Meerrettich-Peroxidase-verkapselte hohle Silica-Nanosphären für die intrazelluläre Erfassung reaktiver Sauerstoffspezies

Hintergrund

Während des aeroben Stoffwechsels werden kontinuierlich reaktive Sauerstoffspezies (ROS), bestehend aus radikalischen und nichtradikalischen Molekülen, wie Superoxidanionen, Wasserstoffperoxid, Hydroxylradikal, Singulettsauerstoff und Peroxynitrit, produziert. Zelluläre ROS werden hauptsächlich aus der mitochondrialen Elektronentransportkette (mETC) erzeugt und werden normalerweise durch enzymatische (wie Superoxid-Dismutasen, Katalasen und Peroxidasen) und nicht-enzymatische (zB Vitamine A, C und E, Urat und Bilirubin) ausgeglichen ) antioxidative Abwehrkräfte [1]. Ungleichgewichte in der ROS-Produktion können jedoch zu oxidativem Stress und nachfolgender Schädigung von DNA, Fettsäuren, Proteinen und anderen zellulären Komponenten führen, was möglicherweise zu Diabetes [2], Krebs [3] und Herz-Kreislauf-Erkrankungen [4] sowie neurodegenerativen Erkrankungen beiträgt [5] wie Alzheimer und Parkinson. Direkte Bildgebung und ROS-Quantifizierung in lebenden Zellen sind sehr wünschenswert, aber sehr anspruchsvoll.

Fortschritte in der Fluoreszenzmikroskopie [6, 7] haben die Entwicklung der nichtinvasiven Messung und Bildgebung der ROS-Evolution auf Einzelzellebene ermöglicht. Zum Nachweis von ROS sind die meisten Sonden so konzipiert, dass sie Änderungen der Fluoreszenzintensität oder Verschiebungen der Emissionswellenlänge (d. h. ratiometrische Methoden) nach der Oxidation profluoreszierender aromatischer Moleküle oder der Entschützung maskierter Verbindungen zu fluoreszierenden Produkten messen [8]. Die Spezifität für einen bestimmten ROS-Typ ist bei der Entwicklung erfolgreicher Sonden von Bedeutung; zum Beispiel wird die Boronatoxidation als bioorthogonaler Reaktionsansatz zum Studium der Chemie von Wasserstoffperoxid in lebenden Systemen verwendet [9]. Um die räumlich-zeitliche Dynamik von ROS zu untersuchen, wurden mehrere Boronat-basierte Sonden, die mit einer positiv geladenen Phosphonium-Einheit konjugiert waren, für das mitochondriale Targeting hergestellt [10, 11]. Ihr Potenzial für die In-vivo-Bildgebung ist jedoch durch ihre Instabilität im biologischen Milieu, die geringe Durchdringung von Gewebebarrieren und die schnelle Elimination aus dem Körper über das Harnsystem begrenzt [12,13,14]. Um solche Probleme zu überwinden, wurden einige Strategien entwickelt, entweder durch chemisches Aufpfropfen einer zusätzlichen stabilisierenden Struktur auf die Sonde [15] (z Biolumineszenz-Reporter [17] oder Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Sonden für die molekulare Bildgebung von ROS [18]. Darüber hinaus hoben mehrere umfassende Studien Nanoformulierungen als wichtige Designüberlegung hervor und zeigten, dass Sonden auf Nanopartikelbasis mechanistische Einblicke und innovative Strategien zur Abbildung von ROS in lebenden Organismen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit liefern können [19,20,21,22]. Enzyme mit hoher katalytischer Aktivität und ausgeprägter Substratselektivität wurden auch als klinische diagnostische Werkzeuge zur Identifizierung von Zielanalyten verwendet. Der Mangel an dauerhafter Stabilität und die Schwierigkeit, biologische Membranen freier Enzyme zu durchdringen, haben jedoch ihre Anwendungen in komplexen biologischen Umgebungen oft eingeschränkt. Auch wenn das Anbringen der Elektrode nicht für intrazelluläre Assays oder In-vivo-Bildgebung geeignet ist, wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Meerrettich-Peroxidase (HRP)-inkorporierte Biosensoren zur Bestimmung von H₂ . zu entwickeln O₂ basierend auf elektrochemischen Methoden [23, 24].

