Der Apoptose-Effekt von mit Lithocholsäure modifizierten Goldnanopartikeln auf Leberkrebszellen

Hintergrund

Goldnanopartikel (AuNPs) als Nanomaterialien finden aufgrund ihrer einzigartigen optischen Eigenschaften, ihrer guten chemischen Stabilität und Biokompatibilität in vielen Bereichen breite Anwendung [1,2,3,4,5]. Es hat also breite Anwendungsperspektiven in der Nanoelektronik, Nanophotonik, Katalyse, Sensoren, Biomarkern und vielen anderen Bereichen [6,7,8]. Da AuNPs eine große Oberfläche und eine sphärische Form haben, können sie als Träger für antineoplastische Medikamente verwendet werden [9,10,11,12]. Darüber hinaus wurden viele AuNP-Komplexe hauptsächlich für die neuartigen Antitumor-Medikamente zur Behandlung von Krebs eingesetzt [13, 14]. Als antineoplastischer Wirkstoffträger kann der AuNP-Komplex die Zellfunktion kontrollieren, die Genexpression regulieren und Analyten in der Zelle nachweisen [15, 16]. Daher wird die Verbesserung funktionalisierter AuNPs zu einem der wichtigsten Trends in der Erforschung der Krebsbehandlung [17,18,19].

Lithocholsäure (LCA) kommt in der Gallenflüssigkeit von höheren Wirbeltieren häufig vor. Die Vielfalt der Gallensäurearten wurde bei der Anwendung verschiedener Arten von Gallensäure und ihren Derivaten in der Medizin und einigen anderen Bereichen berichtet [20,21,22], wie sie beispielsweise bei der Behandlung von Gallensäuremangel, Gallensteinen und eingesetzt werden kann Lebererkrankungen [23,24,25]. Und einige Gallensäuren und ihre Derivate können als Arzneimittelträger auf die Behandlung von Lebererkrankungen abzielen, die Absorption fördern und den Cholesterinspiegel senken. [26,27,28]. Frühere Berichte zeigten, dass LCA eine sehr starke Antitumorwirkung auf Leberkrebszellen hat und der Zelltodmechanismus die Apoptose ist [29, 30]. Apoptose ist ein biologischer aktiver Zelltodprozess und ein wichtiger Mechanismus dafür, dass der Körper eines vielzelligen Organismus die Körperentwicklung reguliert, die Zellalterung kontrolliert und die innere Umgebung stabil hält [31, 32]. Insbesondere die Hemmung der Proliferation, Differenzierung, Reduktion des Malignitätsgrades und Förderung der Tumorzell-Apoptose sind die Zwecke der Tumorbehandlung [33,34,35,36,37].

In dieser Studie synthetisierten wir die AuNPs mit biologischen Targeting-Eigenschaften durch die Kombination von Gold-NPs mit LCA-Derivaten. Wir untersuchten ihre Zytotoxizität mit der MTT-Methode mit HepG2-, SMMC-7721-, QSG-7701- und MCF-7-Zellen für 48 Stunden. Unsere Zytotoxizitätsergebnisse zeigten, dass AuNP@MPA-PEG-LCA das Wachstum mehrerer Leberkrebszellen effektiver hemmen könnte als andere Krebszellen und normale Zellen. Apoptose spielt eine Rolle bei der Hemmung der Zellproliferation, was durch Hoechst 33342-Färbung, Annexin-V-FITC-Färbung, Analyse des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) und AO/EB-Färbungsexperimente bestätigt wurde. Und der ROS-Spiegel stieg in Leberkrebszellen an, was darauf hindeutet, dass AuNP@MPA-PEG-LCA über eine durch die ROS-Generation vermittelte mitochondriale Dysfunktion Apoptose induzieren kann.

Methoden

Materialien

Sofern nicht anders angegeben, wurden Chemikalien von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. RPMI-1640-Medien und fötales Rinderserum (FBS) stammten von Invitrogen Corporation. HepG2 (menschliche hepatozelluläre Leberkarzinomzellen), SMMC-7721 (menschliche hepatozelluläre Leberkarzinomzellen), QSG-7701 (menschliche normale Hepatozytenzellen) und MCF-7 (menschliche Brustkrebszellen) wurden vom Shanghai Institute for Biological Science ( Shanghai, China).

