Theranostische Wirkstoffe der nächsten Generation basierend auf mit Halbleiter-Nanokristallen kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln:Entwicklung und funktionelle Charakterisierung

Hintergrund

Die Verwendung von Polyelektrolyt-Mikrokapseln als Vehikel für die gezielte Abgabe und kontrollierte Freisetzung von Medikamenten und Kontrastmitteln sowie als Fluoreszenzsonden für die In-vitro- und In-vivo-Bildgebung ist eine vielversprechende Forschungslinie in der translationalen Medizin und ein personalisierter Ansatz zur Diagnose und Behandlung verschiedener menschlicher Krankheiten [ 1,2,3,4].

Die Entwicklung theranostischer Wirkstoffe, die die Funktionen von Medikamenten und Werkzeugen zur Bildgebung von Biomarkern kombinieren, um eine frühzeitige Diagnose verschiedener Krankheiten zu ermöglichen, ist eine wichtige Aufgabe im Bereich der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen [5, 6]. Systeme auf Basis von Polyelektrolyt-Mikrokapseln sind vielversprechende Kandidaten für die Kombination beider Funktionen. Die Bedingungen ihrer Herstellung ermöglichen den Einbau von biologisch aktiven Substanzen, Metallnanopartikeln, Fluoreszenzmarkern usw. in die Mikrokapseln [7,8,9]. Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1 zeigt schematisch ein typisches Theranostikum auf Basis von Polyelektrolyt-Mikrokapseln.

Eine der effektivsten Methoden zur Gewinnung von Polyelektrolyt-Mikrokapseln besteht im sukzessiven Aufbringen entgegengesetzt geladener Polymerschichten auf ein kugelförmiges oder anders geformtes Substrat, das anschließend entfernt wird [10, 11]. Die Wechselwirkung des entgegengesetzt geladenen Polykations und Polyanions bei spezifiziertem pH, Ionenstärke und Temperatur der Lösung und Polarität des Lösungsmittels führt zu einem Interpolymerkomplex in Form einer Membran oder Hülle, die das Substrat umhüllt [12,13,14].

Die oben aufgeführten Faktoren beeinflussen auch die Morphologie der resultierenden Mikrokapseln, einschließlich ihrer Porosität und Form und der Integrität der Wand. Beispielsweise erleichtert eine Erhöhung der Ionenstärke oder des pH-Werts der Umgebung der Polyelektrolyt-Mikrokapseln Konformationsänderungen oder Protonierung/Deprotonierung der die Kapselwand bildenden Polyelektrolyte. Dies wiederum führt zu seiner Verformung und Erhöhung der Porosität bis hin zum Verlust der strukturellen Integrität und Übergang in den „offenen“ Zustand, gefolgt von der Freisetzung des inneren Inhalts der Kapseln und der darin eingebetteten Komponenten in die Mikroumgebung [15, 16]. Diese Eigenschaften machen Polyelektrolyt-Mikrokapseln zu guten Kandidaten für die Rolle von reizempfindlichen Abgabesystemen und zu einer vielversprechenden Grundlage für die Entwicklung theranostischer Wirkstoffe [2, 17, 18].

Quantum Dots (QDs) sind fluoreszierende Halbleiter-Nanokristalle mit einem Durchmesser von 2–10 nm, die sich durch ein breites Absorptionsspektrum und ein schmales, symmetrisches Fluoreszenzspektrum auszeichnen. Dies ermöglicht die Anregung von QDs mit unterschiedlichen Fluoreszenzmaxima aus einer einzigen Strahlungsquelle und bietet die Möglichkeit ihrer breiten Verwendung als Fluorophore, insbesondere für die Multiplex-Bildgebung [19, 20]. Eine hohe Photostabilität und helle Fluoreszenz von QDs bestimmen ihren Vorteil gegenüber herkömmlichen organischen Fluorophoren in Detektionsanwendungen [21,22,23,24].

Frühere veröffentlichte Studien, die sich der Entwicklung fluoreszierender polymerer Polyelektrolyt-Mikrokapseln widmeten, zeigen einen typischen Ansatz für klassische organische fluoreszierende Farbstoffe oder die in situ-Bildung von Kohlenstoffpunkten durch hydrothermale Karbonisierung und Umwandlung von Dextran in lumineszierende Kohlenstoff-Nanopartikel in Polyelektrolythülleneinschluss innerhalb der Polymerstruktur der primär hergestellten Polyelektrolyt-Mikrokapseln . Der Ansatz des organischen Farbstoffeinschlusses basiert auf der Diffusion von Fluoresceinisothiocyanat oder Rhodamin B, Tetramethylrhodaminfarbstoffen, die mit niedermolekularem Dextran oder Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert sind, in die poröse Struktur der von Polyelektrolyten gebildeten Membran, was zu einer Aufladung des Fluoreszenzfarbstoffs führt der gesamten Struktur der Polyelektrolyt-Mikrokapsel wie im inneren Hohlraum und wie in der Polymermembran. Die Notwendigkeit einer hohen thermischen Behandlung im Fall von kohlenstoffpunktcodierten Mikrokapseln verändert die Flexibilität der Mikrokapselstruktur und macht sie steifer, was bei der Entwicklung von pH- und Ionenstärke-stimuli-responsiven theranostischen Systemen nicht unerwünscht ist [25,26,27, 28,29,30].

