Verbesserte Osteoinduktivität durch rhBMP-2-beladene Seidenfibroin-Gerüste für die Knochengewebetechnik

Zusammenfassung

Die Nachfrage nach Formulierungen von Seidenfibroin (SF)-Gerüsten für biomedizinische Anwendungen nimmt stetig zu. In dieser Arbeit wurde SF mittels Glutaraldehyd mit dem osteoinduktiven rekombinanten humanen Knochenmorphogenetischen Protein-2 (rhBMP-2) in verschiedenen Verhältnissen vernetzt: (i) 3 % SF ohne rhBMP-2 (SF), (ii) 3 % SF mit gleichmäßiger Menge rhBMP-2 (SF+BMP2) und (iii) 12 % SF mit 3 % rhBMP-2 (4SF+BMP2). Diese Lösungen dienten der elektrospinnbasierten Herstellung von Nanoscaffolds zur Evaluierung des gesteigerten osteoinduktiven Potenzials von SF-Gerüsten mit rhBMP-2. Spannungs-Dehnungs-Beziehungen zeigten keinen Verlust der mechanischen Festigkeit der Fasern durch die Zugabe von rhBMP-2, während die mechanische Festigkeit des Gerüsts mit steigender SF-Konzentration zunahm. Die Assoziation von rhBMP-2 erhöhte die Wasserrückhaltekapazität des Gerüsts, wie Quellversuche belegten. Die Vitalität humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSCs) war in konjugierten Gerüsten höher, und die Gerüste zeigten keine Zytotoxizität gegenüber den Wirtszellen. Zellen wiesen in konjugierten Gerüsten unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen eine höhere alkalische Phosphatase-Aktivität auf, was die gesteigerte Osteoinduktivität des neuartigen Konstrukts bestätigt. Die Gerüste erwiesen sich zudem als effektiv für die In-vivo-Knochenbildung.

Hintergrund

Die regenerative Kapazität von Knochen ermöglicht die Reparatur kleiner Frakturen eigenständig. Knochen wird gebildet, es folgt die Verwachsung und schließlich die Rekonstruktion der ursprünglichen Form. Diese Kapazität ist jedoch begrenzt, was Autotransplantate oder Allotransplantate für die Behandlung erforderlich macht [1]. Allotransplantationen, bei denen Knochen von einem separaten Spender entnommen wird, können immunologische Reaktionen auslösen. Autotransplantationen, bei denen der Knochen aus dem eigenen Körper des Patienten stammt, vermeiden immunologische Probleme, sind jedoch durch die verfügbare Knochenmenge limitiert [2,3,4].

Gewebetechnik wird als potenzielle Technologie angesehen, um die immunologischen Limitationen von Allo- und Autotransplantationen zu überwinden. Dabei werden spezialisierte Zellen wie humane mesenchymale Stammzellen oder Osteosarkomzellen (MG63) unter geeigneten Bedingungen auf einem vorgefertigten Gerüst kultiviert, und dieses Zell-Gerüst-System wird dann als Transplantat verwendet [5, 6].

Das Gerüst dient der Verankerung und bietet eine biochemische Nische für Zellüberleben und -proliferation. Bei der Materialauswahl für die Gerüstherstellung müssen Eigenschaften wie mechanische Festigkeit, Osteoinduktion, Bioresorption, graduierte Porosität und Biokompatibilität berücksichtigt werden. Osteoinduktion (Induktion der Knochenbildung) ist eine der geforderten Eigenschaften für Materialien in der Knochengewebetechnik (BTE) [7]. Gerüste mit osteogenen Faktoren eignen sich gut, um den Knochenregenerationsprozess nachzuahmen, der Angiogenese und Osteogenese koppelt und Vorläuferzellen sowie deren Differenzierung rekrutieren kann. Knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) sind Wachstumsfaktoren, die Knochenbildung induzieren und für BTE-Anwendungen zusammen mit demineralisierter Knochenmatrix (DBM) und Calciumphosphat vorgeschlagen werden [8,9,10].

