Rotspektralverschiebung beim empfindlichen kolorimetrischen Nachweis von Tuberkulose durch ESAT-6-Antigen-Antikörper-Komplex:eine neue Strategie mit Gold-Nanopartikeln

Hintergrund

Tuberkulose (TB) wird durch Mycobacterium tuberculosis . verursacht , eine der führenden tödlichen Erkrankungen beim Menschen, und greift zunächst die Lunge an. Infolgedessen breitet es sich auf andere Teile des Körpers wie die Niere, die Wirbelsäule und das Gehirn aus und wird schlimmer, wenn die Immunität nachlässt. Um Menschen vorsorglich zu retten, ist es zwingend erforderlich, TB im latenten Stadium zu erkennen und zu behandeln. In diesem Stadium wurde der Patient mit M infiziert. Tuberkulose; der Erreger ist jedoch nicht aktiv. Es gibt verschiedene Methoden, die verwendet wurden, um TB im latenten Stadium zu erkennen, darunter der TB-Hauttest und der Interferon-Gamma-Test. In den meisten Fällen ist ein TB-Hauttest allein nicht in der Lage, die aktive TB-Infektion nachzuweisen, und der Patient muss durch andere unterstützende Tests, wie z. B. Röntgenthorax, Sputumzytologie und Sputumkultur, bestätigt werden [1]. Aber diese Tests erfordern härtere Laborschritte und dauern mehrere Monate; Daher ist die Entwicklung einer einfacheren und effizienteren Methode zum Erkennen von TB in einem früheren Stadium zwingend erforderlich.

Ein auf Goldnanopartikeln (GNP) basierender kolorimetrischer Assay genießt aufgrund seiner einzigartigen physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie z. Monodisperse GNP-Lösung zeigt hohe Extinktionskoeffizienten und zeigt das Spektrum im sichtbaren Bereich. Wenn BSP den richtigen Platz zwischen ihnen haben, erscheinen sie als rot gefärbte Lösungen und werden blau, wenn sie unter der verfügbaren Bedingung von zweiwertigen Ionen aggregiert werden [2]. In Anwesenheit der entsprechenden Ionen werden die Räume zwischen den GNPs gefüllt, erreichen das Stadium der Aggregation und zeigen die spektrale Verschiebung in Richtung der sichtbaren Wellenlänge, die als „Rotverschiebung“ bezeichnet wird. Unter Ausnutzung dieser spektralen Verschiebung wurden viele kolorimetrische Assays erstellt, um Krankheiten wie HIV und Influenza zu erkennen [3, 4]. Diese Art von Assays stützen sich auf einzelsträngige Oligonukleotidsequenzen, und Aptamer wurde weithin als geeignetes Molekül zum Nachweis des Ziels verwendet [5, 6]. Durch die Koordination zwischen Gold- und Stickstoffatomen in den DNA-Basen können einzelsträngige DNA- oder RNA-Sequenzen an die Oberfläche von GNP binden [7,8,9]. Die modifizierten GNPs mit Oligonukleotid sind unter höheren Salzbedingungen stabil. Wenn der Analyt verfügbar ist, wird das Oligonukleotid vom Gold getrennt und wird in Gegenwart von zweiwertigen Ionen aggregiert und zeigt dann die blaue Lösung. Die demonstrierten GNP-Assays sind billiger, benötigen weniger Zeit für den Nachweis, sind einfacher zu funktionalisieren und zeigen den visuellen Nachweis mit einer guten Sensitivität [10,11,12,13,14]. Aufgrund dieser positiven Einstellung wurden GNP-basierte kolorimetrische Assays für den Nachweis kleinerer Moleküle wie DNA, RNA, Protein, Ganzzellen und Metallionen erweitert. Mehrere Aptamere standen zur Verfügung, um diese Analyten nachzuweisen, indem die vereinfachten kolorimetrischen Assays auf Aptamer-GNP-Basis verwendet wurden, die die roten Spektralverschiebungen zeigten [15,16,17,18,19].

