Zirkonoxid-Nanopartikel-induzierte toxische Wirkungen in Osteoblasten-ähnlichen 3T3-E1-Zellen

Zusammenfassung

Zirkonoxid (ZrO₂ ) ist aufgrund seiner hohen mechanischen Festigkeit und geringeren Toxizität eines der weit verbreiteten Metalloxide für potenzielle Bioanwendungen wie Biosensoren, Krebstherapie, Implantate und Zahnmedizin. Aufgrund ihrer weit verbreiteten Anwendungen hat die potenzielle Exposition gegenüber diesen Nanopartikeln (NPs) zugenommen, was große Aufmerksamkeit erregt hat. Daher ist es dringend erforderlich, das toxikologische Profil von ZrO₂ . zu untersuchen NPs. Titandioxid (TiO₂ .) ) ist ein weiteres weit verbreitetes Nanomaterial, von dem bekannt ist, dass es schwach toxisch ist. In dieser Studie wurde TiO₂ NPs dienten als Kontrolle, um die Biokompatibilität von ZrO₂ . zu bewerten NPs. Wir haben die Zytotoxizität von TiO₂ . nachgewiesen und ZrO₂ NPs in osteoblastenähnlichen 3T3-E1-Zellen und fanden heraus, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) eine entscheidende Rolle bei der TiO₂ . spielten und ZrO₂ NP-induzierte Zytotoxizität mit konzentrationsabhängiger Weise. Wir haben auch TiO₂ . gezeigt und ZrO₂ NPs könnten nach Kultivierung mit 3T3-E1-Zellen in hohen Konzentrationen Apoptose und Morphologieänderungen induzieren. Darüber hinaus ist TiO₂ und ZrO₂ NPs in hohen Konzentrationen könnten die osteogene Zelldifferenzierung im Vergleich zu solchen in niedrigen Konzentrationen hemmen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass TiO₂ und ZrO₂ NPs könnten in vitro konzentrationsabhängig zytotoxische Reaktionen auslösen, die auch die Osteogenese beeinflussen können; ZrO₂ NPs zeigten stärkere toxische Wirkungen als TiO₂ NPs.

Einführung

In den letzten Jahrzehnten hat sich die Anwendung von technisch hergestellten Nanopartikeln (NPs) in verschiedenen Bereichen wie der Elektronik, biomedizinischen Anwendungen und Pharmazie ausgeweitet. Zirkonoxid (ZrO₂ ) Nanopartikel sind eines der wichtigsten Nanomaterialien, die zur Synthese von Feuerfestmaterialien, Gießereisanden und Keramik verwendet werden. Aufgrund der bevorzugten mechanischen Festigkeit wird dieses Material auch im biomedizinischen Bereich verwendet, einschließlich Biosensoren, Krebstherapie, Implantaten, Gelenkendoprothesen und Zahnmedizin [1, 2]. Die breite Anwendung von Partikeln hat jedoch Bedenken hinsichtlich ihrer potenziellen Risiken für Gesundheit und Umwelt aufkommen lassen, wobei die Gewährleistung der Arbeits- und Verbrauchersicherheit ein wesentliches Anliegen ist. Bisher toxikologische Studien zu ZrO₂ NPs sind begrenzt und die Ergebnisse waren umstritten.

Einige Studien haben berichtet, dass ZrO₂ Nanopartikel zeigten eine bessere Biokompatibilität im Vergleich zu anderen Nanomaterialien, einschließlich Eisenoxid, Titandioxid (TiO₂ ) und Zinkoxid (ZnO) [3,4,5,6]. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen haben andere über ZrO₂ . berichtet NP konnte leichte [3, 7] oder keine zytotoxischen Wirkungen [8,9,10] induzieren, und nur wenige Studien wiesen auf ein mildes zytotoxisches Potenzial hin. Stoccoro et al. [11] entwickelten die toxischen Wirkungen von ZrO₂ NPs und TiO₂ Ob beschichtete NPs oder nicht, sie stellten fest, dass alle Arten von NPs in unterschiedlichem Maße toxische Wirkungen zeigten. Darüber hinaus wurden in einer anderen Studie nach ZrO₂ . Veränderungen der Zellmorphologie und Risse auf der Zelloberfläche beobachtet NP-Behandlung bei Konzentrationen bis zu 1 mg/ml in den roten Blutkörperchen [12]. Daher haben wir in dieser Studie die zytotoxischen Wirkungen von ZrO₂ . untersucht Nanopartikel, die nützliche Erkenntnisse für ihre zukünftige Anwendung in vivo liefern. Inzwischen haben wir die Zellen mit TiO₂ . behandelt NPs als Kontrollgruppe, deren toxikologisches Profil gut entwickelt ist [13].