Verschiedene Gruppen berichteten über den Einsatz von Metallen, Keramiken, synthetischen Polymeren, Kompositen und Seidenfibroin als potenzielle Materialien für die Gerüstherstellung in der BTE. Seidenfibroin (SF) hat sich aufgrund seiner bemerkenswerten mechanischen und biokompatiblen Eigenschaften als geeignetes Material für die Gerüstherstellung in der Gewebetechnik erwiesen [5]. Bislang liegt kein Bericht vor, der die assoziativen Vorteile von BMPs mit elektrogesponnenen SF-Nanoscaffolds bewertet.

Hier berichten wir über die Herstellung neuartiger rekombinanter humaner Knochenmorphogenetischer Protein-2 (rhBMP-2)-konjugierter SF-elektrogesponnener nanofasriger Gerüste. Diese wurden mit reinen SF-Gerüsten verglichen, um den Effekt der rhBMP-2-Konjugation auf die Osteoinduktion zu klären. Zellvitalität und Zellproliferation wurden ebenfalls gemessen, um die Eignung des Gerüsts für neue und verbesserte Anwendungen in der Knochengewebetechnik zu belegen.

Methoden

Herstellung wässriger SF/BMP2-Lösungen

Zunächst wurde SF aus den Kokons des Seidenraupen Bombyx mori als wässrige Lösung isoliert. Ein etabliertes Protokoll wurde mit geringfügigen Modifikationen befolgt [11]. Kokons wurden 20 Minuten in 100 mL 0,02 M Na₂CO₃ gekocht und anschließend gründlich mit destilliertem Wasser gespült, um wasserlösliches Sericin und Wachs zu entfernen. Das extrahierte Fibroin wurde in 9 M Lithiumbromid-Lösung bei 60 °C für 4 Stunden gelöst und 4 Tage lang gegen Wasser dialysiert. Die Endkonzentration wurde durch Wiegen der Trockenmasse nach dem Trocknen bestimmt und betrug 7 % w/v. Diese Lösung wurde durch Dialyse gegen 1 L 25 % Polyethylenglykol (PEG, 10.000 g mol⁻¹) bei Raumtemperatur auf verschiedene Konzentrationen konzentriert. Verdünnte wässrige SF-Lösungen wurden mit destilliertem Wasser hergestellt und alle Lösungen bis zur weiteren Verarbeitung bei 10 °C gelagert. Lyophilisiertes Pulver von rekombinantem humanem Knochenmorphogenetischem Protein-2 (rhBMP-2) wurde in PBS (pH 3,8) gelöst. Die Proteinlösung wurde mit 0,22 µm Spritzenfiltern sterilisiert und als wässrige Lösung unter kontinuierlichem Rühren zu jeder Fibroinlösung gegeben. Zur Assoziation von BMP mit Fibroin wurde eine Glutaraldehyd-vermittelte Vernetzung eingesetzt. Kurz gesagt: Für 10 mL Reaktionsgemisch wurden je 5 mL von 6 % Seidenfibroin und 1 % rhBMP-2 mittels 200 µL Glutaraldehyd und 40 µL 12 N HCl als Gruppenaktivator vernetzt. Mit diesem Verfahren wurden drei Lösungen hergestellt: (i) 3 % Seidenfibroin ohne rhBMP-2 (SF), (ii) 3 % Seidenfibroin mit 0,5 % rhBMP-2 (SF+rhBMP-2) und (iii) 12 % Seidenfibroin mit 0,125 % rhBMP-2 wie in (ii) (4SF+rhBMP-2). Diese Lösungen wurden in Elektrospinnverfahren zur Gerüstherstellung verwendet.

Gerüstherstellung durch Elektrospinnen

Zur Gerüstherstellung wurde jede Lösung in eine 5-mL-Glasspritze mit einer Edelstahlnadel (25G, ID 0,26 mm, Sigma Aldrich) gefüllt, die an eine 5,5-kV-Gleichstromversorgung angeschlossen war. Für die Faserherstellung wurde die Auslassflussrate mit einer Spritzenpumpe auf 0,4 mL h⁻¹ gehalten, und die elektrogesponnenen Fasern wurden auf einer Aluminiumfolie in 15 cm Abstand zur Kapillenspitze gesammelt. Die Proben wurden jeweils 4 Stunden lang gesammelt.