In dieser Studie beschreiben wir alle technologischen Aspekte der Herstellung von polymeren Mikrokapseln, die mit den hochfluoreszierenden wasserlöslichen QDs kodiert sind und eine signifikante kolloidale Stabilität aufweisen, beschreiben ihre physikalisch-chemischen und funktionellen Eigenschaften und demonstrieren ihre Anwendung auf die Bildgebung von lebenden Zellen und die Visualisierung von Mikrokapseln Transport und Lieferung innerhalb der lebenden Zellen. Die Daten könnten den Weg ebnen für den nächsten Schritt zur Entwicklung der nächsten Generation von Theranostika basierend auf multifunktionalen funktionalisierten Mikrokapseln.

Experimentell

Solubilisierung und Charakterisierung von Quantenpunkten

CdSe/ZnS-Kern/Schale-QDs mit einem Fluoreszenzmaximum λ_max gleich 590 nm wurden freundlicherweise von Dr. Pavel Samokhvalov (Laboratory of Nano-Bioengineering, National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute), Moskau, Russland) zur Verfügung gestellt.

Frisch synthetisierte QDs wurden mit Trioctylphosphinoxid (TOPO) beschichtet und waren wasserunlöslich. Ihre Übertragung in die Wasserphase erfolgte durch Substitution von TOPO durch d,l-Cystein und anschließendes Ersetzen von d,l-Cystein durch 12- Einheit PEG-Derivat mit Thiol- und Carboxylendgruppen HS−(PEG)₁₂ −COOH (Thermo Fisher Scientific, USA) wie zuvor beschrieben [22, 31, 32]. Dazu wurde eine Probe von QDs in 800 μl Chloroform gelöst, danach 1200 μl Methanol zugegeben und 5 min zentrifugiert. Der Vorgang wurde dreimal wiederholt. Dann wurde das QD-Pellet in 800 μl Chloroform resuspendiert. Eine Lösung von d,l-Cystein in Methanol wurde der Suspension mit einem Gewichtsverhältnis von QD zu d,l-Cystein von 1:0,13 zugesetzt, und die Mischung wurde bei 16.873 g . zentrifugiert für 10 Minuten (Centrifuge 5418, Eppendorf, USA). Das QD-Pellet wurde von überschüssigem d,l-Cystein mit Methanol durch Zentrifugation für 3 Minuten bei der gleichen Geschwindigkeit gewaschen. Das QD-Pellet wurde in einem Concentrator Plus-Zentrifugalkonzentrator (Eppendorf, USA) 2 min getrocknet. Die getrockneten QDs wurden in 650 μl 0,1 M Natriumhydroxid suspendiert und 10 min in einem Elma Sonic P30H-Ultraschallbad (Elma Schmidbauer, Deutschland) beschallt. Dann wurde die Lösung bei 5509g . zentrifugiert für 10 min und der Überstand wurde durch einen Millipore-Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm (Merck, Deutschland) filtriert. Der QD-Gehalt der Proben wurde spektrophotometrisch bei der Wellenlänge des ersten Exzitonen-Absorptionspeaks bestimmt.

Die erhaltenen wasserlöslichen QD-Proben wurden durch Zugabe von HS−(PEG)₁₂ . stabilisiert −COOH bei einem Molverhältnis von QD zu PEG-Derivat von 1:4,6 und Inkubation der Mischung bei 2–8 °C für 24–48 Stunden.

Synthese von Calciumcarbonat-Mikropartikeln

Calciumcarbonat-Mikropartikel wurden wie an anderer Stelle beschrieben erhalten [33, 34]. Fünfzehn ml 0,33 M Na₂ CO₃ (Sigma-Aldrich, Deutschland) Lösung wurde zu 15 ml einer 0,33 M аСl₂ . gegeben (Sigma-Aldrich, Deutschland) Lösung unter Rühren. Die Reaktionsmischung wurde mit Geschwindigkeiten von 250, 500 und 750 U/min auf einem RCT Basic Magnetrührer (IKA, Deutschland) bei Raumtemperatur 15 bis 60 s lang gerührt. Die аСl₂ und Na₂ CO₃ Lösungen wurden vorab durch Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm gefiltert.

Danach wurde das Rühren beendet und die Reaktionsmischung 10 Minuten inkubiert. Die Mischung wurde mit MilliQ-Wasser durch abwechselndes Resuspendieren und Zentrifugieren bei 452 g gewaschen für 5 min mit einer Centrifuge 5810 (Eppendorf, USA). Die erhaltenen Mikropartikel wurden viermal gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurde das Pellet in einem Ofen bei 60 °C 90 Minuten lang getrocknet.