Obwohl kolorimetrische Assays mit Aptamer, DNA oder RNA gut dokumentiert sind, haben sie in einigen Fällen aufgrund ihrer schlechten Leistung bei längeren Sequenzen und des Versagens bei der Sonden- und Target-Interaktionsanalyse auch negative Auswirkungen [20,21,22]. Dies könnte auf die höheren Ladungen der Biomoleküle zurückzuführen sein, die eine stärkere elektrostatische Wechselwirkung mit der GNP-Oberfläche eingehen, was letztendlich dazu führt, dass das Zielmolekül das angehängte Sondenmolekül auf der GNP-Oberfläche nicht freisetzen kann. Um diese Hürde zu überwinden, haben wir hier einen einstufigen Antikörper-basierten kolorimetrischen Assay zum Nachweis des ESAT-6-Proteins eingeführt. ESAT-6-Protein ist das frühe Sekretionsprotein, das als das wichtige Antigen bei Tuberkulose identifiziert wurde [23,24,25]. Um das ESAT-6-Protein in einem früheren Stadium zu diagnostizieren, ist es zwingend erforderlich, die Krankheit zu behandeln und eine Ausbreitung zu vermeiden. Abbildung 1a, b veranschaulicht die Strategie zum Nachweis von ESAT-6 durch seinen Antikörper mithilfe eines GNP-basierten kolorimetrischen Rotspektralverschiebungsassays. Die folgenden Schritte sind an diesem Nachweisverfahren beteiligt:​​(i) anti-ESAT-6 polyklonaler Antikörper wurde mit ESAT-6/CFP-10-Antigen vorgemischt, (ii) GNP wurde zu dieser Lösung gegeben, (iii) NaCl war hinzugefügt, und (iv) eine visuelle Detektion und eine Analyse der Rotspektralverschiebung durch UV-Spektroskopie wurde durchgeführt. Mit diesen Schritten führten wir die kritische Analyse durch, um die ladungsbasierte Wechselwirkung zwischen GNP und den komplexierten Proteinen aufzuklären, und schlossen die Eignung des Vormischens von Antikörper-Antigen für die kolorimetrischen Assays. Für das Kontrollexperiment wurde das Kulturfiltrat Protein-10 (CFB-10) anstelle von ESAT-6 verwendet (Abb. 1).

Schematische Darstellung für den ESAT-6-Nachweis durch einen einstufigen vorkomplexierten kolorimetrischen Assay auf Antikörperbasis. a Strategie für Anti-ESAT-6-Antikörper-präkomplexiertes ESAT-6. b Strategie für Anti-ESAT-6-Antikörper-präkomplexiertes CFP-10 (Kontrollexperiment)

Methoden

Reagenzien und Biomoleküle

Das frühe sekretorische antigene Ziel (ESAT-6) und das 10 kDa-Kulturfiltratprotein (CFP-10) wurden von Sino Biological Inc. (Beijing, China) bezogen. Anti-ESAT-6 wurde von Santa Cruz Biotechnology (USA) bezogen. Das Goldnanopartikel mit einem Durchmesser von 15 nm wurde von Sigma Aldrich (USA) bezogen. Für das gesamte Experiment wurde entionisiertes Wasser verwendet, das durch das RO-Entionisierungssystem (18,3 MΩ·cm SASTEC (M) Sdn. Bhd) erzeugt wurde.

Optimierung zweiwertiger Ionen zur Aggregation des Bruttosozialprodukts

Für den Nachweis von ESAT-6 in der aktuellen Studie wurden zweiwertige Ionen (NaCl) verwendet, um die Aggregation von BSP zu visualisieren. Um die geeignete Bedingung mit NaCl zu optimieren, wurden verschiedene Konzentrationen (Endkonzentrationen von 50 bis 800 mM) zum konstanten Volumen (20 μl) von GNP [eine optische Dichte (O.D.)] hinzugefügt. Nach 15 Minuten wurden die Farbänderungen mit einer SONY-Digitalkamera fotografiert. Die spektralen Verschiebungen bei diesen Änderungen wurden mit dem Nanophotometer überwacht.

ESAT-6-Biofouling auf der BSP-Oberfläche:Validierung der Spezifität

Um die unspezifische (Biofouling-)Bindung von ESAT-6 auf der GNP-Oberfläche zu validieren, wurden unterschiedliche Konzentrationen (Endkonzentrationen von 1,5 bis 100 nM) zu 20 μl GNP hinzugefügt. Nach 30 Minuten wurde jedem Röhrchen die optimale Konzentration an NaCl zugesetzt und dann die Farbänderungen und Spektralverschiebungen wie im obigen Experiment beschrieben beobachtet. Ebenso wurde das Biofouling auch mit CFP-10 getestet.