Rasterelektronenmikroskopie

Zur morphologischen Untersuchung der hergestellten Gerüste wurde REM mit einem Zeiss EVO40SEM durchgeführt. Proben wurden vor der Bildaufnahme mit Gold sputterbeschichtet. Die Bestimmung des Faserdurchmessers erfolgte durch Mittelung der Durchmesser von 10 zufälligen Fasern im Bildausschnitt.

Mechanische Eigenschaften des Gerüsts

Druckversuche zur Beurteilung der mechanischen Eigenschaften der entwickelten Gerüste wurden mit einem Instron-Einsäulen-Tisch-Elektromechanikprüfgerät (Modell 3345, Instron, Canton, MA) durchgeführt. Fasern mit 0,2 mm Durchmesser, die durch längeres Elektrospinnen gewonnen wurden, dienten zur Bestimmung der Zugfestigkeit und Dehnung bei Bruch aus den Spannungs-Dehnungs-Kurven bei 25 °C und 50 % Luftfeuchtigkeit.

Quellstudie

Zur Messung des Quellverhältnisses wurde jede Formulierung in PBS (pH 7,4) bei 37 °C gelöst. Proben wurden zu vorgegebenen Zeitintervallen entnommen und das Trockengewicht mit einer Elektronenwaage gemessen. Der Test wurde fortgesetzt, bis das Gleichgewichtgewicht erreicht war. Das Quellverhältnis wurde wie folgt ausgedrückt:

$$ \mathrm{Quellverhältnis}(\%)=\frac{W_s-W_o}{W_o} $$

wobei W_o = initiales Trockengewicht der nanofasrigen Matrizen und W_s = Gewicht der gequollenen nanofasrigen Matrizen zu jedem Zeitpunkt.

Zellkultur

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) wurden in der vorliegenden Studie zur Evaluierung des osteoinduktiven Potenzials der hergestellten Nanoscaffolds verwendet. hMSCs wurden in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin bei 37 °C in 5 % CO₂ feuchter Atmosphäre bis zu 90 % Konfluenz kultiviert und unterhalten. Die Zellen wurden dann trypsinisiert, zentrifugiert und für die Quantifizierung in Medium resuspendiert.

Die Gerüste wurden durch Waschen mit Ethanol und Bestrahlung mit UV-Licht für 30 Minuten sterilisiert und anschließend mit PBS (pH 7,4) gewaschen. Vor der Zellaussaat erhielten die Gerüste eine Behandlung mit DMEM. 20 µL Zellsuspension wurden tröpfchenweise auf jedes Gerüst und eine Plastikfolie als Kontrolle gegeben. Die Gerüste ruhten 30 Minuten in feuchter Atmosphäre (37 °C, 5 % CO₂). Anschließend wurden sie 21 Tage in DMEM inkubiert mit regelmäßiger Mediumauffrischung jeden zweiten Tag.

Zelladhäsionsassay

Zur Beurteilung der Adhäsionskapazität der Zellen am Gerüst wurden die Anzahlen nicht adhärenter Zellen nach 1, 3 und 6 Stunden nach der initialen Aussaat gemäß der Literatur mit geringfügigen Modifikationen gezählt [6]. Das Zellmedium wurde gesammelt und die Zellzahl mit einem Hämatokritometer bestimmt. Die Differenz zwischen der initialen Aussaatzahl und der Anzahl nicht adhärenter Zellen wurde als Anzahl adhärenter Zellen betrachtet. Die Ergebnisse wurden als prozentuale Adhäsion gemäß folgender Gleichung ausgedrückt:

$$ \%\mathrm{Adhäsion}=\frac{\mathrm{Initiale\ Aussaat}-\mathrm{Anzahl\ nicht\ adhärenter\ Zellen}}{\mathrm{Initiale\ Aussaat}}\times 100 $$

Zytotoxizitätsassay

Zur Messung des toxischen Effekts der nanofasrigen Matrizen wurde ein MTT-Assay durchgeführt. Nach jeweiligem Zeitrahmen wurden Konstrukte in MTT-Lösung (1 mg mL⁻¹ Stocklösung in PBS (pH 7,4) im Verhältnis 1:10 verdünnt) inkubiert und 4 Stunden inkubiert. Lebende Zellen wandeln MTT in dieser Inkubationszeit in Formazansalz um. Das Formazansalz wurde durch Zugabe von DMSO gelöst und 20 Minuten beiseite gestellt. Die vom Formazansalz ausgehende Absorption wurde quantitativ durch Aufzeichnung der Absorptionsänderungen bei 570 nm mit einem Mikroplattenreader gemessen.