In dieser Arbeit wurden enzymatische Nanoreaktoren, bestehend aus HRP, eingekapselt in 45-nm-Siliciumdioxid-Nanokügelchen, durch eine Wasser-in-Öl (w/o)-Mikroemulsionsroute, gefolgt von einem milden Ätzprozess, synthetisiert [25]. Zuvor haben wir gezeigt, dass solche hohlen Nanomaterialien eine stabile Aktivität der eingekapselten Enzyme und Nanokatalysatoren aufrechterhalten und gleichzeitig vor Proteolyse bzw. Sintern schützen können [26, 27]. In dieser Arbeit haben wir ihre potenziellen Anwendungen als intrazelluläre Biosensoren bewertet, indem wir die Enzymeinfangeffizienz, die Ladekapazität, die Peroxidreaktivität und -selektivität, die zelluläre Aufnahme, die Toxizität und die Proliferationseffekte von HRP@HSNs untersuchten. Unter Verwendung von Dihydrorhodamin 123 (DHR123) als Substrat, das häufig mit HRP gekoppelt wurde, um die intrazelluläre Wasserstoffperoxidproduktion nachzuweisen, wurden Wechselwirkungen zwischen HRP@HSNs und verschiedenen Arten von ROS in wässrigen Lösungen durch Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Verwendung von HRP@HSNs mit DHR123 gleichzeitig physiologisches H₂ . abbilden und quantifizieren kann O₂ Spiegel in Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA)-stimulierten RAW264.7-Makrophagen. Zusammengenommen haben die enzymatischen Nanoreaktoren von HRP@HSNs das Potenzial, ROS-assoziierte Entzündungszellen in vivo abzubilden, und die eingekapselten Komponenten können auf mehrere verschiedene Enzyme [28], Nanopartikel [26] und Erkennungsmoleküle für synergistische Anwendungen erweitert werden.

Methoden/Experimental

Chemikalien und Reagenzien

Dekan, n -Hexanol (98%), Ammoniumhydroxid (NH₄ .) OH, 35 Gew.%), Tetraethylorthosilicat (TEOS, 98%), 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS, 95%) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Isomer wurden von ACROS bezogen. Polyoxyethylen (5) Isooctylphenylether (Igepal CA-520), HRP Typ VI-A (HRP), 3,3′5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB), Zitronensäure, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Rhodamin B Isothiocyanat ( RITC) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. 2-(4-Iodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium wurde von Clontech bezogen. DHR123 und PMA wurden von Cayman Chemical bezogen. Wasserstoffperoxid (H₂ .) O₂ , 35%) wurde von SHOWA Chemical Industry bezogen. Tert-Butylhydroperoxid-Lösung (70 % in H₂ .) O) wurde von Aldrich bezogen. Eisen(II)-perchlorat (Fe(ClO₄ .) )₂ ) wurde von Alfa Aesar gekauft. Ultrareines deionisiertes (D.I.) Wasser wurde durch ein Millipore Milli-Q Plus-System erzeugt. Alle Reagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Synthese hohler Silica-Nanosphären (HSNs)

HSNs wurden durch ein reverses Mikroemulsionssystem synthetisiert, begleitet von einem selektiven Ätzverfahren, wie in unseren früheren Studien beschrieben [25, 29]. Typischerweise 20 ml Decan als Ölphase, 1,63 ml CA-520 als Tensid und 550 μl n -Hexanol als Cotensid wurden gemischt und mit einem 2 cm PTFE-beschichteten Rührstab bei 650 U/min magnetisch gerührt. Danach werden 350 μL D.I. Wasser wurde der Mischung bei Raumtemperatur zugesetzt, wodurch ein Wasser-in-Öl (w/o)-Mikroemulsionssystem erzeugt wurde. Als nächstes wurden 25 μl APTMS-Ethanollösung (200 μl APTMS in 1,4 ml absolutem Ethanol) und 100 μl TEOS unter Rühren zugegeben. Nach 10 Minuten Rühren wurden 250 μL wässriger Ammoniak (35 Gew.-%) unter Rühren bei 20 °C in das System eingeführt. Nach 10 h wurden 95 % Ethanol zugegeben, um das Mikroemulsionssystem zu destabilisieren, und die festen Siliciumdioxid-Nanopartikel (SSNs) wurden durch Zentrifugieren bei 11.000 U/min für 20 Minuten gesammelt. Um HSNs zu erhalten, wurden die SSNs in D.I. Wasser unter Rühren bei 40 °C für 40 min. Als nächstes wurden die HSNs durch Zentrifugation bei 11.000 U/min für 20 Minuten gesammelt und mehrmals mit 95 % Ethanol gewaschen. Schließlich wurden die HSNs suspendiert und in 99,5%igem Ethanol aufbewahrt.

Synthese von Meerrettich-Peroxidase-verkapselten hohlen Silica-Nanosphären (HRP@HSNs)

HRP@HSNs wurden nach einer Methode synthetisiert, die auf unseren früheren Studien basiert [27, 28]. Typischerweise ist die Synthese ähnlich dem obigen Verfahren, außer dass 350 μL D.I. Wasser wurde durch 350 μl wässriges HRP ersetzt (90 μl von 10 mg/ml einer HRP-Lösung in 350 μl D.I.-Wasser). Nach der Synthese wurden HRP@HSNs in D.I. Wasser bei 4 °C.

