Gezielte Hemmung von miR-301 unterdrückt Angiogenese und Tumorwachstum beim Plattenepithelkarzinom des Ösophagus durch PTEN-Aktivierung

Zusammenfassung

Ziel

Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC) zeichnet sich durch frühe Metastasierung und späte Diagnose aus. MicroRNA-301 (miR-301) ist an diversen Krebserkrankungen beteiligt. Dennoch sind die Effekte von miR-301 auf ESCC unerforscht. Daher zielt diese Studie darauf ab, die Rolle von miR-301 in der ESCC-Progression zu erforschen.

Methoden

Expression von miR-301 und Phosphatase und Tensin-Homolog (PTEN) in ESCC-Geweben und Zelllinien wurde analysiert. Anschließend wurden die selektierten Zellen mit veränderter miR-301- oder PTEN-Oligonukleotid- und Plasmid-Expression behandelt, und Koloniebildungsfähigkeit, Zelllebensfähigkeit, Migration, Invasion, Zellzyklusverteilung und Apoptose von ESCC-Zellen wurden bewertet. Zudem wurden Tumorwachstum und Mikrogefäßdichte (MVD) beurteilt, und die Zielbeziehung zwischen miR-301 und PTEN wurde bestätigt.

Ergebnisse

miR-301 war hochreguliert, PTEN herunterreguliert in ESCC-Geweben und -Zellen. KYSE30- und Eca109-Zellen wurden für funktionale Assays ausgewählt. In KYSE30-Zellen unterdrückten inhibierte miR-301 oder überexprimiertes PTEN maligne Zellverhalten, und stillgelegtes PTEN eliminierte den Effekt der miR-301-Inhibition auf ESCC-Progression. In Eca109-Zellen förderten miR-301-Überexpression oder PTEN-Inhibition maligne Verhaltensweisen, und PTEN-Überexpression kehrte die Effekte der miR-301-Erhöhung um. Der In-vivo-Test zeigte, dass miR-301-Inhibition oder PTEN-Überexpression ESCC-Tumorwachstum und MVD unterdrückten, während miR-301-Erhöhung oder PTEN-Reduktion gegenteilige Effekte hatten. Zudem wurde PTEN als Ziel von miR-301 identifiziert.

Fazit

Zusammenfassend zeigte unsere Studie, dass miR-301 Zellwachstum, Metastase und Angiogenese durch Regulation der PTEN-Expression in ESCC beeinflusst.

Einleitung

Ösophaguskrebs (EC), die achtthäufigste Krebserkrankung weltweit, ist eine kritische Malignität mit hoher Mortalität und schlechter Prognose. Etwa 90 % aller EC-Fälle entfallen auf das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC), die Hauptform von EC in China. Mehrere Faktoren wie niedriger sozioökonomischer Status, Rauchen, Alkoholkonsum, schlechte Ernährung, nitrosaminreiche oder mykotoxinbelastete Nahrung führen zur Entstehung von ESCC. Trotz verbesserter klinischer Ergebnisse und Therapien bleibt die Prognose bei ESCC-Patienten schlecht, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 15-25 %. Daher ist es entscheidend, Onkogene oder Tumorsuppressorgene als Biomarker für die ESCC-Entwicklung zu identifizieren, um effektivere Therapiemethoden für ESCC-Patienten bereitzustellen.

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die eine wesentliche Rolle bei der Modulation der Genexpression spielen und die Tumorregression durch Regulierung der mRNA-Stabilität und -fähigkeit beeinflussen können. Mehrere miRNAs wie miR-4324, miR-889-3p und miR-9 wurden mit ESCC-Prozessen assoziiert. miR-301 gehört zur miRNA-Familie, gebildet durch die fam33a-Transkriptionseinheit an 17q22-23 im menschlichen Genom. Die Überexpression von miR-301 wurde zuvor identifiziert und spiegelt wider, dass sie an menschlichen Erkrankungen beteiligt ist. Die Funktionsmechanismen von miR-301 in ESCC sind jedoch noch nicht aufgeklärt. Zudem wurde Phosphatase und Tensin-Homolog (PTEN) als häufig in Tumoren gestörtes Gen und durch Keimbahnmutationen bei Krebspatienten gezieltes Gen bestätigt, das eine tumorhemmende Rolle spielt. Die Dysregulation von PTEN korreliert mit ESCC-Entwicklung. Interessanterweise zeigte eine aktuelle Studie, dass miR-301 PTEN im nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom angreift. Diese Zielbeziehung zwischen miR-301 und PTEN in der ESCC-Entwicklung bleibt jedoch zu enthüllen. Unsere Forschung fokussiert auf die Effekte von miR-301 und PTEN auf ESCC-Progression, die weitgehend unbekannt und neuartig sind. Wir vermuteten, dass miR-301 Angiogenese und Zellwachstum in ESCC durch Modulation der PTEN-Expression beeinflussen könnte.

