Bewertung der zellulären Aufnahmeeffizienz anhand mehrerer Inhibitoren von Fe3O4-Au-Kern-Schale-Nanopartikeln:Möglichkeit zur Kontrolle der spezifischen Endozytose in Darmkrebszellen

Einführung

Nanomaterialien haben neue Wege für die klinische Diagnostik und Therapie eröffnet. Insbesondere Nanopartikel (NPs) sind eines der wichtigsten Werkzeuge und wurden in Anwendungen wie Biosensoren [1, 2], Diagnostik [3, 4] und zielgerichteten Wirkstoffabgabesystemen [5, 6] eingesetzt. Für biomedizinische Anwendungen bestehen NPs im Allgemeinen aus organischen Materialien, die die Oberfläche auf Kernmaterialien umgeben [7,8,9]. Die Kernmaterialien, die aus magnetischen Materialien, Halbleitermaterialien oder anderen Materialtypen bestehen, haben nützliche physikalisch-chemische Eigenschaften, und die äußere organische Oberfläche verleiht den NPs chemische Stabilität und Funktionalität. Für Anwendungen in biologischen Targeting-Systemen sind nicht nur die physikalisch-chemischen Eigenschaften, sondern auch die äußere organische Oberfläche, die zum Targeting biofunktionalisiert sind, kritische Parameter. Beispiele für Targeting-Einheiten zur Funktionalisierung sind Antikörper oder Liganden, die spezifisch für ein Target sind. Abhängig von den biofunktionalisierten Materialien auf der äußeren Oberfläche werden die Endozytosemechanismen von NPs bestimmt. Der Mechanismus, der es NPs ermöglicht, in Zellen einzudringen, war aufgrund ihrer Bedeutung für nanomedizinische Anwendungen Gegenstand vieler neuerer Forschungsarbeiten [10,11,12,13,14,15].

Insbesondere magnetische NPs wurden in vielen spezifischen Zielortungsanwendungen eingesetzt, darunter Zellsortierung [16, 17], MRT [18], DNA-Isolierung [19], Wirkstoffabgabe [20], Hyperthermiebehandlung [21] und Krebs zielgerichtet [22]. Unter verschiedenen magnetischen Nanopartikeln werden Magnetit-Nanokristalle aufgrund ihrer Biokompatibilität und chemischen Stabilität am häufigsten in biomedizinischen Anwendungen eingesetzt. Obwohl viele Anstrengungen auf biomedizinische Anwendungen mit magnetischen Nanopartikeln gerichtet wurden, gibt es noch einige kritische Punkte wie gute Dispergierbarkeit in wässriger Lösung, Funktionalität und Biokompatibilität. Um diese Probleme zu überwinden, haben sich viele Studien auf die Oberflächenmodifizierung von NPs unter Verwendung einer Vielzahl funktioneller Gruppen (z. B. Carboxyl- und Amingruppen) konzentriert [23]. Die Anbringung der funktionellen Gruppen an die Oberfläche von Magnetit-NPs ist jedoch ein zeit- und arbeitsaufwändiger Prozess. Angesichts dieser Tatsache sind Au-beschichtete magnetische NP vom Kern-Schale-Typ attraktiv, da sich die Au-Oberfläche leicht mit Biomolekülen und organischen Materialien verbinden kann.

Insbesondere die magnetischen Eigenschaften der magnetischen Kern-Au-Schale-NPs ermöglichen die magnetische Trennung, erhöhen die Auflösung bei der MRT-Bildgebung und können für die Hyperthermietherapie verwendet werden. Darüber hinaus sind die hervorragenden chemischen Bindungseigenschaften von Gold für den Aufbau von rezeptorvermittelten Abgabesystemen für die spezifische Krebsbekämpfung von Vorteil [24,25,26].

In den letzten Jahrzehnten haben viele Forscher über rezeptorvermittelte Abgabesysteme für die Krebsbekämpfung berichtet [27,28,29].

