Vorbereitungs- und Antibiofilmeigenschaften von Zinkoxid/porösem anodischem Aluminiumoxid-Verbundfilm

Hintergrund

Wie wir wissen, können die Bakterien an festen Oberflächen haften und in geeigneten Umgebungen einen glitschigen Biofilm bilden [1]. Normalerweise haften die Bakterienbiofilme fest an den Oberflächen von Materialien wie Edelstahl [2], Gummi [3], Glas [4] und Styropor [5]. Biofilm würde zu Korrosion der Ausrüstung [6] und Lebensmittelkontamination [7] führen, was zu enormen wirtschaftlichen Verlusten führen würde. Viele Studien haben gezeigt, dass die Biofilmadhäsion durch die Eigenschaften der Materialoberfläche beeinflusst wird, wie z. B. Rauheit [8,9,10,11], Mikrostruktur [12, 13], Hydrophilie [14,15,16,17] und antibiotische Bestandteile [18,19,20]. Bohinc et al. [10] wiesen darauf hin, dass die Bakterienadhäsion mit der Oberflächenrauhigkeit des Glases zunehmen würde. Singh et al. [12] zeigten, dass eine hohe Oberflächenrauheit die Proteinadsorption verbessern und die bakterielle Adhäsion und Biofilmbildung beschleunigen kann. Bonsagliaet al. festgestellt, dass Listeria monocytogenes haftete auf hydrophilen Oberflächen (z. B. Edelstahl und Glas) besser als auf hydrophoben (z. B. Polystyrol) [14]. Andere Studien bewiesen auch, dass eine hydrophobe Oberfläche für die Biofilmadhäsion nicht gut ist [16, 17]. Einige Studien haben gezeigt, dass antibiotische Bestandteile die Biofilmbildung hemmen können [18,19,20]. Dreihundertvier Cu-haltige Edelstahloberflächen haben hervorragende antibakterielle und antibiofilmische Eigenschaften und nutzen die antimikrobielle Aktivität des Cu-Elements [18]. Kurz gesagt, die Oberflächeneigenschaften sind entscheidend für die Antibiofilmeigenschaften der Materialien.

Aluminiummaterialien wurden weit verbreitet verwendet, und poröses anodisches Aluminiumoxid (PAA) hat in den letzten Jahren auf den Gebieten der lichtelektrischen Funktion, der katalytischen Funktion und der Sensorfunktion mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen [21,22,23,24], und seine antimikrobielle Aktivität war gemeldet. Ferrazet al. [24] berichteten, dass PAA aufgrund ihrer Matrixphase und Nanoporosität die anhaftende Aktivierung von Monozyten/Makrophagen induzieren kann.

Darüber hinaus wurden dünne Zinkoxid (ZnO)-Filme als ausgezeichnetes Material für antibakterielle und antimykotische Substanzen untersucht. Die Adhärenz von Pseudomonas aeruginosa auf ZnO-Filme mit Nanostäbchen-Oberflächenstrukturen war schwächer als die von Glas und gesputtertem ZnO und mehr P. aeruginosa werden in den ZnO-Filmen abgetötet [25]. In der Zwischenzeit wies eine Studie darauf hin, dass ZnO-beschichtete Oberflächen die Biofilmbildung drastisch einschränkten und die Bildung von Hydroxylradikalen eine Schlüsselrolle bei der Antibiofilmaktivität spielte, jedoch nicht die Existenz von Zinkionen [26]. Darüber hinaus können ZnO-Verbundfolien in vielen Bereichen zur Einschränkung der Biofilmbildung eingesetzt werden und haben gute Anwendungsperspektiven in der aquatischen Produktkonservierung [27]. ZnO ist hydrophil, während hydrophobe Filme die Biofilmhaftung gut hemmen. Daher ist es notwendig, die hydrophoben Eigenschaften des ZnO-Films zu verbessern.

Wasserprodukte sind aufgrund ihres mikrobiellen Verderbs sehr leicht verderblich [28]. Unter aeroben Lagerbedingungen Pseudomonas spp. und Shewanella putrefaciens sind als dominante Verderbsorganismen bekannt [29]. Shewanella putrefaciens hat psychrotrophe Natur und kann Trimethylamin-N . reduzieren -Oxid zu Trimethylamin [30]. Also, Shewanella putrefaciens werden in dieser Arbeit als Indikatorbakterien verwendet.

Die Mikrostrukturen von ZnO-Filmen würden aufgrund ihrer PAA-Basis unterschiedlich sein, und dann würden die Antibiofilm-Eigenschaften beeinflusst. In dieser Arbeit wurden ZnO-Filme auf PAA mit unterschiedlicher Morphologie hergestellt und modifiziert, um die Hydrophobie zu verbessern. Die Antibiofilm-Eigenschaften von Shewanella putrefaciens der ZnO/PAA-Verbundfilme wurden untersucht. Die Ergebnisse bieten einen potenziellen Wert für Anwendungen in Lebensmittelverpackungen, Lebensmittelverarbeitungsgeräten und anderen Bereichen der antibakteriellen Funktionsmaterialien.