Materialien und Methoden

Ethik-Erklärung

Schriftliche Einwilligungen wurden von allen Patienten vor der Studie eingeholt. Die Protokolle wurden vom Ethikkomitee des Zweiten Krankenhauses der Jilin-Universität genehmigt und basieren auf den ethischen Prinzipien für medizinische Forschung am Menschen der Helsinki-Deklaration. Tierexperimente entsprachen strikt dem Leitfaden für Haltung und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health. Das Protokoll der Tierexperimente wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Zweiten Krankenhauses der Jilin-Universität genehmigt.

Studienobjekte

110 Proben von ESCC-Geweben und angrenzenden Normalgeweben (> 5 cm vom Tumor) wurden von ESCC-Patienten (78 männlich, 32 weiblich) gesammelt, die eine Ösophagektomie in der Thoraxchirurgie des Zweiten Krankenhauses der Jilin-Universität von Januar 2015 bis Dezember 2017 erhielten. Unter den 110 Patienten: 84 Fälle > 60 Jahre, 26 Fälle ≤ 60 Jahre; Tumorgröße: 65 Fälle ≥ 5 cm, 45 Fälle < 5 cm; 71 Fälle ohne Lymphknotenmetastase (LNM), 39 Fälle mit LNM; TNM-Stadium: 60 Fälle Stadium I+II, 50 Fälle Stadium III; Tumorlokalisation: 13 Fälle oberes ESCC, 97 Fälle mittel-unteres ESCC. Alle Patienten wurden mit ESCC diagnostiziert und hatten keine Radio- oder Chemotherapie vorab erhalten. Tumoren wurden vollständig exzidiert, negativer chirurgischer Rand pathologisch bestätigt. Nach UICC-Staging-Kriterien 2009 wurde postoperative pathologische Stadieneinteilung als pT1-4N1-2(I-IIIb) identifiziert. Keine signifikanten Komplikationen postoperativ, perioperativen Todesfälle ausgeschlossen.

Reverse-Transkriptions-Quantitative PCR (RT-qPCR)

Gesamt-RNAs in Geweben und Zellen wurden mit Trizol-Kits (Invitrogen) extrahiert. RNA-Konzentration und -Qualität wurden gemessen. RNA-Primer (Tabelle 1) wurden von TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning, China) entworfen und synthetisiert. RNA wurde basierend auf Takara PrimeScript RT Reagent Kit mit gDNA Eraser in cDNA revers transkribiert. qPCR wurde auf Light Cycler 480II (Roche) mit Power PCR SYBR Green PCR Master Mix (Takara) durchgeführt. U6 diente als Loading Control für miR-301, β-Actin als interne Referenz für PTEN. Daten wurden mit 2^−ΔΔCt-Methode analysiert.

Western Blot Analyse

RIPA-Lysepuffer (Beyotime) extrahierte Gesamtprotein in Zellen und Geweben, quantifiziert mit BCA Protein Assay Kit (Beyotime). 10 % SDS-PAGE wurde durchgeführt. Proben wurden auf Nitrozellulosemembranen transferiert, 5 % Magermilchpulver 4 °C über Nacht blockiert. Primärantikörper PTEN und β-Actin (beide 1:500, Santa Cruz Biotechnology) über Nacht inkubiert, dann sekundäre Antikörper 1 h. Nach 1 min in ECL-Reagenz (Pierce Chemical) wurden Membranen im Dunkeln belichtet und mit LAS4000 Mini Chemilumineszenz-Imager entwickelt. Grauwerte wurden mit Imaging-Software unter β-Actin-Kontrolle ausgewertet. Proteinbänder wurden mit ImageJ2x analysiert.

