Optimierung der Fe3O4-Au-Kern-Schale-Nanopartikel-Aufnahme für gezielte Endozytose in Darmkrebszellen

Zusammenfassung

Magnetit (Fe3O4)-Gold (Au) Kern-Schale-Nanopartikel (NPs) besitzen einzigartige magnetische und optische Eigenschaften. In Kombination mit biologischen Moieties können diese NPs neue Strategien für biomedizinische Anwendungen wie Medikamentenabgabe und Krebs-Targeting bieten. Hier präsentieren wir eine effektive Methode für die kontrollierbare zelluläre Aufnahme von magnetischen Kern-Schale-NP-Systemen in Kombination mit biologischen Moieties. Vimentin, das Strukturprotein, wurde biochemisch bestätigt, die Phagozytose potent zu beeinflussen. Zudem beeinflusst Vimentin die Internalisierung exogener Materialien in Zellen, selbst unter multipler Inhibition biologischer Moieties. In dieser Studie demonstrieren wir die zelluläre Internalisationsleistung von Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs mit Oberflächenmodifikation unter Verwendung einer Kombination biologischer Moieties. Die Photofluoreszenz von Vimentin-markierten NPs blieb unter multiplen Inhibitionstests unbeeinflusst, was darauf hindeutet, dass die NPs minimal durch Nystatin, Dynasore, Cytochalasin D und sogar den Muc1-Antikörper (Ab) beeinflusst wurden. Folglich zeigt dieses Ergebnis, dass der Muc1-Ab spezifische Moleküle ansprechen und spezifische Endozytose kontrollieren kann. Außerdem zeigen wir die Möglichkeit, spezifische Endozytose in Darmkrebszellen zu kontrollieren.

Einleitung

Nanomaterialien haben neue Wege für klinische Diagnostik und Therapeutika eröffnet. Besonders Nanopartikel (NPs) sind eines der wichtigsten Werkzeuge und wurden in Anwendungen wie Biosensoren [1, 2], Diagnostik [3, 4] und gezielten Medikamentenabgabesystemen [5, 6] eingesetzt. Für biomedizinische Anwendungen bestehen NPs allgemein aus organischen Materialien, die das Kernmaterial umgeben [7,8,9]. Die Kernmaterialien, die aus magnetischen Materialien, Halbleitermaterialien oder anderen Materialtypen bestehen, besitzen nützliche physikochemische Eigenschaften, und die äußere organische Oberfläche bietet chemische Stabilität und Funktionalität für die NPs. Für Anwendungen in biologischen Targeting-Systemen sind nicht nur die physikochemischen Eigenschaften, sondern auch die äußere organische Oberfläche, die für das Targeting biofunktionalisiert ist, kritische Parameter. Beispiele für Targeting-Moieties zur Funktionalisierung sind Antikörper oder Liganden, die spezifisch für ein Target sind. Abhängig von den biofunktionalisierten Materialien auf der äußeren Oberfläche werden die Endozytose-Mechanismen der NPs bestimmt. Der Mechanismus, der NPs das Eindringen in Zellen ermöglicht, war Gegenstand vieler aktueller Forschungsarbeiten aufgrund ihrer Bedeutung in nanomedizinischen Anwendungen [10,11,12,13,14,15].

Insbesondere magnetische NPs wurden in vielen spezifischen Targeting-Anwendungen weit verbreitet eingesetzt, einschließlich Zellsortierung [16, 17], MRT [18], DNA-Isolierung [19], Medikamentenabgabe [20], Hyperthermie-Behandlung [21] und Krebs-Targeting [22]. Unter verschiedenen magnetischen NPs wurden Magnetit-Nanokristalle aufgrund ihrer Biokompatibilität und chemischen Stabilität am häufigsten in biomedizinischen Anwendungen verwendet. Obwohl viele Anstrengungen biomedizinischen Anwendungen mit magnetischen NPs gewidmet wurden, gibt es immer noch kritische Probleme wie gute Dispergierbarkeit in wässriger Lösung, Funktionalität und Biokompatibilität. Um diese Probleme zu überwinden, haben viele Studien sich auf die Oberflächenmodifikation von NPs mit verschiedenen Funktionsgruppen (z. B. Carboxyl- und Aminogruppen) konzentriert [23]. Allerdings ist die Anbindung der Funktionsgruppen an die Oberfläche von Magnetit-NPs ein zeitaufwändiger und mühsamer Prozess. Angesichts dieser Tatsache sind Kern-Schale-Typ Au-beschichtete magnetische NPs attraktiv, da die Au-Oberfläche leicht an Biomoleküle und organische Materialien gebunden werden kann.