Frühere Studien zeigten, dass NPs weit verbreitet als Tissue-Engineering-Materialien verwendet wurden und die Fähigkeit besitzen, die osteogene Differenzierung von Osteoblasten zu verbessern [14,15,16,17]. Ein Bericht zeigte, dass Silica (Si) NPs den altersbedingten Knochenverlust bei Mäusen umkehren könnten, wahrscheinlich aufgrund der durch Si NP induzierten Knochenbildung [16]. Liuet al. [14] fanden heraus, dass mit Silber (Ag) NPs/Poly (DL-Milchsäure-co-Glykolsäure) beschichtete Edelstahllegierung eine starke antibakterielle Wirkung hat und die osteoblastische Proliferation und Reifung von MC3T3-E1-Zellen in vitro fördern könnte. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Kohlenstoff-Nanoröhrchen Knochenverkalkung induzieren, was höchstwahrscheinlich auf ihre nanoskaligen Strukturen zurückzuführen ist, die der Größe intrazellulärer Organellen ähneln [18].

ZrO₂ Nanopartikel werden aufgrund ihrer Biokompatibilität und Biokorrosionsbeständigkeit als Hauptbestandteil biokeramischer Implantate verwendet [19]. Obwohl sich die meisten Studien auf die vorteilhaften Eigenschaften von ZrO₂ . konzentriert haben, NPs sind die nachteiligen biologischen Wirkungen nicht zu vernachlässigen. Daher haben wir in dieser Studie TiO₂ . verwendet , als Kontrollgruppe, bei der es sich um ein traditionelles Nanomaterial handelt, das ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften aufwies. Unser Ziel war es, die Auswirkungen von TiO₂ . zu untersuchen und ZrO₂ NPs zu Zelllebensfähigkeit, oxidativem Stress, Zellmorphologie und osteogenen Reaktionen von MC3T3-E1-Osteoblasten nach Co-Kultur und damit zur Aufdeckung der Osteoinduktivität von TiO₂ und ZrO₂ NP-Behandlung.

Materialien und Methoden

Materialvorbereitung und Charakterisierung

TiO₂ NPs (CAS-Nummer 637262) und ZrO₂ NPs (CAS-Nummer 544760) wurden von Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bezogen und durch Transmissionselektronenmikroskop (TEM, MFP-3D-S, Asylum Research, Santa Barbara, CA, USA) charakterisiert. , Zetapotential und dynamische Lichtstreuung (DLS) Partikelgrößenanalysemessungen (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK). Die NPs wurden für die TEM-Detektion in Alkohol dispergiert, was die Morphologie und Partikelgröße der NPs deutlicher zeigen könnte. Darüber hinaus wurde die aggregierte Größe der Partikel über DLS erfasst, wobei vollständiges Kulturmedium verwendet wurde, um die in der Zellkultur aufgebrachten Partikelmerkmale in Übereinstimmung zu bringen. Vor der Zellbehandlung wurde die Stammlösung mit dem Ultrasonic Cell Disruption System (Ningbo Xinzhi Biotechnology, China) 30 Minuten lang unter Eiskühlung dispergiert und vor den Zellexperimenten mit vollständigem Kulturmedium auf verschiedene Konzentrationen verdünnt.

3T3-E1-Zellkultur

Die Zelllinie 3T3-E1 (die Zellbank der Shanghai Infrastructure for Public Research and Development of the Chinese Academy of Medical Sciences, Shanghai, China) wurde in minimal essentiellem Medium Alpha (α-MEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .) kultiviert , USA) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Thermo Fisher Scientific, USA) und 1 % Antibiotikum/Antimykotikum (Thermo Fisher Scientific, USA). Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5 % CO₂ . inkubiert in einer zu 95 % befeuchteten Atmosphäre, und das Kulturmedium wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht.

Zellproliferationsassay

Die zelluläre Lebensfähigkeit wurde unter Verwendung des CCK-8-Assays (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto City, Japan) nachgewiesen. Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 5000 Zellen pro Well ausgesät. TiO₂ NPs und ZrO₂ NPs wurden dann in seriellen Konzentrationen von 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 und 150 μg/ml zu den 96-Well-Platten hinzugefügt, gefolgt von einer Inkubation für 24 und 48 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ , begleitet von N -Acetyl-l-Cystein (NAC) oder nicht, die verwendet wurden, um die ROS-Produktion zu hemmen. Die Kontrollgruppe blieb unbehandelt. Anschließend wurde der CCK-8-Test durch Zugabe von 110 μl Nachweisreagenzien in jede Vertiefung durchgeführt, und die Platten mit 96 Vertiefungen wurden dann für weitere 2 h bei 37 °C inkubiert. Um zu verhindern, dass NPs diesen analytischen Assay stören, wurden die zu testenden Reagenzien in den 96-Well-Platten nach 2 h Reaktionszeit auf eine neue 96-Well-Platte übertragen; die abgeschiedenen NPs und Zellen wurden in der Primärplatte belassen. Die optische Dichte (OD) jeder Vertiefung wurde bei einer einzelnen Wellenlänge von 450 nm mit dem Mikroplatten-Lesegerät (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) gemessen. Jede Behandlung wurde in sechs Wiederholungen durchgeführt.