Herstellung von mit Quantenpunkten kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln

Die Mikropartikel wurden mit QDs kodiert, wobei eine modifizierte Technik der schichtweisen Abscheidung entgegengesetzt geladener Polymere [31, 35] und carboxylierter wasserlöslicher QDs auf präparierten Calciumcarbonat-Mikropartikeln verwendet wurde, die als Matrize dienten. Die Polyelektrolytschichten bestanden aus Polymerpaaren:dem Polykation Poly(allylaminhydrochlorid) (PAH) mit Mw ≈ 15.000 Da (Sigma-Aldrich, USA) und dem Polyanion Poly(natrium-4-styrolsulfonat) (PSS) mit Mw ≈ 70.000 Da ( Sigma-Aldrich, USA).

Die Schichten wurden in der folgenden Reihenfolge aufgetragen:СаСО₃ /PAH/PSS/PAH/PSS/PAH/QD-S-(PEG)₁₂ -COOH/PAH/PSS/PAH/PSS/PAH/PSS.

Eine Probe getrockneter Mikropartikel wurde in 0,5 ml MilliQ-Wasser resuspendiert und in einem Ultraschallbad 10 Minuten lang beschallt. Ein 0,5-ml-Aliquot von 2 mg/ml PAH-Lösung in 0,5 M NaCl wurde zu der Suspension mit 3,7 × 10 ⁸ . gegeben Calciumcarbonat-Mikropartikel in MilliQ-Wasser. Die Suspension wurde 60 s in einem Ultraschallbad beschallt und dann 20 min unter Rühren inkubiert. Danach wurde überschüssiges Polymer aus der Mikropartikelsuspension durch Zentrifugation bei 1054 g . gewaschen für 5 Minuten, gefolgt von Resuspendieren in MilliQ-Wasser. Das Waschen der Calciumcarbonat-Mikropartikel nach der Schichtung des Polykations wurde dreimal wiederholt. Zum Aufbringen der nächsten (Polyanion-)Schicht wurden die Mikropartikel vorläufig in 0,5 ml MilliQ-Wasser resuspendiert; die Suspension wurde mit 0,5 ml einer 2 mg/ml PSS-Lösung in 0,5 M NaCl vermischt, in einem Ultraschallbad 60 s lang beschallt, 20 min unter Rühren inkubiert und dann wie oben beschrieben von überschüssigem Polymer gewaschen.

Auf die Calciumcarbonatpartikel wurden vor der Codierung fünf Polyelektrolytschichten aufgebracht, wobei die äußere Schicht aus PAH bestand. Der Suspension der Mikropartikel wurden 0,10 bis 2,24 mg QDs zugesetzt. Die Mischung wurde 80 Minuten unter Rühren inkubiert und dann dreimal wie oben beschrieben durch Zentrifugation gewaschen. Danach wurden aufeinanderfolgende Schichten von entgegengesetzt geladenen Polymeren aufgebracht. Die kodierten Mikropartikel wurden bei +  4 °C im Dunkeln gelagert.

Um QD-kodierte Polyelektrolyt-Mikrokapseln zu erhalten, wurde der Calciumcarbonatkern von den Mikropartikeln entfernt. Dazu wurde das Pellet der QD-kodierten Mikropartikel nach dem Zentrifugieren in 2 ml 0,2 M Dinatriumethylendiamintetraacetat (EDTA) (pH 6,5) resuspendiert und die Suspension 15 min inkubiert. Um die Auflösung des Calciumcarbonat-Kerns zu gewährleisten, wiederholten wir dieses Verfahren noch zweimal und ersetzten die Lösung jedes Mal durch ein frisches Aliquot von 0,2 M EDTA (pH 6,5) nach 5-minütiger Zentrifugation der Probe bei 2152g . Dann wurde die Suspension von QD-kodierten Mikrokapseln viermal von überschüssigem EDTA durch Resuspendieren in MilliQ-Wasser und Zentrifugieren unter den oben angegebenen Bedingungen gewaschen. Die resultierenden Polyelektrolyt-Mikrokapseln wurden bei +  4 °C im Dunkeln gelagert.

Bei der Untersuchung der Wechselwirkung der QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln mit Zellen modifizierten wir die Mikrokapseloberfläche mit BSA (Hitzeschockfraktion, proteasefrei, endotoxinarm, geeignet für Zellkultur, pH 7, ≥ 98%; Sigma-Aldrich, USA) . Kurz gesagt wurden die kodierten Mikropartikel mit einer Polykation-Oberschicht zusätzlich mit einer Polyanion-Polyacrylsäure (PAA) mit Mw  ≈  15.000 Da (Sigma-Aldrich, USA) beschichtet und der Kern wurde wie oben beschrieben entfernt. Nach dem letzten Waschen wurden die Mikrokapseln in einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,4) mit 1% BSA dispergiert und bei + 4 °C im Dunkeln inkubiert. Vor der Verwendung wurden die Mikrokapseln mit einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,4) von überschüssigem BSA gewaschen.