Besonders die magnetischen Eigenschaften der magnetischen Kern-Au-Schale-NPs ermöglichen magnetische Separation, erhöhen die Auflösung in der MRT-Bildgebung und können für Hyperthermie-Therapie angewendet werden. Zudem sind die überlegenen chemischen Bindungseigenschaften von Gold vorteilhaft für den Aufbau rezeptorvermittelter Abgabesysteme für spezifisches Krebs-Targeting [24,25,26].

In den vergangenen Jahrzehnten haben viele Forscher rezeptorvermittelte Abgabesysteme für Krebs-Targeting berichtet [27,28,29].

Rezeptorvermitteltes Targeting von Krebszellen ist eine Form des aktiven Targetings. Die Wahl des Targets ist der Schlüssel für effektives aktives Targeting, und die Targets müssen auf der extrazellulären Membran überexprimiert sein. Die meisten Forscher haben monoklonale Antikörper für die Krebsbehandlung verwendet, und der therapeutische Effekt konnte erheblich gesteigert werden, wenn monoklonale Antikörpertherapien mit konventioneller Chemotherapie kombiniert wurden [30]. Trotz des Erfolgs der monoklonalen Antikörpertherapie weisen monoklonale Antikörper mehrere Einschränkungen im Krebs-Targeting auf. Ihre große Größe (ca. 150 kDa) ist ein großes Hindernis für die Tumorpenetration [31, 32], und ihre geringe Stabilität und Löslichkeit behindern ihre breite Anwendung [33]. Die inhomogene Ausrichtung ihrer Bindung am Targeting-Träger wird auch als Hindernis für unspezifische Bindung betrachtet. Um Antikörper mit verbesserter Tumorpenetration herzustellen, wurde eine breite Palette von Antikörperformaten entwickelt und getestet [34]. Abgesehen von klassischen Antikörpern ist ein einzigartiges Antikörperformat in Arten der Familie Camelidae vorhanden. Die sogenannten Schwerketten-Antikörper (HCAbs) kommen natürlich im peripheren Blut und in der Milch dieser Arten vor. Die Antigen-bindenden Fragmente solcher HCAbs bestehen aus einer einzelnen Domäne, der Schwerketten-variablen Domäne (VH) des Kameliden-HCAb (VHH). Der rekombinant nach Klonierung und Expression in Bakterien oder Pilzen gewonnene VHH wird als Nanobody bezeichnet. Er hat ein Molekulargewicht von 11–15 kDa und ist der kleinste Antikörper unter allen mAbs [35,36,37]. Nicht nur ihre kleine Größe macht sie potenziell geeignet als Targeting-Sonden gegen Antigene an isolierten Orten, sondern auch ihr leicht modifizierbares terminales Ende ist attraktiv für Anwendungen im Krebs-Targeting.

Die effiziente Abgabe von NPs mit geeignetem Targeting und Internalisierung in Zellen sind ebenfalls wichtige Faktoren im Abgabesystem. Es wurde berichtet, dass Vimentin eine wichtige Rolle als Komponente der Pathogenanheftung und intrazellulären Eintrittspfade spielt. Das Stilllegen der Vimentin-Genexpression inhibiert Phagozytose [38], während gespaltenes Vimentin ein Signal ist, das die Phagozytose signifikant erhöht [39]. Daher ist die Neutralisierung der zellulären Phagozytose-Resistenz, die durch Vimentin auf der Zelloberfläche verursacht wird, wichtig für effiziente Nanopartikel-Abgabe.

In dieser Studie untersuchen wir die Endozytose-Pfade von Nanobody-markierten Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs, modifiziert mit PEG (Polyethylenglycol) Spacern unterschiedlicher Längen. Vimentin, von dem bekannt ist, dass es einen starken Einfluss auf die Phagozytose durch biochemische Experimente [39] hat, wurde als Kontrolle verglichen, und es wurde bestätigt, dass es effektiv auf die zelluläre Internalisierung von NPs wirkt. Daneben wird Muc1, ein Zelloberflächen-Glykoprotein, das in verschiedenen Krebsarten wie Bauchspeicheldrüsen-, Brust-, Lungen- und Magenkrebs überexprimiert ist, als Krebs-Targeting-Biomarker genutzt. Wir bestätigten die effiziente Internalisierung von Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs und die Methoden der kontrollierbaren Targeting zu Krebszellen über den Muc1-Rezeptor-vermittelten Endozytose-Pfad in Kolonzellen.

