Autophagie-Inhibitor (LY294002) und 5-Fluorouracil (5-FU) Kombinations-basiertes Nanoliposom für verbesserte Wirksamkeit gegen Plattenepithelkarzinom des Ösophagus

Hintergrund

Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC) ist eine der häufigsten Arten von Speiseröhrenkrebs, die in Ostasien wie China häufiger vorkommt [1, 2]. Die 5-Jahres-Überlebensrate von ESCC beträgt etwa 25 %. Chirurgie ist die wichtigste Behandlungsoption für die ESCC-Behandlung; Es wird jedoch angenommen, dass eine adjuvante Chemotherapie einen großen Einfluss auf die ESCC-Behandlung haben wird [3, 4]. Es wurde berichtet, dass eine chemotherapeutische Behandlung auf der Grundlage eines einzigen Arzneimittelschemas aufgrund der Heterogenität der Krebszellen zu einer geringen therapeutischen Wirksamkeit führte [5]. Krebszellen sind oft resistent gegen einzelne Krebsmedikamente und sind in der Natur nicht wirksam. In dieser Hinsicht wird eine Kombination von zwei oder mehr Wirkstoffen synergistisch wirken, indem sie auf verschiedene zelluläre Ziele abzielt [6, 7]. Es wurde berichtet, dass die Autophagie-Inhibitoren die Multidrug-Resistenz (MDR) von Krebszellen überwinden. Wenn Zellen über eine begrenzte Ernährung und einen begrenzten Wachstumsfaktor verfügen, bietet die Autophagie der Krebsumgebung die dringend benötigte Homöostase und trägt zu ihrem Überleben bei [8]. Autophagie dient auch dazu, die Krebszellen vor Chemotherapeutika zu schützen. In dieser Studie haben wir LY294002 (LY) als Autophagiehemmer ausgewählt [9].

Mehrere Studien haben berichtet, dass Autophagiehemmer in Kombination mit einem Krebsmedikament am besten wirken. In dieser Studie haben wir 5-Fluorouracil (5-FU) als Chemotherapeutikum ausgewählt. 5-FU ist hauptsächlich bei der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen indiziert und wird bei Patienten mit Brust- und anderen Krebsarten eingesetzt [10]. 5-FU hat anstelle von Wasserstoff ein Fluoratom in der C-5-Position des Uracils. Die krebshemmende Wirkung von 5-FU resultiert aus der Regulierung verschiedener Moleküle wie Bax und Bcl-2 und induziert die Apoptose von Krebszellen [11, 12]. Trotz der potenziellen zytotoxischen Wirkung von 5-FU und LY leiden beide Wirkstoffe unter schlechten Wasserlöslichkeits- und Stabilitätsproblemen, was zu einer kurzen Plasmahalbwertszeit und unerwünschten toxischen Wirkungen auf normale Zellen führt [6]. Darüber hinaus induziert eine einfache Cocktailmischung der beiden Antikrebsmittel aufgrund der zufälligen Freisetzung von Medikamenten und der unkontrollierten Verteilung von Medikamenten in verschiedenen Geweben keinen synergistischen Effekt [7]. Daher ist es äußerst wichtig, beide Krebsmedikamente auf eine programmierte und stark kontrollierte Weise zu verabreichen, um ihre therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen.

Nanopartikel wurden als Wirkstoffträger für Krebs-Targeting-Anwendungen umfassend untersucht [13]. Der schwerlösliche Wirkstoff konnte stabil in die Nanopartikel eingebaut und dadurch seine Löslichkeit und Bioverfügbarkeit verbessert werden. Unter allen Trägern wurde das Liposom auf seine Eignung für systemische Anwendungen eingehend untersucht [14, 15]. Frühere Studien haben gezeigt, dass viele kommerzielle liposomale Formulierungen verfügbar sind, darunter Doxil, Myocet, LipoPlatin und so weiter. Die systemische Zirkulation von Liposomen konnte durch die Oberflächenkonjugation von Polyethylen (Glykol) (PEG) als hydrophile Hülle verbessert werden [16]. Die nanoskalige und hydrophile Schicht von PEG würde eine verlängerte Blutzirkulation bewirken und die retikuloendotheliale (RES)-vermittelte Plasmaclearance reduzieren. Außerdem könnte sich NP über einen verbesserten Permeations- und Retentionseffekt (EPR) passiv im Tumorgewebe anreichern [17, 18]. Daher kann erwartet werden, dass, wenn das Chemotherapeutikum und der Autophagie-Inhibitor in den einzelnen Träger integriert werden könnten, diese eine synergistische Antikrebswirkung beim ESCC haben werden.