Synthese von FITC-HSNs und HRP@FITC-HSNs

HSNs und HRP@HSNs mit eingebautem grün emittierendem Fluorescein-Farbstoff (bezeichnet als FITC-HSNs und HRP@FITC-HSNs) wurden ähnlich dem obigen Verfahren synthetisiert, außer dass die ethanolische APTMS-Lösung durch eine FITC-APTMS-Lösung ersetzt wurde. Eine ethanolische FITC-APTMS-Lösung wurde hergestellt, indem 10 mg FITC und 200 μL APTMS mit 1,4 ml absolutem Ethanol unter dunklen Bedingungen für 18 Stunden bei Raumtemperatur gemischt wurden.

HRP-Einfangeffizienz und Ladekapazität von HRP@HSNs

Zuerst wurde eine Mischung aus HRP (6 mg in 500 μl D.I.-Wasser) und RITC (3 mg in 350 μl DMSO) unter dunklen Bedingungen 24 h bei 4 °C gerührt. Danach wurde die Mischung auf eine Dialysemembran aus regenerierter Cellulose mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 12–14 kDa übertragen. Um das nicht umgesetzte RITC zu entfernen, wurde der Dialysebeutel dann gegen 1 l D.I. Wasser und rührt 3 Tage lang vorsichtig um. Schließlich wurde das RITC-markierte HRP (als RITC-HRP bezeichnet) verwendet, um RITC-HRP@HSNs zu synthetisieren.

Um die HRP-Beladungskapazität zu bestimmen, wurden RITC-HRP@HSNs in 1 ml NaOH (1 M) 1 h lang gelöst und die Menge des eingeschlossenen RITC-HRP wurde aus einer Kalibrierungskurve berechnet, die durch Auftragen der Fluoreszenzintensität gegen die Konzentration von RITC-HRP. Die Fluoreszenz wurde mit einem Hitachi F-4500-Instrument bei einer Anregungswellenlänge von 543 nm und einer Emissionswellenlänge von 550–650 nm gemessen. Die HRP-Einschlusseffizienz und die Ladekapazität von HRP@HSNs wurden wie folgt definiert:Einschlusseffizienz (%) = Masse von RITC-HRP in RITC-HRP@HSNs/Anfangsmasse von RITC-HRP; und Ladekapazität = Masse von RITC-HRP in HRP-RITC@HSNs/Masse von RITC-HRP@HSNs.

HRP-Aktivitätstest

Um die Aktivität des Peroxidase-Enzyms nachzuweisen, wurde ein chromogenes Substrat von TMB verwendet. TMB kann in ein farbiges Produkt umgewandelt werden, wenn es durch HRP unter Verwendung von Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel oxidiert wird. Zunächst wurden verschiedene Konzentrationen von nativem HRP und HRP@HSN in Phosphat- und Citratpuffer (pH 5,2) hergestellt. Dann wurde jede Lösung mit 50 μl der TMB-Lösung (20 μM in DMSO) und 50 μl H₂ . ergänzt O₂ (20 μM in D.I.-Wasser). Die Reaktion wurde überwacht, indem die Absorption bei 655 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Readers (BioTek Synergy Hybrid Reader) gemessen wurde. Die Aktivität von in HSNs verkapseltem HRP wurde aus der Kalibrierungskurve von nativem HRP berechnet.

Reaktivitätsassay von HRP@HSNs auf verschiedene ROS

DHR123 (20 μM) allein oder gemischt mit HRP@HSNs (50 μg/ml) wurde mit verschiedenen Arten von ROS (100 μM) in 100 μl DMEM-Lösung (pH 7,4) inkubiert. Die Fluoreszenzemission bei 530 nm (λex = 488 nm) wurde in den ersten 120 Minuten alle 5 Minuten überwacht. Die untersuchten ROS wurden wie folgt erhalten:Wasserstoffperoxid (H₂ O₂ ) und tert-Butylhydroperoxid (TBHP) wurden aus kommerziell erhältlichen 32 bzw. 70 % wässrigen Lösungen hergestellt. Superoxid (O₂ ^•− ) wurde aus 10 mM Kaliumsuperoxid (KO₂ .) hergestellt ) in DMEM. Hydroxylradikale (•OH) und tert-Butoxyradikale (•OtBu) wurden durch die Reaktion von 1 mM Fe(ClO₄ )₂ mit 100 μM H₂ O₂ bzw. 100 μM TBHP.

Zellkultur- und Lebensfähigkeits-Assay

Die Mausmakrophagenzelllinie RAW264.7 wurde von ATCC erhalten. RAW264.7-Zellen wurden in DMEM mit 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Gibco) bei 37 °C in 5 % CO₂ . gehalten Atmosphäre. Normalerweise 2 × 10 ⁵ RAW264.7-Zellen pro Well wurden in 24-Well-Platten für die Lebensfähigkeitstests ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit unterschiedlichen Mengen (0, 50, 100 und 200 μg/ml) einer Nanopartikelsuspension in serumfreiem DMEM 2 h lang inkubiert. Für den Zytotoxizitätsassay wurden mit Nanopartikeln behandelte Zellen zweimal mit Kulturmedium gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit WST-1-Reagenz (Clontech) bei 37 °C für 2 h. Für den Proliferationsassay ließ man die Zellen nach einer Behandlung mit Nanopartikeln für 2 h 24 h in einem normalen Wachstumsmedium wachsen, gefolgt von einer Inkubation mit dem WST-1-Reagenz. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den Formazanfarbstoff bestimmt, der von lebenden Zellen erzeugt wurde, und die Absorption bei 450 nm wurde mit einer Referenzwellenlänge von 650 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Bio-Rad, Modell 680) gemessen.