Das rezeptorvermittelte Targeting von Krebszellen ist eine Form des aktiven Targetings. Die Wahl des Targets ist der Schlüssel für ein effektives aktives Targeting, und die Targets müssen auf der extrazellulären Membran überexprimiert werden. Die meisten Forscher haben monoklonale Antikörper zur Krebsbehandlung eingesetzt, und der therapeutische Effekt könnte stark gesteigert werden, wenn monoklonale Antikörpertherapien mit konventioneller Chemotherapie kombiniert werden [30]. Trotz des Erfolgs der Therapie mit monoklonalen Antikörpern weisen monoklonale Antikörper mehrere Einschränkungen bei der Krebsbekämpfung auf. Ihre große Größe (ca. 150 kDa) ist ein großes Hindernis für die Tumorpenetration [31, 32] und ihre geringe Stabilität und geringe Löslichkeit behindern ihre breite Anwendung [33]. Die inhomogene Richtung ihrer Anheftung auf dem Targeting-Träger wird auch als Hindernis für eine unspezifische Bindung angesehen. Um Antikörper mit verbesserter Tumorpenetration herzustellen, wurde eine Vielzahl von Antikörperformaten entwickelt und getestet [34]. Abgesehen von klassischen Antikörpern gibt es bei Arten aus der Familie der Camelidae ein einzigartiges Antikörperformat. Die sogenannten Schwerkettenantikörper (HCAbs) kommen natürlicherweise im peripheren Blut und in der Milch dieser Spezies vor. Die Antigen-bindenden Fragmente solcher HCAbs bestehen aus einer einzigen Domäne, der variablen Domäne der schweren Kette (VH) des Kameliden-HCAb (VHH). Das nach Klonierung und Expression in Bakterien oder Pilzen rekombinant gewonnene VHH wird Nanobody genannt. Es hat ein Molekulargewicht von 11–15 kDa und ist der kleinste Antikörper unter allen mAbs [35,36,37]. Nicht nur ihre geringe Größe macht sie potenziell geeignet als Targeting-Sonden gegen Antigene an isolierten Orten, sondern auch ihr leicht modifizierbares terminales Ende ist attraktiv für die Anwendung beim Targeting von Krebs.

Der effiziente Transport von NPs mit geeignetem Targeting und die Internalisierung von Zellen sind ebenfalls wichtige Faktoren im Transportsystem. Es wurde berichtet, dass Vimentin eine wichtige Rolle als Bestandteil der Pathogenanheftung und der intrazellulären Eintrittswege spielt. Das Stummschalten der Vimentin-Genexpression hemmt die Phagozytose [38], während gespaltenes Vimentin ein Signal ist, das die Phagozytose signifikant erhöht [39]. Daher ist die Neutralisierung der durch Vimentin verursachten Zellphagozytoseresistenz auf der Zelloberfläche wichtig für eine effiziente Nanopartikelabgabe.

In dieser Studie untersuchen wir die Endozytosewege von Nanobody-markiertem Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs modifiziert mit PEG (Polyethylenglykol)-Abstandshaltern unterschiedlicher Länge. Vimentin, von dem aus biochemischen Experimenten bekannt ist, dass es eine starke Wirkung auf die Phagozytose hat [39], wurde als Kontrolle verglichen und es wurde bestätigt, dass es effektiv auf die Zellinternalisierung von NPs einwirkt. Außerdem wird Muc1, ein Zelloberflächen-Glykoprotein, das bei verschiedenen Krebsarten, wie Bauchspeicheldrüsen-, Brust-, Lungen- und Magenkrebs, überexprimiert wird, als auf Krebs abzielender Biomarker verwendet. Wir haben die effiziente Internalisierung von Fe₃ . bestätigt O₄ Au-Kern-Schale-NPs und die Methoden des kontrollierbaren Targetings auf Krebszellen über den Muc1-Rezeptor-vermittelten Endozytose-Weg in Dickdarmzellen.

Materialien und Methoden

Materialien

Gold(III)acetat (Au(OOCCH3)3, 99,9%) wurde von Alfa Aesar bezogen. Andere Chemikalien, einschließlich Eisen(III)acetylacetonat (Fe(acac)₃ , 99,9%), 1,2-Hexadecandiol (C14H29CH(OH)CH2(OH), 90%), Poly(ethylenglycol)-Block-Poly(propylenglycol)-Block-Poly(ethylenglycol) (PEG-PPG- PEG) und Octylether (C8H17OC8H17, 99%) wurden von Sigma-Aldrich bezogen und wie erhalten verwendet. Alpha-Pyridyl-2-disulfid-omega-carboxysuccinimidylesterpoly(ethylenglykol) (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K und 10K) wurde von Nanocs bezogen. Natriumbicarbonat, WST-1, Chlorpromazin, Nystatin, Cytochalasin D, Dynasore, Brefeldin A (BFA), Monensin und Trypanblau wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Cy3 und Cy7.5 wurden von Lumiprobe bezogen. Anti-Muc1 Ab wurde von Abcam Inc. (Cambridge, MA) erworben. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium und fötales Rinderserum wurden von Invitrogen Corp. bezogen.