Bisher war das Hauptziel der vorliegenden Studie die Verabreichung einer Kombination von 5-FU und LY zur Behandlung von ESCC. Zu diesem Zweck wurden 5-FU und LY stabil in das PEGylierte Nanoliposom eingebaut. Es wurde erwartet, dass die frühe Freisetzung des Autophagie-Inhibitors (LY) den Schutzmechanismus von Krebszellen stört und 5-FU danach in den Krebszellen stärker wirkt. Das mit Wirkstoff beladene Liposom wurde hinsichtlich Partikelgröße, Form und Freisetzungsmuster charakterisiert. Zellulärer Aufnahme- und Zelllebensfähigkeitstest wurden in ESCC-Krebszellen durchgeführt. Weiterhin wurde ein Apoptose-Assay mittels Annexin V/PI-Färbung und Hoechst 33382-Färbung durchgeführt. Schließlich wurde eine Antitumor-Wirksamkeitsstudie im Tiermodell mit ESCC-Zell-tragenden Xenotransplantaten durchgeführt.

Methoden

Materialien

5-Fluorouracil wurde von Sigma-Aldrich, China, bezogen. 2-(4-Morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-on (LY294002, LY) wurde von Beijing Huafeng United Technology Corporation, China, bezogen. L-α-Phosphatidylcholin (Ei/Huhn) (EPC), Disteroylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol (2000) (DSPE-PEG) und Cholesterin wurden von Avanti Polar Lipids, China, bezogen. Alle anderen Chemikalien waren von Reagensqualität und wurden für weitere Reinigungen verwendet.

Herstellung von dualen Wirkstoff-beladenen Nanoliposomen

EPC, DSPE-PEG und Cholesterin wurden in einem Methanol-Chloroform-Gemisch (10:4:1 M-Verhältnis (insgesamt 10 mg)) gemischt, und zu diesem organischen Gemisch wurden 5-FU (1,5 mg) und LY (1,5 mg) hinzugefügt. Die organischen Lösungsmittel wurden mit einem Rotationsverdampfer (Büchi, USA) bei 60 °C für 1 h verdampft. Der dünne Lipidfilm wurde 1 h mit dem PBS-Puffer hydratisiert und anschließend durch einen Miniextruder über eine Polycarbonatmembran (200 nm) extrudiert. Das arzneimittelbeladene Nanoliposom wurde durch ein Millipore-Röhrchen mit einem MW von 3500 filtriert. Das arzneimittelbeladene Liposom wurde aus der oberen Kammer gesammelt und das nicht eingeschlossene Arzneimittel wurde durch das HPLC-Verfahren bestimmt. Die Wirkstoffbeladung und Verkapselung wurden unter Verwendung der folgenden Gleichungen berechnet:

Partikelgrößenanalyse

Die Partikelgröße und Größenverteilung der Nanopartikel wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) unter Verwendung von Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments, UK) bestimmt. Die Partikelgröße wurde bei 25 °C nach geeigneter Verdünnung mit destilliertem Wasser gemessen. Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt.

Morphologieanalyse

Die Morphologie von NP wurde zuerst durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; H-7600, Hitachi, Tokio, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV untersucht. Die Proben wurden in ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter geladen und getrocknet. Die NP-Morphologie wurde ferner in der Rasterkraftmikroskopie (AFM) beobachtet. Die Proben wurden auf eine Glimmeroberfläche gelegt.