Materialien und Methoden

Materialien

Alle in dieser Studie verwendeten Reagenzien waren analytisch rein. Das entionisierte und sterile Wasser wurde verwendet, um Lösungen mit einer Leitfähigkeit von weniger als 0,5 mS/cm herzustellen. Shewanella putrefaciens ATCC8071 wurde von der American Type Culture Collection erworben. Aluminiumfolien mit einer Dicke von 0,3 mm mit einer Aluminiumreinheit von über 99,99 % wurden von Shengshida Metal Materials Co., Ltd. (China) bezogen.

Vorbereitung von ZnO/PAA-Verbundfolien

Vorbereitung von porösen anodischen Aluminiumoxidfilmen (PAA)

Eine hochreine Aluminiumfolie wurde in eine kleine Abmessung von 10 × 30 mm ² . geschnitten und wurde mit einer Polierpaste aus 50 nm Siliciumdioxid durch einen Polierer (WV80, Positec Machinery Co., Ltd., China) poliert und in Aceton bei 53 kHz, 280 W für 15 min ultraschallentfettet (SK8210HP, Kudos Ultrasonic Instruments Co. Ltd .). ., Schanghai). Dann wurden die Folien zweimal mit Ethanol bzw. Wasser gewaschen. Als Anode wurden die vorbehandelten Aluminiumfolien, als Kathode die flächengleiche Graphitfolie und als Elektrolyt die 0,3 mol/l Oxalsäurelösung verwendet. Die erste Anodisierung erfolgte unter den Bedingungen von 30 °C und 40 V für 90 Minuten. Danach wurden die Aluminiumbleche in die gemischte Lösung von 6,0 Gew.-% H₃ . eingetaucht PO₄ und 1,8 Gew. % H₂ CrO₄ bei 60 °C für 4 h, um die Aluminiumoxidschichten zu entfernen. Die zweite Anodisierung wurde dann unter denselben Bedingungen durchgeführt, jedoch für 0, 40, 60 bzw. 80 Minuten. Die porösen anodischen Aluminiumoxid (PAA)-Filme mit einem anderen Portmodell wurden erhalten.

Vorbereitung von ZnO/PAA-Verbundfolien

Zuerst wurde das gleiche Volumen von 0,02 Mol/L Zinkacetat-Ethanol-Lösung und 0,04 Mol/L NaOH-Ethanol-Lösung unter schnellem Rühren bei 70 °C für 5 Minuten gemischt, und dann wurden die PAA-Filme (Aluminiumfolien) in die gemischte Lösung eingetaucht unter einem Vakuumgrad von – 0,085 MPa. Danach wurde die Lösung zum Sieden erhitzt. Nachdem es zu einem dünnen blauen Sol wurde, wurden die Aluminiumfolien herausgenommen und mit entionisiertem Wasser gespült. Dann wurden die Proben bei – 0,085 MPa, 80 °C für 6 h vakuumgetrocknet, und die ZnO/PAA-Verbundfolien wurden hergestellt, nachdem sie 2 h lang bei 480 °C in Luftatmosphäre kalziniert worden waren. Die Zinkoxidpulver wurden gleichzeitig hergestellt. Schließlich wurden die ZnO/PAA-Verbundfolien und die Pulver mit 1,0 Gew.-% Si69-Ethanollösung bei 65 °C 2 h lang modifiziert und dann bei – 0,085 MPa, 40 °C 12 h lang vakuumgetrocknet.

Charakterisierung von ZnO/PAA-Verbundfolien

Röntgenbeugung der Zinkoxidpulver wurde unter Verwendung eines Röntgenpulverdiffraktometers (Rigaku Ultima IV, Rigaku, Japan) bei einer Stufe von 0,02° und 2 durchgeführt Bereich von 10°–80° mit CuKa-Strahlung von 40 kV, 50 mA. Die thermischen Veränderungen und der Gewichtsverlust der Proben wurden durch ein thermogravimetrisches/differentielles Thermoanalysegerät (TG/DTA, Perkin Elmer Diamond) analysiert. Fourier-Transformations-Infrarotspektren (FT-IR) wurden mit einem Scimitar 2000 Near FT-IR Spectrometer (Agilent, American) im Bereich von 4000–400 cm ⁻¹ . aufgenommen . Die Oberflächenmikrographien von PAA-Filmen und ZnO/PAA-Verbundfilmen wurden durch Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FESEM, S-4800, Hitachi, Japan) abgebildet. Die Nanopartikel-Morphologien der ZnO/PAA-Verbundfilme werden durch Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskopie (FETEM, Jem-2100F, JEOL, Japan) und die ausgewählte Flächenelektronenbeugung (SAED, Jem-2100F, EOL, Japan) der Proben untersucht wurden. Die Wasserkontaktwinkel (CA) der Verbundfolien (vor/nach der Modifizierung) wurden mit der Methode des sessilen Tropfens an mehreren verschiedenen Positionen auf jeder Probenoberfläche unter Verwendung von 3,0-μl-Tröpfchen entionisiertem Wasser (SL200B, USA) gemessen.