Synthese von Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs

Das Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs wurden über eine Nanoemulsionsmethode synthetisiert. Der Syntheseprozess für Kern-Schale-NPs besteht aus zwei Schritten:(1) Bildung des Fe₃ O₄ Kern-NPs und (2) Beschichtung der Au-Schale auf den magnetischen NPs. Im ersten Schritt wird das Fe₃ O₄ NPs wurden aus einer gemischten Lösung von Fe(acac)₃ . hergestellt (0,1766 µg oder 0,5 µmMol), 1,2-Hexadecandiol (0,6468 µg oder 2,5 µmMol) und Blockcopolymer (Poly(ethylenoxid)-Poly(propylenoxid)-Poly(ethylenoxid); PEO-PPO-PEO) ( 0,4 ~ 1,2 µg) in Octylether. Die gemischte Lösung wurde auf 300ºC erhitzt, um den Fe-Vorläufer zu reduzieren. Die Bildung von Fe₃ O₄ Kern-NPs wurde durch Abkühlen der erhitzten Lösung vervollständigt. Das zweite Verfahren wurde nach der Bildung des Magnetkerns ohne irgendein Reinigungsverfahren kontinuierlich durchgeführt. In die aus Fe₃ . bestehende Emulsion wurden Au-Vorläufer (0,2338 µg oder 0,62 µMol) und 1,2-Hexadecandiol (0,88 µg, 3,4 µMol) gegeben O₄ NPs, und dann wurde die gemischte Lösung auf 230 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Emulsion durch Zentrifugation ausgefällt und die Kern-Schale-NPs wurden abgetrennt.

Konstruktion des rekombinanten Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 Expressionsvektors

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3' und des Rückwärtsprimers 5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3' durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und unter Verwendung des QIA Quick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) gelgereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt wurde in EcoRI/XhoI-verdautes pET-23a (Novagen, Darmstadt, Deutschland) kloniert. Escherichia coli (E. coli ) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) wurde mit dem resultierenden Konstrukt durch Hitzeschock transformiert und auf LB-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande) selektiert.

Expression und Reinigung von rekombinantem Protein

Um rekombinantes Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 Protein zu exprimieren und zu reinigen, E. coli BL21-Stämme (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) wurden mit pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 transformiert. Bakterien wurden dann in LB-Brühe gezüchtet, die Ampicillin (100 µg/ml) enthielt. Die Proteinexpression wurde durch Isopropyl-β-d-thiogalactosid (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande) bei einer Endkonzentration von 0,4 µM für 5 Stunden bei 37 °C induziert. Bakterienpellets wurden in Lysepuffer (50 mM NaH₂ .) resuspendiert PO₄ , pH 8,0; 300 µM NaCl), gefolgt von einer Ultraschallbehandlung auf Eis für 10 Minuten. Beschallte Lysate wurden bei 20.000 × g . zentrifugiert 20 min bei 4 °C erhitzt und Ni-NTA His·Bind Resin (Peptron, Daejeon, Korea) ausgesetzt. His-markierte Proteine, die an das Harz gebunden waren, wurden mit Elutionspuffer (50 mM NaH₂ PO₄ , pH 8,0; 300 µM NaCl; 150 µM Imidazol). Gereinigtes Protein wurde auf 15% SDS-PAGE-Gel aufgetrennt.

Modifikation von Core-Shell Fe₃ O₄ -Au-NPs

OPSS-PEG-NHS in verschiedenen Längen (2, 5 und 10&supmin; K) wurde zur Aktivierung der Thiolgruppen in 0,1 M Natriumbicarbonat gelöst. Aktiviertes OPSS-PEG-NHS wurde der Lösung von synthetisiertem Kern-Schale-Fe₃ . zugesetzt O₄ -Au-NPs und gerührt für 12 h bei 4 °C. Die Thiolgruppen von aktiviertem OPSS-PEG-NHS wurden kovalent an die Au-Oberfläche der Kern-Schale-NPs gebunden. Dann wurde dem PEGylierten Fe₃ . eine Nanobody-Lösung (0,25 mg/ml) zugesetzt O₄ -Au-Kern-Schale-NPs für 12 h bei 4 °C. Die Amingruppen der zehn Lysin(K)-Schwänze am Ende wurden bei pH 8,3 kovalent an die NHS-Gruppen von OPSS-PEG-NHS gebunden. Cy3 und Cy7.5 wurden mit den restlichen Amingruppen des Nanokörpers markiert.

Internalisierungskurve

CT26-Zellen wurden mit 5 × 10 ³ . ausgesät Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit klarem Boden und in 250 μL Kulturmedium für 24 h bei 37 °C in 5% CO₂ . inkubiert im Dunkeln. Das Medium wurde entfernt und 250 µl frisches Kulturmedium mit 50 µg/ml Cy3-markiertem Fe₃ O₄ -Au-NPs und PEG-Cy3- oder PEG-Nanobody-Cy3-markierte NPs wurden zu jedem Well hinzugefügt. Die Zellen wurden für verschiedene Zeiträume (0, 10, 20, 30, 60, 120 und 360 min) weiter inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen, um freie NPs zu entfernen, und die Fluoreszenz jedes Wells wurde mit Trypanblau als membranundurchlässigem Fluoreszenzlöscher von SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA) gemessen. Jedes Experiment wurde mit gleichen Mengen an NPs (50 µg/ml) durchgeführt und dreimal wiederholt [40].

