Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies in wässrigen Lösungen, die GdVO4:Eu3+-Nanopartikel und deren Komplexe mit Methylenblau enthalten

Zusammenfassung

In diesem Brief berichten wir über die Untersuchung der Bildung von freien Radikalen und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Wasserlösungen, die Gadoliniumorthovanadat GdVO₄ enthalten :Eu³⁺ Nanopartikel (VNPs) und ihre Komplexe mit Methylenblau (MB) Photosensibilisator. Die katalytische Aktivität wurde unter UV-Vis- und Röntgenbestrahlung mit drei Methoden untersucht (Test auf konjugierte Diene, OH·-Radikal und Singulett-Sauerstoff-Detektion). Es wurde gezeigt, dass die VNPs-MB-Komplexe eine hohe Effizienz der ROS-Erzeugung unter UV-Vis-Bestrahlung zeigen, verbunden mit einer hohen Effizienz der OH·-Radikalerzeugung durch VNPs und der Singulett-Sauerstofferzeugung durch MB aufgrund des nichtstrahlenden Anregungsenergietransfers von VNPs auf MB-Moleküle . Im Gegensatz dazu unter Röntgenbestrahlung das starke OH^. Radikalfänger durch VNPs wurde beobachtet.

Hintergrund

Die Strahlentherapie (RT) bleibt ein wichtiger Bestandteil der Krebsbehandlung, wobei etwa 50 % aller Krebspatienten während ihres Krankheitsverlaufs eine RT erhalten [1,2,3]. Der genaue Mechanismus des Zelltods durch Strahlung ist noch Gegenstand aktiver Forschung. Doppelstrangbrüche nukleärer DNA gelten als wichtigste zelluläre Strahlungswirkung, die zum irreversiblen Verlust der reproduktiven Integrität der Zelle und schließlich zum Zelltod führt [4]. Solche Strahlenschäden können verursacht werden durch (i) direkte Ionisation und (ii) indirekte Ionisation über freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies (ROS), chemisch reaktive sauerstoffhaltige Spezies, die aus der Radiolyse von Zellwasser und Sauerstoffmolekülen entstehen [2,3, 4]. In der klinischen Therapie ist der Schaden häufig eine indirekte Ionisierung. Wasser verliert dabei ein Elektron und wird hochreaktiv. Dann wird Wasser durch eine dreistufige Kettenreaktion nacheinander in eine Reihe von Radikalen und molekularen Produkten umgewandelt:hydratisierte Elektronen ($ {e}_{aq}^{-}\Big) $, Wasserstoffatom( H ^∙ ), Hydroxylradikal OH·, Hydroperoxylradikal ($ {HO}_2^{.}\Big) $, Wasserstoffperoxid (H₂ O₂ ) und Wasserstoffmoleküle (H₂ ) [5, 6]. Hydratisierte Elektronen und Wasserstoffatome sind starke Reduktionsmittel. Im Gegensatz dazu sind Hydroxylradikale sehr starke oxidative Spezies und entfernen sofort Elektronen von jedem Molekül auf ihrem Weg, wodurch dieses Molekül in ein freies Radikal umgewandelt wird und so eine Kettenreaktion propagiert wird [5]. Wenn gelöster molekularer Sauerstoff in bestrahltem Wasser vorliegt, erzeugt seine Reduktion Superoxidradikale ($ {O}_2^{.-} $) und ist die Vorstufe der meisten anderen ROS, einschließlich Singulett-Sauerstoff (¹ O₂ ) [7].

Kürzlich wurde gezeigt, dass Nanopartikel (NPs) mit hoher Ordnungszahl (Au, Ag, Hf, Gd, Ti) [8,9,10,11], Halbleiter-NPs (Metalloxid TiO₂ ZnO, CuO, CeO₂ , Al₂ O₃; Quantenpunkte ZnS, ZnS, LaF₃ , etc.) [8, 12,13,14] und einige anorganische NPs (Kohlenstoff-Nanoröhren) [15, 16] erhöhen die Effizienz der RT. Theoretische Prinzipien der Röntgen-NP-Wechselwirkung sind gut beschrieben [8, 12, 14]. Eine Kaskadenwechselwirkung von hochenergetischen Photonen mit dem Gitter des NP erfolgt hauptsächlich durch den photoelektrischen Effekt und den Compton-Streueffekt. Compton-, Photo- oder Auger-Elektronen können die Emission von Sekundärelektronen induzieren, die in die Umgebung entweichen und von einem nahe der Oberfläche von NPs lokalisierten Akzeptor (dh Wasser, Biomolekül, Sauerstoff, Stickoxide) eingefangen werden und induzieren biomolekulare Radikale und ROS-Produktion [8, 12, 14]. Die strahlensensibilisierende Wirkung von NPs wird mit biomolekularen Radikalen und der ROS-Erzeugung als letzte Stufe der Röntgenwechselwirkung mit NPs in Verbindung gebracht. In Halbleiter-NPs, wie Metalloxid-NPs, kann die mit der ROS-Erzeugung verbundene zytotoxische Wirkung auch durch UV-Bestrahlung induziert werden [17,18,19,20]. Der Mechanismus besteht darin, dass bei Bestrahlung von NPs mit UV-Licht (Energie größer als die Bandlücke) die Ladungstrennung induziert wird, wodurch ein Loch erzeugt wird (h⁺ ) im Valenzband und ein Elektron (e⁻ ) im Dirigentenorchester. Elektronen und Löcher weisen eine hohe Reduktions- bzw. Oxidationsfähigkeit auf [18]. Die Elektronen können mit molekularem Sauerstoff reagieren, um durch einen reduktiven Prozess ein Superoxidradikal (${O}_2^{\cdotp -}$) zu erzeugen, während die Löcher Elektronen aus Wasser und/oder Hydroxylionen abstrahieren können, wodurch Hydroxylradikale (OH ·) durch einen oxidativen Prozess [18,19,20]. Für TiO₂ , CeO₂ , Al₂ O₃ , und ZnO-Nanopartikel, die ¹ O₂ über die Oxidation von $ {O}_2^{\cdotp -} $ wurde berichtet [18, 21, 22].