Zellproliferationsassay

Ein Alamar-Blue-(AB)-Farbstoffreduktionsassay wurde durchgeführt, um die Proliferation der Zellen im Gerüst zu bestimmen. Gerüste wurden 4 Stunden in mit DMEM verdünntem Farbstoff inkubiert, und die Farbstoffreduktion wurde spektrophotometrisch gemessen. Die prozentuale AB-Reduktion wurde berechnet als:

$$ \%\mathrm{AB}\ \mathrm{Reduktion}=\left[\left({\varepsilon}_{\mathrm{ox}}{\lambda}_2\right)\left(\mathrm{A}{\lambda}_1\right)-\left({\varepsilon}_{\mathrm{ox}}{\lambda}_1\right)\left(\mathrm{A}{\lambda}_2\right)/\left({\varepsilon}_{\mathrm{red}}{\lambda}_1\right)\left({\mathrm{A}}^{'}{\lambda}_2\right)-\left({\varepsilon}_{\mathrm{red}}{\lambda}_2\right)\left({\mathrm{A}}^{'}{\lambda}_1\right)\right]\times 100 $$

wobei ελ₁ = molare Extinktionskoeffizient von Alamar Blue bei 570 nm und ελ₂ = molare Extinktionskoeffizient von Alamar Blue bei 600 nm in der oxidierten (ε_ox) und reduzierten (ε_red) Form. Aλ₁ und Aλ₂ bezeichnen die Absorption der Testwellen.

A'λ₁ = Absorption der Negativkontrollwelle bei 570 nm.

A'λ₂ = Absorption der Negativkontrollwelle bei 600 nm.

ALP-Assay

Die alkalische Phosphatase (ALP)-Produktion von kultivierten hMSCs im Gerüst wurde gemäß dem Herstellerprotokoll im Kit gemessen [12]. Kurz gesagt: Steriles PBS (pH 7,4) wurde zum Waschen und Inkubieren der Gerüste verwendet, gefolgt von Homogenisierung mit 1 mL Tris-Puffer (1 M, pH 8,0) und Sonikation für 3 Minuten auf Eis. 25 µL des Lysats wurden dann mit 1 mL p-Nitrophenylphosphatlösung (16 mM) bei 30 °C für 5 Minuten inkubiert. Spektrophotometrische Messungen erfolgten bei 405 nm zur Überwachung der p-Nitrophenol-Produktion in Gegenwart von ALP.

In-vivo-ALP-Aktivität

Neun männliche athymische Nacktratten mit einem Gewicht von jeweils 100–120 g wurden beidseitig an den Bauchmuskeln disseziert, um Taschen zu schaffen. Ein Nacktmausmodell wurde genutzt, um das osteoinduktive Potenzial des Gerüsts in vivo zu demonstrieren. Je eines der drei Gerüsttypen (5 mm × 5 mm) wurde geschnitten und separat in die Muskeltaschen gepackt. Die Tasche wurde dann mit einem nicht resorbierbaren Nahtmaterial verschlossen. Nach 14 Tagen wurden die Implantate durch Exzision der geraden Bauchmuskeln entnommen und in PBS aufbewahrt. Muskelklappen wurden exzidiert, und das Explantatgewebe wurde erhalten, welches in Extraktionspuffer homogenisiert wurde, um alkalische Phosphatase freizusetzen. 50 µL Aliquot der Lösung wurden zur Messung der ALP-Aktivität verwendet.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden in Tripelikat durchgeführt, und die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) der Proben dargestellt, sofern nicht anders angegeben. Ein einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) wurde mit der Statistiksoftware Origin 6.0 durchgeführt, um unsichere und signifikante Unterschiede zu evaluieren. Ein P-Wert von 0,05 oder weniger kennzeichnet signifikante Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen.

