Goldnanopartikel-Wirkstoff-Interaktionen verursachen akute Nierenschäden bei Mäusen: Eine größenabhängige Toxizitätsstudie

Zusammenfassung

Nanomaterialien sind innovative Werkstoffe mit vielen nützlichen Eigenschaften, doch ihre unbekannten Auswirkungen auf lebende Organismen bereiten Sorge. Goldnanopartikel finden aufgrund ihrer hervorragenden Eigenschaften breite industrielle Anwendung. Die potenziellen biologischen Gefahren von Goldnanopartikeln sind jedoch weitgehend ungeklärt. In dieser Studie untersuchten wir daher die in-vivo-Effekte von Goldnanopartikeln mit 10, 50 und 100 nm Durchmesser (GnP10, GnP50, GnP100) sowie deren Interaktionen mit Medikamenten an Mäusen, um ihre Sicherheit für Säugetiere zu bewerten. Cisplatin, Paraquat und 5-Aminosalicylsäure verursachen als Nebenwirkungen Leberschäden und Nierenschäden bei Mäusen. Wurde keines der Goldnanopartikel allein über die Schwanzvene verabreicht, zeigten sich weder Hepato- noch Nephrotoxizität. Im Gegensatz dazu führte die Ko-Verabreichung von GnP10 mit Cisplatin, Paraquat oder 5-Aminosalicylsäure zu nierenschädigenden Nebenwirkungen. Dies deutet darauf hin, dass Goldnanopartikel mit einer Partikelgröße von 10 nm aufgrund ihrer Interaktion mit Arzneimitteln potenziell nephrotoxisch sind.

Einleitung

Die Nanotechnologie spielt im 21. Jahrhundert eine zunehmend wichtige Rolle, wobei Nanomaterialien den technologischen Fortschritt maßgeblich vorantreiben. Jüngste Entwicklungen in der Nanopartikelherstellung haben den weltweiten Einsatz innovativer Nanomaterialien ermöglicht [1, 2]. Nanomaterialien haben einen Durchmesser von 100 nm oder weniger; Beispiele sind Gold-, Silber-, Silica-, Platin- und Titandioxid-Nanopartikel sowie Fullerene und Kohlenstoffnanoröhren [3, 4]. Diese Materialien finden Anwendung in der elektronischen Speichertechnologie, der Gen- und Regenerativen Medizin sowie in elektronischen Bauelementen und bilden die Grundlage neuer Industrien des 21. Jahrhunderts [5]. Allerdings verursachen Nanopartikel wie PM2.5 schwere Umweltbelastung, Atemwegserkrankungen wie Asthma und ischämische Herzkrankheiten [6]. Darüber hinaus können Dieselmotoremissionen biologische Wirkungen entfalten, indem sie in Gehirn und Fortpflanzungsorgane gelangen [7], faserförmige Feinpartikel wie Asbest lösen Mesotheliome aus, und industrielle faserförmige Nanomaterialien wie Kohlenstoffnanoröhren können die menschliche Gesundheit beeinträchtigen [8, 9]. Viele Unbekannte bezüglich der biologischen Effekte von Nanopartikeln bestehen fort.

Gold (Au) besitzt eine niedrige Ionisierungstendenz und hohe Stabilität und wird seit der Antike als Edelmetall für dekorative Zwecke genutzt. Kürzlich entwickelte Goldnanopartikel finden aufgrund ihrer charakteristischen optischen Eigenschaften breite Anwendung in Medizin und Technik [10, 11], und ihre hervorragenden optoelektronischen Eigenschaften führten zu ihrem Einsatz in organischen Solarzellen, Sensorsonden und leitfähigen Materialien [12, 13]. In der chemischen Industrie dienen Goldnanopartikel als Katalysatoren für die Acryharzsynthese. Sie zeigen zudem eine überlegene tieftemperatur-katalytische Aktivität bei der CO-Oxidation im Vergleich zu Platin-Nanopartikeln, weshalb sie als Abgasreinigungskatalysatoren eingesetzt werden. Weitere Anwendungen sind zu erwarten, doch zur Toxizität von Goldnanopartikeln und deren potenziellen Wechselwirkungen mit Arzneimitteln gibt es kaum Forschung.

