Toxizität von Goldnanopartikeln bei Mäusen aufgrund von Nanopartikel-Wirkstoff-Interaktion induziert akute Nierenschädigung

Einführung

Die Nanotechnologie spielt im 21. Jahrhundert eine immer wichtigere Rolle, wobei Nanomaterialien dem Fortschritt in der Nanotechnologie zugrunde liegen. Jüngste Entwicklungen bei der Herstellung von Nanopartikeln haben den weltweiten Einsatz innovativer Nanomaterialien unterstützt [1, 2]. Nanomaterialien haben einen Durchmesser von 100 nm oder weniger, und Beispiele sind Gold-, Silber-, Siliziumdioxid-, Platin- und Titandioxid-Nanopartikel sowie Fullerene und Kohlenstoff-Nanoröhren [3, 4]. Diese Materialien können in der elektronischen Speichertechnologie, der Gen-/regenerativen Medizin und in elektronischen Geräten Anwendung finden und sind die Grundlage für neue Industrien im 21. Jahrhundert [5]. Nanopartikel wie PM2,5 verursachen jedoch schwere Umweltverschmutzung, Atemwegserkrankungen wie Asthma und ischämische Herzkrankheiten [6]. Darüber hinaus können Dieselpartikel, die von Autos emittiert werden, biologische Wirkungen haben, indem sie in das Gehirn und die Fortpflanzungsorgane gelangen [7], faserige Feinpartikel wie Asbest induzieren Mesotheliom und industrielle faserige Nanomaterialien wie Kohlenstoff-Nanoröhrchen können sich negativ auf die menschliche Gesundheit auswirken [8, 9]. Daher bleiben viele Unbekannte bezüglich der biologischen Wirkung von Nanopartikeln.

Gold (Au) hat eine geringe Ionisationstendenz und eine hohe Stabilität und wird seit der Antike als Edelmetall für dekorative Zwecke verwendet. Kürzlich entwickelte Goldnanopartikel werden aufgrund ihrer charakteristischen optischen Eigenschaften häufig in medizinischen und technischen Anwendungen eingesetzt [10, 11] und ihre hervorragenden optoelektronischen Eigenschaften haben zu ihrer Verwendung in organischen Solarzellen, Sensorsonden und leitfähigen Materialien geführt [12, 13] . Goldnanopartikel werden in der chemischen Industrie als Katalysatoren für die Acrylharzsynthese verwendet. Sie weisen im Vergleich zu Platin-Nanopartikeln auch eine überlegene katalytische Aktivität bei niedrigen Temperaturen zur Oxidation von CO auf, was zu ihrer Verwendung als Katalysator zur Abgasreinigung führt. Für die Zukunft werden weitere Anwendungen von Gold-Nanopartikeln erwartet, aber die Toxizität von Gold-Nanopartikeln und ihre potenzielle Wechselwirkung mit Medikamenten wurden noch wenig erforscht.

Das Gebiet der Nanotechnologie erweitert sich, da Forscher die Sicherheit, Pharmakologie und Pharmakokinetik von Nanopartikeln erforschen. Es wurde gezeigt, dass Silica-Nanopartikel Zytotoxizität, Hepatotoxizität und Plazentaschädigung verursachen [14, 15], und Kohlenstoffnanoröhren können ein pulmonales Mesotheliom verursachen [16]. Über die pharmakologischen Wirkungen, die aus Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und Arzneimitteln resultieren, ist jedoch wenig bekannt. In dieser Studie untersuchten wir die Toxizität von Goldpartikeln mit einem Durchmesser von 10, 50 und 100 nm (GnP10, GnP50 bzw. GnP100) bei Mäusen, um ihre Sicherheit bei Säugetieren zu klären. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkungen dieser Nanopartikel auf die Toxizität von Paraquat (PQ, ein bekanntes Hepatotoxin und Nephrotoxin) [17], Cisplatin (CDDP, ein weit verbreitetes Antitumormittel) [18, 19] und 5-Aminosalicylsäure Säure (5-ASA, ein häufiges entzündungshemmendes Mittel) [20].