Die Antibiofilmeigenschaften von ZnO/PAA-Verbundfolien

Anbau von Shewanella putrefaciens Biofilm

Die Bakteriensuspension von sekundär aktivierendem Shewanella putrefaciens (OD₅₉₅ ≈ 0.5) und alkalisches Peptonwasser (APW) von 3% (m/v) NaCl wurden im Verhältnis 1:200 (v /v ). ZnO/PAA-Verbundfilme (0,5 × 0,5 cm) wurden in die verdünnten Inokulums von 3 ml eingetaucht und bei 28 °C für eine bestimmte Zeit inkubiert. Unter dieser Bedingung Shewanella putrefaciens wuchs gut und zeigte eine starke proliferative Fähigkeit.

Adhäsionstest von Shewanella putrefaciens Biofilme auf ZnO/PAA-Verbundfolien

Nach Kultivierung in Bakteriensuspension von Shewanella putrefaciens Für eine gewisse Zeit wurden die ZnO/PAA-Verbundfolien mit Biofilm in ein weiteres steriles Zentrifugenröhrchen überführt und dreimal mit 1 ml einer 0,85% (m/v) sterilen NaCl-Lösung gewaschen, um die freien Bakterien zu entfernen. Der Biofilm wurde mit 1 ml von 0,2 %w/w . gefärbt Kristallviolett für 15 min bei Raumtemperatur und wurde dreimal mit 1 ml einer 0,85% (m/v) sterilen NaCl-Lösung gewaschen, um überflüssiges Kristallviolett zu entfernen. Anschließend wurden die gefärbten Biofilme in 33 % (v /v ) Essigsäure von 200 μL bei 53 kHz, 280 W für 10 min. Der OD₅₉₅ (optische Dichte bei 595 nm) der obigen Lösung wurde mit einem VICTOR™ X3-Mikroplattenlesegerät (Perkin Elmer, Amerika) in den 96-Well-Mikrotiterplatten aufgezeichnet. Die Ergebnisse wurden als „Durchschnitte ± Standardabweichungen“ des dreimal parallelen Experiments angezeigt.

Gesamtbakterienzahl-Assay von Shewanella putrefaciens Biofilm auf ZnO/PAA-Verbundfolien

Die ZnO/PAA-Verbundfolien mit Biofilm wurden dreimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4; 137 mmol/l NaCl, 2,7 mmol/l KCl, 10 mmol/l Na₂ .) gewaschen HPO₄ , und 1,8 mmol/l KH₂ PO₄ ), um schwimmende Bakterien zu entfernen, und die gefärbten Biofilme wurden mit Ultraschall in 10 ml sterilem PBS bei 53 KHz, 280 W für 10 Minuten gestrippt. Anschließend wurde die Gesamtkeimzahl in den Biofilmen mit der Plattenzählmethode gemessen. Bei dem dreimal parallelen Experiment wurden die Ergebnisse als „Durchschnitte ± Standardabweichungen“ angezeigt und die Koloniewachstumskurve der Biofilmbakterien wurde gezeichnet.

Die mikroskopische Messung von Shewanella putrefaciens Biofilme

Nach Entfernung der schwimmenden Bakterien wurden die ZnO/PAA-Verbundfolien mit Biofilm in 2,5 % (w /v ) Glutaraldehyd bei 4 °C für 4 h. Anschließend wurden die Proben alle 30 Minuten mit 50, 70, 80 und 90 % (v /v ) Ethanol bzw. Nach dem Eintauchen in den absoluten Ethylalkohol für 1 h wurden die Proben auf einer sauberen Bank natürlich luftgetrocknet. Die oberflächenmikroskopischen Aufnahmen der Proben wurden mit FESEM (S-4800, Hitachi, Japan) nach einer 40 sek. langen Goldsputterbeschichtung bei 3 kV aufgenommen.

Die CLSM-Messung von Shewanella putrefaciens Biofilme

Die ZnO/PAA-Verbundfilme mit Biofilm wurden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH =  7,4) gewaschen, um die schwimmenden Bakterien zu entfernen, und die Proben wurden im Dunkeln 15 Minuten lang in der gemischten Lösung von 0,01 Gew.-% gefärbt. Acridinorange (AO, Sigma, Amerika) und 0,1 Gew.-% Propidiumjodid (PI, Sigma, Amerika). Danach wurden die Proben dreimal mit PBS gewaschen, um die überflüssige Färbelösung zu entfernen, und die überschüssige Feuchtigkeit wurde entfernt. Auf die Biofilme wurden zehn Mikroliter Anti-Fluoreszenz-Quenching-Versiegelungsmittel (Biosharp BL701A, China) getropft und die Proben wurden bei 4 °C ohne Licht gelagert. Die Anteile an lebenden und toten Zellen der Biofilme wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM, TCS-SP5 II, Deutschland, Leica Instrument Co., Ltd.) beobachtet [31, 32].