Hemmungstest

CT26-Zellen wurden mit 5 × 10 ³ . ausgesät Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit klarem Boden und in 250 µl Medium für 24 Stunden bei 37 °C in 5% CO₂ . inkubiert im Dunkeln. Das Medium wurde entfernt und 250 µl frisches Kulturmedium mit entweder 20 µg/ml Chlorpromazin (CPZ), 50 µg/ml Nystatin, 20 µg/ml Cytochalasin D, 25 µg/ml Dynasore, 20 µg/ml BFA, 140 µg/ ml Monensin oder 5 µM Anti-Muc1 Ab wurden zugegeben und die Zellen wurden 1 Stunde lang inkubiert.

Das Medium wurde wieder entfernt und 250 µl Kulturmedium mit 50 µg/ml Cy3-markiertem Fe₃ O₄ -Au-NPs, PEG-Cy3-markierte NPs, PEG-Nanobody-Cy3-markierte NPs oder Vimentin-Cy3-markierte NPs wurden hinzugefügt.

Nach 1 h bei 37 °C und 5% CO₂ , wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, um freie NPs zu entfernen, und die Fluoreszenz wurde mit Trypanblau als membranundurchlässigem Fluoreszenzlöscher von SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA) gemessen. Jedes Experiment wurde mit gleichen Mengen an NPs (50 µg/ml) durchgeführt und viermal wiederholt.

Ergebnisse und Diskussion

Die Kern-Schale-NPs wurden nach einer veröffentlichten Methode synthetisiert [16, 17]. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Beobachtungen in Abb. 1a, b zeigen, dass das Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs waren kugelförmig mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 13,5 nm und einer engen Größenverteilung.

Charakterisierung des synthetisierten Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs. a , b TEM-Beobachtungen des synthetisierten Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs. c , d NPs in wässriger Lösung, vor und nach dem Anlegen eines externen Magnetfelds. e Der UV-Absorptionspeak synthetisierter Kern-Schale-NPs erscheint bei ~ 530 nm. f Magnetische Hystereseschleifen von Fe₃ O₄ Kern

Der Anstieg von ~ 8.5 nm des Kern-NP (Fe₃ O₄ ) stammt von der Beschichtung einer ~ 2.5 nm dicken Au-Schale auf der Kernoberfläche, was zu einem Kern-Schale-NP führt. Ein hochauflösendes TEM-Bild mit der schnellen Fourier-Transformation (FFT)-Analyse des Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NP ist in den ergänzenden Informationen Abb. S1 enthalten.

Das in organischem Lösungsmittel hergestellte Produkt wurde mittels Magnetseparation gereinigt und ins Wasser überführt.

Die Kern-Schale-NPs waren gut dispergiert und ohne Oberflächenmodifikation in Wasser stabil, da auf den NPs verbliebene Blockcopolymere vorhanden waren.

Abbildung 1c und d zeigen die NPs in wässriger Lösung vor und nach dem Anlegen eines externen Magnetfelds. Unter einem externen Magnetfeld veränderten sich die Kern-Schale-NPs schnell von einer homogenen Dispersion (Abb. 1c) zu einer klaren und transparenten Lösung (Abb. 1d).

Die Absorptionsbande der Kern-Schale-NPs wurde mit UV-Vis-Spektrometrie untersucht. Wie in Abb. 1e gezeigt, erschien ein Absorptionspeak bei ~ 530 nm, was das Vorhandensein von Au auf der Oberfläche der NPs anzeigt (Ergänzende Informationen Abb. S2 enthält das Ergebnis der EDX-Daten für Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs). Da die Probe gereinigt wurde, zeigten die optischen Ergebnisse die Bildung der Kern-Schale-Struktur.

Magnetische Hystereseschleifen wurden aus vibrierenden Probenmessungen erhalten, um die magnetischen Eigenschaften des Fe₃ . zu untersuchen O₄ Kern- und Kern-Schale-NPs. Beide NPs zeigten superparamagnetisches Verhalten mit einer Koerzitivfeldstärke von nahe 0 Oe bei Raumtemperatur (Abb. 1f).

Wie in früheren Arbeiten berichtet, war die Anfälligkeit von Kern-Schale-NPs höher als die von Magnetit-NPs, was teilweise auf Proximity-Effekte und einzigartige räumliche Konfigurationen zurückzuführen sein könnte [41, 42]. Außerdem betragen die Sättigungsmagnetisierungen der Kern-NPs und der Kern-Schale-NPs ~37 emu/g bzw. ~21 emu/g bei 10 kOe. Der Unterschied in Ms rührt von der Existenz einer nichtmagnetischen Komponente (Au) in den Kern-Schale-NPs her.