Ergebnisse und Diskussion

Wir haben zuerst die Partikelgrößen der Goldnanopartikel mit einem Zetasizer gemessen und dann die Partikel mit Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet (Abb. 1a, b, c). Die mittleren Durchmesser der GnP10-, GnP50- und GnP100-Nanopartikel betrugen 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 bzw. 97,0 ± 27,1 nm (Ergänzende Abb. 1). Darüber hinaus aggregieren Goldnanopartikel, wenn sie durch Elektronenmikroskopie gemessen werden, aber nicht, wenn sie Mäusen verabreicht werden. Darüber hinaus haben wir die Goldionenkonzentration durch ICP-MS gemessen, aber es wurden keine Ionen nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Die Oberflächen der Goldnanopartikel wurden mit Zitronensäure modifiziert, um die Affinität der Nanopartikel für Wasser zu erhöhen, aber diese Modifikation zeigte keine andere Funktionalität.

Ultrastrukturen von Goldnanopartikeln. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von GnP10 (a ), GnP50 (b ) und GnP100 (c ) Nanopartikel

Wir untersuchten, ob GnP Hepatotoxizität und Nephrotoxizität aufweist, indem wir Mäusen eine maximale Dosis von 4 mg/kg durch die Schwanzvene verabreichten. Bei alleiniger Verabreichung von Gold-Nanopartikeln wurde keine Hepatotoxizität oder Nephrotoxizität beobachtet (Abb. 2). Die ALT- und AST-Werte von Mäusen, denen GnP10, 50 und 100 allein verabreicht wurden ( 2a , b) waren ähnlich wie die Kontrollwerte, ebenso wie die BUN- und Cr-Werte. Eine einmalige Verabreichung von GnP an Mäuse verursachte weder Leber- oder Nierenschäden noch Herz-, Lungen- oder Milzschäden (Ergänzende Abb. 2), was darauf hinweist, dass Gold-Nanopartikel bei alleiniger Verabreichung an Mäuse nicht toxisch sind.

Wirkung von Goldnanopartikeln auf die durch Cisplatin induzierte Toxizität. Mäusen wurde Cisplatin (CDDP) mit 0 (offene Balken) oder 100 µmol/kg (durchgezogene Balken) intraperitoneal injiziert, zusammen mit einer IV-Injektion von Vehikel oder Gold-Nanopartikeln (4 µg/kg). 24 Stunden nach der Injektion sind die Serumspiegel der Leberenzyme Alaninaminotransferase (ALT; Panel a ) und Aspartataminotransferase (AST; Panel b ) und Plasmaspiegel von Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN; Panel c .) ) und Kreatinin (Cr; Panel d ) wurden mit handelsüblichen Kits bestimmt (siehe Abschnitt „Biochemische Analysen“). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM; n .) dargestellt =4). Signifikanter Unterschied (*P <0,05, **P <0,01) zwischen Vehikel- und CDDP-behandelten Gruppen

Es wurde berichtet, dass Leber- und Nierenschäden durch die gleichzeitige Verabreichung von Silica-Nanopartikeln, Nanoclays oder Polystyrol-Nanopartikeln mit Medikamenten oder Chemikalien induziert werden [14, 21, 22]. Aus diesem Grund haben wir Gold-Nanopartikel zusammen mit PQ (einem Leber-Nieren-Toxin) oder den Medikamenten CDDP oder 5-ASA (die lebernephrotoxische Wirkungen verursachen) verabreicht. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Wechselwirkung zwischen Goldnanopartikeln und CDDP. Die gleichzeitige Verabreichung von GnP10 oder GnP50 und CDDP erhöhte ALT und induzierte Leberschäden (Fig. 2a) und die gleichzeitige Verabreichung von GnP10 und CDDP erhöhte BUN und Cr, was eine Nierenschädigung induziert (Fig. 2c, d). Anschließend untersuchten wir die Wechselwirkung zwischen GnP und 5-ASA, einem weit verbreiteten entzündungshemmenden Medikament, das Leber- und Nierenschäden verursacht. Die gleichzeitige Verabreichung von GnP10 oder GnP50 mit CDDP erhöhte ALT und induzierte Leberschäden (Fig. 3a), während die gleichzeitige Verabreichung mit 5-ASA BUN und Cr erhöhte und eine Nierenschädigung induzierte (Fig. 3c, d). Als nächstes untersuchten wir die Wechselwirkung zwischen GnP und PQ, einer weit verbreiteten Agrochemikalie, die Leber- und Nierenschäden verursacht. Die gleichzeitige Verabreichung von GnP10 und PQ erhöhte die BUN- und Cr-Spiegel und induzierte eine Nierenschädigung (Fig. 4c, d), aber keine Leberschädigung (Fig. 4a, b). Die gleichzeitige Verabreichung der kleinsten getesteten Goldpartikel, GnP10, mit CDDP, 5-ASA oder PQ führte zu den höchsten in dieser Studie beobachteten ALT-, BUN- und Cr-Werten. Die 10x größeren Partikel von GnP100 verursachten bei gleichzeitiger Verabreichung mit CDDP, 5-ASA oder PQ keinen Leber- oder Nierenschaden. Diese Ergebnisse zeigen, dass GnP toxisch ist, wenn Partikel mit einem Durchmesser von weniger als 100 nm zusammen mit CDDP, 5-ASA oder PQ verabreicht werden.