Synthese von AuNP@MPA

Citrat-bedeckte Goldnanopartikel (AuNP@MPA) mit einer durchschnittlichen Größe von 4,0 nm wurden nach der von J. Turkevich et al. entwickelten Methode hergestellt. [38]. Kurz gesagt, 773 μl 38,8 mM Natriumcitratlösung und 2 ml 15 mM HAuCl₄ Lösung wurden in 30 ml Milli-Q H₂ . aufgelöst 0, und die Lösung wurde bei 25 °C gerührt. Dann 3 ml von 0,1 M NaBH₄ (frisch zubereitet) wurde zugegeben. Nach 2 h 25 °C Reaktion änderte sich die Lösung von farblos nach hellorange. Dann wurden 3 ml von 0,01 M 3-Mercaptopropionsäure (MPA) in wasserfreiem Ethanol bei pH 11 zugegeben und 2 h lang bei 25 °C reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde zentrifugiert, um die Verbindung AuNP@MPA zu erhalten.

Synthese von AuNP@MPA-PEG

10,5 mg (0,0875 mmol) 1-Hydroxypyrrolidin-2,5-dion (NHS) und 7 mg (0,035 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC) wurden zu 50 mM AuNP@MPA-Lösung in 4-Morpholinethansulfonsäure (MES) und die Lösung wurde 30 min bei 25 °C gerührt. Dann 0,045 mmol NH₂ -PEG1000-NH₂ zugegeben und die Mischung wurde 24 h bei 25 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung zentrifugiert, um die Verbindung AuNP@MPA-PEG zu erhalten.

Synthese von AuNP@MPA-PEG-LCA

Die Verbindung AuNP@MPA-PEG in Reinstwasser wurde zu 200 μL wasserfreier Dimethylformamid (DMF)-Lösung, einschließlich 17 mg (0,045 mmol) LCA, gegeben und die Reaktionslösung wurde 24 h bei 25 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert, um die Verbindung AuNP@MPA-PEG-LCA zu erhalten.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Die Morphologie und Größe von AuNPs wurden auf einem JEOL JEM-200CX TEM nachgewiesen, das bei bis zu 200 kV betrieben wurde. Die AuNP-Lösung wurde auf ein Kupfergitter (300 mesh) getropft.

Antitumorfähigkeitstests von AuNPs

Wir verwendeten vier Zelltypen (HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 und MCF-7), um die Antitumorfähigkeit der AuNPs durch ein modifiziertes 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 . zu untersuchen -Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Methode. Im Assay wurden 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 mg/ml AuNPs und ursprüngliche Goldnanopartikel (AuNP@MPA) verwendet. Die OD570 jedes Wells wurde auf einem Tecan Infinite M200 Multimode-Plattenlesegerät gemessen.

Bestimmung der Morphologie durch Hoechst-Färbung

Nach 24 und 48 h mit AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml) wurden HepG2-Zellen mit 10 μg/ml Hoechst 33342 für 30 Minuten im Zellinkubator gefärbt. Die Morphologie der Zellkerne wurde mit der konfokalen Mikroskopie Leica-SP8 nachgewiesen.

Zell-Prophase-Apoptose:Annexin-V-FITC-Färbung

Nach 6 h mit AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml) wurden die HepG2-Zellen mit Annexin V-FITC für 10 Minuten im Zellinkubator gefärbt und dann mit einem Leica-SP8-Konfokalmikroskop beobachtet.

Für den Durchflusszytometer-Nachweis von AuNPs wurden HepG2-Zellen nach 6 stündiger Behandlung mit AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml) mit Annexin V-FITC für 10 Minuten im Zellinkubator gefärbt und mit einem FACSCalibur-Durchflusszytometer nachgewiesen (Becton Dickinson &Co., Franklin Lakes, NJ).

Analyse des mitochondrialen Membranpotentials (MMP)

HepG2-Zellen, die mit AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml) für 6 h bei 37 °C behandelt wurden, wurden mit 10 μg/ml JC-1 (5,5′,6,6′-Tetrachlor-1,1 .) inkubiert ′,3,3′-Tetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid; molekulare Sonden) für 10 min bei 37 °C. Die Zellen wurden anschließend mit einem FACSCalibur-Durchflusszytometer nachgewiesen.