Materialien und Methoden

Materialien

Gold(III)-acetat (Au(OOCCH3)3, 99,9 %) wurde von Alfa Aesar bezogen. Andere Chemikalien einschließlich Eisen(III)-acetylacetonat (Fe(acac)3, 99,9 %), 1,2-Hexadecandiol (C14H29CH(OH)CH2(OH), 90 %), Poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol) (PEG-PPG-PEG) und Octylether (C8H17OC8H17, 99 %) wurden von Sigma-Aldrich gekauft und unverändert verwendet. Alpha-Pyridyl-2-disulfid-omega-carboxy-succinimidyl-ester-Poly(ethylenglycol) (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K und 10K) wurde von Nanocs gekauft. Natriumbicarbonat, WST-1, Chlorpromazin, Nystatin, Cytochalasin D, Dynasore, Brefeldin A (BFA), Monensin und Trypanblau wurden von Sigma-Aldrich gekauft. Cy3 und Cy7.5 wurden von Lumiprobe gekauft. Anti-Muc1-Ab wurde von Abcam Inc. (Cambridge, MA) gekauft. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium und fötales Kälberserum wurden von Invitrogen Corp. gekauft.

Synthese von Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs

Die Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs wurden via Nanoemulsionsmethode synthetisiert. Der synthetische Prozess für Kern-Schale-NPs besteht aus zwei Schritten: (1) Bildung der Fe3O4-Kern-NPs und (2) Beschichtung der Au-Schale auf den magnetischen NPs. Im ersten Schritt wurden die Fe3O4-NPs aus einer gemischten Lösung von Fe(acac)3 (0,1766 g oder 0,5 mmol), 1,2-Hexadecandiol (0,6468 g oder 2,5 mmol) und Blockcopolymer (Poly(ethylenoxid)-Poly(propylenoxid)-Poly(ethylenoxid); PEO-PPO-PEO) (0,4 ~ 1,2 g) in Octylether hergestellt. Die gemischte Lösung wurde auf 300 °C erhitzt, um den Fe-Vorläufer zu reduzieren. Die Bildung der Fe3O4-Kern-NPs wurde durch Abkühlen der erhitzten Lösung abgeschlossen. Der zweite Prozess wurde kontinuierlich ohne Reinigungsprozess nach der Bildung des magnetischen Kerns durchgeführt. Au-Vorläufer (0,2338 g oder 0,62 mmol) und 1,2-Hexadecandiol (0,88 g, 3,4 mmol) wurden in die Emulsion bestehend aus Fe3O4-NPs gegeben, und die gemischte Lösung wurde auf 230 °C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Emulsion durch Zentrifugation gefällt und die Kern-Schale-NPs separiert.

Konstruktion des rekombinanten Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 Expressionsvektors

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit dem Vorwärtsprimer 5′-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3′ und dem Rückwärtsprimer 5′-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3′ durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und mit dem QIA quick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) gelreinigt. Das gereinigte PCR-Produkt wurde in EcoRI/XhoI-verdautes pET-23a (Novagen, Darmstadt, Deutschland) kloniert. Escherichia coli (E. coli) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) wurde durch Hitzeschock mit dem resultierenden Konstrukt transformiert und auf LB-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande) selektiert.

Expression und Reinigung des rekombinanten Proteins

Zur Expression und Reinigung des rekombinanten Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 Proteins wurden E. coli BL21 Stämme (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) mit pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 transformiert. Bakterien wurden dann in LB-Brühe mit Ampicillin (100 μg/ml) gezüchtet. Die Proteinexpression wurde durch Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande) bei einer Endkonzentration von 0,4 mM für 5 h bei 37 °C induziert. Bakterienpellets wurden in Lysepuffer (50 mM NaH2PO4, pH 8,0; 300 mM NaCl) resuspendiert, gefolgt von 10 min Ultraschallbehandlung auf Eis. Ultraschallbehandelte Lysate wurden 20 min bei 20.000×g bei 4 °C zentrifugiert und Ni-NTA His·Bind Harz (Peptron, Daejeon, Korea) unterzogen. An das Harz gebundene His-markierte Proteine wurden mit Elutionspuffer (50 mM NaH2PO4, pH 8,0; 300 mM NaCl; 150 mM Imidazol) eluiert. Das gereinigte Protein wurde auf 15 % SDS-PAGE-Gel getrennt.