Ein weiterer Ansatz zur Steigerung der Effizienz der Krebstherapie (photodynamische Therapie, PDT) mit szintillierenden NPs wurde von Chen und Zhang [23] vorgeschlagen. Dieser Ansatz kombiniert röntgenangeregte (szintillierende) NPs und Photosensibilisator(PS)-Moleküle. Szintillierende NPs dienen als Energiewandler, der Energie aus der Röntgenbestrahlung auf den PS überträgt, der Singulett-Sauerstoff für die Tumorzerstörung erzeugt. Dieser Ansatz ermöglicht eine tiefe Krebsbehandlung und verbessert sowohl die PDT als auch die RT. Bisher wurde eine Vielzahl von Szintillations-NPs und deren Komplexe mit PS als durch Röntgenstrahlen induzierbare photodynamische Agentien untersucht [12, 14, 23, 24, 25, 26, 27, 28].

Vor kurzem haben wir über die Bildung von Komplexen auf der Basis von szintillierenden Gadoliniumorthovanadat-NPs, dotiert mit Europiumionen GdVO₄ ., berichtet :Eu³⁺ (VNPs) und Methylenblau (MB) Photosensibilisator und Untersuchung des elektronischen Anregungsenergietransfers in den Komplexen [29]. Es wurde gezeigt, dass sie aufgrund der effektiven Umwandlung der Anregungsenergie in den Komplexen als röntgeninduzierbares photodynamisches Mittel in Frage kommen könnten. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Effizienz der ROS-Erzeugung in wässrigen Lösungen zu untersuchen, die VNPs und deren Komplexe mit MB unter UV- und Röntgenbestrahlung enthalten.

Experimentell

Chemikalien

Gadoliniumchlorid GdCl₃ ·6H₂ O (99,9%), Europiumchlorid EuCl₃ ·6H₂ O (99,9%), Dinatrium-EDTA·2Na (99,8%) und wasserfreies Natriummetavanadat NaVO₃ (96%) wurden von Acros Organic (USA) bezogen und alle ohne weitere Reinigung verwendet. Natriumhydroxid NaOH (99%) wurde von Macrohim (Ukraine) bezogen. Natriumorthovanadat Na₃ VO₄ Lösung wurde durch Zugabe einer 1 M Lösung von NaOH in wässriger Lösung NaVO₃ . erhalten bis pH = 13 L-a-Phosphatidylcholin (PC) aus Eigelb, kationischer Farbstoff 3,7-Bis(dimethylamino)phenazathioniumchlorid (Methylenblau (MB), M_w = 373,90 g/mol), 1,2-Benzopyron (Coumarin, M_w .) =146,14 g/mol) wurden von Sigma-Aldrich (USA) bezogen und wie erhalten verwendet. Antracen-9,10-dipropionsäure Dinatriumsalz (ADPA, M_w = 366.32 g/mol) wurde aus der Farbstoffsammlung von Dr. Igor Borovoy (Institute for Scintillation Materials, NAS of Ukraine) mit einer durch Dünnschichtchromatographie kontrollierten Reinheit erhalten. Alle anderen Chemikalien waren von analytischer Qualität.