Optimierung der obligatorischen Anti-ESAT-6-Antikörperkonzentration auf der BSP-Oberfläche

Um die notwendige Konzentration des Anti-ESAT-6-Antikörpers zur Auswertung der aktuellen Experimente zu optimieren, wurden verschiedene Konzentrationen des Anti-ESAT-6-Antikörpers (Endkonzentrationen 30 bis 500 nM) unabhängig mit 20 μl GNP gemischt. Nach 30 Minuten Inkubation wurde jedem Röhrchen das optimale Volumen an NaCl zugesetzt, Fotos wurden gemacht und nach 15 Minuten wurden spektrale Veränderungen festgestellt.

ESAT-6-Nachweis durch die Antikörper-basierte kolorimetrische Rotspektralverschiebung

Um den kolorimetrischen Nachweis von ESAT-6 durch Antikörper-basierte kolorimetrische Rotverschiebungs-Spektraländerungen zu entwickeln, wurde zunächst 1 μl 1 μM ESAT-6 (Endvolumen 500 nM) mit 1 μl optimaler Anti-ESAT-6-Antikörperkonzentration gemischt . Nach 30 Minuten Inkubation wurden jedem Röhrchen 20 μl GNP zugesetzt und dann 30 Minuten gewartet. Dann wurde die optimale NaCl-Konzentration zugegeben und die spektralen Änderungen bei einer Wellenlänge von 400 bis 800 nm gemessen. Ebenso wurden die anderen Konzentrationen von ESAT-6 (0 bis 500 nM) mit derselben optimierten Anti-ESAT-6-Antikörperkonzentration titriert. Um die Nachweisgrenze zu überprüfen, wurde ESAT-6 von der niedrigsten pikomolaren (von 1,25 pM) bis zur nanomolaren (500 nM) Größenordnung getestet. Die Konzentrationen anderer Moleküle (Anti-ESAT-6-Antikörper, GNP und NaCl) wurden konstant gehalten.

Ergebnisse und Diskussion

Der auf Antikörpern basierende kolorimetrische Assay, der die spektralen Veränderungen als Rotverschiebung zeigte, wurde hier verfolgt, um ESAT-6 nachzuweisen. Abbildung 1a zeigt die schematische Darstellung eines einstufigen kolorimetrischen Assays auf Antikörperbasis; in Gegenwart von ESAT-6 wird erwartet, dass die Farbänderung in der GNP-Lösung blau mit roter Spektralverschiebung ist, wenn die Stabilität von GNP unter einer hohen Konzentration eines zweiwertigen Ions, NaCl, verloren geht, während in Abwesenheit von ESAT-6, GNP ist aufgrund der Anlagerung des Anti-ESAT-6-Antikörpers an die GNP-Oberfläche stabil und führt auch bei hoher NaCl-Konzentration dazu, seine ursprüngliche rote Farbe beizubehalten. Diese Strategie wurde durch die Verwendung des unspezifischen CFP-10 gegen Anti-ESAT-6-Antikörper bestätigt und soll eine rote GNP-Lösung zeigen (Abb. 1b). Da CFB-10 auch das Hauptprotein bei der Entstehung von Tuberkulose ist, haben wir es hier als Kontrollprotein verwendet [26]. Im Allgemeinen ist für diese Art von GNP-basiertem Assay ein GNP mit einer Größe von 13 bis 15 nm gut geeignet, um die höhere Empfindlichkeit zu erreichen [27], und eine Erhöhung der GNP-Größe ist nicht geeignet, um die gute Nachweisgrenze zu erreichen. Dies liegt daran, dass die zunehmende Größe von GNP eine höhere Menge an Antikörpern benötigt, um an die GNP-Oberfläche zu binden. Bindet eine größere Menge Antikörper an die Oberfläche, führt dies zum falsch negativen Ergebnis. Hier wollten wir 15 nm BSP verwenden und erreichten die maximale Empfindlichkeit auf subpikomolarer Ebene.