Charakterisierung der mit Quantenpunkten kodierten Quantenpunkte, Mikropartikel und Polyelektrolyt-Mikrokapseln

Größen- und Gebührenstudie

Der hydrodynamische Durchmesser der solubilisierten QDs, der mit Polymerhüllen beschichteten QD-kodierten Mikropartikel und der QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln wurde durch die dynamische Lichtstreuungsmethode bestimmt; die Oberflächenladung wurde anhand ihrer elektrophoretischen Mobilität unter Verwendung des Doppler-Effekts mittels eines Zetasizer NanoZS (Malvern, UK) abgeschätzt.

Fluoreszenzanalyse

Die Fluoreszenzlebensdauern (Fluoreszenzzerfallskinetik) der solubilisierten QDs, mit Polymerhüllen beschichteten QD-kodierten Mikropartikel und QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln wurden bei der Wellenlänge des Fluoreszenzmaximums gemessen. Die zweite Harmonische eines YAG:Nd ³⁺ Als Anregungsquelle wurde ein Laser mit einer Pulslänge von 350 ps und einer Pulsrate von 50 Hz verwendet. Das Signal wurde von einem Photomultiplier-Detektor erfasst, der mit einem DPO 3054-Oszillographen (Tektronix, USA) mit einer Zeitauflösung von 2 ns verbunden war. Die Suspensionen von QD-kodierten Mikropartikeln und Mikrokapseln wurden während der Messungen mit einem MIXcontrol eco Magnetrührer (2mag, Deutschland) permanent gerührt, um eine Sedimentation der Probe zu verhindern.

Einschätzung der Kodierungseffizienz

Die Kodierungseffizienz wurde aus dem QD-Gehalt des Überstands nach dem Auftragen (Adsorption) von QDs auf die Mikropartikeloberfläche abgeschätzt. Die Menge der an der Mikropartikeloberfläche adsorbierten QDs (\({Q}_{{\mathrm{QD}}_{\mathrm{abs}}}\)) wurde berechnet als

wobei \( {Q}_{{\mathrm{QD}}_0} \) die anfängliche Menge an QDs im Aliquot ist, das für die Codierung verwendet wird, und \( {Q}_{{\mathrm{QD}}_i} \ ) ist die Menge an QDs im Überstand des i Probe.

Der QD-Gehalt der Proben wurde spektrophotometrisch mit einem Infinite 200 PRO Multimode-Plattenlesegerät (Tecan, Schweiz) bestimmt.

Rasterelektronenmikroskopie

Elektronenmikroskopische Aufnahmen der Calciumcarbonat-Mikropartikel wurden unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops JSM-7001F (JEOL, Japan), ausgestattet mit einer Schottky-Kathode, erhalten. Das Pulver aus getrockneten Mikropartikeln wurde auf ein leitfähiges Kohlenstoffklebeband aufgetragen und mit einem Mittelwert von 50, einem Strahlstrom von 20 pA und einer Beschleunigungsspannung von 15–30 kV gescannt.

Um Mikrofotografien der mit Polyelektrolytschichten beschichteten Mikropartikel zu erhalten, wird ein Tropfen einer verdünnten Mikropartikelsuspension mit ~ 10 ⁶ Mikropartikel pro 0,5 ml wurden auf ein vorab gereinigtes Siliziumsubstrat gegeben und bei Raumtemperatur getrocknet. Die resultierenden Proben wurden mit einem Mittelwert von 50, einem Strahlstrom von 20 pA und einer Beschleunigungsspannung von 3–30 kV gescannt.

Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie

Die Morphologie und Größenverteilung der QD-kodierten Mikropartikel wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines Carl Zeiss Axio Scope A1 Mikroskops (Carl Zeiss, Deutschland) mit Texas Red Fluoreszenzemissionsfilter analysiert; Als Eindeckmedium für den Objektträger wurde eine 20 %ige wässrige Glycerinlösung verwendet.

Die Proben von QD-kodierten Mikrokapseln wurden auch mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Deutschland) untersucht, das mit Lasern zur Anregung von 405, 458, 476, 488, 496, 514, 561 und 633 nm und Leica LAS . ausgestattet war AF-Softwareversion 2.7.3.9723. Die Analyse wurde bei der Anregungswellenlänge 488 nm und einem Sammelfiltersatz durchgeführt, der den Emissionsbereich bei 555–620 nm abdeckte, unter Verwendung des Objektivs Leica HCX PL APO CS 63×/1.20 CORR WATER. Eine zwanzigprozentige Lösung von Glycerin in PBS-Puffer pH 7,4 wurde als Trägermaterial für den Objektträger verwendet. Zur Bildanalyse und -verarbeitung wurde die Software Image J 1.51 (USA) verwendet.