Annexin-V-Apoptose-Analyse durch Durchflusszytometrie

Die Zellen wurden in einer 12-Well-Platte bei einer Dichte von 30.000 Zellen/Well für Konfluenz kultiviert. Nach TiO₂ NP und ZrO₂ NP-Behandlung für 48 h, Zellen wurden mit PBS gewaschen und unter Verwendung von EDTA-freiem Trypsinpuffer gesammelt. Die Zellen wurden mit PBS-Puffer in einer Konzentration von 25.000 Zellen/ml resuspendiert und bei 1.000 × g . zentrifugiert . Dann wurden die Zellen mit FITC Annexin V und PI (Invitrogen™, USA) bei Raumtemperatur ohne Lichteinwirkung gefärbt. Schließlich wurden die Zellen mit 400 μL Bindungspuffer gemischt und sofort durch Durchflusszytometrie (BD FACSAria III, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) analysiert.

ROS-Generierungsanalyse

Die Bildung von intrazellulärem ROS wurde mit dem Reactive Oxygen Species Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China) bestimmt. Kurz gesagt, nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen in einer 6-Well-Platte mit 20.000 Zellen/Well in 2 ml Kulturmedium ausgesät und mit TiO₂ . behandelt NPs und ZrO₂ NPs in einer Konzentration von 0, 10, 50 und 100 μg/ml für 48 h, begleitet von NAC oder nicht. Nach Behandlung mit TiO₂ NPs und ZrO₂ NPs, Zellen wurden gesammelt und mit 10 μM DCFH-DA für 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO₂ . inkubiert . Die Fluoreszenzintensitäten wurden auf einem BD FACSAria III (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) analysiert.

Konfokale Mikroskopie

Da ein großer Teil der Zellen in den Apoptosestatus übergegangen ist, haben wir 24 h als Zeitpunkt gewählt, um die Veränderungen der Zytoskelettstruktur der Zellen in unserer Studie zu beobachten. 3T3-E1-Zellen wurden auf Deckgläsern ausgesät und in Gegenwart von TiO₂ . kultiviert NPs und ZrO₂ NPs für 24 Stunden. Die Zellen wurden unmittelbar nach der Behandlung mit PBS-Puffer dreimal gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 0,1% Triton X-100 permeabilisiert und mit PBS, das 5% BSA enthielt, blockiert. Dann wurden die Zellen für α-Tubulin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, 1:4000) bei 4 °C über Nacht inkubiert und mit dem FITC-gebundenen Sekundärantikörper bei 37 °C für 1 h am nächsten Tag beladen dreimal mit PBS waschen. Folglich wurde das Zytoskelett mit Rhodamin-Phalloidin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, 1:1000) für 1 h im Dunkeln gefärbt, und die Kerne wurden mit Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) für 20 min gefärbt. Die Deckgläser wurden mit einem konfokalen Mikroskop FV10i (Olympus, Tokio, Japan) untersucht.

Erkennung der Mineralisierungsinduktion

3T3-E1-Zellen wurden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 15.000 Zellen/Well ausgesät. Die Zellen wurden mit TiO₂ . behandelt NPs und ZrO₂ NPs in Konzentrationen von 10 und 100 μg/ml und das Kulturmedium mit den Nanomaterialien wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht; die Zellen wurden vorsichtig über PBS gewaschen, um die restlichen Nanomaterialien vor jedem Wechsel des Kulturmediums zu entfernen. Nach 7, 14 und 21 Tagen Kultivierung in Gegenwart von TiO₂ NPs und ZrO₂ NPs wurden die Zellen mit Alizarinrot S gefärbt. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd bei 4 °C 30 Minuten lang fixiert und mit Alizarinrot S-Lösung (40 mM, pH 4,1) weitere 20 Minuten bei Umgebungstemperatur gefärbt. Nach dreimaligem Waschen mit destilliertem Wasser wurden mineralisierte Knötchen mit einem Lichtmikroskop (Olympus, Japan) beobachtet.

RNA-Extraktion und RT-PCR

Gesamt-RNA wurde über TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extrahiert. Dann wurde die RNA-Konzentration unter Verwendung eines Ultraviolett-Spektrophotometers bewertet. Die isolierte RNA wurde unter Verwendung eines RT-Reagenzien-Kits (TaKaRa Bio, Dalian, China) in cDNA revers transkribiert. Real-time PCR wurde unter Verwendung von SYBR green Reagenz (TaKaRa Bio, Dalian, China) durchgeführt. Osteogenese-bezogene Gene wurden nachgewiesen, darunter Runt-related Transkriptionsfaktor 2 (RUNX2), Kollagen 1α1 (Col1α1), alkalische Phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN), Osteocalcin (OC) und Knochen-Sialoprotein (BSP). Die Daten wurden mit dem 2^−ΔΔ . analysiert CT-Methode. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. Alle Daten wurden durch den ANOVA-Test statistisch analysiert. Der Varianzhomogenitätstest wurde durchgeführt, und Bonferroni- und Dunnett-T3-Test wurden verwendet, wenn eine gleiche Varianz angenommen wurde bzw. wenn keine Homogenität vorlag. p ein Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Charakterisierung des TiO₂ und ZrO₂ NPs