Modifikation der Kern-Schale-Fe3O4-Au-NPs

OPSS-PEG-NHS in verschiedenen Längen (2, 5 und 10 K) wurde in 0,1 M Natriumbicarbonat zur Aktivierung der Thiolgruppen gelöst. Aktiviertes OPSS-PEG-NHS wurde der Lösung der synthetisierten Kern-Schale-Fe3O4-Au-NPs zugesetzt und 12 h bei 4 °C geschüttelt. Die Thiolgruppen des aktivierten OPSS-PEG-NHS wurden kovalent an die Au-Oberfläche der Kern-Schale-NPs gebunden. Dann wurde eine Nanobody-Lösung (0,25 mg/ml) 12 h bei 4 °C zu den PEGylierten Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs gegeben. Die Aminogruppen der zehn Lysin (K) Schwänze am terminalen Ende wurden kovalent an die NHS-Gruppen von OPSS-PEG-NHS bei pH 8,3 gebunden. Cy3 und Cy7.5 wurden an die verbleibenden Aminogruppen des Nanobodys markiert.

Internalisierungskurve

CT26-Zellen wurden mit 5 × 103 Zellen pro Vertiefung in einer klaren Boden 96-Well-Platte ausgesät und 24 h bei 37 °C in 5 % CO2 im Dunkeln in 250 μl Kultivierungsmedium inkubiert. Das Medium wurde entfernt, und 250 μl frisches Kultivierungsmedium mit 50 μg/ml Cy3-markierten Fe3O4-Au-NPs und PEG-Cy3 oder PEG-Nanobody-Cy3-markierten NPs wurden jedem Well zugegeben. Die Zellen wurden für verschiedene Zeiträume (0, 10, 20, 30, 60, 120 und 360 min) weiter inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen, um freie NPs zu entfernen, und die Fluoreszenz jedes Wells wurde mit Trypanblau als membrangeimpermeablem Fluoreszenzquencher mit SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA) gemessen. Jedes Experiment wurde mit gleichen NP-Mengen (50 μg/ml) durchgeführt und dreimal wiederholt [40].

Inhibitionstest

CT26-Zellen wurden mit 5 × 103 Zellen pro Vertiefung in einer klaren Boden 96-Well-Platte ausgesät und 24 h bei 37 °C in 5 % CO2 im Dunkeln in 250 μl Medium inkubiert. Das Medium wurde entfernt und 250 μl frisches Kultivierungsmedium mit entweder 20 μg/ml Chlorpromazin (CPZ), 50 μg/ml Nystatin, 20 μg/ml Cytochalasin D, 25 μg/ml Dynasore, 20 μg/ml BFA, 140 μg/ml Monensin oder 5 μM Anti-Muc1-Ab wurden zugegeben, und die Zellen wurden 1 h inkubiert.

Das Medium wurde erneut entfernt, und 250 μl Kultivierungsmedium mit 50 μg/ml Cy3-markierten Fe3O4-Au-NPs, PEG-Cy3-markierten NPs, PEG-Nanobody-Cy3-markierten NPs oder Vimentin-Cy3-markierten NPs wurde zugegeben.

Nach 1 h bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, um freie NPs zu entfernen, und die Fluoreszenz wurde mit Trypanblau als membrangeimpermeablem Fluoreszenzquencher mit SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA) gemessen. Jedes Experiment wurde mit gleichen NP-Mengen (50 μg/ml) durchgeführt und viermal wiederholt.

Ergebnisse und Diskussion

Die Kern-Schale-NPs wurden nach einer veröffentlichten Methode [16, 17] synthetisiert. Transmissionelektronenmikroskopie (TEM) Beobachtungen in Abb. 1a, b zeigen, dass die Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs kugelförmig mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 13,5 nm und enger Größenverteilung waren.

Die Zunahme von ~ 8,5 nm des Kern-NPs (Fe3O4) resultiert aus der Beschichtung einer ~ 2,5-nm-dicken Au-Schale auf der Kern-Oberfläche, was zu einem Kern-Schale-NP führt. Ein hochauflösendes TEM-Bild mit schneller Fourier-Transformation (FFT) Analyse des Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs ist in Supplementary Information Fig. S1 enthalten.