Zellaufnahmeanalyse

RAW264.7-Zellen bei 1 × 10 ⁶ pro Well wurden über Nacht in Sechs-Well-Platten ausgesät. Anschließend wurden RAW264.7-Makrophagen mit unterschiedlichen Mengen (0, 50, 100 und 200 μg/ml) einer Nanopartikelsuspension in serumfreiem DMEM-Medium 2 h lang behandelt. Danach wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und durch eine Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst. Die Aufnahme von Nanopartikeln durch RAW264.7-Makrophagen wurde durchflusszytometrisch untersucht. Trypanblau wurde verwendet, um die Fluoreszenz von Nanopartikeln zu löschen, die an der äußeren Zellmembran adsorbiert sind.

Durchflusszytometrie-Analyse der ROS-Produktion in PMA-stimulierten RAW264.7-Makrophagen

Typischerweise wurden die Zellen nach 2 Stunden Behandlung von RAW264.7-Makrophagen mit Nanopartikeln dreimal mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit 20 μM DHR123 in serumfreiem DMEM für 30 Minuten. Dann wurden RAW264.7-Zellen mit PBS gewaschen und mit Kulturmedium, das PMA in unterschiedlichen Konzentrationen enthielt, 1 h lang inkubiert. Nach dem Waschen wurden RAW264.7-Makrophagen geerntet und mit einem FACS Canto II Durchflusszytometer analysiert.

Quantitative Analyse

RAW264.7-Zellen bei 3 × 10 ⁴ pro Well wurden in 96-Well-Platten für semiquantitative Assays ausgesät. Nach Inkubation mit 50 μL 100 μg/ml einer Nanopartikelsuspension in serumfreiem DMEM für 2 h wurden mit Nanopartikeln behandelte Zellen mit 50 μL serumfreiem DMEM mit unterschiedlichen Konzentrationen an PMA und 20 μM DHR123 für zusätzliches behandelt 1 h bei 37 °C. Gleichzeitig werden externe Standards von H₂ O₂ gemischt mit 50 μg/ml HRP@HSNs wurden verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu entwickeln, indem die Fluoreszenzintensität gegen die Konzentration von H₂ . aufgetragen wurde O₂ . Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Mikroplatten-Reader (BioTek Synergy Hybrid Reader) mit Anregung bei 488 nm und Emission bei 530 nm gemessen. Unter Verwendung der erstellten Kalibrierungskurve, Mengen von H₂ O₂ in RAW264.7-Zellen, die mit verschiedenen Mengen an PMA stimuliert wurden, wurden berechnet.

Charakterisierung

Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Bilder wurden auf einem JEOL JEM-1200 EX II aufgenommen, der bei 100 kV betrieben wurde. Die Bilder wurden mit einer GatanOrius CCD-Kamera aufgenommen. Proben wurden in 95 % Ethanol dispergiert und auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter getropft und dann luftgetrocknet und untersucht. Um HRP in den Hohlkugeln zu überprüfen, wurde eine negativ gefärbte Probe 1 h in 1%igem wässrigem Uranylacetat (UA) gerührt und dann zentrifugiert, um das verbleibende UA zu entfernen. Schließlich wurde die Probe in Ethanol dispergiert und zur Abbildung auf das Kupfergitter getropft. Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zetapotentialmessungen wurden auf einem Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK) durchgeführt. Optische Bilder von RAW264.7-Zellen wurden mit einem inversen Mikroskop Zeiss Axio Observer Z1 aufgenommen.

Ergebnisse und Diskussion

Design und Synthese von HSNs und HRP@HSNs

Typischerweise wurden HSNs und HRP@HSNs über einen Ammoniak-katalysierten Sol-Gel-Prozess in Kombination mit einem Wasser-in-Öl (w/o) Mikroemulsionssystem gemäß unserer vorherigen Methode synthetisiert [27, 28]. Schema 1 veranschaulicht die Synthese von HRP@HSNs. Laut TEM-Bildern (Abb. 1) zeigten HSNs mit und ohne gekapseltem HRP einen durchschnittlichen Durchmesser von 45 nm (Zusatzdatei 1:Abbildung S1). Die UA-Färbung zeigte deutlich eine erhöhte Elektronendichte innerhalb der HRP@HSNs, aber außerhalb der HRP@HSNs wurde keine Färbung beobachtet (Abb. 1b), was darauf hindeutet, dass die HRP-Enzyme erfolgreich im Inneren der HRP@HSNs eingeschlossen wurden.