Das Forschungsfeld der Nanotechnologie expandiert, während Wissenschaftler die Sicherheit, Pharmakologie und Pharmakokinetik von Nanopartikeln erforschen. Silica-Nanopartikel verursachen Zytotoxizität, Hepatoxizität und Plazentenschäden [14, 15], und Kohlenstoffnanoröhren können pulmonale Mesotheliome induzieren [16]. Über pharmakologische Effekte durch Interaktionen zwischen Nanopartikeln und Medikamenten ist jedoch wenig bekannt. In dieser Studie untersuchten wir die Toxizität von Goldpartikeln mit 10, 50 und 100 nm Durchmesser (GnP10, GnP50, GnP100) an Mäusen, um ihre Sicherheit für Säugetiere zu klären. Zudem prüften wir die Auswirkungen dieser Nanopartikel auf die Toxizität von Paraquat (PQ, ein bekanntes Hepato- und Nephrotoxin) [17], Cisplatin (CDDP, ein weit verbreitetes Antitumor-Mittel) [18, 19] und 5-Aminosalicylsäure (5-ASA, ein gängiges Antiphlogistikum) [20].

Ergebnisse und Diskussion

Zunächst bestimmten wir die Partikelgrößen der Goldnanopartikel mittels Zetasizer und untersuchten sie per Transmissionselektronenmikroskopie (Abb. 1a, b, c). Die mittleren Durchmesser von GnP10, GnP50 und GnP100 betrugen 15,7 ± 7,0 nm, 53,3 ± 14,2 nm und 97,0 ± 27,1 nm (Zusatzabb. 1). Goldnanopartikel aggregieren bei der Elektronenmikroskopie, nicht jedoch bei der Verabreichung an Mäuse. Die Goldionenkonzentration wurde per ICP-MS gemessen, wobei keine Ionen detektiert wurden (Daten nicht gezeigt). Die Oberflächen der Goldnanopartikel waren mit Zitronensäure modifiziert, um die Wasserlöslichkeit zu erhöhen; diese Modifikation zeigte keine weitere Funktionalität.

Abbildung 1: Ultrastrukturen von Goldnanopartikeln. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von GnP10 (a), GnP50 (b) und GnP100 (c) Nanopartikeln.

Wir prüften, ob GnP Hepato- und Nephrotoxizität hervorrufen, indem wir Mäusen eine Maximaldosis von 4 mg/kg über die Schwanzvene verabreichten. Bei Gabe der Goldnanopartikel allein zeigten sich weder Hepato- noch Nephrotoxizität (Abb. 2). Die ALT- und AST-Werte von Mäusen, die GnP10, 50 und 100 allein erhielten (Abb. 2a, b), entsprachen den Kontrollwerten, ebenso die BUN- und Kreatininwerte. Eine Einzelgabe von GnP an Mäuse induzierte keine Leber- oder Nierenschäden, auch keine Herz-, Lungen- oder Milzschäden (Zusatzabb. 2), was zeigt, dass Goldnanopartikel bei alleiniger Verabreichung an Mäuse ungiftig sind.

Abbildung 2: Effekt von Goldnanopartikeln auf Cisplatin-induzierte Toxizität. Mäuse erhielten intraperitoneale Injektionen von Cisplatin (CDDP) à 0 (offene Balken) oder 100 µmol/kg (gefüllte Balken) zusammen mit einer intravenösen Injektion von Vehikel oder Goldnanopartikeln (4 mg/kg). Nach 24 h wurden Serumwerte der Leberenzyme Alaninaminotransferase (ALT; a) und Aspartataminotransferase (AST; b) sowie Plasmaspiegel von Harnstoffstickstoff (BUN; c) und Kreatinin (Cr; d) mittels kommerzieller Kits bestimmt („Biochemische Analysen“). Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM; n = 4). Signifikanter Unterschied (*P < 0,05, **P < 0,01) zwischen Vehikel- und CDDP-behandelten Gruppen.