Das in organischem Lösungsmittel hergestellte Produkt wurde mittels magnetischer Separation gereinigt und in Wasser überführt.

Die Kern-Schale-NPs waren gut dispergiert und stabil in Wasser ohne jegliche Oberflächenmodifikation, dank der auf den NPs vorhandenen residualen Block-Copolymere.

Abbildung 1c und d zeigen die NPs in wässriger Lösung vor und nach Anlegen eines externen Magnetfeldes. Unter einem externen Magnetfeld änderten sich die Kern-Schale-NPs rasch von einer homogenen Dispersion (Abb. 1c) zu einer klaren und transparenten Lösung (Abb. 1d).

Der Absorptionsband der Kern-Schale-NPs wurde mit UV-Vis-Spektrometrie untersucht. Wie in Abb. 1e gezeigt, erschien ein Absorptionspeak bei ~ 530 nm, was das Vorhandensein von Au auf der Oberfläche der NPs anzeigt (Supplementary Information Fig. S2 enthält das Ergebnis der EDX-Daten für Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs). Da die Probe gereinigt worden war, demonstrierten die optischen Ergebnisse die Bildung der Kern-Schale-Struktur.

Magnetische Hysterese-Schleifen wurden aus Vibrationsprobenmessungen erhalten, um die magnetischen Eigenschaften des Fe3O4-Kerns und der Kern-Schale-NPs zu untersuchen. Beide NPs zeigten superparamagnetisches Verhalten mit einer Koerzitivfeldstärke von nahe 0 Oe bei Raumtemperatur (Abb. 1f).

Wie in früheren Arbeiten berichtet, war die Suszeptibilität der Kern-Schale-NPs höher als die der Magnetit-NPs, was teilweise auf Näheffekte und einzigartige räumliche Konfigurationen zurückzuführen sein könnte [41, 42]. Außerdem betragen die Sättigungsmagnetisierungen der Kern-NPs und der Kern-Schale-NPs ~ 37 emu/g bzw. ~ 21 emu/g bei 10 kOe. Der Unterschied im Ms resultiert aus der Existenz einer nicht-magnetischen Komponente (Au) in den Kern-Schale-NPs.

Das VHH 5-24 K10 Gen wurde in-frame kloniert, um pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 nach PCR-Amplifikation zu produzieren (Abb. 2a). Das rekombinante Protein wurde in E. coli BL21 exprimiert, das mit pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 transformiert wurde, nach Induktion mit IPTG und Reinigung durch Ni-NTA His·Bind Harz. Rekombinantes Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 wurde in E. coli als lösliches 18-kDa-Protein leicht exprimiert. Aus einer 1-L-Kultur erhielten wir 1 ± 0,5 mg gereinigtes rekombinantes Anti-Muc1-VHH 5-24 K10.

Das gereinigte Protein wurde durch 15 % SDS-PAGE-Gel verifiziert. Coomassie-Blau-Färbung des gereinigten Proteins zeigte, dass es > 95 % rein war (Abb. 2b). Die synthetisierten Fe3O4-Au-NPs wurden in drei Schritten modifiziert: PEGylierung, Antikörpermarkierung und Farbstoffmarkierung (Abb. 2c). Nach jedem Modifikationsschritt wurde das Zeta-Potenzial gemessen, um die erfolgreiche Modifikation zu bestätigen. Tabelle 1 zeigt den Effekt der Modifikation auf die entsprechenden Zeta-Potenziale. Das Zeta-Potenzial der nackten Kern-Schale-NPs betrug −19,8 ± 6,68 mV. Die PEGylierung der NPs wurde mit OPSS-PEG-NHS durchgeführt. Um eine Reihe von Nanokomplexen mit unterschiedlichen Größen herzustellen, wurde OPSS-PEG-NHS mit verschiedenen Längen (2 K, 5 K und 10 K) verwendet.

Nach PEGylierung wurden die Zeta-Potenziale reduziert (−44,9 ± 8,19 mV, −40,7 ± 7,88 mV und −39,6 ± 8,74 mV für 2 K, 5 K und 10 K).

Interessanterweise stiegen die Zeta-Potenziale nach Nanobody-Markierung deutlich an (−38,5 ± 5,61 mV, −23,3 ± 8,61 mV und −31,8 ± 7,37 mV für 2 K, 5 K und 10 K).