Für die fluoreszenzmikroskopische Beobachtung wurden die HepG2-Zellen mit AuNP@MPA-PEG-LCA für 10 Minuten mit 10 μg/ml JC-1 behandelt und mit der konfokalen Mikroskopie Leica-SP8 beobachtet.

Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)

Die Akkumulation von intrazellulärem ROS wurde mit 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat (H₂ DCF-DA). Die Behandlung der HepG2-Zellen mit AuNP@MPA-PEG-LCA-Proben (0,5 mg/ml) für 6 Stunden wurde mit 10 μM H₂ . inkubiert DCF-DA für 30 min bei 37 °C. Und die Fluoreszenzintensität der Zellen wurde unter Verwendung eines FACSCalibur-Durchflusszytometers und eines konfokalen Mikroskops betrachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von AuNPs

Zuerst wurde wasserlösliches AuNP@MPA hergestellt (Schema 1). Abbildung 1a zeigt die TEM-Ergebnisse des AuNP@MPA. Es wird darauf hingewiesen, dass die Form und Größe von AuNP@MPA die sehr ähnliche Kugelform mit einer kompakten Größe von 4,0 ± 0,5 nm aufwies. Anschließend wurde die AuNP@MPA-PEG-LCA hergestellt (Schema 1). Auch die Morphologie der Partikel wurde mit TEM analysiert (Abb. 1c). TEM-Bilder zeigten, dass die Morphologie von AuNP@MPA-PEG-LCA der von AuNP@MPA ähnelt. Und die Durchmesser von AuNP@MPA-PEG-LCA betrugen laut statistischer Analyse ~ 16 nm.

Schematische Darstellung der Synthese der AuNP@MPA-PEG-LCA

TEM-Bilder von a AuNP@MPA, b AuNP@MPA-PEG und c AuNP@MPA-PEG-LCA

Die Ergebnisse der Zytotoxizität

Um die Zytotoxizität der AuNPs zu untersuchen, wurden HepG2-, SMMC-7721-, QSG-7701- und MCF-7-Zellen ausgewählt und 48 h mit AuNPs und AuNP@MPA behandelt. Und der MTT-Assay wurde verwendet, um die Zelltoxizität von Proben nachzuweisen. Die Zelllebensfähigkeit der AuNPs und AuNP@MPA auf verschiedenen Zellen ist in Abb. 2 dargestellt. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Zytotoxizität von AuNP@MPA in allen Zellen sehr gering ist. Allerdings könnte die AuNP@MPA-PEG-LCA das Wachstum mehrerer Leberkrebszellen mit steigender Nanopartikelkonzentration effektiver hemmen, aber normale Zellen und andere Krebszellen weniger schädigen. Die antiproliferative Aktivität von AuNP@MPA-PEG-LCA gegenüber HepG2- und SMMC-7721-Zellen war nämlich im Vergleich zu QSG-7701- und MCF-7-Zellen sehr hoch.

Zelllebensfähigkeit von AuNP@MPA und AuNP@MPA-PEG-LCA (AuNPs), inkubiert mit HepG2-, SMMC-7721-, QSG-7701- und MCF-7-Zellen für 48 Stunden

Induktion der Apoptose

Apoptotische Kerne sind ein häufiger Index für Apoptose. Nach Behandlung mit AuNP@MPA-PEG-LCA für die angegebenen Zeiten wurden die Zellen mit Hoechst 33342 inkubiert. Anschließend wurden die morphologischen Eigenschaften des Zellkerns mittels konfokaler Mikroskopie betrachtet. Wie in Abb. 3 gezeigt, zeigen die Kontrollzellen und die mit AuNP@MPA inkubierten Zellen eine intakte und homogene Zellkernfärbung; jedoch nimmt die Anzahl apoptotischer Zellen in mit AuNP@MPA-PEG-LCA behandelten HepG2-Zellen mit zunehmender Inkubationszeit allmählich zu und der Zellkern zeigt typische Apoptose-Merkmale, wie fragmentierte Kerne, kondensiertes Chromatin und Verringerung des Zellvolumens.