Flussdiagramm der Synthese von Meerrettich-Peroxidase-eingekapselten hohlen Silica-Nanosphären (HRP@HSNs). APTMS, 3-Aminopropyltrimethoxysilan; TEOS, Tetraethylorthosilikat; SSN, festes Siliziumdioxid-Nanopartikel

TEM-Bilder von a hohle Siliziumdioxid-Nanokugeln (HSNs), b Mit Uranylacetat gefärbte HSNs, c Meerrettichperoxidase-verkapselte HSNs (HRP@HSNs) und d HRP@HSNs gefärbt mit Uranylacetat. Einschub:eine vergrößerte Ansicht

Die bei Raumtemperatur durchgeführten DLS-Messungen und Zetapotenzialanalysen sind in Tabelle 1 aufgeführt. DLS-Daten zeigten, dass sowohl HSNs als auch HRP@HSNs positive Zetapotenziale in Wasser (pH ~ 6,5) mit hydrodynamischen Durchmessern von 188 ± 4 und 184 ± 6 nm . ergaben im Wasser bzw. Wenn die Nanopartikel jedoch in serumfreiem DMEM dispergiert wurden, erhöhten sich die hydrodynamischen Durchmesser auf 1767 ±   94 nm für HSNs und 1598 ±   127 nm für HRP@HSNs. Diese weisen auf einen geringen Aggregationsgrad von HSNs hin, aber sie waren immer noch gut in Medien suspendiert. Die in Medien gemessenen negativen Zeta-Potentiale beider Nanopartikel lassen vermuten, dass ein Teil der Ionen und Biomoleküle aus dem biologischen Milieu an den Nanopartikeloberflächen adsorbiert worden sein könnte [30, 31]. Unter dieser Bedingung waren die positiv geladenen Oberflächen von Nanopartikeln von negativ geladenen Substanzen bedeckt, die durch elektrostatische Wechselwirkungen schnell zu einer Aggregation der Nanopartikel führten. Um die unspezifische Aggregation zu reduzieren und die kolloidale Stabilität von Nanopartikeln zu fördern, wurde Rinderserumalbumin (BSA) in die biologischen Medien eingeführt [28]. Anschließend zeigten die hydrodynamischen Durchmesser von HSNs und HRP@HSNs beträchtlich verringerte hydrodynamische Durchmesser auf 197 ± 43 bzw. 195 ± 19 nm.

HRP-Einfangeffizienz und Ladekapazität von HRP@HSNs

Um die Effizienz und Beladungskapazität des HRP-Einschlusses zu untersuchen, wurde mit Fluoreszenzfarbstoff (RITC) markiertes HRP hergestellt (als RITC-HRP bezeichnet). Die Fluoreszenzintensität der RITC-HRP@HSNs wurde durch Suspendieren der Nanopartikel in 1 M NaOH gemessen und die Menge an verkapseltem RITC-HRP wurde gemäß einer Kalibrierungskurve bestimmt, die durch Auftragen der Fluoreszenzintensität gegen die Konzentration von nativem RITC-HRP . erstellt wurde unter denselben Bedingungen (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2). Um die Auswirkungen der Enzymkonzentration auf die Einschlusseffizienz und Beladungskapazität zu untersuchen, wurden drei verschiedene Mengen an HRP (11,1, 22,2 und 33,3 nmol) in die Synthese eingeführt. Es ist erwähnenswert, dass in diesem Konzentrationsbereich unabhängig davon, wie viel Enzym eingeführt wurde, die Einschlusseffizienz der Enzyme in jedem der drei Fälle etwa 6% betrug. Diese geringe Effizienz kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass nur ein Bruchteil der Mikroemulsionströpfchen nukleiert und zu HSN gewachsen ist; die meisten Mikroemulsionströpfchen waren nicht nukleiert und blieben in ihrer geringen Größe von ~ 8 nm [25]. Zukünftige Arbeiten können erforderlich sein, um die Ladeeffizienz zu erhöhen. Die HRP-Belastungskapazität von HRP@HSNs stieg jedoch allmählich auf 12,5 ± 1,2 μg HRP/mg HSNs an, wenn 33,3 nmol HRP verwendet wurden (zusätzliche Datei 1:Tabelle S1). Dies weist darauf hin, dass die HRP-Beladungskapazität durch die in der Reaktion vorhandene Enzymmenge gesteuert werden kann.

Zytotoxizität und zelluläre Aufnahme von HSNs und HRP@HSNs

Um die In-vitro-Zytotoxizität von HSNs und HRP@HSNs zu bewerten, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch WST-1-Assays untersucht. Wie in Zusätzliche Datei 1:Abbildung S3 gezeigt, wurde keine signifikante Änderung der RAW264.7-Zellproliferation nach Behandlungen mit Nanopartikeln für entweder 2 Stunden oder 2 Stunden gefolgt von weiteren 24 Stunden Kultur beobachtet. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde keine offensichtliche Wirkung auf die zelluläre mitochondriale Funktion durch die Silica-Nanopartikel gefunden, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von HRP in HSNs.