Leber- und Nierenschäden durch Ko-Verabreichung von Silica-Nanopartikeln, Nanotonen oder Polystyrol-Nanopartikeln mit Medikamenten oder Chemikalien sind beschrieben [14, 21, 22]. Daher ko-verabreichten wir Goldnanopartikel mit PQ (Leber-Nieren-Toxin) oder den Arzneimitteln CDDP oder 5-ASA (die unerwünschte leber- und nierenschädigende Effekte haben). Abbildung 2 zeigt die Interaktion zwischen Goldnanopartikeln und CDDP. Die Ko-Verabreichung von GnP10 oder GnP50 mit CDDP erhöhte ALT und verursachte Leberschäden (Abb. 2a), und die Ko-Verabreichung von GnP10 mit CDDP erhöhte BUN und Kreatinin, was Nierenschäden indizierte (Abb. 2c, d). Anschließend untersuchten wir die Interaktion zwischen GnP und 5-ASA, einem weit verbreiteten Antiphlogistikum, das Leber- und Nierenschäden verursacht. Die Ko-Verabreichung von GnP10 oder GnP50 mit CDDP erhöhte ALT und induzierte Leberschäden (Abb. 3a), während die Ko-Verabreichung mit 5-ASA BUN und Kreatinin erhöhte und Nierenschädigungen hervorrief (Abb. 3c, d). Danach prüften wir die Interaktion zwischen GnP und PQ, einem weit verbreiteten Agrochemikalien, die Leber- und Nierenschäden verursacht. Die Ko-Verabreichung von GnP10 und PQ erhöhte BUN- und Kreatininwerte und induzierte Nierenschäden (Abb. 4c, d), nicht jedoch Leberschäden (Abb. 4a, b). Die Ko-Verabreichung der kleinsten getesteten Goldpartikel, GnP10, mit CDDP, 5-ASA oder PQ führte zu den höchsten ALT-, BUN- und Kreatininwerten dieser Studie. Die 10-mal größeren Partikel GnP100 verursachten bei Ko-Verabreichung mit CDDP, 5-ASA oder PQ keine Leber- oder Nierenschäden. Diese Ergebnisse zeigen, dass GnP toxisch wird, wenn Partikel unter 100 nm Durchmesser mit CDDP, 5-ASA oder PQ ko-verabreicht werden.

Abbildung 3: Effekt von Goldnanopartikeln auf 5-Aminosalicylsäure-induzierte Toxizität. Mäuse erhielten intraperitoneale Injektionen von 5-Aminosalicylsäure (5-ASA) à 0 (offene Balken) oder 500 mg/kg (gefüllte Balken) zusammen mit einer intravenösen Injektion von Vehikel oder Goldnanopartikeln (4 mg/kg). Nach 24 h wurden Serumwerte von ALT (a) und AST (b) sowie Plasmaspiegel von BUN (c) und Kreatinin (d) bestimmt. Daten als Mittelwert ± SEM (n = 4). Signifikanter Unterschied (*P < 0,05, **P < 0,01) zwischen Vehikel- und 5-ASA-behandelten Gruppen.

Abbildung 4: Effekt von Goldnanopartikeln auf Paraquat-induzierte Toxizität. Mäuse erhielten intraperitoneale Injektionen von Paraquat (PQ) à 0 (offene Balken) oder 50 mg/kg (gefüllte Balken) zusammen mit einer intravenösen Injektion von Vehikel oder Goldnanopartikeln (4 mg/kg). Nach 24 h wurden Serumwerte von ALT (a) und AST (b) sowie Plasmaspiegel von BUN (c) und Kreatinin (d) bestimmt. Daten als Mittelwert ± SEM (n = 4). Signifikanter Unterschied (*P < 0,05, **P < 0,01) zwischen Vehikel- und PQ-behandelten Gruppen.

Die histologische Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Nierengewebe nach Ko-Verabreichung von GnP10 mit CDDP, 5-ASA oder PQ (Abb. 5) zeigte Tubulusschäden, was auf die Induktion einer akuten Nierenschädigung hindeutete. Anschließend maßen wir IL-6 und TNF-α im Serum, um die Ursache der GnP10-induzierten akuten Nierenschädigung zu erforschen. Abbildung 6 zeigt die Serum-IL-6-Werte 3 h nach Ko-Verabreichung von GnP10 mit CDDP, 5-ASA oder PQ. IL-6 war in der GnP10-Allein-Gruppe nicht nachweisbar, stieg jedoch bei Ko-Verabreichung mit CDDP, 5-ASA oder PQ an. TNF-α war in keiner Gruppe nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Dies deutet darauf hin, dass IL-6 an der akuten Nierenschädigung durch GnP10 und CDDP, 5-ASA oder PQ beteiligt ist.