In-vitro-Release-Studie

Die In-vitro-Freisetzung von 5-FU und LY aus 5-FU- und LY-beladenen PEGylierten Nanoliposomen (FLNP) wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4) bei 37 °C untersucht. Die NP-Dispersion (1 ml mit 1 mg jedes Arzneimittels in einem Träger) wurde in eine Dialysemembran (MW ~ ~3500) gegeben und beide Enden wurden versiegelt. Die Dialysemembran wurde in ein Röhrchen mit 30 ml Freisetzungsmedium gegeben. Das Dialysemembran enthaltende Röhrchen wurde in ein Schüttelbad gegeben und für den erforderlichen Zeitpunkt inkubieren gelassen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden 100 μl der Probe entnommen und durch eine gleiche Menge frischen Puffers ersetzt. Die im Puffer freigesetzte Wirkstoffmenge wurde mit Hilfe der HPLC-Methode untersucht. Es wurde ein Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-(HPLC)-System (Hitachi, Tokio, Japan) verwendet, das aus einem L-2200-Autosampler und einem L-2420-UV-Vis-Detektor besteht. Eine Inertsil C18-Säule (150 mm × 4,6 mm, 5 μm Partikelgröße; Cosmosil, Nacalai Tesque Inc., USA) wurde unter isokratischer Elution der mobilen Phase bei einer Flussrate von 1,0 ml/min und einer Säulentemperatur von 25 ° . verwendet C. Eine gute Linearität wurde zwischen 0,025 und 2 μg/ml für beide Medikamente mit einem Korrelationskoeffizienten (r ² ) um 0,9995. Die LOD (μg/ml) für 5-FU und LY betrug 0,020 bzw. 0,050. Die LOQ (μg/ml) für 5-FU und LY betrugen 0,070 bzw. 0,150.

Zellkultur

Die Speiseröhrenkrebszelllinie EC 9706 wurde in normalen RPMI-Medien mit 10 % FBS und 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin in 5 % CO₂ . kultiviert und 95 % Luftfeuchtigkeit im Luftbefeuchter.

Zelluläre Aufnahmeanalyse

Die zelluläre Aufnahme von NP wurde mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop (CLSM) beobachtet. Zu diesem Zweck wurde mit Rhodamin B beladenes NP hergestellt und durch Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex G-50-Säule mit HEPES-Puffer gereinigt. Die Zellen wurden in 12-Well-Platten ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Rhodamin B-beladenem NP (10 μg/ml) exponiert und 2 h inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 2% Paraformaldehyd (PFA) fixiert und erneut mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann mit DAPI als nuklearem Färbemittel gefärbt. Die Zellen wurden gewaschen und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon TE2000-E Mikroskop) beobachtet.

Die zelluläre Aufnahme wurde weiter unter Verwendung eines Durchflusszytometers beobachtet. Die Zellen wurden in 12-Well-Platten ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Rhodamin B-beladenem NP exponiert und 1 h bzw. 2 h inkubiert. Die Zellen wurden dann extrahiert und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden in PBS-Puffer resuspendiert und unter Verwendung eines Calibur-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers, ausgestattet mit CELLQuest-Software (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA), analysiert

Zytotoxizitäts-Assay

Das zytotoxische Potenzial einzelner Formulierungen wurde durch 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet. Kurz gesagt, 1 × 10 ⁴ Zellen wurden in eine 96-Well-Platte ausgesät und für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit unterschiedlichen Konzentrationen an freiem 5-FU, LY, 5-FU + LY bzw. FLNP exponiert und weitere 24 h inkubiert. MTT-Lösungen wurden hergestellt (5 mg/ml) und 10 μl MTT-Lösung wurden in jede Vertiefung gegeben und 4 h lang inkubiert. Der Formazan-Kristall wurde durch Zugabe von DMSO extrahiert und die Extinktion wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Synergy™ HTX Multi-Mode Microplate Reader) (bei 570 nm) untersucht.