Als nächstes wurden FITC-konjugierte HSNs bzw. HRP@HSNs hergestellt, um den Konzentrationseffekt von Nanopartikeln auf die RAW264.7-Markierung zu untersuchen. Die durchflusszytometrischen Ergebnisse (zusätzliche Datei 1:Abbildung S4) zeigten, dass RAW264.7-Zellen erfolgreich mit FITC-HSNs und HRP@FITC-HSNs in unterschiedlichen Konzentrationen für 2 h in serumfreiem Medium markiert wurden. In beiden Fällen wurde eine dosisabhängige Steigerung der Markierungseffizienz festgestellt, und mehr als 80 % der RAW264.7-Zellen wurden durch Exposition gegenüber Nanopartikeln in einer Konzentration von> 50 μg/ml für 2 h markiert. Eigenschaften wie hocheffiziente intrazelluläre Markierung mit kurzer Inkubationszeit, eine relativ niedrige Dosis an Nanopartikeln und Nicht-Zytotoxizität machen HRP@HSNs für den intrazellulären Nachweis von ROS geeignet.

Reaktivität von HRP@HSNs auf verschiedene ROS

Gemäß dem HRP-Enzymaktivitätsassay unter Verwendung von TMB als Substrat verblieben etwa 40% der anfänglichen Enzymaktivität bei der anschließenden Einkapselung von HRP in HSNs. Diese Abnahme der beobachteten spezifischen Aktivität des eingekapselten Enzyms (Mol Substrat, die pro Enzymeinheit pro Zeiteinheit umgewandelt werden) könnte auf Stofftransferbeschränkungen zurückzuführen sein, die auftreten, wenn Substrate die Kieselsäurehülle in Richtung HRP passieren [32]. Nichtsdestotrotz bietet die Verkapselungsstrategie zusätzliche Funktionen, beispielsweise kann die poröse Kieselsäurehülle HRP vor Proteolyse schützen und gleichzeitig den Transport kleiner Moleküle von Reaktanten und Produkten ermöglichen [26, 27]. Zusammenfassend könnte die beobachtete Reaktivität von HRP@HSNs gegenüber ROS, bewertet durch den Einbau einer Fluoreszenzsonde (DHR123), aus einer Kombination der Affinität der Nanopartikel sowie der intrinsischen Eigenschaft von HRP für ROS resultieren.

Zellfreie Systeme wurden verwendet, um eine Vielzahl biologisch relevanter ROS zu erzeugen, einschließlich Wasserstoffperoxid (H₂ O₂ ), TBHP, Hydroxylradikale (•OH), tert-Butoxyradikale (•OtBu) und Superoxid (O₂ • ⁻ ). Zuerst wurde DHR123 mit einer Reihe von ROS in Abwesenheit und Anwesenheit von HRP oder HRP@HSNs inkubiert, gefolgt von der Messung der Fluoreszenzintensität des Produkts Rhodamin 123 (R123). Wie in Abb. 2 gezeigt, wurde die Fluoreszenzintensität unabhängig davon, welcher ROS-Typ verwendet wurde, zeitabhängig gemessen (30, 60, 90 und 120 Minuten). Scheinbare Intensitätsunterschiede zwischen verschiedenen ROS hängen jedoch von den intrinsischen Eigenschaften von DHR123 ab. Einerseits zeigt Abb. 2a in Übereinstimmung mit einer früheren Studie [33], dass weder H₂ O₂ noch O₂ • ⁻ könnte DHR123 zu R123 oxidieren. Darüber hinaus zeigte DHR123 gegenüber anderen ROS eine höhere Reaktivität für •OtBu- und •OH-Radikale. Mit der katalytischen Aktivität von HRP wurde eine bemerkenswerte Zunahme der Fluoreszenzintensität in Gegenwart von nativem HRP und HRP@HSNs beobachtet, wie in Abb. 2b, c gezeigt. Es wurde festgestellt, dass die höhere Fluoreszenzintensität, die bei nativem HRP im Vergleich zu HRP@HSNs zur gleichen Reaktionszeit gefunden wurde, positiv mit deren beobachteten Enzymaktivitäten korreliert war.

a –c Zeitabhängige Fluoreszenzintensität der Reaktion ausgewählter reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit a Dihydrorhodamin 123 (DHR123), b DHR123 + Meerrettichperoxidase (HRP) und c DHR123 + Meerrettichperoxidase-verkapselte HSNs (HRP@HSNs). d Verbessertes Intensitätsverhältnis der Reaktion ausgewählter ROS mit DHR123 + HRP und DHR123 + HRP@HSNs nach 1 h. Die gezeigten Daten beziehen sich auf 20 μM DHR123, 400 ng/ml HRP, 50 μg/ml HRP@HSNs und 100 μM ROS. (*p < 0,05 gegenüber der Kontrollgruppe zu entsprechenden Zeitpunkten)