Wir haben zuerst das TiO₂ . charakterisiert NP und ZrO₂ NP-Pulver mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und dynamischer Lichtstreuung (DLS) (Abb. 1a, b, Tabelle 2). Die TEM- und SEM-Bilder zeigten die Partikelformen und -größen. Das TiO₂ NPs waren kleine stäbchenförmige Kugeln mit einer durchschnittlichen Größe von 25,4 ± 2,8 nm. Das ZrO₂ NPs waren kleine stäbchenförmige Kugeln mit einer durchschnittlichen Größe von 31,9 ± 1,9 nm. Um die Größe von TiO₂ . zu messen NPs und ZrO₂ NPs in Lösung, DLS wurde verwendet und die Partikel von TiO₂ NPs und ZrO₂ Die NPs dehnten sich auf 81,2 nm bzw. 93,1 nm aus, was auf einen Agglomerationseffekt hinwies. Die Zetapotentiale von TiO₂ NPs und ZrO₂ Die NPs betrugen 32,9 ± 5,4 mV bzw. 42,4 ± 7,4 mV.

Charakterisierungen des TiO₂ und ZrO₂ NPs. TiO₂ (a ) und ZrO₂ (b ) NP-Morphologie und -Größe wurden mit TEM nachgewiesen. (c ) Die Co-Kultur-Situation von 3T3-Zellen und Nanomaterialien wurde nach TiO₂ . beobachtet und ZrO₂ NP-Behandlungskonzentrationen von 10, 50 und 100 μg/ml. (d ) Die TEM-Ergebnisse wurden nach TiO₂ . erhalten und ZrO₂ NP-Behandlung für 1 h

Dann haben wir das Foto von 3T3-Zellen nach TiO₂ . beobachtet NP und ZrO₂ NP-Exposition bei verschiedenen Konzentrationen. Wir fanden heraus, dass sich die NPs gleichmäßig auf den Zellen verteilten bzw. verteilten. Die NPs zeigten eine starke Aggregationsfähigkeit bei hohen Konzentrationen aufgrund eines kleinen Bruchteils von NPs mit beobachtetem Mikromaßstab, während eine große Masse von NPs im Nanomaßstab klein war und wahrscheinlich in Zellen transloziert, die schwer zu erkennen waren (Abb. 1c). Darüber hinaus TEM-Ergebnisse von Zellen nach TiO₂ und ZrO₂ NP-Behandlung für 1 h wurde erhalten; unsere Daten zeigten, dass NPs in zelluläre Vesikel transloziert werden können. Inzwischen werden auch einige Organellenschäden beobachtet, zum Beispiel mitochondriale Schwellung und Vakuolenbildung.

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte toxische Effekte in 3T3-E1-Zellen

Wir haben die Lebensfähigkeit der Zellen nach TiO₂ . untersucht NP und ZrO₂ NP-Behandlung in Reihenkonzentrationen (10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 μg/ml). Für TiO₂ NPs (Abb. 2a), nach 24 Stunden Inkubation fanden wir, dass TiO₂ NPs waren bei niedrigeren Dosen (≤ 20 μg/ml) nicht toxisch, während bei höheren Konzentrationen (> 20 μg/ml) eine deutliche Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet wurde (p < 0,001). Eine dramatischere Abnahme der Zelllebensfähigkeit in der 20 μg/ml-Behandlungsgruppe wurde nach 48 Stunden Inkubation beobachtet; TiO₂ NPs bei einer Konzentration von 20 μg/ml induzierten eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit (p < 0,01). Darüber hinaus höhere Dosen von TiO₂ NPs (> 20 μg/ml) zeigten eine signifikante Abnahme der Zellviabilität nach 48 h (p < 0,001). Die Lebensfähigkeit der Zellen blieb jedoch stabil, wenn sie mit 10 μg/ml TiO₂ . behandelt wurde NPs für 48 Stunden. Außerdem gilt für ZrO₂ NPs (Abb. 2b), ähnliche Ergebnisse wurden im Vergleich zu TiO₂ . beobachtet NPs; höhere toxische Wirkungen wurden bei einer Konzentration von 150 μg/ml für 48 h beobachtet, wobei die Lebensfähigkeit der Zellen unter 50 % absinkte. Diese Ergebnisse zeigten, dass TiO₂ und ZrO₂ NPs waren bei niedrigeren Dosen biokompatibel. Diese beiden Nanomaterialien zeigten jedoch bei hohen toxischen Konzentrationen eine leichte Zytotoxizität.