Ergebnisse

Morphologie des Gerüsts

REM-Bilder (Abb. 1) der hergestellten Gerüste zeigten fein gesponnene nanofasrige Strukturen. Die durchschnittlichen Faserdurchmesser in SF- und SF+BMP2-Gerüsten schienen ähnlich zu sein und reichten bei allen Konzentrationen von 100 bis 900 nm, da der Durchmesser eine Funktion der Elektrospinn-Dauer ist [13]. SF-Nanofasern wiesen eine einheitliche Struktur auf, während die BMP2-Konjugation zu einer Nicht-Einheitlichkeit des Faserdurchmessers führte. Die Porengröße der Gerüste erschien in den hergestellten Gerüsten homogen und unabhängig von der Fibroinkonzentration. Die SF-Konzentration beeinflusst die Porengröße nicht signifikant [11].

REM-Mikrographien der hergestellten Gerüste. a SF. b SF+rhBMP2. c 4SF+rhBMP2

Mechanische Eigenschaften des Gerüsts

Spannungs-Dehnungs-Kurven der nanofasrigen Gerüste sind in Abb. 2 dargestellt. Es zeigte sich, dass die Zugabe von BMP die mechanischen Eigenschaften des SF-Gerüsts nicht verändert, aber mit steigender Konzentration des Herstellungsmaterials (SF) die Zugfestigkeit der Matrizen verbessert wurde. Dies könnte auf die Bildung von Inter-Faser-Bindungen während der Vernetzung zurückzuführen sein. Niedrigkonzentrierte SF-Fasern wiesen somit keine bessere mechanische Festigkeit auf als höherkonzentrierte.

Spannungs-Dehnungs-Beziehung elektrogesponnener Nanofasern. Der Spannungs-Dehnungs-Verlauf wurde zwischen (a) SF, (b) SF+rhBMP2 und (c) 4SF+rhBMP2 Gerüst verglichen

Quellstudie

Quellverhältnisse als Funktion der Zeit für die Gerüste sind in Abb. 3 dargestellt. Die Gerüste quollen zunächst gleichmäßig mit der Zeit an und erreichten nach ca. 380 Minuten das Gleichgewicht. rhBMP-2-verknüpfte Fasern nahmen mehr Wasser auf als reine SF-Gerüste, was auf eine Zunahme hydrophiler Taschen durch die BMP-2-Assoziation hindeutet. SF-Fasern glichen sich bei ~70 % aus, während BMP-2-haltige Fasern bei ~81 % Wasser im Gleichgewicht waren.

Quelleigenschaften des hergestellten Gerüsts. Änderungen der Quelleigenschaften des SF-Gerüsts wurden nach Modifikation mit SF+rhBMP2 und 4SF+rhBMP2 beobachtet

Zelladhäsionsassay

Die Adhäsion von Zellen am Gerüst ist für das Zellwachstum und die Induktion zur Differenzierung erforderlich. In dieser Studie beobachteten wir, dass hMSCs gut an den Gerüsten hafteten, und die Adhäsion von hMSCs an 4SF-BMP2, SF-BMP2 und SF-Gerüst wurde in Abb. 4 dargestellt.

Histogramm der prozentualen Adhäsion versus Zeit für drei Zeitpunkte. Änderungen des Adhäsionsniveaus in (a) SF, (b) SF+rhBMP2 und (c) 4SF+rhBMP2 Gerüst

Es bestand die Befürchtung eines Adhäsionsverlusts im Blendgerüst, was durch die beobachteten Ergebnisse widerlegt wurde. Die Mischung mit BMP2 verringert die Adhäsionskapazität des Gerüsts nicht. Wie aus Abb. 3 ersichtlich, war verständlich, dass mit zunehmender Porengröße (Abnahme der SF-Konzentration) die Adhäsion der Zellen am Gerüst zunimmt. ANOVA unter den drei Formulierungen differenzierte signifikant Variationen in der 3. und 6. Stunde. In der 1. Stunde wurde jedoch kein signifikanter Unterschied beobachtet.