Das VHH 5-24 K10-Gen wurde im Leseraster kloniert, um nach PCR-Amplifikation pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 zu produzieren ( 2a ). Das rekombinante Protein wurde in E. coli BL21, das nach Induktion mit IPTG mit pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 transformiert und durch Ni-NTA His·Bind Resin gereinigt wurde. Rekombinantes Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 wurde in E leicht exprimiert. coli als lösliches 18-kDa-Protein. Aus einer 1-Liter-Kultur erhielten wir 1 ± 0,5 mg gereinigtes rekombinantes Anti-Muc1-VHH 5-24 K10.

Expression und Reinigung von Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 Fusionsprotein. Das VHH 5-24 K10-Gen wurde im Leseraster kloniert, um a . zu produzieren pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 nach b Reinigung von Muc1-VHH 5-24 K10 Fusionsprotein. Gereinigtes Protein wurde auf 15% SDS-PAGE aufgetrennt. Spur 1 Proteinleiter. Spur 2 gereinigtes Protein. c Schematische Darstellung von PEG-Nanobody-Farbstoff-markierten NPs, die in dieser Studie verwendet wurden

Das gereinigte Protein wurde durch 15% SDS-PAGE-Gel verifiziert. Die Coomassie-Blau-Färbung des gereinigten Proteins zeigte, dass es> 95 % rein war (Fig. 2b). Das synthetisierte Fe₃ O₄ -Au-NPs wurden in drei Schritten modifiziert, nämlich PEGylierung, Antikörpermarkierung und Farbstoffmarkierung (Abb. 2c). Nach jedem Modifikationsschritt wurde das Zetapotential gemessen, um die erfolgreiche Modifikation zu bestätigen. Tabelle 1 zeigt die Auswirkung der Modifikation auf die entsprechenden Zetapotentiale. Das Zetapotential von nackten Kern-Schale-NPs betrug − 19,8 ± 6,68 mV. Die PEGylierung von NPs wurde unter Verwendung von OPSS-PEG-NHS durchgeführt. Um eine Reihe von Nanokomplexen mit unterschiedlichen Größen herzustellen, wurde OPSS-PEG-NHS mit verschiedenen Längen (2 K, 5 K und 10 K) verwendet.

Nach der PEGylierung waren die Zetapotentiale reduziert (− 44.9 ± 8.19 mV, −40,7 ± 7.88 mV und −39,6 ± 8.74 mV für 2 K, 5 K bzw. 10 K).

Interessanterweise stiegen die Zetapotentiale nach dem Tagging von Nanokörpern deutlich an (− 38,5 ± 5,61 µmV, − 23,3 ± 8,61 µmV und − 31,8 ± 7,37 µmV für 2 K, 5 K bzw. 10 K).

Nach der Farbstoffmarkierung stiegen auch die Zetapotentiale (− 12,5 ± 7,25 µmV, − 17,7 ± 3,94 µmV und − 10,6 ± 4,72 µmV für 2, 5 bzw. 10 K).

Das Zetapotential von bloßem Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs waren − 19,8 ± 6,68 mV. Nach der PEGylierung wurde das Zeta-Potential auf fast –40 mV reduziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die PEG-Moleküle gut kovalent an die Au-Schale der Kern-Schale-NPs gebunden waren, da PEG-Moleküle negativ geladene funktionelle N-Hydroxysuccinimid-Gruppen aufweisen. In der Zwischenzeit stieg das Zeta-Potential nach Farbstoff-Tagging an den Nanobody (− 38,5 ± 5,61 µmV für NP-PEG2 K-Nanobody und − 12,5 ± 7,25 µmV für NP-PEG2 K-Nanobody-Farbstoff). Dieses Ergebnis ist vernünftig, da der rekombinante Nanobody zehn Lysin-Schwänze am terminalen Ende aufweist. Jeder Nanobody-Typ wurde durch Zeta-Potential-Messung kategorisiert, und um die Antikörperbindung an den Nanobody zu bestimmen, haben wir die Fluoreszenz für jeden Nanobody-Typ gemessen.