Dual-Luciferase-Reportergen-Assay

Die 3'-UTR-Sequenz von PTEN wurde als Interaktionspartner für miR-301 vorhergesagt, oder eine mutierte Sequenz innerhalb der vorhergesagten Target-Sites wurde synthetisiert und in XbaI- und FseI-Sites des pGL3-Control-Luciferase-Reportervektors (Promega) kloniert. pGL3-PTEN-wt und pGL3-PTEN-mut Vektoren wurden erzeugt. Korrekt identifizierte wt- und mut-Luciferase-Reporterplasmide wurden mit miR-301-Mimic und Mimic-NC in KYSE30- und Eca109-Zellen für 48 h ko-transfiziert. Zellen lysiert, Luciferase-Aktivitäten mit Detektionskits (Promega) bestimmt.

Zellkultur, Gruppierung und Transfektion

ESCC-Zelllinien (KYSE-150, KYSE-30, Eca109, KYSE-70) von Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, CAS; humane Ösophagus-Epithelzellen (HEECs) von Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, China). Zellen in RPMI 1640 mit 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin. miR-301-Expression und PTEN-mRNA-Expression in jeder Zelllinie via RT-qPCR gemessen; Zelllinie mit höchster und niedrigster relativer Expression für nachfolgende Zellexperimente gewählt.

KYSE-30-Zellen in 7 Gruppen: miR-301-Inhibitor, Inhibitor-NC, pcDNA-PTEN (oe-PTEN), pcDNA-NC (oe-NC), miR-301-Inhibitor + si-PTEN, miR-301-Inhibitor + si-NC. Eca109-Zellen in 7 Gruppen: miR-301-Mimic, Mimic-NC, si-PTEN, si-NC, miR-301-Mimic + oe-PTEN, miR-301-Mimic + oe-NC. Oligonukleotide von GenePharma Ltd. (Shanghai); pcDNA-PTEN NC und pcDNA-PTEN von Shanghai Sangon Bio-technology Corporation. Transiente Transfektion mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) bei 60 % Konfluenz.

CCK-8 Assay

Zellen in 96-Well-Platten (1 × 10³ Zellen/Well) inkubiert für verschiedene Zeiträume. Nach 24, 48, 72, 96 h je 10 μl CCK-8-Lösung (5 mg/ml), 2 h bei 37 °C ohne Licht. OD bei 450 nm mit Microplate Reader (Bio-Rad) analysiert.

Koloniebildungsassay

500 Zellen/Well in 6-Well-Platten nach Transfektion, 14 Tage Kultur. Kolonien mit Methanol fixiert, 0,5 % Kristallviolett gefärbt, unter Inversmikroskop gezählt.

Transwell-Assay

Zellen (5 × 10³) in RPMI 1640 in apikale Kammern von Transwell-Geräten mit unbeschichteter oder Matrigel-beschichteter Membran (Corning). Nach 24 h apikale Zellen entfernt, verbleibende auf Unterseite fixiert, 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Mikroskop (Olympus) zur Zählung in 3 zufälligen Feldern.

Durchflusszytometrie

Zellzyklus und Apoptose via Durchflusszytometrie. Annexin V-FITC (10 μl) und Propidiumiodid (PI, 5 μl, Sigma) mit Zellen (5 × 10⁵ Zellen/Well) 30 min bei 4 °C im Dunkeln. Apoptotische Zellen % via Durchflusszytometer (BD Biosciences) mit FlowJo v10. Für Zellzyklus: Zellen mit 75 % Ethanol über Nacht bei 4 °C fixiert, 5 μl PI/Ribonuklease A (Sigma) 30 min bei 4 °C im Dunkeln gefärbt. Daten mit Durchflusszytometer (BD Biosciences), 14.000 Fluoreszenzsignale/Probe, ModFit LT v3.2 (Verity Software House) analysiert.