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte Abnahme der Zelllebensfähigkeit in 3T3-E1-Zellen. 3T3-E1-Zellen wurden mit TiO₂ . behandelt (a ) und ZrO₂ (b ) NPs in Konzentrationen von 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 und 150 μg/ml für 24 und 48 h, und dann wurde die Lebensfähigkeit der Zellen über den CCK-8-Assay nachgewiesen. In der Zwischenzeit wurden die Veränderungen der Zelllebensfähigkeit nach der NAC-Behandlung festgestellt, die intrazelluläres ROS eliminieren konnte. Die Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± SEM. *p <0,05; **p <0,01; ***p < 0,001, verglichen mit der Kontrolle

NAC-Hemmwirkung auf das TiO₂ und ZrO₂ NPs-induzierte Zytotoxizität

Wir haben dann die Hemmwirkung von NAC entdeckt, das ein ROS-Fänger ist. Die Ergebnisse zeigten, dass NAC möglicherweise TiO₂ . hemmt (Abb. 2a) und ZrO₂ NPs (Abb. 2b) induzierten die Lebensfähigkeit der Zellen nach 24 Stunden und 48 Stunden Behandlung. Nach der NAC-Hemmung wurde die Lebensfähigkeit der Zellen bei allen Konzentrationen von TiO₂ . 24 Stunden lang aufrechterhalten und ZrO₂ NP-Behandlung mit Ausnahme der höchsten Konzentration (150 μg/ml). Obwohl die Hemmwirkung bei Zellen, die mit hohen Konzentrationen von TiO₂ . behandelt wurden, leicht verringert war (100 und 150 μg/ml) und ZrO₂ NPs (80, 100 und 150 μg/ml) zum Zeitpunkt von 48 Stunden wurden keine starken Veränderungen der Zellviabilität bei Konzentrationen unter 80 μg/ml beobachtet, wobei die Zellviabilität signifikant höher war als bei denen ohne NAC.

TiO₂ und ZrO₂ NPs-induzierte ROS-Erzeugung in 3T3-E1-Zellen

Wir haben außerdem die ROS-Erzeugung nach TiO₂ . nachgewiesen und ZrO₂ NPs-Exposition in 3T3-E1-Zellen (Abb. 3). Unsere Ergebnisse zeigten, dass TiO₂ und ZrO₂ NPs induzierten nach 24 h eine ROS-Erzeugung, die bei einer Konzentration von 100 μg/ml am signifikantesten war. Es gab keine signifikante ROS-Erzeugung für TiO₂ NPs in einer Konzentration von 10 μg/ml, während ZrO₂ NPs induzierten bei der gleichen Konzentration eine starke ROS-Erzeugung. Unterdessen könnte NAC TiO₂ . signifikant hemmen und ZrO₂ NP-induzierte ROS-Erzeugung in 3T3-E1-Zellen bei allen Konzentrationen.

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte ROS-Erzeugung in 3T3-E1-Zellen. 3T3-E1-Zellen wurden mit TiO₂ . behandelt und ZrO₂ NPs in verschiedenen Konzentrationen für 48 h und NAC (10 mM) wurden gleichzeitig inkubiert, und dann wurden die ROS-Spiegel in den 3T3-E1-Zellen nachgewiesen. Die Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± SEM. *p <0,05; **p <0,01; ***p < 0,001, verglichen mit der Kontrolle

TiO₂ und ZrO₂ NPs-induzierte Apoptose und Nekrose in 3T3-E1-Zellen

Zellapoptose und -nekrose wurden nach verschiedenen Konzentrationen von TiO₂ . nachgewiesen und ZrO₂ NP-Exposition nach 48 h (Abb. 4). Die im dritten Quadranten lokalisierten roten Punkte repräsentierten normale Zellen, während die im ersten und vierten Quadranten lokalisierten roten Punkte die frühen apoptotischen Zellen bzw. spätapoptotischen oder nekrotischen Zellen repräsentierten. Interessanterweise zeigten unsere Ergebnisse, dass TiO₂ und ZrO₂ NPs könnten konzentrations- und zeitabhängig Apoptose induzieren. Nach dem TiO₂ NP-Exposition für 48 h, bei Konzentrationen von 10 μg/ml wurde keine signifikante Zellapoptose nachgewiesen; bei Konzentrationen von 50 und 100 μg/ml erreichte der Prozentsatz spätapoptotischer oder nekrotischer Zellen jedoch hohe Werte. Nach dem ZrO₂ NP-Exposition für 48 h fanden wir auch keine Zellapoptose bei einer Konzentration von 10 μg/ml, aber der Prozentsatz spätapoptotischer oder nekrotischer Zellen betrug 43,7 % bei der 50 μg/ml-Gruppe. Interessanterweise wurde eine signifikante frühe Apoptose (34,1 %) bei einer Konzentration von 100 μg/ml nach 48 Stunden Behandlung beobachtet. Wir fanden heraus, dass die frühen Apoptosespiegel von TiO₂ NPs waren signifikant höher als ZrO₂ NPs; die späten apoptotischen oder nekrotischen Ebenen waren jedoch invers.