Wirkung von Goldnanopartikeln auf die durch 5-Aminosalicylsäure induzierte Toxizität. Mäusen wurde intraperitoneal 5-Aminosalicylsäure (5-ASA) mit 0 (offene Balken) oder 500 mg/kg (durchgezogene Balken) zusammen mit einer IV-Injektion von Vehikel oder Goldnanopartikeln (4 mg/kg) injiziert. 24 Stunden nach der Injektion sind die Serumspiegel der Leberenzyme Alanin-Aminotransferase (ALT; a ) und Aspartat-Aminotransferase (AST; B) und Plasmaspiegel von Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN; c ) und Kreatinin (Cr; d ) wurden mit handelsüblichen Kits bestimmt (siehe Abschnitt „Biochemische Analysen“). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM; n .) dargestellt =4). Signifikanter Unterschied (*P <0,05, **P <0,01) zwischen Vehikel- und 5-ASA-behandelten Gruppen

Wirkung von Goldnanopartikeln auf die durch Paraquat induzierte Toxizität. Mäusen wurde Paraquat (PQ) mit 0 (offene Balken) oder 50 mg/kg (durchgezogene Balken) intraperitoneal injiziert, zusammen mit einer IV-Injektion von Vehikel oder Gold-Nanopartikeln (4 mg/kg). 24 Stunden nach der Injektion sind die Serumspiegel der Leberenzyme Alanin-Aminotransferase (ALT; a ) und Aspartataminotransferase (AST; b ) und Plasmaspiegel von Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN; c ) und Kreatinin (Cr; d ) wurden mit handelsüblichen Kits bestimmt (siehe Abschnitt „Biochemische Analysen“). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM; n .) dargestellt =4). Signifikanter Unterschied (*P <0,05, **P <0,01) zwischen Vehikel- und PQ-behandelten Gruppen

Die Beobachtung von renalem Hämatoxylin und Eosin nach gleichzeitiger Verabreichung von GnP10 mit CDDP, 5-ASA oder PQ (Fig. 5) zeigte eine Tubulusschädigung, was auf die Induktion einer akuten Nierenschädigung hindeutet. Als nächstes haben wir IL-6 und TNF-α im Serum gemessen, um die zugrunde liegende Ursache der GnP10-induzierten akuten Nierenschädigung zu untersuchen. 6 zeigt Serum-IL-6-Spiegel 3 h nach der gleichzeitigen Verabreichung von GnP10 mit CDDP, 5-ASA oder PQ. IL-6 wurde in der Gruppe mit GnP10 allein nicht nachgewiesen, aber ein Anstieg von IL-6 wurde beobachtet, wenn GnP10 zusammen mit CDDP, 5-ASA oder PQ verabreicht wurde. TNF-α wurde in keiner Gruppe nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legen nahe, dass IL-6 an akuten Nierenschäden beteiligt ist, die durch GnP10 und CDDP, 5-ASA oder PQ induziert werden.