Um einen direkten Vergleich zwischen verschiedenen ROS zu ermöglichen, wurden Daten in einem Zeitintervall von 60 Minuten ausgewählt und als relative Fluoreszenzintensität, normalisiert auf die Kontrolle, angegeben (zusätzliche Datei 1:Abbildung S5). Eine anschließende Analyse des verstärkten Intensitätsverhältnisses wurde gezeigt, indem die relative Fluoreszenzintensität von DHR123 + HRP oder DHR123 + HRP@HSNs durch DHR123 geteilt wurde (Abb. 2d). In beiden HRP-haltigen Fällen ein ähnlicher Trend des erhöhten Intensitätsverhältnisses gegenüber verschiedenen ROS sowie eine signifikante Zunahme der Reaktivität von DHR123 gegenüber H₂ O₂ und O₂ • ⁻ wurden beobachtet, was zeigt, dass das verkapselte HRP ein hohes Maß an intrinsischer Enzymaktivität ergab und die Siliciumdioxidhüllen von HRP@HSNs den Transport kleiner Moleküle für eine selektive Biokatalyse ermöglichten.

Intrazelluläre ROS-Erkennung mit HRP@HSNs

Um die ROS-Erkennungsfunktion von HRP@HSNs in Zellen zu bewerten, wurden RAW264.7-Makrophagen 2 h mit HRP@HSNs inkubiert, anschließend gewaschen und dann 30 min mit DHR123 (20 μM) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und für eine weitere Stunde mit PMA (1 μg/ml) behandelt. Es ist bekannt, dass die Stimulierung von Makrophagen mit PMA zur Produktion von Superoxid führt, das durch Superoxiddismutase oder durch spontane Dismutation zu Wasserstoffperoxid dismutiert wird [34,35,36]. Somit kann PMA als Stimulans fungieren, um H₂ . zu erzeugen O₂ in RAW264.7-Makrophagen zur Bewertung des intrazellulären H₂ O₂ -Sensing-Fähigkeit von HRP@HSNs. Wie in Abb. 3a gezeigt, zeigten beide Fälle von allein kultivierten und mit HSNs kultivierten RAW264.7-Makrophagen eine schwache Fluoreszenz in der durchflusszytometrischen Analyse, was darauf hindeutet, dass nicht stimulierte Zellen einen schwachen Basalspiegel von ROS produzierten, bei dem keine signifikanten ROS induziert wurden das Vorhandensein von HSNs. Darüber hinaus zeigten mit HRP@HSNs behandelte Zellen eine signifikante Intensitätszunahme (Abb. 3a), was darauf hindeutet, dass die zugeführten HRP@HSNs eine zusätzliche katalytische Aktivität in den Zellen ergaben.

a Durchflusszytometrie-Analysen von RAW264.7-Makrophagen, die mit und ohne Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) in Gegenwart und Abwesenheit von Nanopartikeln stimuliert wurden. b PMA und c Meerrettichperoxidase-eingekapselte HSNs (HRP@HSNs) veränderten die Fluoreszenz von RAW264.7-Makrophagen konzentrationsabhängig. d Die repräsentativen Fluoreszenzbilder von RAW264.7-Makrophagen unter den angegebenen Bedingungen. Maßstabsleisten 50 μm

Für Stimulationsexperimente erzeugten PMA-behandelte Zellen im Vergleich zu unstimulierten Zellen typischerweise mehr als zweifach höhere R123-Fluoreszenzniveaus. Darüber hinaus wiesen mit HRP@HSNs behandelte Zellen den höchsten Fluoreszenzgrad auf, gefolgt von HSNs und dann Zellen allein. Es wurde festgestellt, dass die Behandlung der stimulierten RAW264.7-Makrophagen mit HSNs zu einer geringen Zunahme der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu der der Kontrolle führte. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass zelluläre Stressreaktionen extrem schnell ausgelöst werden und empfindlich auf äußere Reize, einschließlich der Exposition gegenüber Nanopartikeln, reagieren [37]. Darüber hinaus induzierten sowohl PMA (0,1, 0,25, 0,5, 1 und 2 μg/ml) als auch HRP@HSNs (50, 100 und 200 μg/ml) die Expression von R123 dosisabhängig, wie in Abb . 3b, c.

In Übereinstimmung mit der durchflusszytometrischen Analyse zeigt Abb. 3d die repräsentativen Fluoreszenzbilder von RAW264.7-Makrophagen, die mit und ohne PMA in Gegenwart und Abwesenheit von Nanopartikeln stimuliert wurden. Das System war in der Lage, endogenes H₂ . zu visualisieren O₂ Generation in RAW264.7-Zellen, und die schwächste Fluoreszenzintensität wurde in Zellen beobachtet, die mit HRP@HSNs gefolgt von PMA-Stimulation behandelt wurden. Wie in Abb. 4a gezeigt, ist die Zelllebensfähigkeit von RAW264.7-Makrophagen in Gegenwart des Stimulans PMA oder von exogenem H₂ O₂ wurde durch WST-1-Assays untersucht. Während ROS mit der Apoptose in Verbindung gebracht wurden [38], wurde zum angegebenen Zeitpunkt nur eine geringe Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen festgestellt, was die folgende semiquantitative Analyse praktisch und aussagekräftig macht.

