruierten Gerüste erzeugen keine zytotoxischen Wirkungen auf die betreffenden Gastzellen ( 4 ) und die Zellen proliferierten vergleichsweise gut in allen Gerüsten 5 steigender Trend der Lebensfähigkeit mit der Anzahl der Tage, und das SF+BMP2-Gerüst zeigte zu jedem Zeitpunkt die geringste Toxizität. Die ANOVA zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den Werten der Zelllebensfähigkeit der drei betroffenen Formulierungen.

Zelllebensfähigkeitsassay, dargestellt als Histogramm für vier Zeitpunkte. Der Zellviabilitätsassay wurde durch den MTT-Assay durchgeführt und die Ergebnisse sind als Prozentsatz relativ zur Kontrolle dargestellt.

Aus Fig. 6 kann die Zellproliferation untersucht werden. Die Zellen proliferierten gut in allen drei Gerüstpräparationen mit dem besten in SF+BMP2 zu jedem Zeitpunkt. Größere Poren im SF + BMP2-Gerüst boten maximalen Raum für das Zellwachstum. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen der Gruppe wurde anhand der ANOVA gut nachgewiesen.

Darstellung der Zellproliferation als Prozentsatz der Alamarblau-Farbstoffreduktion zu vier Zeitpunkten für SF, SF+BMP2 und 4SF+BMP2

ALP-Assay

Die ALP-Aktivität ist ein Standardmarker für osteoinduktive Eigenschaften der Umgebung der Zelle [13]. In unserem Experiment beobachteten wir eine höhere ALP-Aktivität in den SF+BMP2-Konstrukten im Vergleich zu nur SF-Konstrukten (Fig. 7). Nanostrukturierte SF-Gerüste konnten auch allein eine Osteoinduktion zeigen, aber wie aus Abb. 7 und ANOVA ersichtlich, erwies sich das SF+BMP2-Gerüst als das beste unter den betroffenen Gerüsten. Die ALP-Konzentration wurde im Laufe des Experiments erhöht, und die Konstrukte mit höherer SF-Konzentration zeigten jedoch eine geringere ALP-Aktivität im Vergleich zu Konstrukten mit niedrigerer SF-Konzentration.

Darstellung der ALP-Aktivität zwischen drei verschiedenen Strategien zur Gerüstherstellung zu verschiedenen Zeitpunkten. (a) SF (b) SF+rhBMP2 (c) 4SF+rhBMP2-Gerüst

In-vivo-ALP-Aktivität

8 zeigt die ALP-Aktivität von Explantaten für (a) SF, (b) SF+rhBMP2 und (c) 4SF+rhBMP2. Wie erwartet induzierten Explantate aus einer Behandlung, die rhBMP2 enthielten, eine höhere ALP-Aktivität, während mit rhBMP2-freiem Gerüst behandelte Mäuse eine niedrigere ALP-Aktivität produzierten.

In-vivo-ALP-Aktivität der nach der Behandlung erhaltenen Explantate. Das nackte Mausmodell wurde verwendet, um das osteoinduktive Potenzial des Gerüsts in vivo zu demonstrieren

Diskussionen

Scaffold-based Tissue Engineering hat sein Potenzial in der regenerativen Medizin bewiesen und als Werkzeug für das HdO beeindruckende Fortschritte erzielt. Frühere Studien haben die entscheidende Rolle der Mikroarchitektur und der physikalischen Eigenschaften von Strukturen bei der Übertragung von in vitro konstruierten Zellgerüstkonstrukten in Knochengewebe nachgewiesen [14,15,16].

Optimale mechanische Eigenschaften (Porengröße, Zugfestigkeit usw.) und Biokompatibilität der Konstrukte sind potenzielle Merkmale, die für die Zellkolonisation und -organisation in Betracht gezogen werden sollten [17]. Die vorgestellte Arbeit beschreibt die Herstellung und Charakterisierung von Gerüsten für das Knochengewebe-Engineering unter Verwendung der Kombination vorteilhafter Eigenschaften der dafür vorgeschlagenen Materialien. Während SF eine entsprechend starke und biokompatible Plattform bietet, induziert eingebettetes rhBMP2 die Bildung neuer Osteozyten. SF wird von mehreren Gruppen in verschiedenen Formulierungen für die osteoblastische Zellproliferation [18] und die Geweberegeneration umfassend untersucht, einschließlich Bänder, Sehnen, Knorpel, Knochen, Leber, Haut, Luftröhre, Hornhaut, Nerven, Trommelfell und Blase [19, 20].