Aufnahme von mit Quantenpunkten kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln durch lebende Zellen in Vitro

Die immortalisierte Maus-Alveolarmakrophagen-Zelllinie MH-S (ATCC, USA) wurde in RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % FCS, 0,05 µM 2-Mercaptoethanol und 2,06 µM Glutamin in einer befeuchteten Atmosphäre bei 5 % CO₂ und 37 °C. Die MH-S-Zellen kultiviert bis zu 3×10 ⁶ Zellen in 35-mm-μ-Schalen und 1,2×10 ⁶ der QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln, die mit BSA beschichtet waren, wurden zu jeder µ-Schale gegeben. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO₂ . weiter inkubiert für 4 bzw. 24 Stunden. Dann wurden die Zellkerne mit DRAQ5-Fluoreszenzsonde (ex/em Wellenlängen 646/697 nm, ThermoFisher, USA) während 30 Minuten gegengefärbt und anschließend wurden die Zellproben gewaschen und mit dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Deutschland .) analysiert ). Die Bilder der zellulären Aufnahme der QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln wurden mit HCX PL APO CS 63,0 × 1,30 GLYC/OIL, HCX PL APO Lambdablau 40,0 × 1,25 OIL aufgenommen. Die Fluoreszenz der QDs wurde bei 488 nm angeregt und die Emission bei 555–620 nm gesammelt, während die Fluoreszenz der mit DRAQ5 gegengefärbten Zellkerne bei 633 nm angeregt und die Emission bei 650–750 nm gesammelt wurde.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der Software MS Office Excel 2007 und Origin Pro 2015 durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwerte und Standardabweichungen unter Verwendung der Ergebnisse von mindestens drei unabhängigen Experimenten gezeigt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von Calciumcarbonat-Mikropartikeln

Die Verwendung von kugelförmigen anorganischen Kristallen, insbesondere von Calciumcarbonat-Mikrosphärolithen, als Substrat wird durch ihre Biokompatibilität sowie die Möglichkeit ihrer Entfernung im Zuge der Bildung von Polyelektrolyt-Mikrokapseln ohne Verwendung von für lebende Systeme aggressiven Lösungsmitteln bestimmt. Calciumcarbonat-Mikropartikel per se können auch als ein System zur Arzneimittelabgabe mit modifizierter oder verlängerter Freisetzung verwendet werden, dienen als Matrix zum Beladen von Arzneimitteln und zur Kontrolle ihrer Freisetzung in die Mikroumgebung, dh sie haben mehrere potenzielle Verwendungen in Abgabesystemen [36,37 ,38,39,40,41,42,43,44,45,46].

Maßgeblich für die Größe und Form der Mikrokristalle sind die Rührgeschwindigkeit und -dauer sowie die Inkubationszeit des Reaktionsgemisches [33, 41]. Wir haben experimentell die Bedingungen zum Erhalten von Calciumcarbonat-Mikrosphärolithen mit einer optimalen Größenverteilung bestimmt. Einzelnes CaCO₃ Es wurde gefunden, dass Mikropartikel eine fast regelmäßige abgerundete Form haben. Zusätzliche Datei 1:Abbildung S2 zeigt die Größenverteilungen von Calciumcarbonat-Mikropartikeln, die bei verschiedenen Rührgeschwindigkeiten erhalten wurden. Wie aus diesen Daten ersichtlich, nahm die Größenheterogenität der Partikel mit zunehmender Rührgeschwindigkeit zu. Wenn die Rührgeschwindigkeit 250 U/min betrug, lag die Größe der erhaltenen Partikel im Bereich von 4,0 bis 6,0 μm. In diesem Fall waren alle Mikropartikel in der Probe getrennt und ihre Größenverteilung war nahezu normal (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2a). Wenn die Mischung jedoch mit 500 U/min gerührt wurde, beobachteten wir Partikel mit unregelmäßiger Form, bei denen es sich um Aggregate kleinerer Partikel handelte, wobei die mittlere Größe der einzelnen Partikel zwischen 2,7 und 5,6 μm variierte (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2b). Bei einer Rührgeschwindigkeit von 750 U/min wurde die Streuung der Partikelgröße erhöht. Diese Probe enthielt auch unregelmäßig geformte Aggregate mit einer mittleren Größe einzelner Mikropartikel im Bereich von 3,8 bis 5,7 μm (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2c).

Das Rühren der Reaktionsmischung mit einer Geschwindigkeit von 250 U/min ermöglichte es daher, Partikel mit einer optimalen Größenverteilung und einer nahezu regelmäßigen Form zu erhalten und Partikelaggregationen zu verhindern. Daher haben wir die Auswirkung der Rührdauer auf die Mikropartikelgrößenverteilung bei dieser Rührgeschwindigkeit geschätzt (zusätzliche Datei 1:Abbildung S3). Rühren der Reaktionsmischung für 15 s ergab eine erhöhte Anzahl größerer Partikel im Vergleich zu 30-sekündigem Rühren. Eine Verlängerung der Rührdauer auf 60 s hatte einen ähnlichen Effekt. Das heißt, die Rührdauer war im ersten Fall (Zusatzdatei 1:Abbildung S3a) unzureichend und im letzteren Fall (Zusatzdatei 1:Abbildung S3c) zu lang. Daher hielten wir eine Geschwindigkeit von 250 U/min und eine Dauer von 30 Sekunden für optimale Rührbedingungen.