Synthese von GdVO₄ :Eu³⁺ kolloidale Lösungen

Wässrige kolloidale Lösungen von Gadoliniumorthovanadat-Nanopartikeln, dotiert mit Europiumionen Gd_0.9 Eu_0,1 VO₄ (GdVO₄ :Eu³⁺ ) wurden nach der zuvor beschriebenen Methode synthetisiert [30]. Zuerst wurden 0,4 ml einer wässrigen Lösung von Gadoliniumchlorid (1 M) mit 0,05 ml Europiumchlorid (1 M) vermischt, dann wurden 49,55 ml zweifach destilliertes Wasser zu der Mischung gegeben. Dann wurde die erhaltene Lösung mit 37,5 ml Dinatrium-EDTA-Lösung (0,01 M) gemischt. Dann 37,5 ml Na₃ VO₄ (0,01 M) wurde tropfenweise geflossen (рН = 10,5). Die Mischung wurde mit einem Magnetrührer intensiv gerührt und auf einem Wasserbad unter einem Rückflusskühler 24 h auf 100 °C erhitzt. Die erhaltene farblose transparente Lösung streut das Licht unter der seitlichen Beleuchtung (der Tyndall-Kegel). Dann wurde die Lösung abgekühlt und 24 h gegen Wasser dialysiert, um den Überschuss an Ionen zu entfernen. Dazu wurde die erhaltene Lösung in einem Dialysebeutel (Cellu Sep T2, Membran mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 12 KDa, Porengröße ~ 2,5 nm) gespült und mit destilliertem Wasser in ein 2 L Glas gegeben. Nach jeweils 6 Stunden wurde das Wasser aufgefrischt.

Instrumentierung und Charakterisierung

Synthetisierte VNPs wurden unter Verwendung von Transmissionselektronenmikroskopie (TEM-125 K-Elektronenmikroskop, Selmi, Ukraine) und dynamischer Lichtstreuungsmethode (ZetaPALS-Analysator, Brookhaven Instruments Corp., USA) charakterisiert. Absorptionsspektren wurden mit einem Specord 200 Spektrometer (Analytik Jena, USA) gemessen. Fluoreszenz- und Fluoreszenzanregungsspektren wurden mit einem Spektrofluorimeter Lumina (Thermo Scientific, USA) aufgenommen.

Herstellung von VNPs-MB-Komplexen

Lösungen für Untersuchungen wurden wie folgt hergestellt. Zuerst wurden Stammlösungen von MB in Wasser (1 mmol/l) hergestellt. Um wässrige VNPs-MB-Lösungen zu erhalten, wurden die erforderliche Menge der Farbstoffstammlösung und die wässrige VNPs-Lösung in einen Kolben gegeben und mit einem Rotationsverdampfer (Rotavapor R-3, Büchi) 1 h lang vorsichtig gerührt, bis das Chloroform vollständig verdampft war. Dann wurde 1 ml einer wässrigen VNPs-Lösung in einen Kolben gegeben und 1 h lang vorsichtig geschüttelt, um die VNPs-MB-Komplexbildung zu erreichen. Die MB-Konzentration in der erhaltenen Lösung betrug 10 μmol/l. Die Konzentrationen der Nanopartikel betrugen 0,1, 1 oder 10 mg/ml.

Erkennung von aktivem Sauerstoff und freien Radikalen

Die Bildung von ROS unter UV-/Röntgenbestrahlung von wässrigen Lösungen mit VNPs, MB oder VNPs-MB-Komplexen wurde spektroskopisch mit verschiedenen Methoden nachgewiesen.

Test zur Bildung konjugierter Diene

Die Lipidoxidation unter UV-Bestrahlung wurde unter Verwendung einer PC-Liposomensuspension gemessen. Unilamellare PC-Lipidvesikel wurden nach der Extrusionsmethode hergestellt [31]. Kurz gesagt wurde eine geeignete Menge PC (25 mg/ml) in Chloroform in einen Kolben gegeben und unter Verwendung eines Rotationsverdampfers (Rotavapor R-3, Büchi) bis zur vollständigen Verdampfung des Chloroforms getrocknet. Der dünne Lipidfarbstofffilm wurde dann mit 10,8 ml zweifach destilliertem Wasser hydratisiert. Die erhaltene Lipidsuspension wurde schließlich unter Verwendung eines Miniextruders (Avanti Polar Lipids, Inc., USA) durch einen Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 100 nm extrudiert. Die PC-Konzentration betrug 1,2 mmol/l. Für den Test zur Bildung konjugierter Diene wurde 1 ml der PC-Liposomensuspension mit 1 ml einer VNPs-Wasserlösung (MB-Wasserlösung oder VNPs-MB-Wasserlösung) gemischt. Die endgültige MB-Konzentration betrug 10 μmol/l und VNPs 1 g/l. Die PC-Konzentration in den Lösungen betrug 0,6 mmol/l. Die erhaltenen wässrigen Lösungen wurden in Quarzküvetten (10 × 10 mm) gegeben und mit einer 250 W-Quecksilberlampe bestrahlt (Bandpass l = 310–400 nm, Lichtstrom 43 W/cm² ) für 30 Minuten. Dann wurde die Extinktion der Suspensionen bei 234 nm (Maximum der konjugierten Diene) unter Verwendung eines Specord 200-Spektrophotometers (Analytik Jena, Deutschland) aufgezeichnet. Als Kontrolle diente die Konzentration der konjugierten Diene, die in Wasser ohne jegliche Zusätze (NPs, MB oder VNPs-MB-Komplexe) gebildet wurden. Jeder experimentelle Punkt war der Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Tests. Die statistische Verarbeitung erfolgte mit dem Softwarepaket Statistika v. 5.0 (StatSoft, USA).