Wie in Abbildung 3 gezeigt, haben wir bestätigt, dass alle Arten von Nanopartikeln und Nanokörpern ohne Inhibitorbeschränkungen eine gute zelluläre Aufnahme und Internalisierung aufweisen. Eine zelluläre Internalisierungskurve wurde von Zellen erhalten, die in Gegenwart von 50 μg/ml Cy3-markiertem Fe₃ . inkubiert wurden O₄ -Au-NPs, PEG-Cy3-markierte NPs und PEG-Nanobody-Cy3-markierte NPs für unterschiedliche Zeiträume (zwischen 0 und 360 min) nach Entfernen des Mediums, Auswaschen freier NPs und abschließender Messung der Gesamtfluoreszenz der Zellen mit Trypan blau (Abb. 3).

Normalisierte Photofluoreszenz von CT26-Mucinzellen nach Inkubation mit 50 μg/ml a Fe₃ O₄ -Au-NPs, b PEGylierte NPs und PEG-Nanobody-markierte NPs und c Fe₃ O₄ -Au-NPs, Nanobody-markierte NPs und Vimentin-markierte NPs bei 37 °C in 5 % CO₂ für verschiedene Zeiträume (10, 20, 30, 60, 120 und 360 min)

Anhand des Ergebnisses der Fluoreszenzintensitätsmessung können wir feststellen, dass die NPs innerhalb von 1 h in die Zellen internalisiert wurden (Abb. 3a). Die Fluoreszenzintensität von NP erreichte innerhalb von 1 h ein Maximum, und die Fluoreszenzintensität nahm nach Erreichen eines stationären Zustands allmählich ab. Obwohl es einen leichten Zeitunterschied in Abhängigkeit von der Anwesenheit von Ak gibt, unterschied sich die Fluoreszenzintensität pro Kultivierungszeit nicht signifikant von dem Ergebnis von nackten NPs (Abb. 3b). Wie in 3c gezeigt, wurde bestätigt, dass die Wirkung von Ab bei der Verwendung von heterogenem Ab von Muc1 und Vimentin bei der zellulären Aufnahme und Internalisierung von NP vernachlässigbar war.

Mit dem WST-1-Assay die Lebensfähigkeit (%) von CT26-Mucinzellen in Abhängigkeit von der Konzentration und Oberflächenmodifikation von Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs wurden nach verschiedenen Expositionszeiten geschätzt (Abb. 4a, b). Die Lebensfähigkeit von CT26-Zellen zeigte keine signifikanten Unterschiede nach 24 h und 48 h Exposition, weder bei unterschiedlichen Dosen noch nach Oberflächenmodifikation der NPs. Die Zelllebensfähigkeit war sowohl auf dem bloßen Fe₃ . als 90 % O₄ -Au-NPs (Abb. 4a) und die oberflächenmodifizierten NPs (Abb. 4b).

Lebensfähigkeit von CT26-Mucinzellen, die mit bloßem Fe₃ . behandelt wurden O₄ -Au-Kern-Schale-NPs und oberflächenmodifiziertes Fe₃ O₄ -Au-NPs in verschiedenen Konzentrationen. a Fe₃ O₄ -Au-NPs und b PEG-Nanobody-Cy3-markierte NPs. Jedes experimentelle Diagramm stellt den Durchschnitt einer Reihe von vier verschiedenen Experimenten dar.

Abbildung 5 zeigt, dass NPs über verschiedene Endozytosewege (Clathrin-vermittelte, Caveolae-vermittelte und Phagozytose/Makropinozytose-Wege) in die CT26-Mucinzellen gelangten. Interessanterweise zeigt Fig. 5b, dass Anti-Muc1-Ak auch hauptsächlich die Endocytose von PEG-Nanobody-Cy3-markierten NPs beeinflusst. Um den Weg der NP-Internalisierung zu verstehen, versuchten wir, die Endozytose-Wege mit spezifischen chemischen Inhibitoren zu hemmen (Abb. 5). Die Wege der Endozytose wurden bekanntlich in drei Typen unterteilt:Clathrin-vermittelte, Caveolae-vermittelte und Makropinozytose/Phagozytose.

Normalisierte Photofluoreszenz von CT26-Mucinzellen, die 1 h mit chemischen Endozytose-Inhibitoren behandelt und mit 50 μg/ml a . inkubiert wurden nackte Kern-Schale-NPs und b Nanobody-markierte NPs bei 37 °C in 5 % CO₂ für 30 min. Inhibitoren mit statistischer Wirkung auf die Internalisierung (Student's t testen, p (*) <0,05 und p (**) <0,01) sind mit schwarzen Sternchen gekennzeichnet

In dieser Studie wurden Inhibitoren als erster Ansatz verwendet, um die Internalisierung von Nanobody-markierten NPs zu untersuchen. CPZ (Clathrin-vermittelter Endozytose-Inhibitor), Nystatin (Caveolen-vermittelter Endozytose-Inhibitor), Dynasore (Dynamin-Inhibitor), Cytochalasin D (Phagozytose-/Makropinozytose-Inhibitor), BFA (Golgi-Apparat-Zerstörer), Monensin (Lysosomen-Inhibitor) oder Anti-Muc1 Ab (rezeptor-/transporterspezifischer Kompetitor) wurden 1 h mit Zellen inkubiert. CPZ, Nystatin, Dynasore und Cytochalasin D beeinflussten die Endozytose von NPs (Abb. 5a).