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von ZnO-Filmen

XRD-Charakterisierung der durch Sol-Gel-Verfahren hergestellten ZnO-Pulver

Die antibakteriellen und antibiofilmischen Eigenschaften von Zinkoxid werden durch seine Kristallstruktur beeinflusst [33, 34]. Abbildung 1 zeigt, dass sich die Kristallstruktur der Proben nach dem Kalzinieren verändert. Vor der Kalzinierung sind die Proben in der hexagonalen Wurtzit-Struktur von ZnO enthalten. Die Beugungspeaks bei 31,70 °, 34,52 °, 36,31 °, 47,68 °, 56,82 °, 62,92 ° und 67,92 ° von 2θ entsprechen (100), (002), (101), (102), (110), (103) und (112) Kristallebenen von Zinkoxid (PDF # 36-1451, a = b = 3,250 und c =5,207). Die breiten Beugungspeaks weisen auf eine geringe Kristallinität und kleine ZnO-Partikel hin. Inzwischen zeigen weniger unreine Peaks das Zwischenprodukt in der Probe. Nach dem Kalzinieren bei 230 °C verschwinden die unreinen Peaks und das gemessene Rauschen nimmt ab, aber die Breite der Beugungspeaks ist unveränderlich. Dies bedeutet, dass das Zwischenprodukt verschwindet und der Kristallgrad zunimmt. Mit steigender Kalzinierungstemperatur werden die Beugungspeaks von ZnO schärfer, was darauf hindeutet, dass die Kristallinität zunimmt und die Kristallpartikel wachsen.

XRD-Muster der bei verschiedenen Temperaturen kalzinierten Zinkoxidpulver

Nur gebundenes Wasser aus Zn(CH₃ COO)₂ ·2H₂ O entsteht in der Ethanollösung von Zn(CH₃ COO)₂ , und die Hydrolyse von CH₃ COO ⁻ ist gehemmt. Erstens, das Zn(CH₃ COO)₂ wird hydrolysiert und bildet das Zwischenprodukt.

4Zn(CH₃ COO)₂ ·2H₂ O → Zn₄ O(CH₃ COO)₆ + 2CH₃ COOH + 3H₂ O(1)

Beim Erhitzen wird das Kollosol durch die Ethanollösung von NaOH und den räumlichen sterischen Effekt von CH₃ . erleichtert COO ⁻ ist von großer Bedeutung für die Stabilität von ZnO-Kollosol. Inzwischen ist die neutrale Reaktion von CH₃ COOH mit NaOH passiert.

5Zn₄ O(CH₃ COO)₆ + 22NaOH + 13H₂ O → 4Zn₅ (OH)₈ (CH₃ COO)₂ ·2H₂ O + 22CH₃ COONa(2)

CH₃ COOH + NaOH→CH₃ COONa + H₂ O(3)

Spanhel und Anderson [35] weisen darauf hin, dass die Zinkoxid-Alkogele aus ZnO-Körnern durch Aggregation und Ostwald-Wachstum (Alterung) gebildet werden. Dann das Zwischenprodukt von Zn₅ (OH)₈ (CH₃ COO)₂ ·2H₂ O wird erhitzt und in die ZnO-Phase zerlegt [36, 37]. Somit ist die hexagonale Wurtzit-Struktur von ZnO die Grundlage der getrockneten Gelatine vor der Kalzinierung.

Zn₅ (OH)₈ (CH₃ COO)₂ ·2H₂ O → 5ZnO + 2CH₃ COOH + 5H₂ O(4)

Hosonoet al. [37] haben diesen Reaktionsmechanismus bestätigt. Die Ethanollösung von Zn(CH₃ COO)₂ ·2H₂ O wurde während des Erhitzens auf 60 °C zu kolloidalen Produkten, und XRD-Ergebnisse zeigen, dass das Trockenprodukt von Gelatine eine Mischung aus kristallinem ZnO und Zn5(OH)₈ . ist (CH₃ COO)₂ ·2H₂ O. Nach 48 h Refluxieren werden die Partikel in Wurtzit ZnO umgewandelt.