OH· Radikalerkennung

Zum Nachweis der Hydroxylradikalbildung in der Lösung unter UV-Bestrahlung wurde Cumarin als Sondenmolekül verwendet. Cumarin reagiert mit OH·-Radikalen unter Bildung von stark fluoreszierendem 7-Hydroxycumarin [32, 33]. Das experimentelle Verfahren war wie folgt. Eine wässrige Cumarin-Lösung (0,1 mmol/l) wurde mit MB (10 μmol/l), VNPs (0,1, 1 oder 10 g/l) oder wässrigen VNPs-MB-Lösungen gemischt. Die erhaltenen wässrigen Lösungen wurden in Quarzküvetten (10 × 10 mm) gegeben und mit einem He-Cd-Laser λ . bestrahlt _exz = 325 nm für 1 h. Im Falle einer Röntgenbestrahlung wurde die Küvette von oben (aus dem offenen Teil) mit einem Röntgengerät unter Verwendung eines ISOVOLT 160 Titan E-Geräts mit einer Wolframkathode für 30 Minuten bestrahlt. Die Spannung an der Röhre betrug 30 kV (20 mA). Der Abstand von der Röntgenröhre zu den bestrahlten Proben betrug 25 cm. Die Fluoreszenzspektren (angeregt bei 325 nm) der Lösungen wurden mit einem Spektrofluorimeter Lumina (Thermo Scientific, USA) aufgenommen. Die relative Intensität der 7-Hydroxycumarin-Fluoreszenz wurde analysiert.

Singulett-Sauerstoffdetektion

¹ O₂ Produktion in den Lösungen, die VNPs, MB oder VNPs-MB-Komplexe enthielten, wurde anhand der Auswertung von ADPA-Fluoreszenzspektren analysiert [34, 35]. Die Messungen wurden in Quarzküvetten (10 × 10 mm) durchgeführt. Wässrige ADPA-Lösung (10 μmol/l) wurde mit MB (10 μmol/l), NPs (1 g/l) oder wässrigen VNPs-MB-Lösungen in einer Küvette gemischt. Die Lösungen wurden bei 457 nm unter Verwendung des blauen Hochstabilitätslasers MBL-457, 50 mW (Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd.) bestrahlt. Die bei 378 nm angeregte Fluoreszenzemission von ADPA wurde in verschiedenen Zeitskalen (0, 10, 20, 30, 40 und 60 min) mit einem Spektrofluorimeter Lumina (Thermo Scientific, USA) gesammelt.

Ergebnisse und Diskussionen

Eigenschaft synthetisierter VNPs

Abbildung 1 a und zusätzliche Datei 1:Abbildung S1 zeigt die TEM-Bilder synthetisierter VNPs mit einem Seitenverteilungshistogramm und einem XRD-Muster, die das GdVO₄ . unterstützen :Eu³⁺ Kristallstruktur von NPs. Synthetisiertes GdVO₄ :Eu³⁺ NPs haben eine spindelähnliche Form mit einer Größe von 8 × 25 nm ± 5 nm und einer tetragonalen Phasenstruktur vom Zirkontyp. Die negative Ladung der NPs-Oberfläche (ζ-Potenzial beträgt − 18.75 ± 0.15 mV, pH = 7.8) ist auf Carboxylatgruppen des Dinatrium-EDTA-Stabilisators zurückzuführen, der während der Synthese verwendet wurde. Der übergroße hydrodynamische Durchmesser von GdVO₄ :Eu³⁺ Nanopartikel beträgt 44,0 ± 0,3 nm. Das Absorptionsspektrum von GdVO₄ :Eu³⁺ NPs repräsentieren das intensive breite Band im Spektralbereich von 250–350 nm, das einem Ladungstransfer von Sauerstoffliganden auf das Vanadiumatom in der ${VO}_4^{3-}$-Gruppe entspricht (Abb. 1b) [36 ]. Doping GdVO₄ NPs mit Eu³⁺ -Ionen verleihen VNPs im roten Spektralbereich eine starke Fluoreszenz, die durch den Übergang innerhalb der f-Elektronen-Konfiguration der Europium-Ionen bestimmt wird [37] (wird in diesem Artikel nicht diskutiert).

TEM-Bild (a ), Absorptionsspektrum (b ) und Energieabhängigkeit von (αhv )² (c ) von GdVO₄ :Eu³⁺ Nanopartikel