Zytotoxizitätsassay und Zellproliferationsassay

Die Zellvitalität war in den rhBMP-2-konjugierten Gerüsten signifikant erhöht, und die konstruierten Gerüste erzeugten keine zytotoxischen Effekte auf die Wirtszellen (Abb. 4), und Zellen proliferierten gut in allen Gerüsten vergleichsweise (Abb. 5). Es gab einen zunehmenden Trend der Vitalität mit der Anzahl der Tage, und das SF+BMP2-Gerüst zeigte an jedem Zeitpunkt die geringste Toxizität. ANOVA zeigte signifikante Unterschiede zwischen den Zellvitalitätswerten der drei Formulierungen.

Zellvitalitätsassay als Histogramm für vier Zeitpunkte. Der Zellvitalitätsassay wurde mittels MTT-Assay durchgeführt, und die Ergebnisse werden als Prozentsatz relativ zur Kontrolle dargestellt

Aus Abb. 6 lässt sich die Zellproliferation untersuchen. Zellen proliferierten gut in allen drei Gerüstpräparationen, am besten in SF+BMP2 an jedem Zeitpunkt. Größere Poren im SF+BMP2-Gerüst boten maximalen Raum für Zellwachstum. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde durch ANOVA gut belegt.

Darstellung der Zellproliferation als Prozentsatz der Alamar-Blue-Farbstoffreduktion an vier Zeitpunkten für SF, SF+BMP2 und 4SF+BMP2

ALP-Assay

ALP-Aktivität ist ein Standardmarker für die osteoinduktive Eigenschaft der Zellumgebung [13]. In unserem Experiment beobachteten wir eine höhere ALP-Aktivität in den SF+BMP2-Konstrukten im Vergleich zu reinen SF-Konstrukten (Abb. 7). SF-nanostrukturierte Gerüste wiesen auch allein osteoinduktive Eigenschaften auf, aber wie aus Abb. 7 und ANOVA ersichtlich, erwies sich das SF+BMP2-Gerüst als das beste unter den untersuchten Gerüsten. Die ALP-Konzentration stieg im Verlauf des Experiments an, und Konstrukte mit höherer SF-Konzentration zeigten jedoch im Vergleich zu Konstrukten mit niedrigerer SF-Konzentration eine geringere ALP-Aktivität.

Darstellung der ALP-Aktivität unter drei verschiedenen Gerüstherstellungsstrategien zu verschiedenen Zeitpunkten. (a) SF (b) SF+rhBMP2 (c) 4SF+rhBMP2 Gerüst

In-vivo-ALP-Aktivität

Abb. 8 zeigt die ALP-Aktivität von Explantaten für (a) SF, (b) SF+rhBMP2 und (c) 4SF+rhBMP2. Wie erwartet, induzierten Explantate aus Behandlungen mit rhBMP-2 eine höhere ALP-Aktivität, während rhBMP-2-freie Gerüst-behandelte Mäuse eine niedrigere ALP-Aktivität aufwiesen.

In-vivo-ALP-Aktivität der nach Behandlung erhaltenen Explantate. Ein Nacktmausmodell wurde genutzt, um das osteoinduktive Potenzial des Gerüsts in vivo zu demonstrieren

Diskussion

Gerüstbasierte Gewebetechnik hat ihr Potenzial in der regenerativen Medizin bewiesen und beeindruckende Fortschritte als Werkzeug für die BTE verzeichnet. Frühere Studien haben die entscheidende Rolle der Mikroarchitektur und physikalischen Eigenschaften von Strukturen bei der Übersetzung von in-vitro-entwickelten Zell-Gerüst-Konstrukten in Knochengewebe etabliert [14,15,16].