Nach Farbstoffmarkierung stiegen die Zeta-Potenziale ebenfalls an (−12,5 ± 7,25 mV, −17,7 ± 3,94 mV und −10,6 ± 4,72 mV für 2, 5 und 10 K).

Das Zeta-Potenzial der nackten Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs betrug −19,8 ± 6,68 mV. Nach PEGylierung wurde das Zeta-Potenzial auf nahezu −40 mV reduziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die PEG-Moleküle gut kovalent an die Au-Schale der Kern-Schale-NPs gebunden waren, da PEG-Moleküle negativ geladene N-Hydroxysuccinimid-Funktionsgruppen haben. Gleichzeitig stieg das Zeta-Potenzial nach Farbstoffmarkierung am Nanobody (−38,5 ± 5,61 mV für NP-PEG2K-Nanobody und −12,5 ± 7,25 mV für NP-PEG2K-Nanobody-Farbstoff). Dieses Ergebnis ist plausibel, da der rekombinante Nanobody zehn Lysin-Schwänze am terminalen Ende hat. Jeder Nanobody-Typ wurde durch Zeta-Potenzial-Messung kategorisiert, und um die Antikörperbindung am Nanobody zu bestimmen, maßen wir die Fluoreszenz für jeden Nanobody-Typ.

Wie in Abb. 3 gezeigt, bestätigten wir, dass alle Arten von Nanopartikeln und Nanobodies eine gute zelluläre Aufnahme und Internalisierung ohne Inhibitor-Restriktionen aufweisen. Eine zelluläre Internalisierungskurve wurde aus Zellen erhalten, die in Gegenwart von 50 μg/ml Cy3-markierten Fe3O4-Au-NPs, PEG-Cy3-markierten NPs und PEG-Nanobody-Cy3-markierten NPs für verschiedene Zeiträume (zwischen 0 und 360 min) inkubiert wurden, nach Entfernen des Mediums, Auswaschen freier NPs und schließlich Messen der Gesamtfluoreszenz der Zellen mit Trypanblau (Abb. 3).

Laut dem Ergebnis der Fluoreszenzintensitätsmessung können wir bestimmen, dass die NPs innerhalb von 1 h in den Zellen internalisiert wurden (Abb. 3a). Die Fluoreszenzintensität der NPs erreichte innerhalb von 1 h ein Maximum, und die Fluoreszenzintensität nahm nach Erreichen eines stationären Zustands allmählich ab. Obwohl es einen leichten Zeitunterschied je nach Vorhandensein von Ab gibt, war die Fluoreszenzintensität pro Kultivierungszeit nicht signifikant vom Ergebnis der nackten NPs verschieden (Abb. 3b). Wie in Abb. 3c gezeigt, wurde bestätigt, dass der Effekt von Ab, durch Verwendung heterogener Ab von Muc1 und Vimentin, vernachlässigbar war bei der zellulären Aufnahme und Internalisierung von NPs.

Mit WST-1-Assay wurde die Vitalität (%) von CT26-Muzinzellen in Abhängigkeit von Konzentration und Oberflächenmodifikation der Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs nach verschiedenen Expositionszeiten geschätzt (Abb. 4a, b). Die Vitalität der CT26-Zellen zeigte keine signifikanten Unterschiede nach 24 h und 48 h Exposition, weder bei variierenden Dosen noch nach Oberflächenmodifikation der NPs. Die Zellvitalität war sowohl bei nackten Fe3O4-Au-NPs (Abb. 4a) als auch bei oberflächenmodifizierten NPs (Abb. 4b) größer als 90 %.

Abbildung 5 zeigt, dass NPs in CT26-Muzinzellen über verschiedene Endozytose-Pfade (clathrin-vermittelt, caveolae-vermittelt und Phagozytose/Makropinozytose-Pfade) eingingen. Interessanterweise zeigt Abb. 5b, dass Anti-Muc1-Ab auch hauptsächlich die Endozytose von PEG-Nanobody-Cy3-markierten NPs beeinflusste. Um den Pfad der NP-Internalisierung zu verstehen, versuchten wir, Endozytose-Pfade mit spezifischen chemischen Inhibitoren zu inhibieren (Abb. 5). Die Endozytose-Pfade sind bekanntlich in drei Typen unterteilt: clathrin-vermittelt, caveolae-vermittelt und Makropinozytose/Phagozytose.