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte Apoptose in 3T3-E1-Zellen. a Nachdem die 3T3-E1-Zellen mit dem TiO₂ . behandelt wurden und ZrO₂ NPs in verschiedenen Konzentrationen für 48 h wurden die Niveaus der Zellapoptose nachgewiesen. b Die apoptotischen Spiegel, einschließlich der Spiegel der frühen Apoptose und der späten Apoptose, wurden berechnet, und dann führten die Daten die Statistik durch. Die Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± SEM. *p <0,05; **p <0,01; ***p < 0,001, verglichen mit der Kontrolle

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte morphologische Veränderungen in 3T3-E1-Zellen

Untersuchung der morphologischen Veränderungen von 3T3-E1-Zellen nach Exposition gegenüber TiO₂ und ZrO₂ NPs führten wir eine Fluoreszenzfärbung gefolgt von einer konfokalen Mikroskopie durch (Abb. 5 und 6). Im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen gab es nach 10 μg/ml TiO₂ . keine morphologische Veränderung und ZrO₂ NP-Behandlung nach 24 h, während die Zellen nach 100 μg/ml TiO₂ . rund und kleiner wurden und ZrO₂ NP-Behandlung. Interessanterweise wurde nach 50 μg/ml TiO₂ . eine leichte Abnahme der Zellfläche beobachtet und ZrO₂ NP-Behandlung, wobei TiO₂ zeigte eine stärkere Abnahme der Zellfläche. Konsequenterweise bestätigten quantitative Ergebnisse eine signifikante Abnahme der Zellfläche nach 100 μg/ml TiO₂ und ZrO₂ NP-Behandlung (Abb. 5).

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte Zellbereichsänderungen in 3T3-E1-Zellen. Nachdem die 3T3-E1-Zellen mit dem TiO₂ . behandelt wurden (a ) und ZrO₂ (b ) NPs in Konzentrationen von 10 und 100 μg/ml für 24 h, die Zellen wurden mit Tubulin (grün), Aktin (rot) und Hoechst 33342 (blau) beladen. Die Zellmorphologie wurde anhand der Veränderungen des Aktin- (rot) und Tubulinsystems (grün) beobachtet und die Veränderungen der Zellflächenverteilung berechnet

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte Zytoskelettveränderungen in 3T3-Zellen. Nachdem die 3T3-E1-Zellen mit dem TiO₂ . behandelt wurden (a ) und ZrO₂ (b ) NPs bei Konzentrationen von 10 und 100 μg/ml für 24 h, die Veränderungen des Zytoskeletts wurden anhand der Veränderungen des Aktin- (rot) und des Tubulinsystems (grün) bewertet

Wir haben die Veränderungen des Zytoskeletts sowohl in den Aktinfilamenten als auch in den Mikrotubuli weiter untersucht (Abb. 6). Ebenso wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und 10 μg/ml TiO₂ . gezeigt und ZrO₂ NP-Behandlung und Zellen in beiden Gruppen zeigten eindeutige Strukturen der Aktinfilamente und des Mikrotubulussystems. Im Gegensatz dazu 100 μg/ml ZrO₂ Die NP-Behandlung induzierte eine Schrumpfung von 3T3-E1-Zellen, zusammen mit Pyknose-ähnlichen Kernen und kondensierten unklaren Aktinfilamenten und Mikrotubuli-Strukturen. Für TiO₂ NPs, so viele Aktinpunkte wurden beobachtet und die Aktinfilamente an der Zellmembran waren neblig und rau. Für ZrO₂ NPs, eine stärkere Zerstörung des Zytoskeletts wurde festgestellt und die Aktin- und Mikrotubulusstruktur waren rau und defekt.

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte Mineralisierung in 3T3-Zellen

Als nächstes haben wir den Mineralisierungsstatus von 3T3-Zellen durch Alizarinrot-Färbung festgestellt und die Bildung von mineralisierten Knötchen unter dem Lichtmikroskop beobachtet (Abb. 7). Die Zellen wurden nach osteogener Induktion 7, 14 und 21 Tage lang in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von TiO₂ . gefärbt und ZrO₂ NPs. Wir haben festgestellt, dass nach 14 und 21 Tagen Induktion mineralisierte Knötchen sichtbar wurden. Es gab keinen signifikanten Unterschied bei der Mineralisierung nach 14 und 21 Tagen Induktion zwischen der Kontrollgruppe und TiO₂ und ZrO₂ NP-Behandlung mit 10 μg/ml. Nach TiO₂ . wurde jedoch wahrscheinlich eine Abnahme der Mineralisierung beobachtet und ZrO₂ NP-Behandlung mit 100 μg/ml aufgrund des mineralisierten Knötchens, das kleiner und verschwommen wurde.