Die Targeting-Einheit ist der Schlüssel zum Erfolg der Krebs-Targeting, die in der Krebstherapie außerordentlich wichtig ist. Für das Targeting ist eine effektive Oberflächenmodifikation sehr wichtig, um die therapeutische Effizienz zu erhöhen und Nebenwirkungen zu begrenzen. Nanobody-markiertes Fe₃ O₄ -Au-Kern-Schale-NPs wurden erfolgreich aus den synthetisierten NPs und rekombinanten Nanokörpern hergestellt. Tabelle 1 zeigt deutlich, dass jeder Änderungsschritt erfolgreich durchgeführt wurde.

Die Lebensfähigkeit der Zellen ist eines der wesentlichen Elemente für die biologische Anwendung von Nanomaterialien. Die Zelllebensfähigkeiten waren auf den nackten Kern-Schale-NPs und den modifizierten NPs größer als 90% (Abb. 4a, b). Diese Ergebnisse implizieren, dass reines Fe₃ O₄ -Au-NPs und modifizierte NPs verursachten keine signifikante konzentrations- und modifikationsabhängige Zytotoxizität und dass die modifizierten NPs für biologische Anwendungen geeignet waren.

Die Untersuchungen der Internalisierungseffizienz und der Inhibitorwirkung von NPs liefern wichtige Informationen zum Verständnis der Mechanismen, durch die NPs in Zellen eindringen. PEGylierte NPs wurden im Vergleich zu bloßen NPs relativ langsam in Zellen internalisiert, aber Nanobody-markierte NPs wurden etwas schneller in Zellen internalisiert als bloße NPs (Abb. 3a, b). Da die PEGylierung eine bekannte Methode zur Oberflächenmodifizierung ist, um die Internalisierung von NPs zu verhindern, lässt sich die Internalisierungsneigung von PEGylierten NPs leicht erklären. Darüber hinaus induzierte der Nanobody die Endozytose von NPs. Um die Spezifität des Nanobody zu überprüfen, bestätigten wir die Internalisierungsrate von Vimentin-Ab-markierten NPs. Interessanterweise förderten Vimentin-Ab-markierte NPs die zelluläre Internalisierung nicht (Abb. 3c).

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Nanobody effektiv die Internalisierung von Nanomaterialien in CT26-Mucinzellen induzieren kann und implizieren, dass die Internalisierungsneigung durch spezifische Modifikation der äußeren Membran von NPs kontrolliert werden kann. Darüber hinaus wurden die Mechanismen der Endozytose von Nanobody-markierten NPs durch Inhibitionstests und konfokale Mikroskopie-Bildgebung klar gezeigt. Die Photofluoreszenz sowohl der Nanobody-markierten NPs als auch der nicht-markierten NPs zeigte ähnlich abnehmende Werte, wenn sie mit CPZ, Nystatin oder Dynasore kultiviert wurden (Abb. 5a, b). CPZ, Nystatin und Dynasore spielen eine Rolle bei der Hemmung der Clathrin-vermittelten Endozytose bzw. Caveolae-vermittelten Endozytose und Dynamin, einer großen GTPase, die an der Knospung und Abspaltung von entstehenden Vesikeln von Elternmembranen beteiligt ist. Dabei nahmen die Photofluoreszenzwerte in beiden Fällen rapide ab, da Dynamin eng mit der Produktion von Vesikeln für die Clathrin-vermittelte und Caveolae-vermittelte Endozytose zusammenhängt. Wie in Abb. 5a gezeigt, zeigten sowohl nicht-markierte (Abb. 5a) als auch nanobody-markierte NPs (Abb. 5b) eine schnelle Abnahme der Photofluoreszenz.