Subkutane Tumorigenese in Nacktmäusen

42 weibliche BALB/c-nu Nacktmäuse (4 Wochen, 16-24 g) von Experimental Animal Center Jilin University (Changchun, China). 14 Gruppen (n=3). 7 Gruppen mit KYSE-30-Zellen gemäß Zellgruppierung, 7 Gruppen mit Eca109-Zellen. Konzentration transfizierter Zellen: 5 × 10⁶ Zellen/100 μl. Mäuse fixiert, subkutan mit ESCC-Zellen unter sterilen Bedingungen injiziert. Größte Länge (L) und Breite (W) der Tumoren wöchentlich gemessen; Tumorvolumen V = 1/2 × L × W². Mäuse in 5. Woche euthanisiert, Tumoren reseziert, gewogen, fotografiert. Tumorbildungsrate = Mäuse mit subkutanem Tumor / gesamte injizierte Mäuse × 100 %. Injektionszeit als Abszisse, Tumorgröße als Ordinate → Tumorwachstumskurve.

Immunhistochemische Färbung

Tumorgewebe der Nacktmäuse: 10 % Formaldehyd fixiert, Paraffin eingebettet, 4 μm geschnitten. 2 h bei 60 °C getrocknet, Xylol entwaxt, Ethanol-Gradient dehydriert, 50 μl 3 % H₂O₂ 10 min inkubiert. 0,01 M Zitronensäurepuffer, 95 °C 20 min gekocht, normale Ziegenserum-Lösung 37 °C 10 min blockiert, CD₃₄ (1:100, Santa Cruz) 4 °C über Nacht. HRP-markiertes Ziegen-anti-Kaninchen/Maus-IgG-Polymer (ZSGB-Bio, Beijing), Hämatoxylin-Gegenfärbung, Dehydrierung, Permeabilisierung, neutrales Balsam versiegelt. PBS statt Primärantikörper als NC. MVD-Messung: Schnitte unter Niedrigvergrößerung. Endothelzelle oder -cluster, braungelb gefärbt, deutlich von Tumorzellen und Bindegewebe unterschieden = Mikrogefäß. Zweigstruktur auch als Gefäß wenn disjunkt; Gefäße mit Lumen > 8 Erythrozyten, Muskelschicht oder dickerem Lumen ausgeschlossen. Mikrogefäßzahlen in 3 Hochvergrößerungsfeldern aufgezeichnet, Mittelwert = MVD pro Fall.

Statistische Analyse

Alle statistischen Analysen mit SPSS 21.0 (IBM Corp.) und GraphPad Prism 6.0. Daten als Mittelwert ± Standardabweichung. Unterschiede zwischen zwei unabhängigen Gruppen: Student's t-Test. Drei oder mehr Gruppen: Einfaktorielle ANOVA. p < 0,05 = statistisch signifikant.

Ergebnisse

miR-301 hoch, PTEN niedrig in ESCC-Geweben und -Zellen

miR-301- und PTEN-Expression in ESCC-Geweben und angrenzenden Normalgeweben via RT-qPCR und Western Blot analysiert. Ergebnis (Abb. 1a-c): miR-301 hochreguliert, PTEN herunterreguliert in ESCC-Geweben. Patienten in niedrige/hohe Expressionsgruppen nach Medianwert von miR-301 oder PTEN eingeteilt, Korrelation mit klinisch-pathologischen Merkmalen analysiert. miR-301/PTEN-Expression korrelierte nicht mit Alter, Geschlecht, Tumorgröße, Lokalisation, Differenzierung, aber mit TNM-Stadium und LNM (Tabelle 2).

Abb. 1: miR-301 hoch, PTEN niedrig in ESCC-Geweben und -Zellen. a miR-301- und PTEN-mRNA-Expression in ESCC-Gewebe (RT-qPCR); b PTEN-Protein-Expression in ESCC-Gewebe (Western Blot); c PTEN-Proteinbänder (Western Blot); d miR-301- und PTEN-mRNA-Expression in ESCC-Zelllinien (RT-qPCR); e PTEN-Protein-Expression in ESCC-Zelllinien (Western Blot); f PTEN-Proteinbänder (Western Blot). *p < 0,05 vs. HEEC. Daten als Mittelwert ± SD, t-Test für Zwei-Gruppen-Vergleiche.

Dann miR-301- und PTEN-Expression in 4 ESCC-Zelllinien und HEECs via RT-qPCR und Western Blot. Ergebnis (Abb. 1d-f): miR-301 hoch, PTEN niedrig in ESCC-Zelllinien. KYSE-30: höchste miR-301, niedrigste PTEN; Eca109: gegenteiliger Trend. Daher KYSE-30 mit herunterregulierter miR-301/überexprimiertem PTEN, Eca109 mit überexprimierter miR-301/stillgelegtem PTEN in Zellexperimenten behandelt.