Laut Rasterelektronenmikroskopie (REM)-Daten war die Oberfläche der Calciumcarbonat-Mikropartikel heterogen, gekennzeichnet durch Porosität (Abb. 1a). Bei einer Vergrößerung von × 40.000 war zu erkennen, dass die Mikropartikel wiederum von kleineren, submikrometergroßen Partikeln gebildet wurden (Abb. 1b). So wiesen die erhaltenen Mikropartikel eine poröse Struktur auf und stellten Matrices dar, die sich nicht nur als Substrate eignen, sondern auch per se als Abgabesysteme verwendet werden können und aufgrund ihrer besonderen Oberflächenstruktur problemlos als Matrice für schichtweises Auftragen verwendet werden können Polymerabscheidung.

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Calciumcarbonat-Mikropartikeln (a ) und ihre Oberfläche bei höherer Vergrößerung (b )

Herstellung und Charakterisierung von mit Quantenpunkten kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln

Die hergestellten wasserlöslichen QDs zeichneten sich durch ein breites Absorptionsspektrum und ein schmales Fluoreszenzspektrum mit einem Emissionsmaximum von 590 nm aus (Abb. 2). Der hydrodynamische Durchmesser dieser QD-Proben reichte von 23,96 bis 28,2 nm. Zusätzliche Datei 1:Abbildung S4 zeigt die Größenverteilung der QDs stabilisiert mit HS−(PEG)₁₂ -COOH. Die Modifikation der QD-Oberfläche mit HS−(PEG)₁₂ −COOH gewährleistete die QD-Stabilität in der Wasserphase sowie die negative Oberflächenladung, die für die effektive Adsorption von QDs zwischen positiv geladenen Polyelektrolytschichten während des Kodierungsvorgangs ausreichte [22, 47].

Optische Eigenschaften der mit HS−(PEG) solubilisierten CdSe/ZnS-Kern/Schale-Quantenpunkte₁₂ −COOH-Liganden

Die gemessenen Oberflächenladungswerte der Calciumcarbonat-Mikropartikelproben während jedes Abscheidungsschritts der Polyelektrolytschichten und QDs (Tabelle 1) bestätigten, dass die Oberflächenladung der ursprünglichen Matrize, die solubilisierten QDs sowie die Oberflächenneuladung nach jeder Polymerabscheidung sind ausreichend für die effektive Absorption jeder nachfolgenden Schicht.

Die intrinsische Oberflächenladung und die poröse Oberflächenstruktur der synthetischen Calciumcarbonat-Mikropartikel ermöglichten ihre Verwendung als Matrize für den entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten und die QD-Abscheidung (Abb. 3). Die Anwendung von PAH- und PSS-Polymeren in QD-kodierten Polyelektrolyt-Polymer-Mikrokapseln wird durch ihre Biokompatibilität und Nichttoxizität sowie durch ihre Nicht-Bioabbaubarkeit bestimmt, die zusätzlich dazu beiträgt, QDs in der Hülle zu halten. Die biologische Abbaubarkeit von Poly-L-Arginin, Poly-L-Lysin, Chitosan, Alginsäure-Natriumsalz und Dextransulfat, die auch häufig bei der Bildung von Polyelektrolyt-Mikrokapseln verwendet werden, induziert die QD-Diffusion aus der Polymermembran, die zu einer Abnahme führen sollte der fluoreszierenden Eigenschaften der Mikropartikel [3, 11, 39, 48.49,50,51,52]. Das in dieser Studie verwendete PAH-Polykation und PSS-Polyanion enthalten Amin- bzw. Sulfatgruppen, die eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen den Polymerschichten gewährleisten, die zur Bildung von Interpolymerkomplexen führt [16, 25, 36, 37]. Die Wahl der ersten Polymerschicht wurde durch den Oberflächenladungswert der synthetisierten Calciumcarbonat-Mikropartikel bestimmt.

Herstellungsverfahren für mit Quantenpunkten kodierte Mikrokapseln:Bildung der Schichten des Polykations (1) und des Polyanions (2), der PAH- bzw. PSS-Polyelektrolyten auf der Matricesoberfläche; Codieren der resultierenden Mikropartikel mit Quantenpunkten und weitere schichtweise Polymerabscheidung (3); Entfernung des Calciumcarbonatkerns (4)

Abbildung 4 zeigt REM-Bilder der Phasen der Polymerhüllenbildung auf der Substratoberfläche. Wie in den Mikrofotografien zu sehen ist, enthielten die Mikropartikel einen Kern aus Calciumcarbonatkörnern und eine Hülle, die mit zunehmender Zahl der adsorbierten Polymerschichten deutlicher wurde. Die Oberfläche der mit den Polyelektrolytschichten beschichteten Mikropartikel folgte der Form des Substrats mit seiner charakteristischen Homogenität, was darauf schließen lässt, dass es auch porös war (Abb. 4a, b) [44]. Mit zunehmender Dicke der Polymerhülle wurde die Oberfläche der Mikropartikel gleichmäßiger und glatter (Abb. 4c, d).