a WST-1-Assay von RAW 264.7-Makrophagen nach Behandlungen mit exogenem H₂ O₂ oder Stimulation mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) für 1 h. b Nachweis der Konzentration von H₂ O₂ endogen produziert von RAW264.7-Makrophagen unter verschiedenen Konzentrationen des PMA-Stimulans in Gegenwart von Meerrettich-Peroxidase-eingekapselten hohlen Silica-Nanosphären (HRP@HSNs) und Dihydrorhodamin 123 (DHR123). Inset:a calibration curve obtained from the external standards of H₂ O₂ mixed with HRP@HSNs and DHR123

Application of HRP@HSNs In Vitro for Quantitative Analysis of H₂ O₂

To evaluate the capacity of HRP@HSNs for quantifying endogenous hydrogen peroxide produced in PMA-stimulated RAW264.7 cells, a calibration curve from the exogenous H₂ O₂ experiment, with a detection range of 0.625~15 μM, was established by microplate measurements (Fig. 4b, inset). The standard calibration curve appears to be linear as expected. Then, RAW264.7 cells were treated with 100 μg/mL of HRP@HSNs for 2 h, followed by co-incubation with various concentrations of PMA and 20 μM of DHR123 at 37 °C for 1 h. After that, the concentration of H₂ O₂ endogenously produced by PMA-stimulated RAW264.7 cells was determined by measuring the fluorescence intensity, followed by conversion using the established calibration curve. Notably, because most of the HRP@HSNs were uptaken within the cells, the H₂ O₂ -triggered fluorescence of R123 could be attributed to intracellular enzyme-catalyzed reactions rather than the extracellular contribution. Although H₂ O₂ is able to diffuse across biomembranes, due to its limited diffusion and rapid enzymatic consumption inside cells, concentration gradients of H₂ O₂ are formed across membranes [39, 40]. Typically, under normal physiological conditions, H₂ O₂ has an extracellular concentration estimated at 10 ^− 7 ~10 ^− 6  M, which is about 10-fold higher than that observed in intracellular fluid [1, 41, 42]. In pathological conditions, extracellular concentrations of H₂ O₂ are in the range of 10~50 μM and are additionally elevated to as high as 10 ^− 4  M in apoptosis [1]. As shown in Fig. 4b and Additional file 1:Table S2, endogenous hydrogen peroxide caused by PMA-stimulated RAW264.7 cells was created in a dose-dependent manner and produced at levels of about 10 μM when the concentration of PMA used exceeded 0.25 μg/mL. Taken together, these results indicate that HRP@HSNs were capable of detecting semi-quantitatively endogenous the concentration of hydrogen peroxide of RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.

Conclusions

In summary, we have demonstrated that hollow silica nanospheres encapsulating HRP can be synthesized via a microemulsion-templating system and act as intracellular fluorescent ROS sensors. The shells of HRP@HSNs are permeable to small molecules, such as the enzyme substrates, which allows them to react with large enzyme payloads in the hollow cavity. Both the effective intracellular delivery and satisfactory catalytic activity of HRP@HSNs significantly enhance reduction-triggered fluorescence and constitute the ability of semi-quantitative measurements of endogenous H₂ O₂ in RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.

Because the concentration and location of H₂ O₂ in eukaryotic cells strongly rely on the types of cells, and cellular compartments [1], specific targeting of tumor cells or organelles could further be achieved by surface modification of HRP@HSNs with monoclonal antibodies or peptides. Also, non-enzymatic H₂ O₂ detection could be realized by replacing the interior nanoreactors of HRP with nanoparticles [43, 44] or boronate-based fluorescent probes [42, 45]. Future efforts should be devoted to maximizing the sensitivity and specificity for H₂ O₂ as well as enabling more informative designs of next-generation nanomaterials. Such hollow capsules could be a promising platform for modern nanomedicines that aims to simultaneously image, sensing, and deliver therapeutic molecules specifically to defective cells.

Abkürzungen

APTMS:

3-Aminopropyltrimethoxysilane

BSA:

Bovine serum albumin

DHR123:

Dihydrorhodamine 123

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

HRP:

Horseradish peroxidase

HSNs:

Hollow silica nanospheres

Igepal CA-520:

Polyoxyethylene (5) isooctylphenyl ether

mETC:

Mitochondrial electron transport chain

PET:

Positron emission tomography

PMA:

Phorbol 12-myristate 13-acetate

R123:

Rhodamine 123

RITC:

Rhodamine B isothiocyanate

ROS:

Reactive oxygen species

SSN:

Solid silica nanoparticles

TBHP:

Tert-butyl hydroperoxide

TEM:

Transmission electron microscopic

TEOS:

Tetraethyl orthosilicate

TMB:

3,3′5,5′-Tetramethylbenzidine