PTEN wird von miR-301 gezielt

Bioinformatik-Software (https://www.microrna.org/) sagte PTEN als Target-Gen von miR-301 voraus (Abb. 2a). Dual-Luciferase-Reportergen-Assay bestätigte: Luciferase-Aktivität signifikant verringert in ESCC-Zellen ko-transfiziert mit PTEN-wt-Vektor und miR-301-Mimic vs. PTEN-mut-Vektor und miR-301-Mimic, was spezifische Bindung von miR-301 an PTEN impliziert (Abb. 2b,c).

Abb. 2: PTEN ist Target-Gen von miR-301. a Bindungsstellen von miR-301 und PTEN via Online-Vorhersage; b Target-Beziehung in KYSE-30-Zellen (Dual-Luciferase); c Target-Beziehung in Eca109-Zellen (Dual-Luciferase); d miR-301- und PTEN-mRNA-Expression in KYSE-30 nach miR-310-Downregulation oder PTEN-Upregulation (RT-qPCR); e PTEN-Protein-Expression in KYSE-30 (Western Blot); f PTEN-Proteinbänder (Western Blot); g miR-301- und PTEN-mRNA-Expression in Eca109 nach miR-310-Upregulation oder PTEN-Downregulation (RT-qPCR); h PTEN-Protein-Expression in Eca109 (Western Blot); i PTEN-Proteinbänder (Western Blot). *p < 0,05 vs. Inhibitor-NC; & p < 0,05 vs. oe-NC; #p < 0,05 vs. miR-301-Inhibitor+si-NC; a p < 0,05 vs. Mimic-NC; b p < 0,05 vs. si-NC; c p < 0,05 vs. miR-301-Mimic+oe-NC; N=3. Daten als Mittelwert ± SD, t-Test für Zwei-Gruppen, ANOVA für Mehrfachvergleiche.

RT-qPCR und Western Blot in transfizierten Zellen: In KYSE-30 (Abb. 2d-f) miR-301-Inhibitor downregulierte miR-301, upregulierte PTEN; pcDNA-PTEN (oe-PTEN) erhöhte PTEN; si-PTEN kehrte Effekt von miR-301-Inhibitor auf PTEN um. In Eca109 (Abb. 2g-i) miR-301-Mimic upregulierte miR-301, downregulierte PTEN; si-PTEN verringerte PTEN; pcDNA-PTEN (oe-PTEN) kehrte inhibitive Rolle von miR-301-Mimic auf PTEN um. Daten deuten darauf hin, dass miR-301 PTEN zielt.

Inhibierte miR-301 oder überexprimiertes PTEN beschränkt ESCC-Zelllebensfähigkeit; Erhöhte miR-301 oder reduziertes PTEN fördert Lebensfähigkeit

Zelllebensfähigkeit via Koloniebildung und CCK-8. Ergebnis: In KYSE-30 (Abb. 3a-c) miR-301-Inhibitor oder oe-PTEN reprimierte Koloniebildung und Zelllebensfähigkeit; si-PTEN eliminierte Effekt von miR-301-Inhibitor. In Eca109 (Abb. 3d-f) miR-301-Mimic oder si-PTEN förderte Koloniebildung und Lebensfähigkeit; PTEN-Überexpression kehrte promotiven Effekt von miR-301-Erhöhung um. Ergebnisse: miR-301-Knockdown oder PTEN-Überexpression reprimierte ESCC-Zelllebensfähigkeit, gefördert durch miR-301-Erhöhung oder PTEN-Inhibition.

Abb. 3: Inhibierte miR-301/überexprimiertes PTEN beschränkt ESCC-Zelllebensfähigkeit; erhöhte miR-301/reduziertes PTEN fördert Lebensfähigkeit. a Koloniezahl KYSE-30 (Koloniebildung); b Koloniebildungsfähigkeit KYSE-30; c Lebensfähigkeit KYSE-30 (CCK-8); d Koloniezahl Eca109; e Koloniebildungsfähigkeit Eca109; f Lebensfähigkeit Eca109 (CCK-8). Signifikanz wie Abb. 2. N=3, ANOVA für Mehrfachvergleiche.