TG/DTA-Analyse

Das TG/DTA-Ergebnis von Zinkoxidgelatine ist in Abb. 2 dargestellt, und die TG-Kurve konnte in drei Stufen unterteilt werden. In der ersten Stufe beträgt der Massenverlust 68,6 % von Raumtemperatur bis 100 °C, und bei 62 °C lag ein endothermer Peak vor. Es entspricht dem verlorenen Ethanol-Lösungsmittel und Wasser in Zinkoxid-Gelatine. In der zweiten Stufe beträgt der Massenverlust von 100 bis 400 °C nur noch 3,8%. XRD-Ergebnisse zeigen, dass die Verunreinigung verschwunden ist, die Kristallinität erhöht ist und die Kristallpartikel nach dem Kalzinieren bei 230, 280 bzw. 360 °C wachsen. Ein geringer Massenverlust kann der Verlust von Porenwasser und der Übergang der Verunreinigung sein. Von 400 bis 850 °C gibt es keinen Massenverlust und keinen endothermen Peak, was auf keine Kristallumwandlung in dieser Phase hinweist. Unterdessen zeigt das XRD-Ergebnis, dass der Kristall nach der Kalzinierung bei 480 °C wächst. Die Ergebnisse von TG/DTA stimmen mit den XRD-Ergebnissen überein.

TG/DTA-Diagramme für Zinkoxidgelatine

FT-IR-Charakterisierung der unmodifizierten/modifizierten Zinkoxidschichten

Abbildung 3 zeigt die FT-IR-Spektren der unmodifizierten und hydrophob modifizierten ZnO-Filme. Die breiten Gipfel bei 3600–3300 cm ⁻¹ werden der Streckschwingung von −OH und dem Peak bei 1651 cm ⁻¹ . zugeschrieben wird der Biegeschwingung von –OH zugeschrieben, was auf das absorbierte Wasser und das Kapillarwasser in den Proben hinweist [38]. Die Spitzen bei 2360 und 2328 cm ⁻¹ werden dem Kohlendioxid in der Luft zugeschrieben. Die Spitzen bei 2943 und 2864 cm ⁻¹ sind auf asymmetrische und symmetrische Streckschwingungen von −CH₂ . zurückzuführen , bzw. Der stärkere Peak bei 1475 cm ⁻¹ wird der in der Ebene liegenden Biegeschwingung oder Scherenschwingung von -CH₂ . zugeschrieben Gruppen [39] und der Peak bei 895 cm ⁻¹ wird den Streckschwingungen von Si-O-Gruppen zugeschrieben [40]. Die Spitzen bei etwa 440 und 414 cm ⁻¹ werden der Gerüstschwingung von Zn-O-Gruppen des unmodifizierten/modifizierten ZnO zugeschrieben [41]. Die Ergebnisse zeigen, dass durch Modifikation –S–S–-Bindungen von Si69 brechen und Triethoxysilylpropyl auf die Proben aufgepfropft wird, sodass die hydrophoben Eigenschaften von ZnO-Filmen zunehmen. Wang [42] berichtete, dass die Nano-ZnO-Dispersion durch in-situ-Modifizierung von Si69 und Si69, die auf die Oberfläche von Nano-ZnO-Partikeln durch die chemische Reaktion aufgepfropft wurden, verbessert werden konnte. Dies stimmt mit unseren Analyseergebnissen überein.

FT-IR-Spektren der unmodifizierten/modifizierten Zinkoxidschichten

Mikromorphologie-Analyse von PAA-Filmen

Die Morphologien von PAA-Filmen werden durch die zweite anodisierte Oxidationszeit beeinflusst. Wie in Abb. 4 gezeigt, ist der PAA-Film nach dem Entfernen der Aluminiumoxidschichten der ersten Anodisierung ein reihenförmiger sechseckiger Wabenrahmen mit Nanoporen von 5–10 nm (Abb. 4a). Nach einer zweistufigen Anodisierung für 40 Minuten werden die Nanoporen in mehrschichtige Schalenrahmen umgewandelt (Abb. 4b). Nach einer zweistufigen Anodisierung für 60 min verblassen die mehrschichtigen Schalenrahmen und der Durchmesser der Nanoporen wird auf 20–40 nm vergrößert, währenddessen befinden sich die Rippen auf der Oberfläche (Abb. 4c). Wenn die zweistufige Anodisierungszeit auf 80 min verlängert wird, werden die Nanoporen auf 60–70 nm vergrößert und die Rippen verschwinden (Abb. 4d).

REM-Bilder des porösen anodischen Aluminiumoxids (PAA) mit unterschiedlichen Zeiten der zweiten Anodisierungsdauer a 0 Minute, b 40 Minuten, c 60 Minuten und Tag 80 Minuten

Gemäß der Theorie der sauren feldunterstützten Auflösung (AFAD) [43] wurden beim Anodisierungsprozess die Oxidfilme der Barriereschicht ungleichmäßig und die Rippen wurden gebildet. An diesen Stellen wird die Bildung und Entwicklung der Mikroporen durch das verschlimmerte AFAD gefördert. Mit der Verlängerung der zweiten Anodisierungszeit werden die geordneten Löcher und Durchgangslöcher allmählich auf der Oberfläche gebildet, und dann verschwanden die mehrschichtigen Schalenrahmen und Grate (Abb. 4b–d). Das Ergebnis ähnelt dem von Reddy, das PAA über einen zweistufigen Anodisierungsprozess in 0,3 mol/l Oxalsäure herstellte [44].