In dieser Studie wurden Inhibitoren als erster Ansatz verwendet, um die Internalisierung von Nanobody-markierten NPs zu untersuchen. CPZ (Clathrin-vermittelter Endozytose-Inhibitor), Nystatin (Caveolae-vermittelter Endozytose-Inhibitor), Dynasore (Dynamin-Inhibitor), Cytochalasin D (Phagozytose/Makropinozytose-Inhibitor), BFA (Golgi-Apparat-Zerstörer), Monensin (Lysosom-Inhibitor) oder Anti-Muc1-Ab (Rezeptor-/Transporter-spezifischer Kompetitor) wurden 1 h mit Zellen inkubiert. CPZ, Nystatin, Dynasore und Cytochalasin D beeinflussten die Endozytose von NPs (Abb. 5a).

Das Targeting-Moiety ist der Schlüssel zum Erfolg des Krebs-Targetings, was in der Krebstherapie außerordentlich wichtig ist. Für Targeting ist effektive Oberflächenmodifikation sehr wichtig, um therapeutische Effizienz zu steigern und Nebenwirkungen zu begrenzen. Nanobody-markierte Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs wurden erfolgreich aus den synthetisierten NPs und rekombinantem Nanobody hergestellt. Tabelle 1 zeigt deutlich, dass jeder Modifikationsschritt erfolgreich durchgeführt wurde.

Zellvitalität ist eines der wesentlichen Elemente für die biologische Anwendung von Nanomaterialien. Die Zellvitalitäten waren sowohl bei nackten Kern-Schale-NPs als auch bei modifizierten NPs größer als 90 % (Abb. 4a, b). Diese Ergebnisse implizieren, dass nackte Fe3O4-Au-NPs und modifizierte NPs keine signifikanten konzentrations- und modificationsabhängigen Zytotoxizitäten verursachten und dass die modifizierten NPs für biologische Anwendungen geeignet waren.

Die Untersuchungen zur Internalisierungseffizienz und zum Inhibitor-Effekt von NPs liefern wichtige Informationen, um die Mechanismen zu verstehen, durch die NPs in Zellen eindringen. PEGylierte NPs wurden relativ langsam in Zellen internalisiert im Vergleich zu nackten NPs, aber Nanobody-markierte NPs wurden etwas schneller in Zellen internalisiert als nackte NPs (Abb. 3a, b). Da PEGylierung eine bekannte Oberflächenmodifikationsmethode zur Verhinderung der Internalisierung von NPs ist, ist der Internalisierungstrend von PEGylierten NPs leicht erklärbar. Zudem induzierte der Nanobody die Endozytose von NPs. Um die Spezifität des Nanobodys zu überprüfen, bestätigten wir die Internalisierungsrate von Vimentin-Ab-markierten NPs. Interessanterweise förderten Vimentin-Ab-markierte NPs die zelluläre Internalisierung nicht (Abb. 3c).

Diese Ergebnisse zeigen, dass der Nanobody die Internalisierung von Nanomaterialien in CT26-Muzinzellen effektiv induzieren kann und implizieren, dass der Internalisierungstrend durch spezifische Modifikation der äußeren Membran von NPs kontrolliert werden kann. Zusätzlich wurden die Mechanismen der Endozytose von Nanobody-markierten NPs durch Inhibitionstests und Konfokalmikroskopie-Bildgebung deutlich gezeigt. Die Photofluoreszenz sowohl der Nanobody-markierten NPs als auch der nicht-markierten NPs zeigte ähnliche abnehmende Werte, wenn sie mit CPZ, Nystatin oder Dynasore kultiviert wurden (Abb. 5a, b). CPZ, Nystatin und Dynasore spielen eine Rolle bei der Inhibition von clathrin-vermittelter Endozytose, caveolae-vermittelter Endozytose und Dynamin, einer großen GTPase, die an der Knospung und Abtrennung naszenter Vesikel von Elternmembranen beteiligt ist. Dadurch sanken die Photofluoreszenzwerte in beiden Fällen rapide ab, da Dynamin eng mit der Produktion von Vesikeln für clathrin-vermittelte und caveolae-vermittelte Endozytose verbunden ist. Wie in Abb. 5a gezeigt, zeigten sowohl nicht-markierte (Abb. 5a) als auch Nanobody-markierte NPs (Abb. 5b) rapide Abnahmen der Photofluoreszenz.

Insbesondere zeigten Nanobody-markierte NPs signifikant niedrigere Photofluoreszenzwerte in CPZ, Nystatin und Dynasore. Zudem bestätigten wir, dass nicht-markierte NPs stärker beeinflusst wurden als Nanobody-markierte NPs, wenn Cytochalasin D angewendet wurde, ein zellpermeables Toxin, das die Polymerisation von Aktinfilamenten für Phagozytose blockiert [43]. Diese Ergebnisse implizieren, dass nicht-markierte NPs über mehrere Mechanismen wie clathrin-vermittelte Endozytose, caveolae-vermittelte Endozytose und Phagozytose internalisiert wurden. Folglich hängt die zelluläre Internalisierung von Nanobody-markierten NPs von clathrin-vermittelter und caveolae-vermittelter Endozytose ab. Außerdem wurde die Menge der zellulären Aufnahme von Nanobody-markierten NPs erheblich reduziert, wenn Zellen mit dem Muc1-Antikörper kultiviert wurden (Abb. 5b). Dieses Ergebnis zeigt, dass der freie Muc1-Antikörper als Kompetitor des Nanobodys auf den modifizierten NPs bei der Anheftung an die CT26-Zellmembran fungiert und dass der Muc1-Antikörper einen wichtigen Teil in der Zellinternalisierung der modifizierten NPs spielt. Merkwürdigerweise zeigten Vimentin-Ab-markierte NPs offensichtliche Unterschiede im Vergleich zu Nanobody-markierten NPs hinsichtlich der Inhibitionsfähigkeit. Die Photofluoreszenz von Vimentin-markierten NPs blieb unter multiplen Inhibitionstests unbeeinflusst, was darauf hindeutet, dass die NPs minimal durch Nystatin, Dynasore, Cytochalasin D und sogar den Muc1-Ab beeinflusst wurden. Dieses Phänomen könnte ein Beweis für die Wirksamkeit von Vimentin sein, das biochemisch bestätigt wurde, die Phagozytose potent zu beeinflussen [39]. Folglich zeigt dieses Ergebnis, dass der Muc1-Ab spezifische Moleküle ansprechen und spezifische Endozytose kontrollieren kann.

Wie in Abb. 6 gezeigt, wurden analoge Ergebnisse erhalten, wenn Zellen mit Cy7.5-markierten nackten Kern-Schale-NPs und PEG-Nanobody-markierten NPs behandelt wurden, was ähnliche zelluläre Aufnahme in beiden Fällen ohne Dynasore-Inhibition anzeigt. Dynasore-Inhibition induzierte deutlich niedrigere zelluläre Internalisierung der PEG-Nanobody-markierten NPs im Vergleich zu nackten NPs (Abb. 6b, untere Reihe). Diese Ergebnisse implizieren, dass es zwei Endozytose-Mechanismen gibt: unspezifische Endozytose von nackten NPs und eingeschränkte Endozytose von Nanobody-markierten NPs über das Dynamin-Molekül. Sobald der Nanobody an die äußere Zellmembran bindet, könnten Nanobody-markierte NPs leicht durch die Zellmembran passieren, wegen der gleichzeitigen Aktivierung der clathrin- und caveolae-vermittelten Mechanismen. Folglich können wir annehmen, dass die Hauptmechanismen sowohl clathrin- als auch caveolae-vermittelte Endozytose für die Internalisierung von Nanobody-markierten NPs in CT26-Muzinzellen sind.

Schlussfolgerungen

Nanomaterialien für Krebs-Targeting und kontrollierbare Einbringung exogener Materialien wie Medikamente, Gene und Peptide sind kritische Fortschritte in biomedizinischen Anwendungen. Diese vertrauten, aber kreativen Konzepte können Strategien für neue therapeutische Methoden bieten. In dieser Arbeit demonstrierten wir die verbesserte zelluläre Aufnahme von Fe3O4-Au-Kern-Schale-NPs nach PEGylierung mit dem Muc1-Antikörper. Die Hauptendozytose-Mechanismen von Nanobody-markierten NPs wurden demonstriert, was die Möglichkeit kontrollierbarer spezifischer Endozytose in Darmkrebszellen zeigt. Diese Erkenntnisse geben Einblicke in das Targeting zwischen Nanobody-markierten NPs und Darmkrebszellen, um das Design hocheffizienter Targeting-Träger zu unterstützen.