Histologische Analyse von Nierengewebe von mit Goldnanopartikeln behandelten Mäusen. 24 Stunden nach der IV-Verabreichung nur von GnP10 (a ), GnP10 mit CDDP (b ), GnP10 mit 5-ASA (c ) und GnP10 mit PQ (d ) wurden Gewebe gesammelt, mit 4% Paraformaldehyd fixiert, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Pfeile kennzeichnen Stellen mit Nierenschäden

IL-6-Spiegel im Serum, gemessen durch ELISA. Mäuse erhielten eine IV-Injektion von GnP10 mit CDDP, 5-ASA oder PQ. Die Zytokinspiegel wurden 3 h nach der Verabreichung gemessen. Werte sind der Mittelwert ± Standardfehler (SE; n =4)

Wir untersuchten die Wirkung der gleichzeitigen Verabreichung von Goldnanopartikeln und Medikamenten auf Nebenwirkungen (d. h. Leber- und Nierenschäden). Die kleinste Partikelgröße, GnP10, induzierte bei gleichzeitiger Verabreichung mit CDDP, 5-ASA oder PQ Nieren- und Leberschäden. Wir verabreichten Mäusen auch GnP10 zusammen mit Acetaminophen, Streptomycin oder Tetracyclin und beobachteten keine Leber- oder Nierenschädigung (Daten nicht gezeigt). Wir haben zuvor berichtet, dass Siliziumdioxid-Nanopartikel je nach Partikelgröße Leberschäden verursachen [23] und Polystyrol-Nanopartikel bei gleichzeitiger Verabreichung mit einem Medikament je nach Partikelgröße Leberschäden verursachen können [24]. Xiaet al. berichteten, dass kleinere Goldnanopartikel in vitro genotoxischer sind [25]. Zusammengenommen werden Goldnanopartikel aufgrund von Wechselwirkungen mit Medikamenten hochgiftig, wenn die Partikelgröße verringert wird.

Die gleichzeitige Verabreichung von Gnp10 mit Cisplatin, 5-ASA oder PQ erhöhte die IL-6-Spiegel (Fig. 6). IL-6 wurde weder durch die Verabreichung von GnP10 allein ( 6 ) noch durch die Verabreichung von CDDP, PQ oder 5-ASA allein (Daten nicht gezeigt) erhöht. Es wurde bereits berichtet, dass IL-6 an der Induktion von Leber- [26] und akuten Nierenschäden [27, 28] beteiligt ist. Wir glauben, dass Gnp10 IL-6 induziert, das wiederum Leber- und Nierenschäden induziert, aber der zugrunde liegende Mechanismus bleibt unklar. Bauzaet al. berichten, dass IL-6 Leberschäden durch die Induktion von Transkriptionsfaktoren in Hepatozyten induziert [29]. Um die Beteiligung zellspezifischer Transkriptionsfaktoren an IL-6-induzierten Leber- und Nierenschäden zu verstehen, sind weitere Experimente zum Mechanismus der Zytotoxizität von Goldnanopartikeln erforderlich.

In jüngster Zeit haben Goldnanopartikel als funktionelles Biomaterial für Arzneimittelabgabesysteme Aufmerksamkeit erregt [30], und es wird aktiv an der Krebsbehandlung mit Goldnanopartikeln geforscht. Anselmo et al. berichteten, dass PEG-beschichtete Silica-Gold-Nanopartikel die lokale Temperatur bei Absorption von Licht und thermisch aufgelösten soliden Tumoren erhöht [31], was zeigt, dass Gold-Nanopartikel vielversprechende Materialien für die Krebsbehandlung sind. Wir fanden jedoch heraus, dass die Wechselwirkung zwischen dem Krebsmedikament Cisplatin und Gold-Nanopartikeln Nierenschäden induzierte (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass die Verwendung von Gold-Nanopartikeln in der Krebsbehandlung eine Untersuchung ihrer Sicherheit bei gleichzeitiger Verabreichung mit dem Medikament erfordert.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend führte Gnp10 bei gleichzeitiger Verabreichung mit CDDP, PQ oder 5-ASA zu Nierenschäden. GnP50 verursachte nur bei gleichzeitiger Verabreichung mit 5-ASA Nierenschäden, während GnP100 dies nicht tat. Wir haben gezeigt, dass Gold-Nanopartikel Nierenschäden verursachen können und dass dieser Effekt durch Wechselwirkungen mit Chemikalien oder Medikamenten synergistisch verstärkt werden kann. Weitere Studien auf der Grundlage dieser Daten sind erforderlich, um die toxikologischen Profile von Nanopartikeln, die für diagnostische oder therapeutische Zwecke vorgeschlagen werden, vollständig aufzuklären.