Abbildung 5: Histologische Analyse von Nierengeweben goldnanopartikel-behandelter Mäuse. 24 h nach intravenöser Verabreichung von nur GnP10 (a), GnP10 mit CDDP (b), GnP10 mit 5-ASA (c) und GnP10 mit PQ (d) wurden Gewebe entnommen, mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, geschnitten und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Pfeile kennzeichnen Stellen von Nierenschäden.

Abbildung 6: IL-6-Spiegel im Serum, gemessen per ELISA. Mäuse erhielten eine intravenöse Injektion von GnP10 mit CDDP, 5-ASA oder PQ. Zytokinwerte wurden 3 h nach Verabreichung gemessen. Werte als Mittelwert ± Standardfehler (SE; n = 4).

Wir untersuchten den Effekt der Ko-Verabreichung von Goldnanopartikeln und Arzneimitteln auf Nebenwirkungen (Leber- und Nierenschäden). Die kleinste Partikelgröße, GnP10, induzierte bei Ko-Verabreichung mit CDDP, 5-ASA oder PQ Nieren- und Leberschäden. Wir ko-verabreichten GnP10 auch mit Paracetamol, Streptomycin oder Tetracyclin an Mäusen und beobachteten keine Leber- oder Nierenschäden (Daten nicht gezeigt). Wir berichteten zuvor, dass Silica-Nanopartikel in partikelgrößenabhängiger Weise Leberschäden induzieren [23], und Polystyrol-Nanopartikel können bei Ko-Verabreichung mit einem Medikament in partikelgrößenabhängiger Weise Leberschäden verursachen [24]. Xia et al. berichteten, dass kleinere Goldnanopartikel in vitro genotoxischer sind [25]. Zusammengenommen werden Goldnanopartikel durch Interaktionen mit Arzneimitteln hochtoxisch, je kleiner die Partikelgröße ist.

Die Ko-Verabreichung von GnP10 mit Cisplatin, 5-ASA oder PQ erhöhte die IL-6-Werte (Abb. 6). IL-6 wurde weder durch GnP10 allein (Abb. 6) noch durch Verabreichung von CDDP, PQ oder 5-ASA allein erhöht (Daten nicht gezeigt). IL-6 wurde zuvor als an der Induktion von Leber- [26] und akuten Nierenschäden [27, 28] beteiligt berichtet. Wir vermuten, dass GnP10 IL-6 induziert, welches wiederum Leber- und Nierenschäden auslöst, der zugrundeliegende Mechanismus bleibt jedoch unklar. Bauza et al. berichten, dass IL-6 Leberschäden durch Induktion von Transkriptionsfaktoren in Hepatozyten vermittelt [29]. Das Verständnis der Beteiligung zellspezifischer Transkriptionsfaktoren an IL-6-induzierten Leber- und Nierenschäden erfordert weitere Experimente zum Mechanismus der Zytotoxizität von Goldnanopartikeln.

Kürzlich haben Goldnanopartikel als funktionale Biomaterialien in Drug-Delivery-Systemen an Aufmerksamkeit gewonnen [30], und die Krebsbehandlung mit Goldnanopartikeln wird aktiv erforscht. So berichteten Anselmo et al., dass PEG-beschichtete Silica-Gold-Nanopartikel durch Lichtabsorption die lokale Temperatur erhöhten und solide Tumoren thermisch auflösten [31], was Goldnanopartikel als vielversprechende Materialien für die Krebstherapie ausweist. Allerdings fanden wir, dass die Interaktion zwischen dem Antitumor-Mittel Cisplatin und Goldnanopartikeln Nierenschäden induzierte (Abb. 2), was nahelegt, dass der Einsatz von Goldnanopartikeln in der Krebstherapie eine Sicherheitsprüfung bei Ko-Verabreichung mit dem Medikament erfordert.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend verursachte GnP10 Nierenschäden bei Ko-Verabreichung mit CDDP, PQ oder 5-ASA. GnP50 verursachte Nierenschäden nur bei Ko-Verabreichung mit 5-ASA, während GnP100 keine Schäden hervorrief. Wir demonstrierten, dass Goldnanopartikel Nierenschäden verursachen können und dass dieser Effekt durch Interaktionen mit Chemikalien oder Arzneimitteln synergistisch verstärkt werden kann. Weitere Studien auf Basis dieser Daten sind erforderlich, um die toxikologischen Profile von Nanopartikeln, die für diagnostische oder therapeutische Zwecke vorgeschlagen werden, vollständig zu klären.