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Calciumcarbonat-Mikropartikeln nach Auftragen von vier (a , b ) und zehn (c , d ) Polyelektrolytschichten

Der letzte Schritt der Herstellung von QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln umfasste die Entfernung des Calciumcarbonat-Kerns und die Bildung der endgültigen Struktur der Mikrokapseln. Um die aus Calciumcarbonatkörnern bestehende Matrice aufzulösen, wurden die Mikropartikel mit EDTA gewaschen. EDTA wurde hauptsächlich verwendet, weil es bei Wechselwirkung mit Salzen zweiwertiger Metalle, einschließlich Calcium, wasserlösliche Komplexe bildet und sein niedriges Molekulargewicht die Durchlässigkeit der Polyelektrolythülle für EDTA und seine Komplexierung mit Ca ²⁺ . gewährleistet . Dies führt zur Auflösung des Kerns der Polyelektrolytpartikel und zur Bildung einer Hohlstruktur [45, 46].

Die in unserer Studie erhaltenen QD-kodierten Mikropartikel und Polyelektrolyt-Mikrokapseln hatten eine kugelförmige oder fast kugelförmige Form und eine Größe von 3,8 bis 6,5 μm (Abb. 5). Die Analyse der Morphologie und Struktur der Mikropartikel und Mikrokapseln im Fluoreszenzmodus zeigte Hohlräume innerhalb der Polyelektrolyt-Mikrokapseln, was durch ihre höhere Transparenz im Vergleich zu den Mikropartikeln ersichtlich ist (Abb. 5b). Dies zeigte, dass das Verfahren der Kernauflösung mit EDTA wirksam war. Die konfokalen Mikroskopiedaten zeigten auch die Hohlstruktur der erhaltenen fluoreszierenden Polyelektrolyt-Mikrokapseln (Abb. 6). Diese Mikrokapseln konnten als Einzelpartikel unterschieden werden (Abb. 6a, b), die aufgrund ihrer Oberflächenmodifizierung durch BSA-Beschichtung als kugelförmige Partikel mit rauer Oberfläche charakterisiert werden können.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von mit Polyelektrolyt beschichteten und mit Quantenpunkten kodierten Calciumcarbonat-Mikropartikeln (a ) und daraus gewonnene Polyelektrolyt-Mikrokapseln (b )

Konfokalmikroskopische Aufnahmen der mit Quantenpunkten kodierten und mit BSA beschichteten Polyelektrolyt-Mikrokapseln:Querschnitte der Mikrokapseln (a ); 3D-Projektion einer einzelnen Polyelektrolyt-Mikrokapsel (b )

Einschätzung der Codierungseffizienz

Die Kodierungseffizienz wurde anhand der Menge an QDs abgeschätzt, die auf der positiv geladenen Polymeroberfläche des Mikropartikels adsorbiert wurden. Die Abschätzung der QD-Mengen in der zur Mikropartikelcodierung verwendeten Originallösung und im Überstand vor und nach der Inkubation der Mikropartikel mit der QD-Lösung zeigte, dass die Zahl der an die Mikropartikeloberfläche gebundenen QDs mit steigendem QD-Gehalt im Reaktionsgemisch von 0,36 bis 2,241 mg (Abb. 7a). Further increase in the amount of QDs in the solution led to a decrease in the number of adsorbed QDs. This may have resulted from an insufficient density of the positive charge determined by amine groups of PAH on the microparticle surface because of an excessive amount of QDs and the resultant saturation of the surface with them. Apparently, the QDs were adsorbed more efficiently if their amount was smaller than 2.241 mg owing to sterically favorable conditions and less interference with one another’s attachment. The pattern of the dependence of the encoding efficiency on the QD content of the solution used for the encoding agrees with our earlier data [22].

Estimation of the efficiency of encoding of microparticles with different amounts of quantum dots (a ) and their fluorescence characteristics (b ). Asterisk indicates significant difference of QD-encoded microbeads from the QD-encoded microcapsules (p  < 0.05)

Estimation of the optical characteristics of the obtained polyelectrolyte microcapsules is an essential stage of the assessment of encoding efficiency. Its results show how suitable the given technique is for fabrication of imaging agents based on QD-encoded polyelectrolyte microcapsules.

Figure 7b shows the fluorescence intensities of the microparticles and microcapsules measured as the mean normalized intensity of gray color as dependent on the amount of QDs used for encoding them. As seen from the figure, the fluorescence intensity of the encoded microparticles was higher than that of the microcapsules obtained from them. At the same time, the microcapsules encoded with different amounts of QDs did not differ significantly from one another in fluorescence intensity (p> 0,05). Despite some decrease in the fluorescence intensity of the microcapsules, their encoding with the amount of QDs indicated above ensures a contrast sufficient for effective imaging.

Quantum Dot Fluorescence Lifetime within Encoded Polyelectrolyte Microcapsules

As noted above, the fluorescence intensity of the polyelectrolyte microcapsules was decreased compared to the microparticles used for their fabrication and encoded with the same QDs. Therefore, we have estimated the fluorescence lifetimes of both the original QDs and the same QDs embedded in the microparticles or the polymeric walls of the microcapsules.