Wir haben wässrige Lösungen von SF und SF+rBMP2 für unsere Studie verwendet, da wässrige Lösungen gegenüber organischen Lösungsmitteln für die Herstellung von SF-Lösungen bevorzugt werden, da der Abbau von SF in organischen Lösungen ungünstig ist [18]. Von elektrogesponnenen SF-Fasern wurde zuvor berichtet, dass sie eine homogene Faserstruktur mit einheitlichem Durchmesser aufweisen, und das Netz ist hochporös mit vernetzten und querverbundenen Poren, was auch in enger Übereinstimmung mit unserer Studie steht [21, 22]. Es gab keine Beobachtung der Bildung von perlartigen Strukturen in SF-Fasern in unseren Gerüsten und den zuvor beschriebenen [21]. Es wurde zuvor berichtet, dass der Durchmesser der reinen SF-Faser mit zunehmender Mischung abnimmt [11, 21]; wir haben jedoch keinen Durchmesserverlust aufgrund der Vermischung beobachtet. Aber die Gleichmäßigkeit der Faser wurde in gemischten Fasern möglicherweise aufgrund einer ungleichmäßigen Assoziation von rBMP2 an die SF-Fasern gestört.

Ausreichende mechanische Festigkeit ist eine wesentliche Eigenschaft für ein Gewebegerüst. Das Mischen von reinem SF erhöhte die Flexibilität von Nanofasern in unserem Experiment, und frühere Berichte zeigten auch einen ähnlichen Trend bei der Verbesserung der mechanischen Eigenschaften beim Mischen von SF mit anderen Materialien, um verwendbare gemischte Biomaterialien zu erhalten [21, 23]. Daher besitzt unser hergestelltes Gerüst die wesentliche mechanische Festigkeit und Flexibilität, die in Tissue-Engineering-Anwendungen erforderlich sind.

Gerüste für das Tissue Engineering sollten in der Lage sein, Zellen darüber anzuheften, sollten die Zellproliferation und Osteoinduktion erleichtern und sollten für eine bessere Akzeptanz am wenigsten zytotoxisch sein. Frühere Berichte über SF-Gerüste haben ihre nicht-zytotoxischen und zellproliferativen Aktivitäten nachgewiesen [21, 24], und unsere Studien standen in enger Übereinstimmung mit den zuvor berichteten Ergebnissen.

Aufgrund seiner osteoinduktiven Eigenschaften wird rhBMP2 von mehreren Gruppen im Knochengewebe-Engineering verwendet [25,26,27]. Diese Studien haben gezeigt, dass Zellen, die auf BMP2-haltigen Gerüsten kultiviert wurden, eine höhere ALP-Aktivität, einen Biomarker der Osteoinduktion, aufwiesen. Der Effekt der BMP2-Assoziation wurde mit fortschreitender Inkubationszeit besser kontrastiert. Kimet al. verwendeten BMP2-assoziierte poröse Mikrokügelchen und beobachteten eine ähnliche Verbesserung der Osteoinduktion [25].

Schlussfolgerungen

Wir haben erfolgreich SF-basierte Fasergerüste hergestellt, die rhBMP2 enthalten. Diese Gerüste waren homogen und wiesen ausreichende mechanische Eigenschaften und Biokompatibilität auf. Eine weitere rhBMP2-Assoziation wird dem osteoinduktiven Potenzial der hergestellten Gerüste zugeschrieben. Die Gerüste wurden weiter für In-vivo-Anwendungen evaluiert und für Anwendungen mit Knochengewebe-Engineering als geeignet befunden.

Abkürzungen

ALP:

Alkalische Phosphatase

HdO:

Knochengewebe-Engineering

hMSCs:

Humane mesenchymale Stammzellen

rhBMP2:

Rekombinantes humanes morphogenes Knochenprotein-2

SF:

Seidenfibroin