Materialien und Methoden

Materialien

Suspensionen von Citrat-ligand-beschichteten Goldpartikeln mit 10, 50 und 100 nm Durchmesser wurden von NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, USA) bezogen. Die Partikelgrößenverteilungen wurden mittels Zetasizer (Sysmex Co., Kobe, Japan) und TEM JEOL JEM-1011 Transmissionselektronenmikroskop analysiert. Die mittleren Durchmesser betrugen 15,7 ± 7,0 nm, 53,3 ± 14,2 nm und 87,0 ± 27,1 nm (Abb. 1, Zusatzabb. 1). Wässrige Suspensionen (1 mg/mL) wurden vor Gebrauch durch Sonikation gründlich dispersiert und mit Wasser verdünnt. Das Vorhandensein ionisierten Goldes in den Goldnanopartikel-Suspensionen wurde per ICP-MS geprüft; ionisiertes Gold wurde nicht detektiert. Identische Volumina jeder Suspension wurden in jedes Experiment an Mäuse injiziert. Die geometrischen Partikelgrößen wurden per TEM charakterisiert. Paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Cisplatin und 5-Aminosalicylsäure (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) wurden in Kochsalzlösung gelöst und bei −20 °C bis zum Gebrauch gelagert. Alle Reagenzien waren forschungsgradig.

Tiere

Acht Wochen alte BALB/c-Mäuse (männlich) wurden von Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Japan) bezogen. Die Tiere wurden in kontrollierter Umgebung (Temperatur 23 ± 1,5 °C; 12-h Licht/Dunkel-Zyklus) mit freiem Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser gehalten. Den Mäusen wurde 1 Woche Akklimatisierung vor Experimentbeginn gewährt. Die experimentellen Protokolle entsprachen den ethischen Richtlinien der Teikyo Heisei University Graduate School of Pharmaceutical Sciences, zusammengestellt aus den Richtlinien für Tierversuche der Japanese Association for Laboratory Animal Sciences.

Biochemische Analysen

Serum-Alaninaminotransferase (ALT), Serum-Aspartataminotransferase (AST), Blutharnstoffstickstoff (BUN) und Kreatinin (Cr) wurden mittels kommerzieller Kits (Wako Pure Chemical Industries) gemäß Herstellerprotokoll gemessen. Kurz: 10 µL Serum wurden mit 1 mL Farbreagenz A (enthält Urease) kombiniert und 15 min bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 1 mL Farbreagenz B erfolgte erneute Inkubation 10 min bei 37 °C. Die Absorption wurde bei 570 nm gemessen. Interleukin (IL)-6 und TNF-α wurden per Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit (BioSource International, CA, USA) analysiert. Alle Analysen erfolgten strikt gemäß Herstelleranweisungen.

Histologische Analyse

24 h nach Dosisapplikation wurden die Tiere euthanasiert, die Lebern entnommen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach Verarbeitung und Schnitt wurden dünne Gewebeschnitte mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt zur histologischen Beurteilung.

Statistische Analyse

Statistische Analysen erfolgten mit Statcel Add-in Forms, 3rd Excel Software (EMS Publication Co., Ltd., Saitama, Japan). Alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Experimentalgruppen wurden mit dem Dunnett-Test bestimmt; ein P-Wert < 0,05 galt als signifikant.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend.

Abkürzungen

ALT:

Alaninaminotransferase

AST:

Aspartataminotransferase

BUN:

Blutharnstoffstickstoff

PQ:

Paraquat

Cr:

Kreatinin