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte Mineralisierungseffekte in 3T3-Zellen. Nachdem die 3T3-E1-Zellen mit einer mineralisierten Lösung für 7 Tage, 14 Tage und 21 Tage differenziert wurden, begleitet von TiO₂ (a ) und ZrO₂ NPs (b ) in verschiedenen Konzentrationen. Die Alizarinrot-Färbung wurde verwendet, um das mineralisierte Knötchen (schwarzer Pfeil) zu erkennen

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte Expression von Osteogenese-bezogenen Genen in 3T3-Zellen

Um den Mechanismus von TiO₂ . zu untersuchen und ZrO₂ NP-induzierte Osteogenese in 3T3-Zellen, wir haben die Menge an Osteogenese-bezogenen Genen in 3T3-Zellen nach TiO₂ . nachgewiesen und ZrO₂ NP-Behandlung, einschließlich Gene, die vorzugsweise während der frühen (Runx2 , Col1α1 , und Alpen ) und spät (Opn , Ocn , und Bsp ) Phasen der Osteogenese (Abb. 8). Wir haben festgestellt, dass 10 μg/ml TiO₂ und ZrO₂ NPs induzierten das höchste Expressionsniveau von Runx2 nach 3 Tagen der Behandlung, während am Tag 7 Runx nach ZrO₂ . auf das niedrigste Niveau gesunken NP-Behandlung mit 100 μg/ml. Col1α1 erhöht nach 10 μg/ml TiO₂ und ZrO₂ NP-Behandlung sowohl an Tag 3 als auch an Tag 7, während Zellen mit 100 μg/ml TiO₂ . behandelt wurden und ZrO₂ NPs, Col1α1 zuerst an Tag 3 signifikant hochreguliert, aber nach 7 Tagen dramatisch abgenommen. Wir haben auch einen signifikanten Rückgang von Alp . festgestellt Ausdruck nach TiO₂ und ZrO₂ NP-Behandlung mit 100 μg/ml für 3 Tage.

TiO₂ und ZrO₂ NP-induzierte Osteogenese-bezogene Genveränderungen in 3T3-Zellen. Nach der Differenzierung der 3T3-E1-Zellen mit mineralisierter Lösung für 3, 7, 14 und 21 Tage, begleitet von TiO₂ und ZrO₂ NPs in verschiedenen Konzentrationen. Die osteogenesebedingten Genveränderungen wurden mittels RT-PCR nachgewiesen. Die Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. *p <0,05; **p <0,01; ***p < 0,001, verglichen mit der Kontrolle

Bei Genen, die in der späten Phase der osteogenen Induktion hochreguliert werden, sind die Expressionsspiegel von Opn , Ocn , und Bsp signifikant erhöht nach 10 μg/ml TiO₂ und ZrO₂ NP-Behandlung für 14 Tage und Opn an Tag 21 kontinuierlich auf ein höheres Niveau hochreguliert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass im Vergleich zu Ocn und Bsp , Opn war ein Marker von TiO₂ . im späteren Stadium und ZrO₂ NP-induzierte Osteogenese. Interessanterweise 100 μg/ml TiO₂ und ZrO₂ NPs konnten die Expression von Opn . nicht verbessern , Ocn , oder Bsp am Tag 14; außerdem zeigten diese Gene am 21. Tag eine signifikante Herunterregulierung.

Diskussion

ZrO₂ Nanopartikel waren wichtige Komponenten in feuerfesten Materialien, Keramik und biomedizinischen Geräten, einschließlich Implantaten, Gelenkendoprothesen und Dentalmaterialien. Bisher TiO₂ NPs als eine der anderen NPs mit ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften haben sich viele Studien auf ihre toxikologischen Daten konzentriert. Sie fanden heraus, dass TiO₂ NPs konnten in Zellen translozieren und zeigten aufgrund unterschiedlicher physikalisch-chemischer Eigenschaften potenzielle Zellschäden [20, 21]. In der Zwischenzeit fehlten die toxikologischen Daten für ZrO2-NPs. In unserer Studie haben wir TiO₂ . betrachtet NPs als Kontrollgruppe und untersuchten die toxikologischen Wirkungen von TiO₂ und ZrO₂ NPs auf 3T3-E1-Zellen. Es ist bekannt, dass physikalisch-chemische Eigenschaften von Nanopartikeln, insbesondere Größe und Morphologie, die biologische Sicherheit wirksam beeinflussen. Einige Studien haben gezeigt, dass nanoskalige Partikel signifikant toxischer sind als mikroskalige Partikel [22, 23]. In den meisten Fällen wurde auch berichtet, dass die Partikelmorphologie die Toxizität beeinflusst [24,25,26]. In unserer Studie haben wir gezeigt, dass TiO₂ und ZrO₂ NPs waren stäbchenförmige Kugeln. Im Vergleich zu früheren Berichten [5, 27, 28] ist unser TiO₂ und ZrO₂ NPs hatten einen relativ schwächeren Agglomerationseffekt in Wasser, wo sich die Partikel auf eine Größe von 81,2 und 93,1 nm vergrößerten, während wir auch einige mikroskalige Materialien im Kulturmedium nach NP-Exposition mit konzentrationsabhängiger Weise beobachten konnten, was den Agglomerationseffekt in dieser Studie sogar bestätigt nach Verwendung der Ultraschall-Dispersionstechnologie. Der Agglomerationseffekt konnte jedoch die NP-Translokation in das Zytoplasma nicht hemmen, da potente NPs in intrazellulären Vesikeln nachgewiesen wurden. Organellen, wie Mitochondrien, waren wahrscheinlich ein Hauptziel.