The QD fluorescence kinetic curves (Fig. 8) are characterized by monoexponential dependence of fluorescent intensity on time according to the following equation:

Fluorescence lifetimes of the solubilized CdSe/ZnS quantum dots with a fluorescence peak at 590 nm incorporated in the fabricated microparticles and microcapsules

wo ich (t ) is the intensity of QD fluorescence in response to excitation pulses and A ₁ , х , and t ₁ are parameters describing the change in the intensity with time.

We determined the fluorescence lifetime for each sample (Table 2). The original solubilized QDs had the longest fluorescence lifetime; it was decreased after the QDs were adsorbed onto the microparticles and incorporated into the structure of the polymer shell. This may have resulted from interaction between the QDs and PAH, as we found earlier [22]. In the case of microcapsules, the QD fluorescence lifetime tended to further decrease compared to the QDs within the microparticles from which the microcapsules were fabricated. A possible cause of this decrease was a technological factor entailed in the fabrication of microcapsules, namely, the dissolution of the core and the related increase in the necessary number of washings.

It should be noted, that the fluorescence lifetime also tended to decrease with time after the microcapsule fabrication. However, since 48 h after the microcapsule fabrication, further changes in the mean fluorescence lifetime were insignificant. The fluorescence decay was apparently caused by a decrease in the fluorescence quantum yield of QD embedded in the shells of the capsules. This effect is likely to have resulted from the change in the distribution of the electron potential and the geometric rearrangement of QDs in the inner layers of the polymer shell after the core removal that increased the probability of nonradiative recombination due to the charge transfer to between neighboring QDs or between QDs and polymer molecules [22].

Interaction of Quantum Dot- Encoded Polyelectrolyte Microcapsules with Phagocytic Cells In Vitro

We used confocal microscopy to analyze the interaction of QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with live phagocytic cells, their uptake by cells, and the possibility of cell labeling. The murine alveolar macrophage (MH-S) cells were used as a model, because of the capability of these cells to phagocytize xenogenic objects.

The MH-S cells were treated with approximately 1.2×10 ⁶ of QD-encoded microcapsules by short-term (4 h) or long-term (24 h) incubations. We observed signs of primary uptake of the microcapsules in both cases:after the short- and (Fig. 9a–d) long-term incubation (Fig. 9e–h). Polyelectrolyte microcapsules or their conglomerates could be seen in green color. The microcapsules could be clearly distinguished both in the external environment of cells and inside the MH-S cells that could be evidenced by the distance between the microcapsules and nuclei of the MH-S cells which were stained by far-red DNA stain DRAQ5 and can be seen as red spherical shaped objects at all the microphotographs. As individual microcapsules and as their conglomerates were detected to undergo the uptake process. The fact that microcapsules were located in internal cell environment or at least attached to the surface of the macrophages is confirmed by clearly distinguished short distances between the nuclei and the polyelectrolyte microcapsules (Fig. 9b, d, g, h). In Fig. 9g, residually stained boundaries of the macrophage cytoplasmic membranes are distinctly seen, which indicates effective uptake, and well-discernible microcapsules are easy to detect to be attached on their surface either within the cells.

Confocal images of the MH-S cells treated with the QD-encoded polyelectrolyte microcapsules coated with BSA. The upper row shows the images of the samples after 4 h of short-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (a –d ). The lower row demonstrates the images of the samples after 24 h of long-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (e –h ). The nuclei of the macrophages were counterstained with far-red DNA stain DRAQ5

During the short-term incubation, single microcapsules were found to be phagocytized by MH-S cells prior to conglomerates of the microparticles. While after long-term incubation (24 h), the amount of the conglomerates of the polyelectrolyte microcapsules undergoing the uptake process and located inside cells or at least attached to the cell surface was more significant than after short-term incubation. Thus, the polyelectrolyte microcapsules obtained in this study used as promising tools for imaging and tracking of live cells.

Conclusions

Our study has demonstrated the feasibility of fabrication of stable QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with optimized fluorescence characteristics and a narrow size distribution. The technique for incorporation of water-soluble and stabilized with three-functional polyethylene glycol derivatives core/shell QDs into the polymer wall of the microcapsules and detailed characterization at each stage of experimental procedure ensured efficient fluorescent encoding of microcapsules. The efficient intracellular uptake of developed QD-encoded microcapsules by murine macrophages was demonstrated, thus confirming the possibility of efficient use of developed system for live cell imaging and visualization of microcapsules transportation and delivery within the living cells.

Abkürzungen

EDTA:

Disodium ethylenediaminetetraacetat

PAA:

Polyacrylic acid

PAH:

Polycation poly(allylamine hydrochloride)

PEG:

Polyethylene glycol

PSS:

Polyanion poly(sodium 4-styrenesulfonate)

QD:

Quantum dot

RPMI medium:

Roswell Park Memorial Institute medium

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

TOPO:

Trioctylphosphine oxide