Mikromorphologie-Analyse von ZnO-Filmen

Die Antobiofilmeigenschaften der Materialoberflächen werden durch deren Morphologie und Substanz beeinflusst [12]. Wie in Abb. 5 gezeigt, unterscheiden sich die Morphologien von ZnO-Filmen erheblich, die auf den PAA-Filmen mit unterschiedlicher Zeit der zweiten Anodisierungsdauer hergestellt werden. Auf den Oberflächen des PAA-Films mit Nanoporen von 5–10 nm sind die agglomerierten großen Partikel von 20–30 nm dicht angelagert und bilden dicke ZnO-Filme (Abb. 5a). Auf der Oberfläche des PAA-Films, der durch zweistufige Anodisierungsdauer von 40 min vorbereitet wurde, bleiben die mehrschichtigen Schalenrahmen auf dem ZnO-Film (Abb. 5b). Wie in Abb. 5c gezeigt, wurden die ZnO-Partikel am Skelett des PAA-Films befestigt und haben größere Löcher gebildet. Auf der Probe mit Nanoporen von 60–70 nm sind die ZnO-Partikel von 10–20 nm am Rand der PAA-Löcher befestigt und ein Teil der Partikel trat in die Nanoporen ein (Abb. 5d). Dies kann das Kollosol sein, das unter Vakuumbedingungen in die größeren Löcher eindringt und dann die ZnO-Partikel bildet. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die Haftgeschwindigkeit von ZnO umso höher ist, je kleiner die Nanoporendurchmesser von PAA sind. Wuet al. [45] gehen davon aus, dass sich die Kollosolpartikel aufgrund des Negativs der Solpartikel und des Positivs der PAA-Porenwände leicht an der Wand der Löcher bilden. Das Ergebnis stimmt auch mit der Studie von Bousslama et al. [46]. Das Kollosol haftet einfach an der Lochwand, wenn der PAA-Film 24 Stunden lang in Zinksol eingetaucht wird und dann die Löcher 48 Stunden lang gefüllt sind, was darauf hindeutet, dass die Kollosolpartikel vorzugsweise an der Lochwand haften.

REM-Bilder der auf PAA hergestellten ZnO-Filme mit unterschiedlicher Zeit der zweistufigen Anodisierungsdauer a 0 Minute, b 40 Minuten, c 60 Minuten und Tag 80 Minuten

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die Kollosolpartikel leicht in große Löcher eindringen und sich unter Vakuumbedingungen an der Innenfläche anlagern; die Kollosolpartikel haften jedoch nur mit den kleinen Löchern an den Skeletten der Außenflächen von PAA.

Die TEM-Bilder des vom ZnO/PAA-Verbundfilm abgeschnittenen ZnO-Films sind in Abb. 6 dargestellt. Auf der nur durch einstufige Anodisierung hergestellten PAA-Oberfläche sind die delaminierten ZnO-Partikel etwa 10 nm groß, aber die Partikel von 20–30 nm sind im SEM-Bild (Abb. 5a) gezeigt, was darauf hinweist, dass die ZnO-Partikel agglomeriert sind. Auf der durch zweistufiges Anodisieren hergestellten PAA-Oberfläche sind die delaminierten ZnO-Partikel ungefähr 20 nm groß, und ein Teil der Partikel ist an den einzelnen Stellen agglomeriert. Es zeigt sich, dass die ZnO-Partikel zuerst am Rand der PAA-Löcher befestigt werden (Abb. 6c, e, f).

TEM-Bilder (a , c , e , f ) und SAED-Muster (b , d ) der auf PAA hergestellten ZnO-Filme mit unterschiedlicher Zeit der zweistufigen Anodisierungsdauer a , b 0 Minute c , d 40 Minuten; e 60 Minuten; und f 80 Minuten

Die Gitterebenen (100), (101), (102), (110) und (103) der hexagonalen Wurtzitstruktur ZnO sind in SAED-Mustern gezeigt (Abb. 6b, d), was darauf hinweist, dass ZnO ein hexagonaler Wurtzit ist. Die Ergebnisse stimmen mit der XRD-Analyse überein.

Hydrophobizität-Hydrophilie-Charakterisierung der ZnO-Filmoberfläche

Um die bakterielle Adhäsion der Materialien zu verringern, werden die hergestellten ZnO-Filme mit unterschiedlicher Mikromorphologie behandelt, um die Hydrophobie zu verbessern, und der Wasserkontaktwinkel der Dünnfilmoberfläche vor und nach der Modifizierung ist in Tabelle 1 gezeigt.