Materialien und Methoden

Materialien

Suspensionen von mit Citrat-Ligand bedeckten Goldpartikeln mit einem Durchmesser von 10, 50 und 100 nm wurden von NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, USA) bezogen. Die Größenverteilungen der Partikel wurden unter Verwendung eines Zetasizers (Sysmex Co., Kobe, Japan) und eines TEM JEOL JEM-1011 Transmissionselektronenmikroskops analysiert. Die mittleren Durchmesser betrugen 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 und 87,0 ± 27,1 nm (Abb. 1, ergänzende Abb. 1). Wässrige Suspensionen (1 µg/ml) wurden vor der Verwendung gründlich durch Ultraschall dispergiert und mit Wasser verdünnt. Das Vorhandensein von ionisiertem Gold in den Gold-Nanopartikel-Suspensionen wurde durch ICP-MS untersucht, und es wurde kein ionisiertes Gold nachgewiesen. Identische Volumina jeder Suspension wurden Mäusen für jedes Experiment injiziert. Die geometrischen Größen der Partikel wurden durch TEM charakterisiert. Paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Cisplatin und 5-Aminosalicylsäure (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) wurden in Kochsalzlösung gelöst und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert. Alle Reagenzien waren Forschungsqualität.

Tiere

Acht Wochen alte männliche BALB/c-Mäuse wurden von Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Japan) gekauft. Die Tiere wurden in einer kontrollierten Umgebung (Temperatur 23 ± 1,5 °C; heller 12-h-Hell/Dunkel-Zyklus) mit freiem Zugang zu Standard-Nagerfutter und Wasser gehalten. Den Mäusen wurde 1 Woche Zeit gegeben, um sich zu akklimatisieren, bevor die Experimente begonnen wurden. Die Versuchsprotokolle entsprachen den ethischen Richtlinien der Teikyo Heisei University Graduate School of Pharmaceutical Sciences, die aus den Richtlinien für Tierversuche der japanischen Vereinigung für Labortierwissenschaften zusammengestellt wurden.

Biochemische Analysen

Serum-Alanin-Aminotransferase (ALT), Serum-Aspartat-Aminotransferase (AST), Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) und Kreatinin (Cr) wurden mit kommerziell erhältlichen Kits (Wako Pure Chemical Industries) gemäß den Protokollen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, gesammeltes Serum (10 ml) wurde mit 1 ml Farb-A-Reagens (das Urease enthielt) kombiniert und bei 37 °C für 15 Minuten inkubiert. Nach der Zugabe von 1 ml Farb-B-Reagens wurde die Probe 10 min bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 570  nm gemessen. Interleukin (IL)-6 und TNF-α wurden unter Verwendung eines Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Kits (BioSource International, CA, USA) analysiert. Alle Analysen wurden streng nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Histologische Analyse

24 h nach der Dosisverabreichung wurden die Tiere getötet und die Lebern wurden entnommen und mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Nach der Verarbeitung und dem Schneiden wurden dünne Gewebeschnitte mit Hämatoxylin und Eosin zur histologischen Beobachtung gefärbt.

Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit den Statcel-Add-In-Formularen, 3rd Excel Software (EMS Publication Co., Ltd., Saitama, Japan) durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Signifikante Unterschiede zwischen der Kontroll- und der Versuchsgruppe wurden mit dem Dunnett-Test bestimmt; ein P ein Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend.

Abkürzungen

ALT:

Alanin-Aminotransferase

AST:

Aspartat-Aminotransferase

BUN:

Blutharnstoffstickstoff

PQ:

Paraquat

Cr:

Kreatinin