Divalente Ionenoptimierung für kontrollierte BSP-Aggregation

Für diese Erkennungsoptimierung haben wir NaCl für die Aggregation von BSP verwendet. Als wir nach der erforderlichen NaCl-Konzentration suchten, wie in Abb. 2 gezeigt, wurden dem BSP verschiedene Konzentrationen von NaCl zugesetzt, die Farbe der Lösung begann blau zu erscheinen, was die Aggregation mit 100 mM NaCl anzeigte. Und auch aus dem Spektrum war deutlich zu erkennen, dass nur beim aggregierten BSP (NaCl-Konzentrationen von 100 bis 800 mM) eine Rotverschiebung bei der Wellenlänge ~ 600 nm vorliegt, während das dispergierte BNP (NaCl-Konzentrationen von 0 bis 50 mM) behalten immer noch ihr Spektrum bei ~ 500 nm. Es gibt jedoch eine unbedeutende spektrale Spitzenänderung bei 50 mM NaCl. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass wir mindestens 100 mM NaCl für die Aggregation von BSP benötigen, aber um die erhöhte Empfindlichkeit zu erzielen, haben wir für weitere Experimente eine höhere Konzentration (800 mM) an NaCl verwendet. Zuvor wurde die ähnliche Bandbreite von NaCl für die Aggregation von BSP von Gopinath et al. [10].

Optimierung zweiwertiger Ionen. 0 bis 800 mM NaCl wurden mit konstantem GNP (1 O.D.) gemischt. Nach 15 Minuten bei einer Wellenlänge von 400 bis 800 nm gescannt. Die Fotografien wurden mit der Digitalkamera wie in der Abbildung aufgenommen. Das Spektrum und die Farbänderungen werden durch die Aggregation des BSP mit 100 mM NaCl angezeigt. Peaks wurden mit den entsprechenden farbigen Kugeln gekennzeichnet

ESAT-6-Antikörperoptimierung für die Verteilung von BSP

Nach der NaCl-Optimierung bestimmten wir als nächstes die geeignete Konzentration des Anti-ESAT-6-Antikörpers, um die Experimente durchzuführen. Da die Empfindlichkeit stark von der Antikörperkonzentration abhängt, ist es notwendig, die geeignete Konzentration des Anti-ESAT-6-Antikörpers zu wünschen, um die GNP-Dispersion zu induzieren. Die Idee dahinter ist, dass, wenn die minimale Antikörperkonzentration erwünscht ist, diese bei der Zugabe des Targets leicht komplexiert werden kann und keine freien Moleküle an das GNP gebunden werden können, wohingegen, wenn mehrere Antikörper verfügbar sind, wenn wir versuchen, die geringe Konzentration von ESAT-6, nur eine geringe Menge an Antikörpern wird komplexiert. Dann bindet der verbleibende Antikörper an die GNP-Oberfläche und induziert die Stabilität von GNP, was zu einer geringeren Empfindlichkeit führt. Das IgG des Antikörpers hat ein höheres Molekulargewicht (~ 150 kDa), wodurch die freien Antikörper durch elektrostatische Wechselwirkung oder Ionen-/Wasserstoffbindung zwischen den oberflächenterminierten anionischen Gruppen auf der GNP-Oberfläche leicht an die GNP-Oberfläche binden [28]. Aufgrund des höheren Molekulargewichts ist die Anzahl der Antikörper geringer, und hier wurde sie mit 6 kDa Molekulargewicht ESAT-6 ausgeglichen, das auch bei niedrigerer Konzentration mehr Moleküle enthält. Wie in Abb. 3a gezeigt, haben wir zuerst die niedrigste Konzentration des Anti-ESAT-6-Antikörpers (30 nM) hinzugefügt und bis zur maximalen Konzentration (500 nM) zum BSP erhöht. Es wurde gezeigt, dass 30 nM Anti-ESAT-6-Antikörper mit GNP selbst bei 800 mM NaCl im Übergang zur Aggregation sind, da nicht genügend Antikörper auf der GNP-Oberfläche verfügbar sind, aber ab 60 nM Anti-ESAT-6-Antikörper, der Die Lösung hat ihre rote Farbe aufgrund der ausreichenden Anzahl von Anti-ESAT-6-Antikörpern, die an die GNP-Oberfläche binden, beibehalten. Bis zur Prüfung der maximalen Konzentration (500 nM) wurde die BSP-Farbe mit hoher Stabilität in roter Farbe gehalten. Nachdem wir die geeignete Konzentration auf 60 nM Antikörper festgelegt hatten, versuchten wir, die NaCl-Konzentrationen zu erhöhen, um die Stabilität von Anti-ESAT-6-Antikörper- und GNP-Konjugaten zu überprüfen. Wie in Abb. 3b gezeigt, ist das hergestellte Antikörper-GNP-Konjugat (60 nM Antikörper mit GNP) selbst bei Zugabe von 1 M NaCl sehr stabil. Das Spektrum in Abb. 3c zeigt auch das gleiche Ergebnis wie bei der visuellen Erkennung; die vorbereiteten Anti-ESAT-6-Antikörper-GNP-Konjugate behalten ihren Peak bei ~ 520 auch bei einer hohen Konzentration von NaCl und gleichzeitig führt nur GNP mit 800 mM NaCl zur Aggregation mit dem Peakmaximum bei ~ 500 nm.