Es ist bekannt, dass die Größe von NPs die optische Energielücke in Halbleitermaterialien beeinflusst. Die Bandlückenenergie E _g , kann aus der Absorptionskantenwellenlänge des Zwischenbandübergangs gemäß der Tauc-Beziehung [38] abgeschätzt werden:

$$ {\left(a\textrm{hv}\right)}^{\left(1/n\right)}=A\cdot \left(\textrm{hv}-{E}_g\right), $ $ (1)

wobei a der Absorptionskoeffizient ist, hv die einfallende Photonenenergie ist, A die energieunabhängige Konstante (der Bandtailing-Parameter) ist und n ist die Konstante (Leistungsfaktor des Übergangsmodus), die von der Materialbeschaffenheit (kristallin oder amorph) abhängt. Der Wert von n bezeichnet die Art des Übergangs, n = 1/2 für direkt erlaubte Übergänge, n = 3/2 für direkte verbotene Übergänge, n = 2 für indirekte erlaubte Übergänge und n = 3 für indirekten verbotenen Übergang [39]. GdVO₄ ist ein Halbleiter mit direkter Bandlücke, für den n = 1/2 [40] Somit ist Gl. (1) kann umgeschrieben werden als:

$$ {\left(\alpha\mathrm{hv}\right)}^2=A\cdot \left(\mathrm{hv}-{E}_g\right) $$ (2)

Absorptionskoeffizient (a ) wird aus der Extinktion als a . berechnet = 2.303D /l , wobei D ist Absorption und l ist die optische Weglänge.

Abbildung 1c zeigt die Energieabhängigkeit von (a hv)² für synthetisiertes GdVO₄ :Eu³⁺ Nanopartikel. Der Bandlückenwert E _g wurde durch Extrapolation des linearen Anteils des (a hv)² Kurve gegen die Photonenenergie hv auf Null. Der erhaltene Wert E _g = 4.13 eV ist höher als für GdVO₄ reported gemeldet :Eu³⁺ Pulver mit einer Kristallitgröße von 14,4 bis 43 nm (3,56–3,72 eV) [41, 42]. Wir vermuten, dass es an den Unterschieden in den verwendeten Synthesemethoden liegen könnte, die in unserem Fall kleinere NPs mit schmaler und blauverschobener Absorptionsbande im Vergleich zu denen ergeben, die mit der Hydrothermal- oder Pechini-Methode erhalten wurden.

Photoinduzierte Bildung freier Radikale (Test auf konjugierte Diene)

Es wird allgemein akzeptiert, dass Baumtypen von ROS ($ \mathrm{OH}\cdotp, {\mathrm{O}}_2^{\cdotp -} $ und ¹ O₂ ), die in NP-Systemen unter UV-Bestrahlung erzeugt werden, tragen zum größten oxidativen Stress in biologischen Systemen bei [43, 44]. Obwohl die photokatalytische Aktivität solcher Metalloxid-NPs wie TiO₂ , ZnO, CuO, CeO₂ , Al₂ O₃ , und Fe₂ O₃ ist gut beschrieben [17,18,19,20], wenig Forschung hat die photokatalytische Aktivität von ReVO₄ . untersucht NPs [45,46,47,48]. Es wurde gezeigt, dass ReVO₄ Nanopartikel sind bei der photokatalytischen Zerstörung organischer Schadstoffe wirksam. Allerdings hat keine Forschung die Arten von ROS untersucht, die von ReVO₄ erzeugt werden NPs unter UV-Bestrahlung.

Um die biologische Umgebung nachzuahmen, verwendeten wir eine PC-Liposomensuspension und wiesen die Bildung freier Radikale unter UV-Bestrahlung in den Suspensionen nach, die MB, VNPs oder VNPs-MB-Komplexe bei der Lipidoxidation enthielten (Test zur Bildung konjugierter Diene) [49,50,51]. Die Lipidoxidation durch molekularen Sauerstoff über Radikalkettenreaktionen kann durch ionisierende Strahlung initiiert werden, wenn ROS und freie Radikale im System auftreten [43, 44]. Radikalkettenreaktionen mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren führen zu einer Umlagerung der Doppelbindungen, die zu konjugierten Dienen führt. Die resultierenden konjugierten Diene zeigen eine Absorptionsbande bei 234 nm, die photometrisch nachgewiesen werden konnte. Abbildung 2 zeigt die relativen Konzentrationen von konjugierten Dienen, die in Lipidsuspensionen gebildet werden, die MB, VNPs oder VNPs-MB-Komplexe enthalten. Es war zu erkennen, dass in allen Lösungen die Konzentration an konjugierten Dienen im Vergleich zur reinen PC-Liposomensuspension ansteigt. Die Effizienz dieses Verfahrens ist jedoch unterschiedlich. Methylenblau ist eines der herkömmlichen Photosensibilisatormoleküle mit den Hauptabsorptionsmaxima λ _max = 665 nm und eine weniger intensive Absorptionsbande im UV-Spektralbereich (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2). Unter UV-Bestrahlung von MB können die beiden wichtigsten photochemischen Prozesse ablaufen [34, 52]. Durch UV-Licht angeregte MB durchläuft einen Intersystem-Crossing-Prozess (Q _p =0.54 [53]) in den langlebigen Triplettzustand (³ MB^* ) und reagiert mit Sauerstoffmolekülen (³ O₂ ) Bildung von Singulett-Sauerstoff (¹ O₂ ):

$$ {\mathrm{MB}}^{+}+ hv\to {}^3{\mathrm{MB}}^{+^{\ast}} $$ (3) $$ {}^3{\ mathrm{MB}}^{+^{\ast}}+{}^3{\mathrm{O}}_2\to {\mathrm{MB}}^{+}+{}^1{\mathrm{O }}_2 $$ (4)