Vor der Modifizierung sind die ZnO-Filme aufgrund der Oberflächenhydroxylgruppen auf den ZnO-Partikeln hydrophil. Die Hydrophilie ist am besten aufgrund seiner porösen Struktur, die auf der PAA-Oberfläche mit einer zweistufigen Anodisierungsdauer von 40 min hergestellt wurde. Bei den anderen Proben mit zweistufiger Anodisierungsdauer von 60 und 80 min nimmt die Hydrophilie aufgrund der geringen adhäsiven Menge an ZnO allmählich ab. Bei der Probe mit einstufiger Anodisierungsdauer ist die geringe Hydrophilie auf ihre nicht poröse Struktur zurückzuführen.

Nach der Modifizierung werden die ZnO-Filme in hydrophob übersetzt. Laut FT-IR-Analyse wird das Triethoxysilylpropyl auf die Proben gepfropft, nachdem –S–S–-Bindungen von Si69 geplatzt sind. Inzwischen könnte es an seiner porösen Struktur und mehr ZnO-Partikeln liegen; der Film hat die höchste Hydrophobie mit einer zweistufigen Anodisierungsdauer von 40 Minuten.

Charakterisierung von Shewanella putrefaciens Biofilme

Chiet al. [47] berichteten, dass eloxiertes Aluminium keine antibakterielle Wirkung auf gramnegative Bakterien (Escherichia coli und P. aeruginosa ) und grampositive Bakterien (Streptococcus faecalis .) und Staphylococcus aureus ). ZnO besitzt jedoch eine ausgezeichnete antibakterielle und antibiofilmische Aktivität [25,26,27] und es besteht eine positive Korrelation zwischen antibakterieller und antibiofilmischer Aktivität [48, 49]. Darüber hinaus werden die antibakteriellen Eigenschaften von ZnO durch seine Mikrostruktur beeinflusst [50, 51]. Um eine ausgezeichnete Antibiofilm-Aktivitätsoberfläche zu erhalten, wurden die ZnO-Filme mit unterschiedlicher Mikrostruktur auf PAA-Filmen mit unterschiedlichen Zeiten der zweiten Anodisierungsdauer hergestellt und die Antibiofilm-Eigenschaften gemessen.

Die Haftung der Biofilme und Wachstumskurven der Biofilmbakterien

Die Bildung und Entwicklung eines bakteriellen Biofilms lässt sich in fünf Stufen abschließen:zunächst die reversible Anhaftung von Bakterien an der Oberfläche; die Umwandlung von der reversiblen Adhäsion in die irreversible Adhäsion; die anfängliche Bildung des Biofilms; die Entwicklung des ausgereiften Biofilms; und die Degeneration des Biofilms und die Bakterien kehren in den planktonischen Zustand zurück [52].

Wie in Abb. 7(1) gezeigt, ist in 2 Stunden die Adhärenz von Shewanella putrefaciens Biofilm auf den ZnO-Filmen nimmt schnell zu, was die Umwandlung von der reversiblen Adhäsion von Bakterien in die irreversible Adhäsion veranschaulicht. Von 2 bis 12 h nimmt die Haftung des Biofilms allmählich zu, was die Wachstumsphase des Biofilms ist. Von 12 bis 24 Stunden nimmt die Anhaftung des Biofilms leicht zu oder ab, was das reife Stadium des Biofilms manifestiert. Nach 24 h nimmt die Anhaftung des Biofilms ab und die Biofilme treten in das degenerierende Stadium ein. Abbildung 7(2) zeigt, dass die Variationstendenz der Biofilmbakterien mit der Anhaftung des Biofilms übereinstimmt, was darauf hinweist, dass die Entwicklung des Biofilms von den Biofilmbakterien abhängt.

Die Haftung von Shewanella putrefaciens Biofilm (1 ) und Koloniewachstumskurve der Biofilmbakterien (2 ) auf den auf PAA hergestellten ZnO-Filmen mit unterschiedlicher Zeit der zweistufigen Anodisierungsdauer (a) 0 min, (b) 40 min, (c) 60 min und (d) 80 min