ESAT-6-Antikörperoptimierung und -stabilität. Verschiedene Konzentrationen von Anti-ESAT-6-Antikörper wurden mit 800 mM NaCl getestet. a Aggregation oder Dispersion von GNP mit dem Anti-ESAT-6-Antikörper (0 bis 500 nM); Der Pfeil zeigt die Übergangsregion für die optimale Antikörperkonzentration an. b Stabilität von 60 nM Antikörper-komplexiertem GNP mit unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen (0,012 bis 1000 mM). c Spektren für verschiedene Komplexe. Peaks wurden mit den entsprechenden farbigen Kugeln gekennzeichnet

ESAT-6-Nachweis mit vorkomplexiertem Antikörper durch kolorimetrische Rotspektralverschiebung und Validierung von ESAT-6-Biofouling

Da der Antikörper von 60 nM eine ausgezeichnete Stabilität zeigt, haben wir zunächst versucht, ESAT-6 im Komplex mit 60 nM Anti-ESAT-6-Antikörper nachzuweisen. ESAT-6 ist das Protein mit kleinerem Molekulargewicht mit einer Größe von 6 kDa und gut für den kolorimetrischen Assay geeignet. Vor der Durchführung des Nachweisexperiments überprüften wir das Biofouling von ESAT-6 auf der GNP-Oberfläche; da die Möglichkeit einer Bindung von ESAT-6 an GNP besteht, kann dies zu falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen führen. Wie in Abb. 4 gezeigt, war GNP in ESAT-6 mit einer Konzentration bis 100 nM bei 800 mM NaCl nicht stabil, was darauf hindeutet, dass ESAT-6 nicht elektrostatisch an die GNP-Oberfläche bindet. Dieses Non-Fouling deutete auch darauf hin, dass die Aminosäurezusammensetzung von ESAT-6 in diesem Assay eine wichtige Rolle spielt. Nach dieser Bestätigung haben wir ESAT-6 nachgewiesen, das mit 60 nM Anti-ESAT-6-Antikörper vorkomplexiert war. Verschiedene Konzentrationen von ESAT-6 wurden mit der konstanten Konzentration (60 nM) des Antikörpers komplexiert und dann zu GNP hinzugefügt. Schließlich wurden 800 mM NaCl zugegeben, um die Aggregation mit der roten Spektralverschiebung zu bewerten. Wie in Abb. 5a (Einschub) gezeigt, hat der Nachweis von ESAT-6 von 0,5 nM bis 500 nM eine deutliche Farbänderung mit Übergängen im Vergleich zur Kontrolle (mit nur 60 nM Antikörper) bestätigt. Die Farbe der Lösungen hat sich schon bei 0,5 nM von Rot nach Blau geändert und bei 15 nM stärker intensiviert, was möglicherweise an der vollständigen Sättigung mit ESAT-6 liegt. Es scheint, dass selbst bei 0,5 nM kein Antikörper übrig bleibt, der an GNP bindet. Unter Bezugnahme auf die grafische Darstellung von Fig. 5a zeigen 15 bis 500 nM von ESAT-6 die vollständige Sättigung. Aus Abb. 5b ist klar ersichtlich, dass das Spektrum des Kontrollexperiments (kein ESAT-6-Protein) ein schönes Profil bei ~ 500 nm aufweist, während bei ESAT-6 mit 0,5 und 500 nM die Spektren rotverschoben waren. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass wir ESAT-6-Protein ab 0,5 nM nachweisen können und aufgrund der offensichtlich blauen Farbe immer noch auf niedrigere Konzentrationen absinken können.