Morphologische Eigenschaften des Zellkerns von HepG2-Zellen, gefärbt mit Hoechst 33342. HepG2-Zellen wurden mit AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml) für a . inkubiert 0 h, b 24 Stunden und c 48 h und d AuNP@MPA (0,5 mg/ml) inkubiert für 48 Stunden. Apoptotische Zellen zeigten kondensierte und fragmentierte Kerne und eine Schrumpfung des Zellvolumens; Maßstabsleiste 20 μm

Wie wir alle wissen, kann die Annexin-V-Färbung die frühen Stadien der Apoptose von nekrotischen Zellen unterscheiden. Im frühen Stadium der Apoptose könnte Annexin V an das Membran-Phospholipid Phosphatidylserin (PS) binden, das von der inneren zur äußeren Oberfläche der Plasmamembran ausgelagert wird [39]. Daher untersuchten wir das Potenzial, die Apoptose von AuNP@MPA-PEG-LCA durch Annexin-V-FITC-Färbungsassays zu induzieren. Wie in Abb. 4a gezeigt, gibt es keine offensichtliche grüne Fluoreszenz in der Zellmembran der Kontrolle, aber eine offensichtliche grüne Fluoreszenz in der Zellmembran von HepG2-Zellen, die mit AuNP@MPA-PEG-LCA behandelt wurden. Dieses Phänomen ist ein starker Indikator für die Apoptose im Frühstadium. Wie wir alle wissen, bewiesen die Bilder der konfokalen Mikroskopie nur das Auftreten von Apoptose; die Durchflusszytometrie konnte jedoch das Auftreten von Apoptose schnell und empfindlich messen und die Apoptoserate genau bestimmen. Aus diesem Grund haben wir die Stadien der Apoptose mit Durchflusszytometrie weiter untersucht. Abbildung 4b zeigt die Ergebnisse der Apoptoserate durch Durchflusszytometrie. Der Prozentsatz der Apoptose betrug etwa 38,45 % der mit AuNP@MPA-PEG-LCA behandelten HepG2-Zellen, aber der Prozentsatz der Apoptose betrug nur etwa 8,16 % in den Kontrollzellen. Der signifikante Prozentsatz der Apoptose legt nahe, dass die mit AuNP@MPA-PEG-LCA inkubierte Zelle die Apoptose aufrechterhielt.

Die Apoptose-Ergebnisse von a konfokale Bilder und b Durchflusszytometriedaten von HepG2-Zellen, die mit AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml) behandelt wurden. Die Zellen wurden mit Annexin V-FITC gefärbt (Anregung bei 488 nm und Emission bei 500–560 nm); Maßstabsleiste 20 μm

Der Rückgang von MMP

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der Apoptose, da sie proapoptotische Faktoren wie Cytochrom C und den Apoptose-induzierenden Faktor freisetzen können [40,41,42]. Daher haben wir die Veränderung von MMP mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht. Abbildung 5a zeigt die Fluoreszenzbilder von JC-1-markierten HepG2-Zellen, die mit AuNP@MPA-PEG-LCA durch konfokale Mikroskopie behandelt wurden. Wir können eine deutliche rote JC-1-Fluoreszenz und gesunde Mitochondrien in den HepG2-Kontrollzellen beobachten, was auf das Vorliegen einer JC-1-Aggregation hinweist. Es gibt jedoch mehr grüne Fluoreszenz in den mit AuNP@MPA-PEG-LCA behandelten HepG2-Zellen, was darauf hindeutet, dass die Membran zusammenbricht. Die mitochondriale Zerstörung in apoptotischen Zellen weist darauf hin, dass sich das JC-1 nicht in den Mitochondrien ansammelt, sondern sich in der Zelle verteilt. Und als monomere Form fluoresziert das verstreute JC-1, das existiert, grün. Um die Veränderung von MMP weiter zu quantifizieren, bewerteten wir die mit JC-1 gefärbten HepG2-Zellen durch Durchflusszytometrie. Repräsentative JC-1-Rot/Grün-Verhältnis-Signale, die in HepG2-Zellen aufgezeichnet wurden, die mit AuNP@MPA-PEG-LCA und Kontrollzellen durch Durchflusszytometrie behandelt wurden, sind in Abb. 5b gezeigt. Aus der quantitativen Analyse von JC-1-gefärbten Zellen können wir beobachten, dass das Verhältnis von Rot/Grün eine signifikante Abnahme der mit AuNP@MPA-PEG-LCA behandelten Zellen zeigte, während dies einen signifikanten Anstieg der Kontrollzellen aufwies, was darauf hindeutet, dass AuNP@ MPA-PEG-LCA kann in HepG2-Zellen Apoptose induzieren.