Darüber hinaus sind die Haftung des Biofilms und die Gesamtmenge der Biofilmbakterien für den auf der PAA-Oberfläche mit einer zweistufigen Anodisierungsdauer von 80 Minuten hergestellten ZnO-Film unter den vier Proben am höchsten. Für den auf der PAA-Oberfläche hergestellten ZnO-Film mit einer zweistufigen Anodisierungsdauer von 40 Minuten ist die Antibiofilm-Eigenschaft jedoch optimal. Dies könnte an der Biofilm-Adhäsion liegen, die durch die höchste Hydrophobie gehemmt wird, und dann weniger Exopolysaccharide (EPS) und der andere Nährstoff gegen das Wachstum von Biofilm-Bakterien. Bei dem auf der PAA-Oberfläche hergestellten ZnO-Film mit einer zweistufigen Anodisierungsdauer von 80 Minuten ist seine Hydrophilie gut für die anfängliche Haftung des Biofilms, und weniger ZnO-Partikel hemmen das Wachstum der Biofilmbakterien nicht. Inzwischen ernähren mehr Biofilm-Klebstoffe die Biofilm-Bakterien, und die Biofilm-Bakterien vermehren sich schnell. In Übereinstimmung mit unserer Forschung wird die Biofilmadhäsion durch die höhere Hydrophobie des ZnO-Films im Anfangsstadium der Biofilmbildung gehemmt [49]. Die Haftung von Biofilmen wird durch die hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften der Materialien beeinflusst [14, 53, 54]. Bonsagliaet al. [14] berichteten, dass L. monocytogenes haften leichter an der hydrophilen Oberfläche als an der hydrophoben Oberfläche. Viele Studien fanden heraus, dass die bakterielle Adhäsion durch hydrophobe Oberfläche reduziert oder gehemmt wird [47, 54]. Schaer et al. [54] indicated that the biofilm colonization on the functionalizing orthopedic hardware could be prevented by hydrophobic polycations. Chenet al. [55] also suggested that the biofilm could be inhibited by low surface free energy. The results matched those from us.

The Morphological Characteristics of Shewanella putrefaciens Biofilm

The microtopographies of Shewanella putrefaciens biofilm at various stages are shown in Fig. 8.

SEM images of the biofilms on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

After cultivated for 2 h, there are less adhesive materials on the ZnO film prepared on PAA without two-step anodization (a) and with two-step anodization duration for 40 min (b), but more adhesive materials and a few bacteria on the other two (c, d). It is indicated that the anti-adhesive properties of the former two are better than the latter two, it is consistent with Fig. 7. After cultivated for 12 h, more and more EPS and bacteria are attached to ZnO films, signifying the rapid growth of the biofilm. At 24 h, the EPS films are thickened gradually and biofilm bacteria grew well, indicating mature biofilms. At 36 h, the deciduous EPS films and dead bacteria illustrate the biofilm degenerating stage.

According to the antibacterial mechanisms of dissolved metallic ions, the dissolved zinc ions are combined with active proteinase of bacteria, make proteinase lose its bioactivity, and damage its bacterial cells to death [34, 56]. Thus, the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to the latter two (c, d) due to their plentiful ZnO particles on the films. Xie [57] and Jones [58] also thought that the antibacterial abilities strengthened with the dosage increasing of ZnO particles. Meanwhile, the adhesive materials and bacteria on the sample (d) are all more than the others, according to the analysis of adhesion of Shewanella putrefaciens biofilm and colony growth curve of the biofilm bacteria (Fig. 7). Fenget al. [59] found that the hypha of Escherichia coli easily reached into the PAA pores with diameters of 50 and 100 nm, and the biofilm accumulated and adhered to the surface of PAA. However, there is no hypha of Shewanella putrefaciens could be observed in our study. It can be inferred that the optimal antibiofilm properties are ascribed to the lower hydrophobicity of ZnO film in the initial stage of the biofilm formation.

The CLSM Characteristics of the ZnO/PAA Composite Biofilms

As shown in CLSM images, the live Shewanella putrefaciens bacteria are green, and the dead ones are red (Fig. 9). The black images indicate that the counts of live bacteria on the surfaces are few after biofilm cultivation for 2 h. Biofilm bacteria multiply rapidly, and the counts of live bacteria are significantly increased with the cultivation time. More dead bacteria are observed in the former two (a, b) at 24 h and in all samples at 36 h. The counts of dead bacteria of the latter two (c, d) are less than that of the former two (a, b). The results indicate that the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to that of the latter two (c, d), which is according to the previous analysis.

CLSM images biofilms formed on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

Conclusions

In this work, the PAA films with different microstructures were prepared by two-step anodic oxidation first, and then the ZnO/PAA composite films are prepared by sol-gel. The ZnO films are hydrophilic due to the surface hydroxyl group on the ZnO particles. After being modified by Si69, the ZnO films translate to hydrophobicity because of its hydrophobic group. The antibiofilm properties of the ZnO films are affected by the hydrophobicity and amount of ZnO particles. The hydrophobicity inhibits the initial adherence of the biofilm and less EPS and the other nutrient against the growth of biofilm bacteria. So, the antibiofilm properties of the ZnO/PAA film are optimal which are prepared on the PAA surface with two-step anodization duration for 40 min because of its super-hydrophobicity and plenty of ZnO particles.

Abkürzungen

AO:

Acridine orange

CA:

Water contact angle

EPS:

Exopolysaccharides

FT-IR:

Fourier transform infrared spectrometer

PAA:

Porous anodic alumina

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PI:

Propidium iodide

SAED:

Ausgewählte Bereichselektronenbeugung

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

TG/DTA:

Thermogravimetric/differential thermal analyze

XRD:

X-ray diffusion