Test auf ESAT-6-Fouling auf der BSP-Oberfläche. Verschiedene Konzentrationen von ESAT-6 wurden mit GNP gemischt und nach 30 min wurden 800 mM NaCl zugegeben. Eine schematische Darstellung wird ebenfalls gezeigt. Das Erscheinen einer blauen Farbe zeigt die Aggregation an

ESAT-6-Nachweis bei höheren Konzentrationen. a Grafische Darstellung zum Nachweis von ESAT-6. Verschiedene Konzentrationen von ESAT-6 wurden mit 60 nM Antikörper gemischt und nach 30 Minuten Inkubation wurde GNP zugegeben. Dann wurden 800 mM NaCl zugegeben, um die Farbänderung zu induzieren. ESAT-6 von 0,5 nM wurde mit dem deutlichen Farbumschlag (rot nach blau) nachgewiesen. Die Fotografien wurden mit der Digitalkamera wie in der Abbildung aufgenommen. b Spektrale Änderungen bei der Wellenlänge von 400 bis 800 nm. Peaks wurden mit den entsprechenden farbigen Kugeln gekennzeichnet

Nachweisgrenze von ESAT-6 durch die kolorimetrische Rotspektralverschiebung

Da 60 nM Anti-ESAT-6-Antikörper eine offensichtliche Verbesserung für den Nachweis von ESAT-6 zeigten, haben wir zum Ermitteln der Nachweisgrenze mit ESAT-6 weiter bis zum niedrigsten pikomolaren Wert (1,25 pM bis 5000 pM ). Wie in Abb. 6a gezeigt, beginnt ab 1,25 pM ESAT-6 eine blaue Farbe aufgrund der Komplexbildung zwischen ESAT-6 und dem Antikörper. Ab 2,5 pM hat sich die Farbe der Lösung, die sich in Blau verändert hat, intensiviert und die Farbänderungen bei weiteren Konzentrationen beibehalten. Im Kontrollexperiment (ohne ESAT-6) schien die Farbe der Lösung rot zu sein, was die Spezifität des aktuellen Experiments unterstützt (Abb. 6a). Dieses Ergebnis wurde auch durch das Spektrum bestätigt, wie in Abb. 6b gezeigt. Bei der Kontrolllösung ändert sich das Spektrum nicht, aber von 1,25 bis 5 nM ESAT-6-Protein wurden die Spektren in Richtung 600 nm rotverschoben. Bei 5 nM von ESAT-6 wurde eine vollständige spektrale Verschiebung mit Spitzenmaxima beobachtet. Basierend auf diesen experimentellen Ergebnissen konnten wir schlussfolgern, dass die Nachweisgrenze von ESAT-6 bei Verwendung des Antikörper-ESAT-6-Präkomplexes um den niedrigsten pikomolaren Bereich (1,25 pM) liegt.

Nachweisgrenze von ESAT-6 durch den Antikörper-basierten kolorimetrischen Assay. a Grafische Darstellung zum Nachweis von ESAT-6. Verschiedene Konzentrationen von ESAT-6 wurden mit 60 nM Antikörper gemischt und nach 30 Minuten Inkubation wurde GNP zugegeben. Dann wurden 800 mM NaCl zugegeben, um die Farbänderung zu induzieren. ESAT-6-Protein wurde von 1,25 pM bis 5000 pM titriert. Die Fotografien wurden mit der Digitalkamera wie in der Abbildung aufgenommen. b Spektrale Änderungen bei der Wellenlänge von 400 bis 800 nm. Peaks wurden mit den entsprechenden farbigen Kugeln gekennzeichnet