Wir haben die Lebensfähigkeit von 3T3-E1-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen von TiO₂ . nachgewiesen und ZrO₂ NP-Behandlung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass 10 μg/ml TiO₂ und ZrO₂ NPs is a biosafety concentration for 3T3-E1 cells. The cell viability decreased in time- and concentration-dependent manner, which implied that TiO₂ and ZrO₂ NPs were potentially cytotoxic after longer exposure of higher doses compared with other oxide metal nanoparticles, such as silicon dioxide and ZnO [4, 28, 29]. Moreover, ZrO₂ NPs showed more potent toxic effects than TiO₂ NPs in our study at high toxic concentrations.

Oxidative stress, a byproduct of outpaced ROS generation and decreased antioxidant factors, is known as one crucial factor in nanomaterial-induced cytotoxicity, and it is reported to trigger cell apoptosis through distinct mechanism [30, 31]. Furthermore, Kozelskaya et al. [12] observed that ZrO₂ NPs induced the increase of membrane microviscosity, cell morphology changes, and surface cracks on the red blood cells due to the oxidative stress. In agreement with these studies, we detected the ROS levels in 3T3-E1 cells after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment and found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce significant ROS generation in concentration-dependent manners, and ZrO₂ NPs induced more potent oxidative stress effects. Moreover, the elevated ROS levels could be eliminated by NAC which is a ROS scavenger. These results suggested the important role of ROS in TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cell cytotoxicity.

Apoptosis is a type of cell death which clears the senescent and abnormal cells, so as to sustain the cell biological functions [32]. Some studies have reported that apoptosis was one of the main toxic responses after treating with oxide metal nanomaterials, such as TiO₂ , ZnO, Si, and Ag [33,34,35,36]. In our study, we found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce apoptotic/necrotic body formation in 3T3-E1 cells in time/concentration-dependent manners, which was correlated with the decreased cell viability shown previously. Moreover, we found that when large parts of late apoptotic or necrotic cells were observed after ZrO₂ NP treatment, the cell status for TiO₂ NPs largely was early apoptosis. These phenomena applied that ZrO₂ NPs induced more rapid and potent apoptosis effects. Similarly, other studies also showed that ZrO₂ NPs induced significant apoptotic and necrotic processes in MSTO cells [4, 11].

The cytoskeleton metabolism is a dynamic biological process involving polymerization and depolymerization, which could sustain cell morphology and promote cell function. Some studies have shown that nanomaterials could affect the cell morphology and cytoskeleton system [37,38,39]. We found 3T3-E1 cells became smaller and rounded in the high-dose group of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL), along with decreased cell area due to cytoskeleton disruptions. These findings were also supported by previous reports that ZrO₂ NP treatment could induce cell morphology changes in MSTO cells at higher concentration [4]. Another study showed the disrupted blood cell morphology after ZrO₂ NP treatment [12].

Alizarin red staining is a key indicator of osteogenic responses. In our study, no impact on osteogenic induction has been shown by TiO₂ and ZrO₂ NP treatment (10 μg/mL), except that cells treated with a cytotoxic dose of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL) had a significant decrease of mineralized nodules due to the potential inhibition of osteoinductive properties. In addition, the expression level of osteogenesis-related genes was important biomarkers. Our results showed that lower concentration (10 μg/mL) of TiO₂ and ZrO₂ NPs promoted the expression of osteogenesis-related genes; however, TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations (100 μg/mL) could significantly inhibit gene expression for both early- and late phases of mineralization, indicating that TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations indeed inhibited osteoinductive properties. Other studies also obtained similar results; they claimed that TiO₂ NPs inhibited the osteogenesis of osteoblasts in a size-dependent manner while potentially promoted osteoclastogenic process [33]. Sengstock et al. [40] found that sub-toxic concentrations of Ag NPs and Ag ions could significantly impair the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. More ongoing or newly initiated researches are focused on developing nanoparticles with acceptable biosafety and osteogenic potential to promote osseointegration for in vivo application [18, 41].

Conclusion

In conclusion, our data indicated that ZrO₂ NPs were nanoparticles with good biocompatibility, just like TiO₂ NPs, while they could induce toxic effects at high toxic concentrations on 3T3-E1 cells. ROS played a key role on TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cytotoxicity, including cell viability, apoptosis and necrosis, and changes in cell morphology. Moreover, TiO₂ and ZrO2 NPs at high concentrations showed inhibitory effects on osteogenic differentiation of 3T3-E1 cells. Our findings could provide deep insights into the biocompatibility and potential application of ZrO2 NPs.