Vergleich zwischen Folsäure und gH625-Peptid-basierter Funktionalisierung von magnetischen Fe3O4-Nanopartikeln für eine verbesserte Zellinternalisierung

Hintergrund

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​ist eine dynamische Schnittstelle zwischen Blut und Gehirn, die eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des zentralen Nervensystems (ZNS) spielt. Die Hauptkomponenten der BHS sind die Endothelzellen (d. h. Astrozyten und Perizyten), die eine kontinuierliche Schicht bilden, die die innere Oberfläche der Mikrogefäße des Gehirns bedeckt. Sie sind durch Tight Junctions miteinander verbunden, die sowohl für die Kontrolle der Gefäßpermeabilität der BHS [1] als auch für den Schutz des Gehirns vor verschiedenen zirkulierenden Toxinen und anderen schädlichen Molekülen entscheidend sind [2, 3]. Neuronen und Mikroglia, die andere Komponenten der neurovaskulären Einheit sind, spielen bei der BHS eine andere Rolle [4, 5].

Aufgrund der Endothelzellen-Endlosschicht passieren 98 % der niedermolekularen Arzneimittel und 100 % der großmolekularen Arzneimittel die BHS nicht, sodass die Arzneimittel nicht an das Hirngewebe abgegeben werden [6]. Um effiziente Verabreichungssysteme für die Behandlung vieler Hirnerkrankungen zu entwickeln, ist es daher entscheidend, die Fähigkeit der Träger zu untersuchen, die BHS zu überwinden [7].

In den letzten zehn Jahren wurden auf Nanopartikeln basierende Systeme als wirksame Therapeutika für die gezielte Krebsbehandlung und -therapie untersucht. In diesem Zusammenhang haben organisch funktionalisierte magnetische Eisennanopartikel (MNPs) großes Interesse auf sich gezogen, da sie die Vielseitigkeit der Oberflächenfunktionalisierung mit den magnetischen Eigenschaften und der nicht toxischen biokompatiblen Natur ihres Kerns kombinieren. MNPs sind weit verbreitet für theranostische Anwendungen (diagnostisch und therapeutisch) wie Protein- und Zellsortierung und -manipulation [8, 9], Zellmarkierung [10, 11], magnetisch kontrollierte Wirkstoffabgabe [12, 13], Magnetresonanztomographie (MRT) [14, 15] und Hyperthermie [16,17,18,19]. Um effizient für biomedizinische Anwendungen genutzt zu werden, sollten MNPs in der Lage sein, Zellmembranen zu durchqueren und insbesondere die verschiedenen biologischen Barrieren zu überwinden. Die Modifizierung der MNP-Oberfläche mit funktionellen Molekülen wurde oft verwendet, um ihre Zellinternalisierung zu verbessern, aber in vielen Fällen bleibt die Überquerung der BHS ein Problem.

In diesem Zusammenhang ist die Verwendung von zelldurchdringenden Peptiden (CPPs) zu sehen, einer Gruppe relativ kurzer Peptide (5–40 Aminosäuren), die entweder aus natürlichen Quellen oder aus synthetisch entworfenen Konstrukten stammen und die Membrandoppelschicht leicht durchqueren können als vielversprechender Ansatz. Unter den zahlreichen verfügbaren CPPs wurde kürzlich das 20-Reste-Peptid gH625, das vom Glykoprotein H (gH) des Herpes-simplex-Virus 1 abgeleitet ist, entwickelt und verwendet, um die BHS zu überwinden, um die Aufnahme einer Vielzahl von Ladungen zu verbessern [20, 21] in das Zytosol.

In der vorliegenden Studie wurden MNPs mit zwei verschiedenen Klassen von Targeting-Beschichtungen funktionalisiert, die beide auf einer Kopplungsschicht aus 3-Aminopropylphosphonsäure (NH₂ -PA). Die beiden Beschichtungen wurden durch Verbindung mit dem NH₂ . erhalten -PA-modifizierte MNPs (NH₂ .) @MNPs) entweder das gH625 (gH625@MNPs) zellpenetrierende Peptid oder PEG und Folsäure (PEG,FA@MNPs) Moleküle. Insbesondere die Einführung von Folsäure (FA) in die PEGylierten Nanopartikel zielt darauf ab, sowohl die zelluläre Aufnahme in Tumorzellen durch FA-Rezeptor-vermittelte Internalisierung [22] als auch die Biokompatibilität des gesamten Nanosystems [23] zu verbessern. Die Auswirkungen der beiden Oberflächenbeschichtungen auf die intrazelluläre Aufnahme von MNP in primäre mikrovaskuläre Endothelzellen aus dem menschlichen Gehirn (HBMECs) wurden durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie bewertet. Zu diesem Zweck wurden in beide Systeme lumineszierende Sonden eingebaut. Insbesondere wurde gH625 mit der 4-Chlor-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD)-Sonde markiert, während ein Carboxy-X -Rhodamin (Rhod)-Sonde wurde der Hülle von PEG,FA@MNPs hinzugefügt.

Die Untersuchung der intrazellulären Aufnahme von gH625-modifizierten MNPs in Endothelzellen und ihr Vergleich mit FA-modifizierten MNPs wurde unseres Wissens noch nie zuvor berichtet.

Neben der Fähigkeit, die BHS zu durchqueren, ist das Zielen auf Hirntumorzellen eine weitere wichtige Voraussetzung für Therapeutika für Hirntumore. Daher wurde auch die zelluläre Internalisierung der beiden unterschiedlich beschichteten MNPs in einem der häufigsten menschlichen malignen Gliome, dem A-172-Glioblastom, untersucht.

Beachten Sie, dass, obwohl gH625-funktionalisierte Eisen-Nanopartikel kürzlich von Perillo et al. [24] berichten wir in der vorliegenden Arbeit über eine andere Synthesestrategie, die auf einer äußerst vielseitigen Phosphonsäureplattform basiert. Insbesondere ermöglicht die Phosphonsäurechemie die Bildung starker Bindungen zwischen MNPs und Phosphonsäuremonoschichten, deren Stabilität mit der von silanisierten MNPs vergleichbar ist. Da außerdem die P-O-P-Selbstkondensation vernachlässigbar ist, überwindet die Verwendung von Phosphonic-Linkern die Nachteile der Oligomerbildung, die häufig bei der Verwendung von Silanen auftreten [25].

Methoden

Materialien

Alle für die MNP-Synthese und Funktionalisierung verwendeten Reagenzien, FeCl₂ ·4H₂ O, FeCl₃ ·6H₂ O, 3-Aminopropylphosphonsäure, Methoxypolyethylenglycolessigsäure N -Succinimidylester (PEG-NHS) mit Molekulargewicht 5000 Da, Folsäure, N -Hydroxysuccinimid (NHS) und Carboxy-X -Rhodamin N -Succinimidylester (Rhod-NHS) wurden von Sigma-Aldrich bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-geschützten Aminosäuren, die für die Peptidsynthese verwendet wurden, wurden von Romil Del Chimica, Chemicals gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet. Das Wasser hatte Milli-Q-Qualität (18,2 MO cm) und wurde durch einen 0,22-μm-Filter gefiltert.

Synthese von MNP

Blanke Eisenoxid-MNPs wurden durch alkalische Copräzipitation von Fe ³⁺ . synthetisiert und Fe ²⁺ , nach dem in der Literatur beschriebenen Protokoll [26]. Kurz gesagt, FeCl₂ ·4H₂ O und FeCl₃ ·6H₂ O (Molverhältnis 1:2) wurden in Wasser (50 ml) unter einem N₂ . gelöst Atmosphäre unter kräftigem Rühren. NH₃ 25 % in H₂ O (5 ml) wurde bei 80 °C zu der Lösung gegeben und die Reaktion wurde 30 Minuten lang fortgesetzt. Die resultierende Suspension wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit ultrareinem Wasser gewaschen. Die erhaltenen nackten magnetischen Nanopartikel (nackte MNPs) wurden durch magnetisches Dekantieren aus dem Lösungsmittel isoliert.

Synthese von gH625

Das Peptid wurde wie zuvor beschrieben [27] unter Anwendung der Standard-Festphasenmethode 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) hergestellt. Kurz gesagt wurden 50 μmol des Peptids auf einem Wang-Harz (0,75 mmol/g) durch aufeinanderfolgende Entschützungs- und Kupplungszyklen synthetisiert. Das harzgebundene Peptid wurde dann mit 4-Chlor-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) umgesetzt; die Reaktion wurde über Nacht in Gegenwart von DIPEA durchgeführt. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten und durch Behandlung mit einer Mischung aus Trifluoressigsäure (TFA) und Radikalfängern entschützt und nach Ausfällen in eiskaltem Ethylether ausgefällt. Das Peptid wurde in Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Die Charakterisierung des Rohpeptids wurde durch Elektrospray-Ionisation (ESI) LC-MS mit einem linearen Gradienten von Acetonitril (0,1 % TFA) in Wasser (0,1 % TFA) von 20 bis 80 % in 15 min durchgeführt. Anschließend wurde es durch präparative Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gereinigt.

Synthese von N -Hydroxysuccinimidester der Folsäure (FA-NHS)

FA-NHS wurde nach dem folgenden veröffentlichten Verfahren hergestellt [28]. 500 Milligramm Folsäure (FA) wurden in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) mit 240 ml Triethylamin gelöst. NHS (260 mg) und N ,N -Dicyclohexylcarbodiimid (470 mg) wurden zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln umgesetzt. Das Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt. Anschließend wurde die DMSO-Lösung im Vakuum eingeengt und FA-NHS in Diethylether ausgefällt. Das Produkt wurde mehrmals mit wasserfreiem Ether gewaschen und an der Luft getrocknet.

Synthese funktionalisierter MNPs

Synthese von NH₂ @MNPs

MNP (200 mg) wurden in H₂ . dispergiert O (25 ml) mit einem Ultraschallbad für 30 Minuten. NH₂ -PA (100 mg) wurde zugegeben und die Suspension wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel wurden magnetisch abgetrennt und viermal mit H₂ . gewaschen O und dann mit Ethanol und an der Luft getrocknet.

Synthese von gH625@MNPs

NH₂ @MNPs (300 mg) und gH625 (1,2 mg) wurden in DMSO (20 ml) dispergiert. Die Lösung wurde über Nacht bei 25 °C gemischt. Die erhaltenen Partikel wurden magnetisch getrennt; gewaschen mit DMSO, H₂ O und Ethanol; und unter Luft getrocknet.

Synthese von PEG,FA@MNPs

NH₂ @MNPs (300 mg), PEG-NHS (30 mg), FA-NHS (3 mg) und Rhod-NHS (3 mg) wurden in DMSO (15 ml) dispergiert und die Lösung über Nacht bei 25 °C gemischt . Die erhaltenen Partikel wurden magnetisch getrennt; gewaschen mit DMSO, H₂ O und Ethanol; und unter Luft getrocknet.

Beispielcharakterisierungen

Röntgenpulverbeugungsmessungen (XRD) wurden mit einem θ . durchgeführt –θ 5005 Bruker-AXS-Diffraktometer (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) mit Cu Kα-Strahlung bei 40 kV und 30 mA. Die Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS) wurde mit einem PHI 5600-Multitech-ESCA-Auger-Spektrometer mit einer Standard-Al-Kα-Röntgenquelle durchgeführt. Die Analysen wurden mit einem Photoelektronenwinkel von 45° (bezogen auf die Probenoberfläche) mit einem Akzeptanzwinkel von ± 7° durchgeführt. Die XPS-Bindungsenergie (B.E.)-Skala wurde kalibriert, indem der C 1s-Peak aufgrund von Kohlenwasserstoffeinheiten und zufälligem Kohlenstoff bei 285,0 eV zentriert wurde. UV/Vis-Messungen wurden mit einem JASCO V-560 UV/Vis-Spektrophotometer durchgeführt und die Spektren wurden mit einer Auflösung von ± 0,2 nm aufgenommen. Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zeta-Potential-Messungen von MNPs wurden bei 25 °C mit einem Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) mit He-Ne-Laser (633 nm) und einem Rückstreudetektor (173° .) durchgeführt ). Transmissions-FT-IR-Messungen wurden mit einem JASCO FTIR 430-Spektrometer unter Verwendung der KBr-Pellet-Technik aufgezeichnet, wobei 100 Scans pro Spektrum gesammelt wurden (Scanbereich 560–4000 cm ^− 1 , Auflösung 4 cm ^− 1 ).

Zellkultur

Mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Gehirns (HBMEC) und die menschliche Glioblastomzellinie A-172 wurden gemäß der beschriebenen Methode in mit Rattenschwanzkollagen Typ I beschichteten Gewebekulturflaschen bis zur Konfluenz gezüchtet [29]. Kurz gesagt wurden HBMEC in dem Endothelzellmedium gezüchtet, das mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Endothelzellwachstumsergänzungsmittel ergänzt war. Die A-172-Zelllinie wurde in DMEM gezüchtet, das 2 mM Glutamin und 10 % FBS enthielt, wie zuvor beschrieben [30]. In beiden Fällen wurden den Kulturen zusätzlich 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin zugesetzt.

Zelllebensfähigkeitstest

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem [3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H . bestimmt -Tetrazoliumbromid] (MTT)-Test [31]. Unter allen experimentellen Bedingungen wurde die FBS-Konzentration auf 1% reduziert (hungerndes Medium). Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit 7000 Zellen/Vertiefung ausgesät, um während des gesamten Experiments eine optimale Zelldichte zu erhalten. In allen Assays wurden die Zellen zuerst 3 h bei 37 °C mit MTT inkubiert; dann wurde Isopropanol mit 0,04 M HCl zugegeben und die Extinktion nach 1 h in einem Plattenlesegerät (Synergy 2-BioTek) mit einer Testwellenlänge von 570 nm gemessen [32].

Konfokale Mikroskopie

Konfokale Mikroskopie wurde sowohl an HBMEC- als auch an A-172-Glioblastom-Zellen durchgeführt, die auf Mikroskop-Deckgläsern in einer 24-Well-Platte gezüchtet wurden. Nach Inkubationen mit oder ohne MNPs wurden die Zellen durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert und wie bereits beschrieben für die Immunzytochemie aufgearbeitet [33]. Konfokalmikroskopische Analysen wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) Olympus FV1000 durchgeführt, das mit den folgenden Anregungsquellen ausgestattet war:Diodenlaser (405 nm), Mehrlinien-Ar-Laser (457, 488 und 515 nm), HeNe(G)-Laser ( 543 nm) und HeNe(R)-Laser (633 nm). Ein Ölimmersionsobjektiv (60xO PLAPO) wurde verwendet und das emittierte Licht wurde im sequentiellen Modus durch ein Spektralfiltersystem detektiert. Die Detektorverstärkung wurde auf einen konstanten Wert festgelegt, und für alle Proben wurden Bilder an zufälligen Orten im gesamten Bereich des Bohrlochs aufgenommen. Die folgenden Erfassungsparameter wurden verwendet:λ ex/em = 405/425 − 475 nm (blauer Kanal, Kernfärbung durch DAPI); λ ex/em = 488/500 − 530 nm (grüner Kanal, gH625@MNPs-Markierung durch NBD); und λ ex/em = 633/650 − 700 nm (roter Kanal, PEG,FA@MNPs-Markierung durch Rhod). Die quantitative Fluoreszenzanalyse wurde mit der ImageJ-Software (1.50i-Version, NIH) durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von MNPs

Die Gesamtstrategie zur Herstellung von gH625@MNPs und PEG,FA@MNPs aus Fe₃ O₄ Nanopartikel, die durch gemeinsame Fällung erhalten werden, umfassen zwei Schritte, wie in Abb. 1 dargestellt. Der erste Schritt, der für beide Nanopartikelklassen gleich ist, basiert auf der MNP-Funktionalisierung mit einer Phosphonsäure, die eine Aminogruppe trägt (NH₂ -PA). Im zweiten Schritt wird das NH₂ -PA-präfunktionalisierte MNPs (NH₂ .) @MNPs) werden über NHS-Kupplungsreaktionen weiter mit spezifischen funktionellen Molekülen konjugiert. Insbesondere die N -Hydroxysuccinimid-aktivierte Form von gH625, markiert mit NBD, wurde für die Herstellung von gH625@MNPs verwendet, und N -Hydroxysuccinimid-aktivierte Formen von PEG, FA und Rhod wurden verwendet, um PEG,FA@MNPs zu erhalten. Beachten Sie, dass sowohl gH625@MNPs als auch PEG,FA@MNPs mit Lumineszenzsonden (d. h. NBD bzw. Rhod) markiert wurden, um konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Studien durchzuführen.

Reaktionsschema. Reaktionsschritte zur Herstellung funktionalisierter MNPs

Die röntgendiffraktometrische (XRD) Charakterisierung von nackten MNPs, die nach dem Copräzipitationsschritt erhalten wurden, ähnelt der in unseren früheren Veröffentlichungen [34, 35]. Kurz gesagt zeigt ein typisches Muster (Abb. 2a) vier Beugungspeaks (2θ = 30,16°, 35,48°, 43,10° und 57,04°), was mit dem Vorhandensein von Magnetit, Maghemit oder irgendeiner Zwischenzusammensetzung zwischen den beiden Phasen übereinstimmt. Die Gitterkonstante a , die mit 8.389(4) Å in guter Übereinstimmung mit dem Gitterparameter von Bulk-Magnetit (8.396 Å) gefunden wurde, sowie die durchschnittliche Kristallgröße von 11.2, bestimmt mit der Debye-Scherrer-Gleichung, sind mit den vorherigen Werten vergleichbar berichtet [34, 35].

Typische XRD- und XPS-Spektren von MNPs. XRD-Muster von a) nackten MNPs und hochauflösendem Fe 2p_3/2 XPS-Spektralbereiche von b) nackten MNPs und c) NH₂ @MNPs

Beachten Sie, dass da die Kristallstruktur von Fe₃ O₄ Magnetit ist dem von γ-Fe₂ . sehr ähnlich O₃ Maghemit, ist es sehr schwierig, die beiden Phasen durch XRD zu unterscheiden. Aus diesem Grund wurde die Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) verwendet, um die MNPs weiter zu analysieren. Abbildung 2b zeigt Fe 2p_3/2 hochauflösende XPS-Spektren von nackten MNPs. Der bei 710,9 eV beobachtete Schwerpunkt der Bande entspricht dem Fe 2p_3/2 Gipfel. Dieser Wert ist niedriger als der für Fe ³⁺ . berichtete entweder in oktaedrischen Löchern von α-Fe₂ O₃ (711.6 eV) [36, 37] oder in gemischten tetraedrischen und oktaedrischen Löchern von γ-Fe₂ O₃ (711.4 eV) und stimmt mit der gemischten Oxidationsstufe von Fe in Fe₃ . überein O₄ [37, 38].

Schließlich wird in unseren früheren Arbeiten über eine detaillierte magnetische Charakterisierung ähnlicher MNPs berichtet [34, 35].

Der Funktionalisierungsprozess wurde durch FT-IR und XPS evaluiert. Nach Funktionalisierung mit phosphonischen Monoschichten wird das Fe 2p_3/2 Band (Abb. 2c) zeigt keine relevanten Veränderungen, was bestätigt, dass das Fe₃ O₄ Phase bleibt erhalten. Allerdings ist eine leichte Verschiebung (0,4 eV) des Fe 2p_3/2 Schwerpunkt in Richtung niedrigerer Bindungsenergie (B.E) wurde beobachtet, was mit der Verankerung der Phosphon-Monoschicht in Verbindung gebracht wurde. Ähnliche Verschiebungen wurden in der Tat bei der Phosphatadsorption verschiedener Eisenoxide beobachtet [39] und können einem gewissen Ladungstransfer vom Adsorbat auf die Fe-Atome zugeschrieben werden. Das Fe 2p_3/2 Position von 710,5 eV wurde nach allen Funktionalisierungsschritten für die Verankerung von PEG und FA beibehalten.

Abbildung 3 zeigt den Vergleich der Spektralbereiche P2p, N1s und C1s von NH₂ @MNPs, PEG,FA@MNPs bzw. gH625@MNPs. Die P2p-Peakposition (133,2 eV) von NH₂ @MNPs ist typischerweise mit der Anwesenheit der Phosphonsäure assoziiert, die zweizähnig an der Oberfläche verankert ist [40,41,42,43]. Die Position der P2p-Bande in den Spektren von gH625@MNPs und PEG,FA@MNPs ist dieselbe wie die von NH₂ @MNPs-Spektrum, was zeigt, dass die Phosphonmoleküle während der Kopplungsreaktionen für die Immobilisierung von Peptid und Folsäure nicht entfernt werden.

XPS-Charakterisierung funktionalisierter MNPs. Hochauflösende P 2p, C 1s und N 1s XPS Spektralbereiche von a) NH₂ @MNPs, b) PEG,FA@MNPs und c) gH625@MNPs

Die Form und die Peakposition der N1s-Spektren von NH₂ @MNPs stimmen mit dem Vorhandensein des verankerten NH₂ . überein -PA. Die Bande besteht aus zwei unterschiedlichen Komponenten:Die erste bei 399,9 eV ist mit den -NH-Gruppen des verankerten Aminopropylphosphats verbunden, und die zweite bei 401,5 eV zentrierte Komponente ist auf die Wechselwirkung der Aminogruppen mit der Oberfläche von Fe_{3 . zurückzuführen} O₄ durch Protonierung oder Bildung von –H-Bindungen.

Nach der Verankerung von entweder gH625-Peptid oder FA, PEG und Rhod steigt die N1s-Komponente bei 399,8 eV im Vergleich zu der Komponente bei 401,8 eV in Bezug auf protonierte Aminoeinheiten von NH₂ @MNPs. Dieses Inkrement ist auf die überlappenden Signale der N-Atome zurückzuführen, die an der amidischen Bindung (400.2 eV) zwischen dem verankerten Aminopropylphosphat und den konjugierten Molekülen (z. B. gh625, FA, PEG und Rhod) beteiligt sind, sowie der N-Atome von gh625 und FA (bei 399,1 und 400,6 eV).

Das C 1s-Band von NH₂ Das @MNPs-Spektrum besteht aus einem einzelnen Peak bei 285,0 eV, der aliphatischen Kohlenstoffen zugeordnet ist, wie bereits berichtet [40].

In den C1s-Spektren von gH625@MNPs und PEG,FA@MNPs ist die Anwesenheit einer C1s-Komponente bei 288.3 eV auf die Carboxyl- und Amidgruppen der gh625-, FA- und Rhod-Moleküle zurückzuführen.

FT-IR-Spektren von NH₂ @MNPs, gH625@MNPs und PEG,FA@MNPs sind in Abb. 4 dargestellt. In allen Proben zeigen die Spektren nicht die Banden bei 1250 cm ^− 1 aufgrund von P=O und den scharfen Peaks im 900–1050 cm ^− 1 Bereiche aufgrund von P–O–H-Streckung [44,45,46], aber eine breite und starke Bande bei 1040 cm ^− 1 , die mit den Schwingungen des PO₃ . verbunden ist ²⁻ Gruppe an die Eisenoberfläche gebunden. Diese Bande weist nach XPS-Ergebnissen darauf hin, dass die Phosphonsäuren deprotoniert und über P-O-Fe-Bindungen an der Oberfläche verankert sind, wie bereits berichtet [34, 40, 41]. Der IR-Spektralbereich zwischen 1500 und 1700 cm ^− 1 zeigt die Banden, die zu den Amino- und Amidgruppen von gH625 und FA gehörten. Insbesondere Spektrum von NH₂ @MNPs zeigt einen scharfen Peak bei etwa 1650 cm ^− 1 verbunden mit NH₂ Biegen [47]. Nach PEG-, Rhod- und FA-Verankerung 1700–1500 cm ^− 1 Region von PEG,FA@MNPs zeigt aufgrund der Faltung der Schwingungen von nicht reagiertem NH₂ . breitere Bänder , Amidgruppen und Benzolringe von FA und Rhod (1630–1600 cm ^− 1 ) [35]. Analog dazu sind nach der Peptidverankerung die breiten Banden bei etwa 1650–1600 cm ^− 1 kann auf den Beitrag mehrerer Schwingungen zurückzuführen sein, die auf nicht reagiertes NH₂ zurückzuführen sind und aminische Einheiten der Peptidseitenketten und der C=O-Strecke der amidischen Peptidbindungen [48]. Außerdem eine Komponente bei etwa 1540 cm ^− 1 aufgrund der kombinierten δ (N–H)/ν(C–N)-Schwingungen des Peptids [48] sind ebenfalls vorhanden.

FT-IR-Charakterisierung von funktionalisierten MNPs. FT-IR-Spektralbereich im Bereich 850–1900 cm ⁻¹ Bereich von a) NH₂ @MNPs, b) gH625@MNPs und c) PEG,FA@MNPs

Die Verankerung von FA auf MNPs wurde auch durch die UV/Vis-Spektren einer kolloidalen PEG,FA@MNPs-Lösung nachgewiesen. Abbildung 5 vergleicht die Spektren von NH₂ @MNPs und PEG,FA@MNPs kolloidale Dispersionen. Als Referenz wurde das Spektrum einer FA-Lösung (5 μM) hinzugefügt. Eine für FA typische deutliche Bande bei 274 nm ist sowohl in der Referenz- als auch in der kolloidalen PEG,FA@MNPs-Lösung deutlich sichtbar, was das Vorhandensein von FA in den MNPs bestätigt. Beachten Sie, dass die leichte Verschiebung von der FA-NHS-Absorption bei 280 nm auf den Wert von 274 nm nach der Verankerung wahrscheinlich auf die Änderung der Umgebung von freiem FA-NHS und Nanopartikel-verankerten FA zurückzuführen ist. Das Vorhandensein variabler Verschiebungen der Absorptionsbande bei 280 nm nach FA-Oberflächenverankerung oder Konjugation mit anderen Molekülen wurde bereits in der Literatur beobachtet [49,50,51].

UV/Vis-Charakterisierung funktionalisierter MNPs. UV/Vis-Spektren einer 5 μM FA-NHS-Lösung und von NH₂ @MNPs und PEG,FA@MNPs kolloidale Dispersionen. Beachten Sie, dass der in den Spektren von NH₂ . beobachtete hohe Hintergrund @MNPs und PEG,FA@MNPs ist auf die Streuung der kolloidalen Nanopartikeldispersion zurückzuführen

Der mittlere hydrodynamische Durchmesser, der Polydispersitätsindex (PDI) und das Zetapotential funktionalisierter MNPs wurden durch DLS in PBS-Puffer bei pH 7,4 an MNP-Dispersionen wie hergestellt und nach 72 Stunden Alterung bestimmt (Tabelle 1). Die hydrodynamischen Durchmesser von NH₂ -PA@MNPs, gH625@MNPs und PEG,FA@MNPs betrugen 73,0 ± 3,0 nm, 104,0 ± 4,0 nm bzw. 51 ± 2 nm, und die PDI-Werte weisen auf eine ausreichend enge Verteilung der Partikelgröße hin. Wie erwartet erhöhte die Konjugation mit gH625 die Größe der Nanopartikel, während die Verringerung der Größe von PEG,FA@MNPs auf eine bessere Dispersion als bei NH₂ . zurückzuführen ist @MNPs, bezogen auf das Vorhandensein der PEG-Ketten.

Beachten Sie in jedem Fall, dass für alle Systeme ein stark negatives Zetapotential (< − 30 mV) beobachtet wurde. Solche negativen Zetapotential-Werte gewährleisten die Langzeitstabilität und vermeiden eine großflächige Partikelaggregation [52, 53]. Tatsächlich war die negative Oberflächenladung nur geringfügig von der Beschichtung abhängig, sondern resultierte hauptsächlich aus der Kombination des negativ geladenen Kerns von Fe₃ O₄ Nanopartikel [54] und die Wirkung von Phosphonsäuregruppen, wie sie für ähnliche Systeme beobachtet wurde [52, 34]. Daher ermöglicht die Verwendung von Phosphonsäuremonoschichten als Linker im Vergleich zu anderen Synthesestrategien zur Funktionalisierung von MNPs nicht nur die Bildung einer stabilen Bindung zwischen der Oberfläche und den funktionellen Gruppen, sondern induziert auch ein stark negatives Zetapotential. Nach 72 Stunden Alterung sind die Größe und das Zeta-Potential von NH₂ -PA@MNPs, gH625@MNPs und PEG,FA@MNPs bleiben ungefähr gleich, was darauf hindeutet, dass alle dekorierten Oberflächen im Laufe der Zeit stabil sind.

Zelllebensfähigkeit

Die Lebensfähigkeit von HBMEC- und A-172-Zellen, die mit gH625@MNPs und FA,PEG@MNPs inkubiert wurden, wurde mit dem MTT-Assay zu unterschiedlichen Inkubationszeiten und in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von Nanopartikeln (10 und 20 μg/ml) bewertet. Wie in Abb. 6 gezeigt, wurde keine konzentrations- und/oder zeitabhängige (24–48–72 h) zytotoxische Wirkung der dekorierten Systeme auf HBMEC- und A-172-Zellen beobachtet.

Zellengesundheit. Zelllebensfähigkeit von a HBMEC und b A-172-Zellen inkubiert für 24, 48 und 72 h mit gH625@MNPs 10 μg/ml (schwarzer Balken), gH625@MNPs 20 μg/ml (roter Balken), PEG,FA@MNPs 10 μg/ml (blauer Balken ) und PEG,FA@MNPs 20 μg/ml (magentafarbener Balken)

Intrazelluläre Aufnahme

Um zu bestimmen, ob die zellpenetrierende Fähigkeit des gH625-Peptids nach seiner Immobilisierung an der Nanopartikeloberfläche erhalten bleibt, und um die Fähigkeit von gH625 und FA, die BHS zu überwinden, zu vergleichen, wurde die Internalisierung von NBD-markierten gH625@MNPs in menschliche Gehirn-Endothelzellen und Rhod-markierte PEG,FA@MNPs wurden mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersucht.

Nach 24 Stunden Inkubation ist die Aufnahme von PEG-FA@MNPs nicht offensichtlich, während die Internalisierung von gH625@MNPs deutlich sichtbar ist (Abb. 7). Die Konjugation mit gH625 führt zu einer schnelleren Aufnahme und einer fast zweifach höheren Intensität der intrazellulären Fluoreszenz (Abb. 8).

LSM-Fluoreszenzmikroskopaufnahmen von HBMEC. LSM-Fluoreszenzmikroskopie von HBMEC, 24 h inkubiert (b , f ) und 72 h (d , h ) mit NBD-markiertem gH625@MNPs 15 μg/ml (b , d ) und deren Bedienelemente (a , c ) oder Rhod-markiertes PEG,FA@MNPs 15 μg/ml (f , h ) und deren Bedienelemente (e , g ). Maßstabsleiste = 20 μm

Normalisierte Intensitäten der intrazellulären Fluoreszenz. Quantitative Analyse der intrazellulären Fluoreszenz nach HBMEC-Inkubation nach 24 und 72 h mit NBD-markierten gH625@MNPs und Rhod-markierten FA,PEG@MNPs

Bei längeren Inkubationszeiten (72 h) verringern sich die Unterschiede zwischen der Internalisierung der beiden Systeme. Dieses Verhalten ist nicht unerwartet, da bei langen Inkubationszeiten unspezifische Internalisierungsprozesse von FA,PEG@MNPs auftreten können und unsere Ergebnisse bestätigen weiter, was wir zuvor für die Aufnahme von funktionalisierten und unfunktionalisierten Polystiren-Nanopartikeln berichtet haben [55].

Um die Möglichkeit der Verwendung von gH625@MNPs als Therapeutikum für Hirntumore weiter zu untersuchen, wurde die zelluläre Aufnahme von gH625@MNPs und FA,PEG@MNPs unter Verwendung der A-172-Glioblastom-Zelllinie untersucht. Das Glioblastom ist einer der häufigsten primären Hirntumore und auch einer der tödlichsten Krebsarten.

Die zelluläre Aufnahme von gH625@MNPs und FA,PEG@MNPs nach 24 Stunden Inkubation ist vergleichbar, wie in Abb. 9 gezeigt.

LSM-Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Glioblastomzellen. LSM-Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Glioblastomzellen. Zusammengeführte blau-grüne Bilder:Kontrollzellen (a ) und Zellen, die mit 15 μg/ml NBD-markierter gH625@MNPs inkubiert wurden (b ). Zusammengeführte blau-rote Bilder:Kontrollzellen (c ) und Zellen inkubiert mit 15 μg/ml Rhod-markiertem PEG,FA@MNPs (d ). Maßstabsbalken = 20 μm

Dieses Verhalten deutet darauf hin, dass der gH625 in der Lage ist, Gehirntumore mit der gleichen Effizienz wie die häufiger eingesetzten FA-Targeting-Einheiten zu bekämpfen.

Schlussfolgerungen

Fe₃ O₄ nanoparticles have been functionalized with the gH625 viral cell penetrating peptide adopting a versatile route based on MNP prefunctionalization with a monolayer consisting of a bifunctional phosphonic linker, 3-aminopropylphosphonic acid. The cell internalization capabilities of this system have been evaluated by comparing them with those of a reference system based on MNPs functionalized with PEG, rhodamine, and folic acid, obtained adopting the same NH₂ -PA-based platform. The uptake of the two differently decorated MNPs was assessed in primary microvascular endothelial cells from human brain, which are the main components of the BBB and simulate an in vitro model of the BBB. These surface modifications influence the internalization of MNPs in HBMEC and, therefore, their capability to cross the BBB. In fact, conjugation with the gH625 peptide upgraded the delivery of nanoparticles across the in vitro BBB, leading to significant higher cell uptake in HBMEC after 24 h compared with that of FA bearing MNPs (FA,PEG@MNPs). Note that also other strategies have been used to enhance nanoparticle uptake across the BBB. A common approach is to attach targeting ligands in order to activate receptor-mediated endocytosis. As examples, transferrin-coupling nanoparticles can penetrate into the BBB through a transferrin receptor-mediated process [56]. Analogously, the linkage of the apolipoprotein E to the nanoparticles enhances the BBB penetration [57]. Besides, nanoparticles having a surface charges modified with polyethylenimine (PEI) has been reported to cross the BBB by absorptive-mediated transcytosis [58]. Finally, the ability of MNPs to pass through human brain microvascular endothelial cells, used as an in vitro BBB model, can be also facilitated by an external magnet [59]. In our work, we studied a different approach which use a cell penetrating peptide, the gh625, to improve internalization capabilities of Fe₃ O₄ Nanopartikel. These results are in accordance with those previously obtained by D. Guarnieri et al. using different kinds of MNPs [55, 60] confirming that the gH625-decorated magnetic nanoparticle has a relevant role in crossing the BBB and could be used as a safe and effective drug delivery system.

Abkürzungen

A-172:

Human glioblastoma cell line

B.E.:

Binding energy

BBB:

Blood-brain barrier

CNS:

Central nervous system

CPPs:

Cell-penetrating peptides

DIPEA:

N ,N -Diisopropylethylamine

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

FA:

Folic acid

FA-NHS:

Activated form of FA with NHS

FBS:

Fetal bovine serum

Fmoc:

9-Fluorenylmethoxycarbonyl

FT-IR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

gh625:

20-Residue peptide derived from the glycoprotein H (gH) of the Herpes simplex virus 1

gH625@MNPs:

NH₂ @MNPs functionalized with gh625

HBMECs:

Microvascular endothelial cells from human brain

MNPs:

Magnetic iron nanoparticles

MTT:

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H -tetrazolium bromide

NBD:

4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole

NH₂ @MNPs:

MNPs modified with NH₂ -PA

NH₂ -PA:

3-Aminopropylphosphonic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

PBS:

Phosphate-buffered saline

PDI:

Polydispersitätsindex

PEG:

Polyethylene glycol

PEG,FA@MNPs:

NH₂ @MNPs functionalized with FA, Rhod and PEG

PEG-NHS:

Methoxypolyethylene glycol acetic acid N -succinimidyl ester

PEI:

Polyethylenimine

Rhod:

Carboxy-X -rhodamine

Rhod-NHS:

Carboxy-X -rhodamine N -succinimidyl ester

TFA:

Trifluoroacetic acid

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

XRD:

X-ray powder diffraction