Apoptose-Assay

Die Apoptose der Krebszelle wurde durch das Annexin-V/PI-Färbeprotokoll (BD Biosciences, USA) bestimmt. Kurz gesagt, EC 9706 wurde in eine 12-Well-Platte ausgesät und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden mit freiem 5-FU, LY, 5-FU + LY bzw. FLNP inkubiert und für 24 h weiter inkubiert (1 μg äquivalenter Wirkstoffkonzentration). Die Zellen wurden extrahiert und mit Annexin V-FITC und PI für 15 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt und dann mittels Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung einer FACS CELLQuest-Software (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA) gezählt.

Hoechst 33342 Assay

Die Apoptose der Krebszelle wurde ferner durch das Färbeprotokoll von Hoechst 33342 bestimmt. Kurz gesagt, EC 9706 wurde in eine 12-Well-Platte ausgesät und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden mit freiem 5-FU, LY, 5-FU + LY bzw. FLNP inkubiert und für 24 h weiter inkubiert (1 μg äquivalenter Wirkstoffkonzentration). Die Zellen wurden mit 2% PFA fixiert und mit Hoechst 33342 (1 μg/ml) für 15 Minuten inkubiert. Die Zellapoptose wurde dann unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.

Western Blotting

EC 9706-Zellen wurden ausgesät und mit freiem 5-FU, LY, 5-FU + LY bzw. FLNP behandelt und weitere 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann lysiert und der Überstand wurde einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen und auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (Millipore) geblottet. Die Membranen wurden mit 5% Magermilch blockiert und anschließend mit den spezifischen Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach Inkubation mit dem sekundären Antikörper-Konjugat Meerrettich-Peroxidase wurden Blots unter Verwendung des ECL-Systems (AbClon) zur Signaldetektion freigelegt. Die Filme wurden mit einem Kodak M35-A X-OMAT-Prozessor entwickelt.

In-vivo-Hemmung des Tumorwachstums

Die Tierstudien wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee, Subei People’s Hospital der Provinz Jiangsu, China, durchgeführt. Eine 6 Wochen alte weibliche Nacktmäuse wurde mit 1 × 10 ⁶ . geimpft OE-19-Zellen auf der rechten Flanke der Mäuse in einem 100 μl-Medium. Die Tumoren durften bis 80 mm ³ . wachsen (Tag 10). Das Tier wurde in fünf Gruppen mit sechs Mäusen in jeder Gruppe eingeteilt. Den Mäusen wurden die jeweiligen Formulierungen mit einer festen Dosis von 5 mg/kg injiziert und während der ersten 10 Tage des Experiments dreimal verabreicht. Die Tumorgröße wurde anhand des Tumorvolumens unter Verwendung von Messschiebern gemessen und die Größe mithilfe der Formel geschätzt; Volumen = (Breite ² × Länge)/2.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als mittlere ± ± Standardabweichungen ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde mit t . bestimmt Test und Analyse der Varianz (ANOVA). P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Krebszellen sind oft resistent gegen einzelne Krebsmedikamente und sind in der Natur nicht wirksam. In dieser Hinsicht wird eine Kombination von zwei oder mehr Wirkstoffen synergistisch wirken, indem sie auf verschiedene zelluläre Ziele abzielt. Es wurde berichtet, dass die Autophagie-Inhibitoren die Multidrug-Resistenz (MDR) von Krebszellen überwinden. Mehrere Studien haben berichtet, dass Autophagiehemmer in Kombination mit einem Krebsmedikament am besten wirken. In dieser Studie haben wir 5-Fluorouracil (5-FU) als Chemotherapeutikum und LY294002 (LY) als Autophagiehemmer ausgewählt. Um die Löslichkeits- und Stabilitätsprobleme freier Wirkstoffe auszuräumen, die wiederum zu einer kurzen Plasmahalbwertszeit und einer unerwünschten toxischen Wirkung führen, haben wir 5-FU und LY stabil in das PEGylierte Nanoliposom eingebaut (Abb. 1).

Schematische Darstellung der Herstellung von 5-Fluorouracil und LY-beladenen PEGylierten Nanoliposomen

Herstellung und Charakterisierung von 5-FU- und LY-beladenen Nanoliposomen

Das mit zwei Wirkstoffen beladene Liposom wurde durch ein Dünnfilm-Hydratationsverfahren hergestellt. Die durchschnittliche Partikelgröße des leeren Liposoms betrug ~ 110 nm mit einem ausgezeichneten Dispersitätsindex. Die Partikelgröße des dualen Wirkstoff-beladenen Liposoms (FLNP) stieg auf ~ 150 nm mit einem guten Polydispersitätsindex (PDI ~ 150) (Abb. 2a). Die Zunahme der Partikelgröße wurde hauptsächlich dem Einbau hydrophober Arzneimittel in das Liposom zugeschrieben. Es wurde berichtet, dass eine Partikelgröße von etwa 200 nm die Akkumulation des Arzneimittels in den Tumorgeweben aufgrund des verstärkten Permeations- und Retentionseffekts (EPR) erhöht. Das arzneimittelbeladene Liposom wies eine Langzeitspeicherfähigkeit auf, die dem Vorhandensein von PEG auf seiner Oberfläche zugeschrieben wird, das zur Antifouling-Wirkung beitrug. Darüber hinaus wies FLNP eine mittlere Oberflächenladung von ~ 25 mV auf, was auf seine kolloidale Stabilität hinweist. Die negative Oberflächenladung vermeidet jegliche Wechselwirkungen in den systemischen Kreisläufen.

Physikochemische Charakterisierungen von FLNP. a Partikelgrößenverteilung von FLNP nach der DLS-Methode. b TEM-Bild von FLNP. c AFM-Bild von FLNP

Die Morphologie von FLNP wurde zuerst mit TEM beobachtet (Abb. 2b). Wie zu sehen war, waren die Partikel typisch kugelförmig und gleichmäßig im Kupfergitter dispergiert. Eine leicht gräuliche Schale am Umfang wurde dem Vorhandensein von PEG auf seiner Oberfläche zugeschrieben. Die von TEM beobachtete Partikelgröße war im Vergleich zu der von DLS etwas kleiner. Die Partikelgröße aus TEM betrug ~ 130 nm im Vergleich zu ~ 150 nm aus DLS. Der Größenunterschied der Partikel aus zwei Techniken könnte auf den Messzustand zurückgeführt werden. Das TEM misst die Partikel unter getrockneten Bedingungen, während DLS die Partikel unter hydratisierten Bedingungen und die PEG-Kettenverlängerung misst. Die Partikelmorphologie wurde weiter durch AFM bestätigt (Abb. 2c). Die Partikel waren kreisförmig und lagen als abgeflachtes Objekt auf der Glimmeroberfläche vor.

Drug Loading und In-vitro-Drug-Release

FLNP zeigte eine hohe Einschlusseffizienz für beide Medikamente (92,5 % für 5-FU und 86 % für LY) mit einer Wirkstoffbeladung von etwa ~ 16 % w /w . Das Freisetzungsverhalten von 5-FU und LY aus FLNP in vitro wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) beobachtet. Die beiden Komponenten von FLNP werden unter pH 7,4-Bedingungen kontrolliert freigesetzt. Zum Beispiel werden bis zum Ende von 24 Stunden ~ 30 % 5-FU und ~ 40 % LY aus dem Liposom freigesetzt. Die Wirkstofffreisetzung dauerte bis 90 h an, wobei ~ 60 % 5-FU und ~ 75 % LV freigesetzt wurden (Abb. 3). Es sollte beachtet werden, dass die Freisetzungsrate nach 24 h bis 90 h signifikant abnahm, was auf die langsame Diffusion von Wirkstoffen aus dem NP-System hinweist. Eine solche kontrollierte Freisetzung des Arzneimittels wäre für die Krebs-Targeting-Anwendungen von Vorteil. Darüber hinaus weist eine langsame Freisetzung des Arzneimittels unter neutralen Bedingungen auf geringere Nebenwirkungen auf das normale Gewebe hin. Es ist erwähnenswert, dass LY im Vergleich zu 5-FU relativ schneller freigesetzt wird. Dies ist eine vorteilhafte Situation, da die LY die Krebszellen empfindlicher für 5-FU machen würde, was zu einer verstärkten zytotoxischen Wirkung im Tumorgewebe führt.

Freisetzungsprofile von 5-FU und LY aus FLNP in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4). Die Menge des freigesetzten Arzneimittels wurde durch HPLC-Analyse quantifiziert

Zelluläre Internalisierungsstudie

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) wurde durchgeführt, um das subzelluläre Muster von FLNP zu bestimmen. Das Rhodamin B wurde als Fluoreszenzsonde verwendet, um die intrazelluläre Aufnahme der NPs in ESCC zu verfolgen. Wie zu sehen ist (Abb. 4), wurde im zellulären Zytoplasma am Umfang des Zellkerns ein starkes rotes Fluoreszenzsignal beobachtet, das die typische Endozytose-vermittelte Zellaufnahme anzeigt. Die rezeptorvermittelte zelluläre Aufnahme ermöglicht die allmähliche Freisetzung des Arzneimittels in der sauren Umgebung. Die Nanogröße der Partikel ermöglichte die einfache Internalisierung des NP-Systems. Die Ergebnisse zeigten eindeutig, dass das Medikament über einen spezifischen Weg in die Krebszellen gelangt und nicht über die einfache Diffusion. Die zelluläre Aufnahme wurde weiter durch FACS überwacht. Wie zu sehen ist, wurde nach 1 h Inkubation eine bemerkenswerte Aufnahme von NP beobachtet, und die zelluläre Aufnahme nahm mit zunehmender Inkubationszeit (2 h) zu. Die größere zelluläre Aufnahme von NP wird die intrazelluläre Konzentration von eingekapselten Krebsmedikamenten erhöhen, was die therapeutische Wirksamkeit bei ESCC weiter erhöht.

a Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)-Bild von HT-29-Krebszellen nach 2-stündiger Inkubation mit FLNP. Der Zellkern wurde mit DAPI gefärbt und Rhodamin B wurde als Fluoreszenzsonde verwendet. b Durchflusszytometer-Analyse von FLNP nach Inkubation für verschiedene Zeitpunkte

In-vitro-Antikrebswirkung

Die zytotoxische Wirkung einzelner Formulierungen wurde durch den MTT-Assay untersucht (Abb. 5). Wie gezeigt, zeigten sowohl freie Wirkstoffe als auch kombinatorische NP eine typische konzentrationsabhängige zytotoxische Wirkung bei ESCC. Die 5-FU zeigte eine relativ höhere Antikrebswirkung im Vergleich zu der von LY in den Krebszellen. Die Kombination von 5-FU und LY führte zu einer stärkeren zytotoxischen Wirkung im Vergleich zu einzelnen Arzneimitteln. Am wichtigsten ist, dass FLNP im Vergleich zu freien Cocktailkombinationen eine signifikant höhere Antikrebswirkung in Krebszellen aufwies. Der IC50-Wert von 5-FU, LY, 5-FU + LY und FLNP lag bei 2,68 µg/ml, 5,98 µg/ml, 1,54 µg/ml bzw. 0,58 µg/ml. Dies könnte auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass LY die Autophagie in den Krebszellen hemmen und sie besser auf 5-FU ansprechen kann. Es sollte beachtet werden, dass FLNP aufgrund einer stärker programmierten Freisetzung von Medikamenten auf kontrollierte Weise wirksamer war als freie Cocktailkombinationen. Die schnellere Freisetzung von LY aus FLNP führt zu einer Autophagie-Hemmung, die die Empfindlichkeit von Krebszellen gegenüber 5-FU verbessert, was zu mehr Zelltod führt [19]. Es wurde berichtet, dass 5-FU nach Eintritt in die Krebszellen über Fluoruridinmonophosphat (FUMP) in Fluoruridintriphosphat (FUTP) umgewandelt oder über zwei verschiedene Wege in Fluordesoxyuridintriphosphat (FdUTP) metabolisiert wird. Das FdUTP fungiert als Substrat für die Thymidylat-Synthase (TS) und blockiert die Nukleotidsynthese. Der 5-FU-Metabolit bindet an die Nukleotidbindungsstelle von TS und hemmt die Nukleotidsynthese. Dieser Zyklus führt zur Erschöpfung von Desoxythymidintriphosphat (dTTP), was die DNA-Synthese verhindert und zu einem verstärkten Absterben von Krebszellen führt [20, 21].

Zelllebensfähigkeit von HT-29-Krebszellen nach Inkubation mit freiem 5-FU, LY, 5-FU + LY bzw. FLNP. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den MTT-Assay bestimmt

Apoptose-Aufsatz

Die Apoptosewirkung der Formulierung wurde durch das Annexin-V/PI-Färbeverfahren bewertet (Fig. 6a, b). Dies wird es ermöglichen, die Apoptosewirkung sowohl des individuellen als auch des Kombinationswirkstoffsystems zu bestimmen. In Übereinstimmung mit dem MTT-Assay führte 5-FU (~ 20 %) im Vergleich zu LY (~ 12 %) zu einer stärkeren Apoptose von Krebszellen, während die 5-FU + LY-Kombination einen stärkeren apoptotischen Zelltod induzierte (~ 30 %). Verglichen mit jeder anderen Gruppe induzierte FLNP eine stärkere Apoptose (~~48%) von Krebszellen, was darauf hindeutet, dass die rezeptorvermittelte zelluläre Aufnahme die intrazelluläre Konzentration von Krebsmedikamenten stark erhöhte, was zu einer höheren therapeutischen Wirkung führte. Ein wichtiger Grund für die stärkere Antikrebswirkung von FLNP wurde hauptsächlich der sequentiellen Freisetzung von verkapselten Arzneimitteln zugeschrieben, wobei LY die Tumorzellen sensibilisiert und 5-FU seine starken zytotoxischen Wirkungen induziert. Krebstherapien wirken, indem sie Apoptose in Krebszellen induzieren, ohne die umliegenden normalen Zellen zu schädigen. Die bemerkenswerte apoptotische Aktivität von FLNP wurde hauptsächlich auf die höhere Akkumulation von Nanopartikeln in den Zellen über die Endozytoseaufnahme und die sequentielle Freisetzung von Wirkstoffen in die intrazelluläre Umgebung zurückgeführt, die zu einem synergistischen therapeutischen Effekt führten. Es wurde erwartet, dass eine frühzeitige Freisetzung des Autophagie-Inhibitors (LY) den Schutzmechanismus der Krebszellen stört und 5-FU danach in den Krebszellen stärker wirkt.

Repräsentative durchflusszytometrische Analyseergebnisse der Zellapoptose von HT-29-Krebszellen nach Inkubation mit freiem 5-FU, LY, 5-FU + LY bzw. FLNP. Unten links, lebende Zellen; unten rechts, frühe apoptotische Zellen; oben rechts, spätapoptotische Zellen; und oben links nekrotische Zellen

Western Blot-Analyse

Der Wirkungsmechanismus von Formulierungen wird durch Western-Blot-Analyse bestimmt (Abb. 7). Die Expression von pro-apoptotischen und anti-Apoptose-Proteinspiegeln bei Exposition gegenüber entsprechenden Formulierungen ist in 8 dargestellt. p53 ist einer der wichtigen Zellzyklusregulatoren, und seine Herunterregulierung ist mit einem erhöhten Überleben von Krebszellen verbunden. Es ist ersichtlich, dass Formulierungen die Expressionsniveaus von p53 signifikant herunterregulierten, was auf die bemerkenswerte Wirkung auf die ESCC-Zellen hinweist. Es wurde berichtet, dass DNA-Schäden zur Aktivierung der Caspase-Kaskade führen, die zur Spaltung von PARP-1 führt, das als Kennzeichen der Zellapoptose gilt [22, 23]. Unsere Ergebnisse zeigten eindeutig, dass 5-FU und LY einzeln die Expression von Caspase-3 und PARP erhöhten, während FLNP wie erwartet eine bemerkenswerte Expression dieser Proteinmarker induzierte, was auf eine überlegene Antikrebswirkung hinweist. Konsequenterweise hat FLNP die Expression des anti-apoptotischen Proteins (Bcl-2) signifikant herunterreguliert, was auf seine Wirksamkeit zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit bei ESCC hinweist.