Feinabstimmung mit Spezifität

Da wir ESAT-6 mit 60 nM Anti-ESAT-6-Antikörper nachweisen konnten, versuchten wir als Nächstes denselben Nachweis mit einer etwas hohen Konzentration an Anti-ESAT-6-Antikörper von 75 nM. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Abb. 7a zu sehen. Es wurde festgestellt, dass bei Verwendung von 75 nM vorkomplexiertem Antikörper bei 850 pM ESAT-6 eine leichte Farbänderung auftrat. Wir erhöhten die ESAT-6-Konzentration auf 100 nM und konnten den Fortschritt der Farbänderung zu Blau beobachten. Bei diesen Experimenten wurde festgestellt, dass die Nachweisgrenze bei Verwendung von 75 nM vorkomplexiertem Antikörper im nanomolaren Bereich lag. Um die Spezifität der ESAT-6-Bindung zu bestätigen, testeten wir schließlich auch den ähnlichen Assay unter Verwendung des Präkomplexes von Anti-ESAT-6- und CFP-10-Protein von M. Tuberkulose . Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass nur ESAT-6 die Spezifität besitzt und CFP-10 die geeignete Kontrolle sein kann (Abb. 7b). Insgesamt wurde anhand der obigen Ergebnisse erkannt, dass die Optimierung der Antikörperkonzentration zwingend erforderlich ist, um die Sensitivität des kolorimetrischen Assays zu verbessern.

ESAT-6-Nachweis mit 75 nM Anti-ESAT-6-Antikörper. a Darstellung für Farbwechsel. Verschiedene Konzentrationen von ESAT-6 wurden mit 75 nM Antikörper gemischt und nach 30 Minuten Inkubation wurde GNP zugegeben. Dann wurden 800 mM NaCl zugegeben, um die Farbänderung zu induzieren. ESAT-6 von 0,85 nM wurde mit dem deutlichen Farbumschlag (rot nach blau) nachgewiesen. Die Fotos wurden mit einer Digitalkamera aufgenommen. b Spektrale Änderungen bei der Wellenlänge von 400 bis 800 nm. Peaks wurden mit den entsprechenden farbigen Kugeln angezeigt. Der Spezifitätstest wurde mit CFP-10 durchgeführt und erwies sich als Negativkontrolle

Schlussfolgerungen

Tuberkulose (TB) ist eine lebensbedrohliche Hauptkrankheit für den Menschen, und die Identifizierung von TB in einem früheren Stadium kann die Ausbreitung verhindern und die Krankheit behandeln. In dieser Studie wählen wir ein frühes sekretorisches Antigen-Target (ESAT-6), eines der Hauptproteine ​​bei TB. Wir haben einen einstufigen, auf Antikörpern basierenden kolorimetrischen Rot-Spektralverschiebungs-Assay mit Gold-Nanopartikeln eingeführt, und die Nachweisgrenze lag bei 1,25 pM. Die Spezifität dieses Assays wurde unter Verwendung des Kontrollproteins (CFP-10) aufgeklärt und zeigt keine Farbänderung bei Zugabe von GNP. Andererseits ist ESAT-6 allein nicht an das BSP gebunden. Mit diesem Beweis wurde die Anwesenheit von präkomplexiertem ESAT-6- und Anti-ESAT-6-Antikörper mit der Zuverlässigkeit des kolorimetrischen Rotspektralverschiebungsassays nachgewiesen. Diese Strategie ist einfach und schnell, um ähnliche Arten von Analyten in einem einzigen Schritt nachzuweisen. Außerdem kann dieser Assay mit einem kleinen Molekül erweitert werden, das mit einem geeigneten Antikörper komplexiert ist, um für den Point-of-Care-Nachweis geeignet zu sein. Diese Methodik wird definitiv mit kleineren Proteinen und Peptiden funktionieren. Bei größeren Proteinen kann es je nach Aminosäureladung zu Abweichungen kommen.

Abkürzungen

CFP-10:

10 kDa-Kulturfiltratprotein

DNA:

Desoxyribose-Nukleinsäure

ESAT-6:

6 kDa frühes sekretorisches antigenes Ziel

BSP:

Gold-Nanopartikel

NaCl:

Natriumchlorid

O.D:

Eine optische Dichte

RNA:

Ribose-Nukleinsäure

TB:

Tuberkulose

UV:

Ultraviolett