a Fluoreszenzbilder von JC-1-markierten Zellen, betrachtet durch konfokale Mikroskopie und b Auswirkungen von AuNP@MPA-PEG-LCA auf MMP, analysiert durch Durchflusszytometrie

Auswirkungen von AuNP@MPA-PEG-LCA auf ROS

Wie wir alle wissen, kann die Apoptose mit erhöhten intrazellulären ROS-Spiegeln ausgelöst werden, die auch ein starker Beweis für die Induktion der Apoptose sind [43]. Um weiter zu untersuchen, ob die mitochondriale Dysfunktion mit der Bildung von ROS zusammenhängt, haben wir den ROS-Spiegel in mit H₂ . gefärbten HepG2-Zellen bestimmt DCF-DA unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie und der Durchflusszytometrie. Wie in Abb. 6a gezeigt, ist die Intensität der grünen Fluoreszenz von H₂ DCF-DA zeigt einen signifikanten Anstieg der mit AuNP@MPA-PEG-LCA behandelten HepG2-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen. Das heißt, der Gehalt an ROS in mit AuNP@MPA-PEG-LCA behandelten HepG2-Zellen war signifikant erhöht. Anschließend wurde die quantitative Analyse des ROS-Gehalts in Zellen mittels Durchflusszytometrie untersucht. Wie in Abb. 6b gezeigt, wurde die höhere Fluoreszenzintensität in mit AuNP@MPA-PEG-LCA inkubierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass der ROS-Gehalt in den mit AuNP@MPA-PEG-LCA behandelten Zellen höher ist . Die Daten legten nahe, dass die mitochondriale Dysfunktion möglicherweise mit der Bildung von ROS zusammenhängt. Diese Ergebnisse weisen vorläufig darauf hin, dass die Bildung von ROS eine wichtige Rolle bei der Apoptose-auslösenden AuNP@MPA-PEG-LCA spielt.

Analyse der ROS-Produktion, nachdem HepG2-Zellen 6 h lang mit AuNP@MPA-PEG-LCA behandelt wurden. Der Gehalt an ROS in HepG2-Zellen wurde von a . untersucht konfokale Mikroskopie (Anregung bei 488 nm und Emission bei 530 nm) und b Durchflusszytometrie (Anregung bei 488 nm und Emission bei 525 nm)

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir die AuNP@MPA-PEG-LCA mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 16,0 nm synthetisiert, die das Wachstum mehrerer Leberkrebszellen hemmen kann. Die AuNP@MPA-PEG-LCA hemmte effektiv die Zellproliferation aufgrund von Apoptose, was durch Kernfärbung, JC-1-Färbung, MMP-Analyse und Annexin-V-FITC-Färbungsexperimente nachgewiesen wurde. In der Durchflusszytometrie-Studie beweist der AuNP@MPA-PEG-LCA-Arrest in Leberkrebszellen deren Apoptoseverhalten weiter. Daher können die AuNPs effizient Apoptose über eine ROS-vermittelte mitochondriale Dysfunktion induzieren und sind in einer vorläufigen mechanistischen Studie effektiver bei der Förderung des programmierten Zelltods in Leberkrebszellen.

Abkürzungen

AuNPs:

Goldnanopartikel

DMF:

Dimethylformamid

EDC:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid

FBS:

Fötales Rinderserum

H₂ DCF-DA:

2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat

HepG2:

Humane hepatozelluläre Leberkarzinomzellen

JC-1:

5,5′,6,6′-Tetrachlor-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbo-cyaninjodid

LCA:

Lithocholsäure

MCF-7:

Menschliche Brustkrebszellen

MES:

4-Morpholinethansulfonsäure

MMP:

Mitochondriales Membranpotential

MPA:

3-Mercaptopropionsäure

MTT:

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

NHS:

1-Hydroxypyrrolidin-2,5-dion

PEG:

Polyethylenglykol

PS:

Phosphatidylserin

QSG-7701:

Menschliche normale Hepatozytenzellen

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

SMMC-7721:

Humane hepatozelluläre Leberkarzinomzellen

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie