Reduzierung der Zytotoxizität von Silbernanopartikel-Beschichtungen mit Graphenoxid: Verbesserte antibakterielle Leistung und Biokompatibilität eines Ag-GO-Nanokomposits

Zusammenfassung

Silbernanopartikel (AgNP)-beschichtete Oberflächen gelten als vielversprechende Alternative zu konventionellen Antibiotika. Doch ihre hohe Oberflächenreaktivität wirft Sicherheitsbedenken in biomedizinischen Kontexten auf. Hier berichten wir, dass die Integration von Graphenoxid (GO) in AgNP-Beschichtungen die Zytotoxizität gegenüber menschlichen Fibroblasten, Endothelzellen und der Hühnerembryo-Chorioallantois-Membran erheblich senkt, während gleichzeitig die antibakterielle Aktivität gegen Salmonella enteritidis erhöht wird. Der Ag-GO-Komposit zeigte überlegene bakterielle Hemmung und deutlich reduzierte Freisetzung entzündlicher Zytokine, was auf eine sicherere Nanoplattform für medizinische Anwendungen hinweist.

Einleitung

Antimikrobielle Oberflächen, die Nanomaterialien – insbesondere Silbernanopartikel – enthalten, entwickeln sich als wirksame Alternativen zu traditionellen Antibiotika und chemischen Desinfektionsmitteln. Die Eigenschaften, die antibakterielle Potenz verleihen, tragen jedoch auch zu potenzieller Zytotoxizität und Immunogenität bei, was die klinische Translation limitiert. Eine Schlüsselstrategie zur Toxizitätsminderung ist die feste Immobilisierung von Nanopartikeln auf dem Substrat, um ihre Freisetzung zu begrenzen, während die antimikrobielle Funktion erhalten bleibt. Ultraschallabscheidetechniken haben sich als effektiv für Beschichtung und Bildung stabiler Nanokomposite erwiesen, wie AgNPs auf Graphenoxid (GO). GO's reichliche oxygenierte Funktionsgruppen fördern starke elektrostatische oder kovalente Bindung mit Metallionen, was die Adhäsion verbessert und Partikelauslaugung reduziert. In dieser Studie untersuchten wir die Hypothese, dass Polyurethanfolien, beschichtet mit einem Ag-GO-Komposit, geringere Toxizität im Vergleich zu reinen AgNP-Beschichtungen aufweisen, ohne die antibakterielle Wirksamkeit zu beeinträchtigen.

Ergebnisse

AgNPs und GO bilden einen stabilen Nanokomposit

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigte kugelförmige AgNPs (~55 nm), die fest an GO-Blättern hafteten (Abb. 1a-e). Zeta-Potenzial-Messungen zeigten, dass der Ag-GO-Hydrokolloid nach 24 h stabilisiert war (−15,68 mV bis −27,7 mV), während AgNPs allein instabil blieben (−31,11 mV). Dynamische Lichtstreuung (DLS) zeigte eine Z-average-Größe von 1157 nm für den Komposit, intermediär zwischen AgNPs (93 nm) und GO (1485 nm), was eine erfolgreiche Hybridisierung bestätigt (Abb. 1b,d,f). Ramanspektroskopie bestätigte die charakteristischen D (1347 cm⁻¹) und G (1578 cm⁻¹) Bänder von GO mit einem ID/IG-Verhältnis von 1,34, was eine hochgradig ungeordnete, aber funktionalisierte Struktur anzeigt (Abb. 2a). FT-IR-Spektren verifizierten weiterhin das Vorhandensein von Hydroxyl-, Carboxyl- und Epoxygruppen (Abb. 2b).

Nanopartikelmorphologie und Größenverteilung. Transmissions-Elektronenmikroskopie-Bilder von a Silbernanopartikeln, c Graphenoxid und e Silbernanopartikel- und Graphenoxid-Komposit. Größenverteilung von b Silbernanopartikeln, d Graphenoxid und f Silbernanopartikel- und Graphenoxid-Komposit

Strukturelle Merkmalsanalyse von Graphenoxid. a Ramanspektrum von Graphenoxid mit vorgeschlagener Dekonvolution der D, G und D'-Bänder. b Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (ATR, abgeschwächte Totalreflexion) Spektrum von Graphenoxid mit Zuordnung der Funktionsgruppen

Antibakterielle Wirksamkeit gegen Salmonella enteritidis

Nach 24 h Inkubation bei 37 °C reduzierten alle Nanoplattformen – AgNP, GO und Ag-GO – das bakterielle Wachstum im Vergleich zu unbeschichteten Folien. Der Ag-GO-Komposit erreichte die stärkste Hemmung mit einer >90 % Reduktion der koloniebildenden Einheiten, quantifiziert durch PrestoBlue-Assay (Abb. 3c). Rasterelektronenmikroskopie (SEM) zeigte spärliche bakterielle Kolonien und Membranstörungen auf Ag-GO-Oberflächen, was physischen Kontakt-vermittelten Abtötung bestätigt (Abb. 3b).

Nanoplattformen, beschichtet mit Silbernanopartikeln und Graphenoxid, verringerten die Vitalität von S. enteritidis. Rasterelektronenmikroskopie-Bilder von a Kontroll-S. enteritidis-Bakterien und b S. enteritidis nach Inkubation auf einer mit Silbernanopartikeln und Graphenoxid beschichteten Nanoplattform, nach Inkubation bei 37 °C für 24 h. c Vitalität von S. enteritidis nach Inkubation auf der Nanoplattform für 24 h wurde mit einem PrestoBlue-Assay bewertet. Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3, jedes Experiment in Triplicate) ausgedrückt. Statistische Signifikanz wird durch unterschiedliche Hochindizes angezeigt (einfaktorielle ANOVA; P < 0,05). Abkürzungen: C, Kontrollgruppe (Folie ohne Nanopartikel); AgNPs, Nanoplattform beschichtet mit Silbernanopartikeln; GO, Nanoplattform beschichtet mit Graphenoxid; Ag-GO, Nanoplattform beschichtet mit Komposit aus Graphenoxid und Silbernanopartikeln; RU, relative Einheiten

Reduzierte Zytotoxizität in menschlichen Zellen

Menschliche Fibroblasten und HUVECs wurden direkt auf jeder Nanoplattform für 24 h kultiviert. Vitalitätsassays zeigten eine 40–50 %ige Abnahme auf reinen AgNP-Folien, während GO- und Ag-GO-Oberflächen eine Vitalität vergleichbar mit unbeschichteten Kontrollen aufwiesen (Abb. 4e,f). Morphologische Beurteilung zeigte, dass AgNP-Beschichtungen ausgeprägte Zellaggregation induzierten, während GO und Ag-GO normales Ausbreiten und Morphologie förderten (Abb. 4a-d). Diese Ergebnisse unterstreichen den schützenden Effekt von GO im Komposit.

Nanoplattformen, beschichtet mit Graphenoxid, verringerten die Zytotoxizität von Silbernanopartikeln. Morphologie von Fibroblasten kultiviert auf a unbeschichteten Nanoplattformen, b silbernanopartikel-beschichteten Nanoplattformen, c graphenoxid-beschichteten Nanoplattformen, d silbernanopartikel- und graphenoxid-komposit-beschichteten Nanoplattformen. Morphologie wurde durch Lichtmikroskopie mit Phasenkontrast bei ×200 Vergrößerung beurteilt. Fibroblasten (e) und HUVEC (f) Vitalität nach 24 h Inkubation auf den Nanoplattformen wurde mittels PrestoBlue-Assay bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3, jedes Experiment in Triplicate) ausgedrückt. Statistische Signifikanz wird durch unterschiedliche Hochindizes angezeigt (einfaktorielle ANOVA; P < 0,05). Abkürzungen: HUVECs, humane Nabelschnur-Endothelzellen; C, Kontrollgruppe (Folie ohne Nanopartikel); AgNPs, Nanoplattform beschichtet mit Silbernanopartikeln; GO, Nanoplattform beschichtet mit Graphenoxid; Ag-GO, Nanoplattform beschichtet mit Komposit aus Graphenoxid und Silbernanopartikeln; RU, relative Einheiten

Chorioallantois-Membran-Kompatibilität

Direkter Kontakt der Nanoplattformen mit der Hühnerembryo-Chorioallantois-Membran für 48 h zeigte, dass reine AgNP-Beschichtungen Kapillarverlust und Oberflächenverrauung verursachten, während GO und Ag-GO eine glatte, vaskularisierte Morphologie ähnlich den Kontrollen beibehielten (Abb. 5b). Dieses in-vivo-ähnliche Modell bestätigt die in vitro beobachtete reduzierte Endotheltoxizität.

Graphenoxid verringerte die morphologischen Veränderungen der Chorioallantois-Membran, die durch Silbernanopartikel verursacht wurden. Die Morphologie der Hühnerembryo-Chorioallantois-Membran nach 48 h Inkubation mit den Nanoplattformen. a Kontrollgruppe (Folie ohne Nanopartikel), b Nanoplattform beschichtet mit Silbernanopartikeln, c Nanoplattform beschichtet mit Graphenoxid, d Nanoplattform beschichtet mit Komposit aus Graphenoxid und Silbernanopartikeln

Modulation der entzündlichen Zytokinfreisetzung

Antikörper-Array-Profilierung von Fibroblasten-Überständen zeigte, dass sowohl AgNP- als auch Ag-GO-Beschichtungen die IL-8-Sekretion markant unterdrückten, während GO allein keine Wirkung hatte (Abb. 6a). Alle Nanoplattformen reduzierten IL-6-Freisetzung, und GO/Ag-GO erhöhten die TNF-β-Produktion, was auf eine ausgewogene Entzündungsreaktion hindeutet. Andere Zytokine blieben unverändert, was die geringe Immunogenität des Komposits anzeigt.

Antikörper-Array-Analyse der entzündlichen Zytokinfreisetzung von Fibroblasten nach 24 h Inkubation. a Kontrollgruppe (Folie ohne Nanopartikel), b Nanoplattform beschichtet mit Silbernanopartikeln, c Nanoplattform beschichtet mit Graphenoxid, d Ag-GO-Nanoplattform beschichtet mit Komposit aus Graphenoxid und Silbernanopartikeln. Die AgNP- und Ag-GO-Nanoplattformen verringerten das Freisetzungsniveau von IL-8 (Punkte: E5, F5). Sowohl die GO- als auch die Ag-GO-Nanoplattformen verringerten die Synthese von GM-CSF (Punkte: G5, H5). Zusätzlich führten die GO- und Ag-GO-Nanoplattformen zu erhöhter Synthese von TNF-β (Punkte: A9, B9). Die AgNP-, GO- und Ag-GO-Nanoplattformen verringerten das Freisetzungsniveau von IL-6 (Punkte: E8, F8). Eine vollständige Array-Karte ist in Additional file 1 verfügbar

Diskussion

Unsere Daten bestätigen, dass die Integration von GO in AgNP-Beschichtungen nicht nur die bakterielle Eradikation verbessert, sondern auch zytotoxische und entzündliche Reaktionen in menschlichen Zellen und in einem Wirbeltiermodell mildert. Die verbesserte Stabilität von AgNPs innerhalb der GO-Matrix begrenzt wahrscheinlich Ionenfreisetzung und Partikelablösung, wodurch zelluläre Aufnahme und oxidativer Stress reduziert werden. Zudem verringert die größere Kompositgröße (≈1150 nm) die Endozytoseraten, wie für andere Nanostrukturen beobachtet, was die Toxizität weiter senkt. Wichtig ist, dass der Komposit keine signifikanten Zytokinstürme auslöst und ein neutrales immunologisches Profil beibehält, das für die klinische Translation essenziell ist.

Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten über GO's Fähigkeit überein, Metallnanopartikel zu stabilisieren und ihre Auslaugung zu reduzieren, während die antimikrobielle Potenz erhalten oder sogar gesteigert wird. Die vorliegende Arbeit erweitert dieses Konzept auf ein realistisches Polymer-Substrat (Polyurethanfolien) und validiert Biokompatibilität über mehrere Zelltypen und ein in-vivo-ähnliches Modell.

Fazit

Der Ag-GO-Nanokomposit übertraf sowohl reine AgNP- als auch reine GO-Beschichtungen in antibakterieller Wirksamkeit gegen Salmonella enteritidis und in der Reduzierung der Zytotoxizität gegenüber Fibroblasten, HUVECs und der Chorioallantois-Membran. Das ausgewogene Zytokinprofil des Komposits unterstützt zusätzlich seine Eignung für biomedizinische Geräte wie Wundauflagen und Implantatbeschichtungen. Zukünftige Arbeiten werden Langzeitstabilität, Freisetzungskinetik und in-vivo-Infektionsmodelle untersuchen, um die klinische Anwendung voranzutreiben.

Materialien und Methoden

Herstellung und Charakterisierung der Nanoplattformen

Polyurethanfolien (15 × 15 mm, 0,05 mm) wurden in wässrigen Suspensionen von AgNPs (100 mg l⁻¹), GO (200 mg l⁻¹) oder Ag-GO (200 mg l⁻¹) eingetaucht, die durch Ultraschallbehandlung (20 kHz, 60 % Effizienz, 30 °C) hergestellt wurden. Beschichtete Proben wurden in deionisiertem Wasser gespült und unter sterilen Bedingungen getrocknet. TEM, Raman, FT-IR, Zeta-Potenzial- und DLS-Messungen bestätigten Morphologie und Stabilität jeder Formulierung (Details im Supplementary Material).

Bakterienkultivierung und Vitalitätsassay

Salmonella enteritidis (ATCC 13076) wurde auf Tryptic-Soy-Agar gezüchtet, geerntet und per OD₆₀₀ quantifiziert, um 5 × 10³ CFU ml⁻¹ in MH-Bouillon zu erreichen. Folien wurden 24 h bei 37 °C mit Bakterien inkubiert. Nach Inkubation wurde die bakterielle Vitalität mit PrestoBlue gemessen, und CFU-Zahlen wurden durch serielles Verdünnen und Ausplattieren ermittelt.

Rasterelektronenmikroskopie

Bakterielle und zelluläre Proben wurden in 2,5 % Glutaraldehyd fixiert, mit Osmiumtetroxid kontrastiert, dehydriert, kritisch-punkt-getrocknet und mit Gold gesputtert vor SEM-Bildgebung bei 15 kV.

Humane Zellkultur

HUVECs und Fibroblasten wurden in niedrig-serumhaltigen Medien mit Supplementen kultiviert (Details oben). Zellen wurden direkt auf Folien (1 × 10⁴ Zellen ml⁻¹) gesät und 24 h inkubiert. Vitalität wurde durch PrestoBlue-Fluoreszenz (λ_ex = 560 nm, λ_em = 590 nm) bewertet. Morphologie wurde durch Phasenkontrastmikroskopie untersucht.

Chorioallantois-Membran-Assay

Embryonen (Tag 8) wurden Folien ausgesetzt, die 48 h auf der Chorioallantois-Membran platziert wurden. Membranen wurden entnommen, stereoskopisch abgebildet und auf vaskuläre Integrität bewertet.

Antikörper-Array-Analyse

Fibroblasten-Überstände (80 µl pro Probe) wurden gepoolt, verdünnt und auf einem Antikörper-Array (Abcam, Katalog ab134003) aufgetestet, um 40 entzündliche Zytokine zu quantifizieren. Signale wurden mit HRP-konjugiertem Streptavidin detektiert und auf einem ChemiDoc-System abgebildet.

Statistische Analyse

Daten wurden mit einseitiger ANOVA und Tukeys HSD Post-hoc-Test (GraphPad Prism 8) analysiert. Signifikanz wurde bei p < 0,05 festgelegt.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die während dieser Studie generierten Datensätze sind auf angemessene Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

Ag-GO

Komposit aus Silbernanopartikeln und Graphenoxid

AgNPs

Silbernanopartikel

CFU

Koloniebildende Einheiten

DLS

Dynamische Lichtstreuung

FT-IR

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

GM-CSF

Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor

GO

Graphenoxid

HUVECs

Humane Nabelschnur-Endothelzellen

IL-6

Interleukin 6

IL-8

Interleukin 8

SEM

Rasterelektronenmikroskop

TEM

Transmissionselektronenmikroskop

TNF-α

Tumornekrosefaktor alpha

TNF-β

Tumornekrosefaktor beta