Western-Blot-Analyse von HT-29-Krebszellen nach Inkubation mit freiem 5-FU, LY, 5-FU + LY bzw. FLNP. Western-Blot-Analyse von gespaltener Caspase-3, PARP, Bcl-2 und p53 wurde bestimmt

In-vivo-Antitumor-Wirksamkeitsstudie im Tiermodell. Die Formulierungen freies 5-FU, LY, 5-FU + LY bzw. FLNP wurden Tumormäusen verabreicht und die Wirksamkeit wurde 20 Tage lang untersucht

In-vivo-Analyse der Hemmung des Tumorwachstums

Den Mäusen wurden die entsprechenden Formulierungen in Mäuse injiziert und das Tumorvolumen wurde bis 20 Tage notiert. Wie zu sehen ( 8 ) zeigte die Kontrollgruppe eine stetige Zunahme des Tumorvolumens zu jedem Zeitpunkt bis zum 18. Tag. Im Vergleich zur Kontrolle kontrollierten freie Medikamente das Wachstum des Tumors; es war jedoch nicht zufriedenstellend. Die Cocktailmischung aus zwei Medikamenten war bei der Kontrolle des Tumorvolumens relativ wirksamer als die einzelnen Medikamente. Wichtig ist, dass FLNP signifikant (p <0,05; p < 0,0001) höhere Antitumorwirksamkeit im Vergleich zu jeder anderen Gruppe. Das endgültige Tumorvolumen betrug ~ 500 mm ³ im Vergleich zu ~ 1400 mm ³ für unbehandelte Mäuse. Die signifikant höhere Antitumorwirkung im Tumormodell wurde den Nanopartikeln zugeschrieben, die sich aufgrund der verstärkten Permeations- und Retentionswirkung in den Tumorgeweben anreichern könnten. Auch die kontrollierte Freisetzung von Medikamenten in das Tumorgewebe trug zu seiner höheren Wirksamkeit bei [24].

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend wurde 5-Fluorouracil (5-FU) und LY294002 (LY)-beladenen PEGylierten Nanoliposom erfolgreich hergestellt, um Plattenepithelkarzinome des Ösophagus (ESCC) zu bekämpfen. FLNP zeigte eine rezeptorvermittelte zelluläre Aufnahme, die die allmähliche Freisetzung des Arzneimittels in der sauren Umgebung ermöglicht. Die Kombination von 5-FU und LY führte zu einer stärkeren zytotoxischen Wirkung im Vergleich zu einzelnen Arzneimitteln. Am wichtigsten ist, dass FLNP im Vergleich zu freien Cocktailkombinationen eine signifikant höhere Antikrebswirkung in Krebszellen aufwies. Die schnellere Freisetzung von LY aus FLNP führt zu einer Autophagie-Hemmung, die die Empfindlichkeit von Krebszellen gegenüber 5-FU verbessert, was zu mehr Zelltod führt. Konsequenterweise induzierte FLNP im Vergleich zu allen anderen Gruppen eine stärkere Apoptose (~~48%) von Krebszellen. Die Western-Blot-Analyse zeigte deutlich, dass 5-FU und LY einzeln die Expression von Caspase-3 und PARP erhöhten, während FLNP wie erwartet eine bemerkenswerte Expression dieser Proteinmarker induzierte, was auf die überlegene Antikrebswirkung hindeutet. Wir glauben, dass die programmierte Freisetzung von Autophagie-Inhibitor und Chemotherapeutikum aus einem einzigen Nanoträger die Aussicht auf eine Krebstherapie bei ESCC erhöhen wird. A broader study on different squamous cell carcinoma and development of the orthotropic model and patient-derived xenograft (PDX) model will be the subject of future investigation.

Abkürzungen

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Enhanced permeation and retention effect

ESCC:

Esophageal squamous cell carcinoma

FLNP:

5-FU and LY-loaded lipid nanoparticles