Insbesondere zeigten die Nanobody-markierten NPs signifikant niedrigere Photofluoreszenzwerte in CPZ, Nystatin und Dynasore. Darüber hinaus bestätigten wir, dass die nicht-markierten NPs stärker betroffen waren als Nanobody-markierte NPs, wenn sie auf Cytochalasin D angewendet wurden, einem zelldurchlässigen Toxin, das die Polymerisation von Aktinfilamenten für die Phagozytose blockiert [43]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass nicht-markierte NPs durch mehrere Mechanismen wie Clathrin-vermittelte Endozytose, Caveolae-vermittelte Endozytose und Phagozytose internalisiert wurden. Folglich hängt die zelluläre Internalisierung von Nanobody-markierten NPs von Clathrin-vermittelter und Caveolae-vermittelter Endozytose ab. Außerdem wurde die Menge der zellulären Aufnahme von Nanobody-markierten NPs erheblich reduziert, wenn Zellen mit dem Muc1-Antikörper kultiviert wurden (Abb. 5b). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass der freie Muc1-Antikörper als Konkurrent des Nanobodys auf den modifizierten NPs bei der Anheftung an die CT26-Zellmembran eine Rolle spielt und dass der Muc1-Antikörper eine wichtige Rolle bei der Zellinternalisierung der modifizierten NPs spielt. Bemerkenswerterweise zeigten Vimentin-Ak-markierte NPs offensichtliche Unterschiede im Vergleich zu Nanobody-markierten NPs in Bezug auf die Hemmfähigkeit. Die Photofluoreszenz von Vimentin-markierten NPs blieb bei mehreren Hemmtests unbeeinflusst, was darauf hindeutet, dass die NPs nur minimal von Nystatin, Dynasore, Cytochalasin D und sogar dem Muc1 Ab beeinflusst wurden. Dieses Phänomen könnte ein Beweis für die Wirksamkeit von Vimentin sein, von dem biochemisch bestätigt wurde, dass es die Phagozytose stark beeinflusst [39]. Folglich weist dieses Ergebnis darauf hin, dass der Muc1 Ab auf spezifische Moleküle abzielen und eine spezifische Endozytose kontrollieren kann.

Wie in Fig. 6 gezeigt, wurden analoge Ergebnisse erhalten, wenn die Zellen mit Cy7.5-markierten nackten Kern-Schale-NPs und PEG-Nanobody-markierten NPs behandelt wurden, was auf eine ähnliche zelluläre Aufnahme in beiden Fällen ohne Dynasore-Hemmung hinweist. Dynasore-Hemmung induzierte eine deutlich geringere zelluläre Internalisierung der PEG-Nanobody-markierten NPs im Vergleich zu bloßen NPs (Abb. 6b, untere Reihe). Diese Ergebnisse implizieren, dass es zwei Endozytose-Mechanismen gibt, nämlich die unspezifische Endozytose von bloßen NPs und die eingeschränkte Endozytose von Nanobody-markierten NPs über das Dynamin-Molekül. Sobald sich der Nanobody an die äußere Zellmembran anlagert, können die Nanobody-markierten NPs aufgrund der gleichzeitigen Aktivierung der Clathrin- und Caveolae-vermittelten Mechanismen die Zellmembran leicht passieren. Folglich könnten wir annehmen, dass die Hauptmechanismen sowohl die Clathrin- als auch die Caveolae-vermittelte Endozytose für die Internalisierung von Nanobody-markierten NPs in CT26-Mucinzellen sind.

Konfokale mikroskopische Bildgebung von CT26-Mucinzellen, die mit a . inkubiert wurden Fe₃ O₄ -Au-NPs und b PEG-Nanobody-markierte NPs für 1 h bei 37 °C in 5 % CO₂ Inkubator, vor und nach Dynasore-Hemmung (1 ng/ml)

Schlussfolgerungen

Nanomaterialien für die gezielte Krebsbehandlung und die kontrollierbare Insertion von exogenen Materialien wie Medikamenten, Genen und Peptiden sind entscheidende Fortschritte bei biomedizinischen Anwendungen. Diese bekannten, aber kreativen Konzepte können Strategien für neue Therapiemethoden bieten. In diesem Artikel haben wir eine verbesserte zelluläre Aufnahme von Fe₃ . gezeigt O₄ -Au-Kern-Schale-NPs nach PEGylierung mit dem Muc1-Antikörper. Die wichtigsten Endozytose-Mechanismen von Nanobody-markierten NPs wurden demonstriert, was die Möglichkeit einer kontrollierbaren spezifischen Endozytose in kolorektalen Krebszellen zeigte. Diese Ergebnisse liefern einen Einblick in das Targeting zwischen Nanobody-markierten NPs und Darmkrebszellen, um das Design hocheffizienter Targeting-Träger zu unterstützen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Abkürzungen

Fe₃ O₄ :

Magnetit

Au:

Gold

NPs:

Nanopartikel

Ab:

Antikörper

HCAbs:

Schwerkettenantikörper

VHH:

VH des Kameliden HCAb

PEG:

Poly(ethylenglycol)

PPG:

Poly(propylenglycol)

PCR:

Polymerase-Kettenreaktion

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

PEO-PPO-PEO:

Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid)

OPSS-PEG-NHS:

Orthopyridyldisulfid PDP PEG Succinimidylester

BFA:

Brefeldin A

CPZ:

Chlorpromazin