Relative Effizienz der Bildung konjugierter Diene in Lipidsuspensionen:1 - ohne Zusatzstoffe; 2 - mit MB; 3 - mit VNPs; 4 - mit VNPs-MB-Komplexen

Der zweite photochemische Prozess kann bei hohen MB-Konzentrationen stattfinden. Die MB-Moleküle im Grundzustand können als Reduktionsmittel wirken, indem sie ein Elektron an das MB-Triplett abgeben und das halbreduzierte Radikal (MB·) bzw. das halbreduzierte Radikal (MB^{· 2+} ) [52]:

$$ {}^3{\mathrm{MB}}^{+^{\ast}}+{\mathrm{MB}}^{+}\to \mathrm{MB}\cdotp +{\mathrm{MB} }^{\cdotp 2+} $$ (5)

Die Oxidation von MB· durch molekularen Sauerstoff, der den Grundzustandsfarbstoff zurückgibt und zur Bildung von Superoxidradikalen führt ($ {O}_2^{\cdotp -} $):

$$ \mathrm{MB}\cdotp +^3{\mathrm{O}}_2\kern0.5em \to {\mathrm{MB}}^{+}+{O}_2^{\cdotp -} $$ (6)

Singulett-Sauerstoff- und Superoxid-Radikale sowie MB-Radikale, die in den Reaktionen (4)–(6) gebildet werden, können den Lipidoxidationsprozess beeinflussen. In verdünnter Lösung, in der keine MB-Dimerbildung beobachtet wird ([MB] < 20 μM), dominieren die Reaktionen (3) und (4) [52]. In VNPs-MB-Komplexen kann jedoch aufgrund der erhöhten MB-Konzentration innerhalb der VNPs-Oberfläche [29] der zweite photochemische Prozess stattfinden. Somit kann die Zunahme der Bildung von konjugiertem Dien in der MB-haltigen Lipidsuspension durch die MB-Wirkung als ¹ . erklärt werden O₂ Photogenerator unter UV-Bestrahlung. Es sollte beachtet werden, dass die Effizienz dieses Prozesses viel geringer ist als bei MB-Anregung innerhalb des langwelligen Absorptionsmaximums.

In der Suspension mit GdVO₄ :Eu³⁺ Nanopartikel ist die Lipidoxidation effektiver. Dieser Effekt könnte dem photokatalytischen Verhalten von VNPs unter UV-Bestrahlung zugeschrieben werden. Leitende Bandelektronen (e⁻ ) und Valenzbandlöcher (h⁺ ) gebildet unter UV-Bestrahlung (E> E _g ) kann mit molekularen Sauerstoff- und Wassermolekülen, die auf der NP-Oberfläche adsorbiert sind, durch folgende Reaktionen wechselwirken [18, 20, 47]:

$$ {}^3{\mathrm{O}}_2+{e}^{-}\to \kern0.5em {\mathrm{O}}_2^{.-} $$ (7) $$ {\mathrm {H}}_2\mathrm{O}+{\mathrm{h}}^{+}\to \mathrm{OH}\cdot $$ (8)

Hydroxylionen, die während der Wasserphotolyse gebildet und an der NP-Oberfläche adsorbiert werden, können auch mit Löchern interagieren, um Hydroxylradikale zu erzeugen:

$$ {\mathrm{OH}}^{-}+{\mathrm{h}}^{+}\to \mathrm{OH}\cdot $$ (9)

Außerdem erzeugt die Oxidation von $ {O}_2^{\cdotp -} $ Singulett-Sauerstoff [18, 21, 22]:

$$ {\mathrm{O}}_2^{\cdotp -}+{\mathrm{h}}^{+}{\to}^1{\mathrm{O}}_2 $$ (10)

Seine Reaktion mit Wasserstoffionen führt zur Bildung von Wasserstoffperoxid:

$$ 2{\mathrm{O}}_2^{\cdotp -}+2{\mathrm{H}}^{+}\to {\mathrm{H}}_2{\mathrm{O}}_2 $$ (11)

durch seine Wechselwirkung mit Elektronen können Hydroxylradikale und Hydroxylionen gebildet werden:

$$ {\mathrm{H}}_2{\mathrm{O}}_2+{\mathrm{e}}^{-}\to \mathrm{OH}\cdot +{\mathrm{O}\mathrm{H} }^{-} $$ (12)

Somit kann die Effizienzsteigerung der Konzentration konjugierter Diene in einer Suspension mit VNPs (Abb. 2, Spalte 3) auf die Produkte zurückgeführt werden, die über die Reaktionen (7)–(12) entstehen und die Lipidoxidation erleichtern.

In der Lipidsuspension, die die Komplexe VNPs-MB enthält, können die höchsten Konzentrationen an konjugierten Dienen durch Produkte erklärt werden, die sowohl über die Reaktionen (3)–(6) als auch über die Reaktion (7)–(12) erzeugt werden (Abb. 2, Spalte 4). Darüber hinaus könnte in VNPs-MB-Komplexen in Reaktion (3) und (4) die Singulett-Sauerstofferzeugung sowohl durch direkte MB-Anregung als auch durch strahlungslose Anregungsenergieübertragung von VNPs auf MB erfolgen, die in dieser Zusammensetzung ziemlich effektiv ist [29].

Detektion von Hydroxylradikalen

Der nächste Schritt bestand darin, die Effizienz von OH· und ¹ . genauer zu untersuchen O₂ Erzeugung in den Lösungen unter UV-/Röntgenbestrahlung. Cumarin wurde als Sondenmolekül verwendet, um das Auftreten von Hydroxylradikalen in den betrachteten Lösungen zu validieren. Es ist bekannt, dass OH·-Radikale eines der Hauptprodukte der Wasserphotolyse/Radiolyse unter UV-/Röntgenbestrahlung sind [5, 6]. In wässriger Lösung wechselwirken OH·-Radikale mit Cumarin-Molekülen, um das stark fluoreszierende Produkt 7-Hydroxycumarin zu bilden (siehe Schema in Abb. 3), das spektroskopisch durch das Auftreten einer neuen Bande (λ _max ~ 460 nm) in Bezug auf die Cumarin-Fluoreszenzbande zum langwelligen Spektralbereich hin verschoben (λ _max ~ 400 nm), Abb. 3 [32, 33]. Je höher die Konzentration an OH·-Radikalen in der Lösung ist, desto effektiver ist die Cumarin-Oxidation und desto intensiver sind die langwelligen Banden. Somit könnte die Analyse der relativen Intensität der langwelligen Bande Informationen über die Konzentration von OH·-Radikalen in der Lösung unter Einfluss verschiedener Faktoren liefern.

Reaktion von Cumarin mit Hydroxylradikal zu fluoreszierendem 7-Hydroxycumarin. Normalisierte Fluoreszenzspektren einer Cumarin-Wasserlösung, λ _exz = 325 nm

Die Fluoreszenzemissionsspektren der Cumarin-Wasserlösung, die MB, VNPs oder VNPs-MB-Komplexe enthält, gemessen nach 1 h UV-Bestrahlung, sind in Abb. 3 dargestellt. Es wird gezeigt, dass die UV-Bestrahlung einer Cumarin-Wasserlösung ohne jegliche Zusätze (Kontrolle) die Bildung einer neuen langwelligen Fluoreszenzbande, die auf die Bildung von OH·-Radikalen und die Cumarin-Oxidation hinweist (Abb. 3). In Gegenwart von MB-Molekülen in der Lösung ändert sich die relative Intensität dieser Bande nicht, was auf keine zusätzlichen Auswirkungen von MB auf die Erzeugung von OH·-Radikalen hinweist (Abb. 3). In der Lösung, die VNPs enthält, nimmt die Intensität der 7-Hydroxycumarin-Bande aufgrund der photokatalytischen Aktivität der VNPs unter UV-Bestrahlung deutlich zu (Abb. 3), Reaktionen (8), (9) und (12). Beachten wir, dass die scharfen Peaks bei 535–540 nm zur Europium-Ionen-Fluoreszenz in GdVO₄ . gehören :Eu³⁺ Nanopartikel (Intrakonfigurationsübergänge). In der Lösung mit VNPs-MB-Komplexen war die relative Intensität der 7-Hydroxycumarin-Bande etwa doppelt so gering wie in der Lösung mit VNPs, was auf eine weniger effektive Produktion von OH·-Radikalen hinweist (Abb. 3). Dies kann durch die Tatsache erklärt werden, dass die MB-Farbstoffadsorption innerhalb der VNPs-Oberfläche die Adsorption von Wassermolekülen und Hydroxylionen verhindern kann und folglich die photokatalytische Aktivität von VNPs hinsichtlich der OH·-Radikalerzeugung über die Reaktionen (8) und (9) verringert. Darüber hinaus wird in VNPs-MB-Komplexen ein Teil der adsorbierten Energie strahlungslos auf MB-Moleküle übertragen [29] was auch die Effizienz der Erzeugung von Elektron-Loch-Paaren und folglich die Fähigkeit der VNPs zur Erzeugung von OH·-Radikalen in solchen Komplexen verringert.