Optimale mechanische Eigenschaften (Porengröße, Zugfestigkeit etc.) und Biokompatibilität der Konstrukte sind potenzielle Merkmale für Zellkolonisation und -organisation [17]. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung und Charakterisierung von Gerüsten für die Knochengewebetechnik unter Nutzung der vorteilhaften Eigenschaften vorgeschlagener Materialien. Während SF eine entsprechend starke und biokompatible Plattform bietet, induziert eingebettetes rhBMP-2 die Bildung neuer Osteozyten. SF wird von verschiedenen Gruppen in unterschiedlichen Formulierungen intensiv für osteoblastische Zellproliferation [18] und Geweberegeneration einschließlich Band, Sehne, Knorpel, Knochen, Leber, Haut, Trachea, Hornhaut, Nerv, Trommelfell und Blase untersucht [19, 20].

Wir verwendeten wässrige Lösungen von SF und SF+rBMP2 für unsere Studie, da wässrige Lösungen gegenüber organischen Lösungsmitteln für die Herstellung von SF-Lösungen bevorzugt werden, da die Degradation von SF in organischen Lösungen ungünstig ist [18]. Elektrogesponnene SF-Fasern wurden zuvor als homogen strukturierte Fasern mit einheitlichem Durchmesser berichtet, und das Netzwerk ist hochporös mit miteinander verbundenen und kreuzvernetzten Poren, was in enger Übereinstimmung mit unserer Studie steht [21, 22]. In unseren Gerüsten wurde keine Bildung von perlenartigen Strukturen in SF-Fasern beobachtet, ebenso wenig in zuvor berichteten [21]. Der Durchmesser reiner SF-Fasern wurde zuvor als abnehmend mit zunehmender Mischung berichtet [11, 21]; wir beobachteten jedoch keinen Durchmesserverlust durch Mischen. Die Einheitlichkeit der Faser wurde in gemischten Fasern gestört, möglicherweise aufgrund ungleichmäßiger Assoziation von rBMP-2 auf den SF-Fasern.

Ausreichende mechanische Festigkeit ist eine für ein Gewebegerüst essentielle Eigenschaft. Die Mischung von reinem SF erhöhte die Flexibilität der Nanofaser in unserem Experiment, und frühere Berichte zeigten einen ähnlichen Trend bei der Verbesserung mechanischer Eigenschaften durch Mischen von SF mit anderen Materialien zu einsetzbaren gemischten Biomaterialien [21, 23]. Somit besitzt unser hergestelltes Gerüst die für Gewebetechnik-Anwendungen erforderliche mechanische Festigkeit und Flexibilität.

Gerüste für die Gewebetechnik sollten in der Lage sein, Zellen anzulagern, Zellproliferation und Osteoinduktion zu fördern und möglichst wenig zytotoxisch zu sein für bessere Akzeptanz. Frühere Berichte über SF-Gerüste haben deren nicht-zytotoxische und zellproliferative Aktivitäten etabliert [21, 24], und unsere Studien stimmen eng mit den zuvor berichteten Ergebnissen überein.

Aufgrund seiner osteoinduktiven Eigenschaften wird rhBMP-2 von verschiedenen Gruppen in der Knochengewebetechnik genutzt [25,26,27]. Diese Studien zeigten, dass Zellen, die auf BMP2-haltigen Gerüsten kultiviert wurden, eine höhere ALP-Aktivität aufwiesen, einen Biomarker für Osteoinduktion. Der Effekt der BMP2-Assoziation wurde besser kontrastiert, je länger die Inkubationszeit fortschritt. Kim et al. nutzten BMP2-assoziierte poröse Mikrosphären und beobachteten eine ähnliche Verstärkung der Osteoinduktion [25].

Schlussfolgerungen

Wir haben erfolgreich SF-basierte faserige Gerüste mit rhBMP-2 hergestellt. Diese Gerüste waren homogen und wiesen adäquate mechanische Eigenschaften und Biokompatibilität auf. Darüber hinaus verlieh die rhBMP-2-Assoziation den hergestellten Gerüsten osteoinduktives Potenzial. Die Gerüste wurden weiterhin für In-vivo-Anwendungen evaluiert und als geeignet für Anwendungen in der Knochengewebetechnik befunden.

Abkürzungen

ALP:

Alkalische Phosphatase

BTE:

Knochengewebetechnik (Bone Tissue Engineering)

hMSCs:

Humane mesenchymale Stammzellen

rhBMP2:

Rekombinantes humanes Knochenmorphogenetisches Protein-2

SF:

Seidenfibroin