Bei der Röntgenbestrahlung der VNP-haltigen Lösungen wurden unerwartete Ergebnisse beobachtet (Abb. 4). Im Gegensatz zur UV-Bestrahlung beobachten wir, dass die relative Intensität der 7-Hydroxycumarin-Bande im Vergleich zur Cumarin-Wasserlösung ohne Nanopartikel abnimmt, was auf das Abfangen von OH·-Radikalen hinweist, die in den Lösungen als Ergebnis der Wasserradiolyse gebildet werden. Der beobachtete Effekt hängt stark von den VNP-Konzentrationen ab (Abb. 4). Es sollte beachtet werden, dass sich die Hauptdiskussion über die Fähigkeit von Nanopartikeln, als ROS-Fänger zu dienen, hauptsächlich auf CeO₂ . konzentriert Nanokristalle (Nanoceria) [54,55,56,57]. Die Hauptmerkmale, die Nanoceria dazu zwingen, als ROS-Fänger zu wirken, werden im Allgemeinen dem hohen Gehalt an Sauerstoffleerstellen und Ce³⁺ . zugeschrieben Ionen in Nanoceroxid und sein Wechsel zwischen den Oxidationsstufen 3+ und 4+. Die kritische Abhängigkeit der biologischen Aktivität von Nanoceria von ihrer Größe und dem Selbstregenerationsmechanismus wird jedoch noch diskutiert [54,55,56,57]. Wir stellen auch fest, dass die Schutzwirkung von GdVO₄ :Eu³⁺ und CeO₂ NPs gegen röntgeninduzierte Schäden wurden in unserer Gruppe in früheren In-vivo-Experimenten beobachtet [57]. Nach unserem besten Wissen ist die Fähigkeit von GdVO₄ :Eu³⁺ Nanopartikel zum Entfernen von OH·-Radikalen, die in der wässrigen Lösung unter Röntgenbestrahlung erzeugt werden, wurden zum ersten Mal beobachtet und bedürfen weiterer eingehenderer Forschung.

Normalisierte Fluoreszenzspektren einer Cumarin-Wasserlösung, die unterschiedliche Konzentrationen von VNP enthält, aufgenommen nach 30 minütiger Röntgenbestrahlung

Singulett-Sauerstofferzeugung

Um die Effizienz von VNPs-MB-Komplexen von ¹ . zu bewerten O₂ Erzeugung in Wasser verwenden wir die methodenbasierte ADPA-Oxidation durch Singulett-Sauerstoff unter Bildung des nicht fluoreszierenden Endoperoxids ADPAO₂ (Abb. 5). Somit wird die ADPA-Fluoreszenz in Gegenwart von Singulett-Sauerstoff irreversibel gelöscht. Wir sollten beachten, dass ADPA-Moleküle unter UV-Bestrahlung einem starken Photobleichen unterliegen, was die Identifizierung von MB, VNPs oder VNPs-MB-Komplex-Auswirkungen im Zusammenhang mit der ¹ . erschwert O₂ Generation. Um diesen Nachteil zu überwinden, wenden wir eine Laserbestrahlung bei 457 nm an, die einem der Anregungspeaks von Eu³⁺ . entspricht Ionen dotiert in GdVO₄ Nanokristalle (Zusatzdatei 1:Abbildung S3). Abbildung 5 zeigt, dass die ADPA-Moleküle bei Bestrahlung mit 457 nm Licht keine photochemischen Reaktionen eingehen. In der MB-haltigen Lösung konnte eine leichte Abnahme der ADPA-Intensität mit der Zeit beobachtet werden (Abb. 5), die mit einer leichten MB-Anregung bei dieser Wellenlänge und einer Wirkung als Photosensibilisator gemäß Reaktion (3) und (4) einhergeht. Der gleiche Effekt wird für die Lösung mit VNPs beobachtet (Abb. 5) und könnte der Bildung von ${O}_2^{\cdotp -}$-Radikalen auf der Oberfläche von VNPs zugeschrieben werden (Reaktion (7)) gefolgt durch seine Oxidation gemäß Reaktion (10) unter Erzeugung von Singulett-Sauerstoff. Die stärkere ADPA-Fluoreszenzlöschung wird in VNPs-MB-Komplexen beobachtet. Die Effizienz dieses Verfahrens ist doppelt so hoch wie bei der Lösung mit MB oder VNPs. Die höhere Effizienz der Singulett-Sauerstofferzeugung in der Lösung mit VNPs-MB-Komplexen ist mit dem Energietransfer von VNPs auf MB in den Komplexen verbunden, in denen VNPs als Energiewandler für MB-Photosensibilisatoren dienen.

Reaction of ADPA with singlet oxygen to form endoperoxide ADPAO₂ . ADPA photobleaching after irradiation with λ = 457 nm in water solutions

Unfortunately, due to ADPA sensor instability, we were not successful to measure the efficiency of the ¹ O₂ generation in water solution under X-ray excitation.

Schlussfolgerungen

The efficiency of ROS generation in water solutions containing GdVO₄ :Eu³⁺ nanoparticles and their complexes with MB have been analyzed under UV-Vis and X-ray irradiation by three methods (conjugated dienes test, OH· radical, and singlet oxygen detection). Complexes VNPs–MB reveal high efficiency of ROS generation under UV-Vis irradiation associated with both high efficiency of OH· radicals generation by VNPs and ¹ O₂ generation by MB due to nonradiative excitation energy transfer from VNPs to MB molecules. For the first time, the strong OH· radicals scavenging by VNPs has been observed under X-ray irradiation. Our observation indicates that VNPs–MB complexes can be potentially used to activate photodynamic therapy.