Inhibierte miR-301 oder überexprimiertes PTEN reprimiert Migration und Invasion; Erhöhte miR-301 oder reduziertes PTEN induziert Migration und Invasion

Migration/Invasion via Transwell-Assay. In KYSE-30 (Abb. 4a,b) Migration/Invasion durch miR-301-Inhibition oder PTEN-Überexpression gehemmt; si-PTEN kehrte suppressive Rolle von miR-301-Inhibitor um. In Eca109 (Abb. 4c,d) Migration/Invasion durch miR-301-Mimic oder si-PTEN gefördert; PTEN-Überexpression kehrte Effekt von miR-301-Mimic um. Befunde: Migration/Invasion von ESCC-Zellen gehemmt durch miR-301-Repression oder PTEN-Erhöhung, gefördert durch miR-301-Upregulation oder PTEN-Downregulation.

Abb. 4: Inhibierte miR-301/überexprimiertes PTEN reprimiert Migration/Invasion; erhöhte miR-301/reduziertes PTEN fördert Migration/Invasion. a Migration/Invasion KYSE-30 (Transwell); b Statistik migrierte/invasive KYSE-30; c Migration/Invasion Eca109; d Statistik migrierte/invasive Eca109. Signifikanz wie Abb. 2. N=3, ANOVA.

Inhibierte miR-301 oder überexprimiertes PTEN induziert Zellzyklusarrest und Apoptose; Erhöhte miR-301 oder reduziertes PTEN unterdrückt Zellzyklusarrest und Apoptose

Durchflusszytometrie für Zellzyklus und Apoptose nach Transfektion. In KYSE-30 (Abb. 5a-d) miR-301-Inhibitor oder oe-PTEN förderte Apoptoserate, erhöhte Zellen in G0/G1, verringerte S und G2/M; si-PTEN kehrte Apoptose- und Zellzyklusänderungen um.

Abb. 5: Inhibierte miR-301/überexprimiertes PTEN induziert Zellzyklusarrest/Apoptose; erhöhte miR-301/reduziertes PTEN unterdrückt Zellzyklusarrest/Apoptose. a Zellzyklus KYSE-30 (Durchflusszytometrie); b Prozent G0/G1, S, G2/M KYSE-30; c Apoptose KYSE-30; d Apoptoserate KYSE-30; e Zellzyklus Eca109; f Prozent G0/G1, S, G2/M Eca109; g Apoptose Eca109; h Apoptoserate Eca109. Signifikanz wie Abb. 2. N=3, ANOVA.

In Eca109 (Abb. 5e-h) miR-301-Mimic oder si-PTEN hemmte Apoptoserate, verringerte G0/G1, erhöhte S und G2/M; PTEN-Überexpression kehrte Effekt von miR-301-Mimic auf Apoptose und Zellzyklus um. Schlussfolgerung: Downregulierte miR-301 oder upreguliertes PTEN förderte Zellzyklusübergang und Apoptose in ESCC-Zellen, während inhibierte miR-301 oder stillgelegtes PTEN gegenteilige Effekte zeigte.

Inhibierte miR-301 oder überexprimiertes PTEN hemmt Tumorwachstum und Angiogenese in vivo; Erhöhte miR-301 oder reduziertes PTEN steigert Tumorwachstum und Angiogenese in vivo

Wachstum und Veränderungen von ESCC-Tumoren in Nacktmäusen beobachtet. Tumorwachstum bewertet: In KYSE-30 (Abb. 6a-e) Mäuse mit miR-301-Inhibitor oder oe-PTEN zeigten reduziertes Tumorvolumen und -gewicht; si-PTEN hob repression von miR-301-Inhibitor auf. In Eca109 (Abb. 6f-j) Tumorvolumen und -gewicht bei miR-301-Mimic oder si-PTEN erhöht; PTEN-Überexpression kehrte Effekt von miR-301-Mimic um. CD34-Expression in Xenotransplantaten via Immunhistochemie: In KYSE-30-Xenotransplantaten (Abb. 7a-d) MVD gehemmt nach miR-301-Downregulation oder PTEN-Upregulation; si-PTEN kehrte Effekt von miR-301-Inhibition auf MVD um. In Eca109-Xenotransplantaten MVD erhöht nach miR-301-Upregulation oder PTEN-Downregulation; PTEN-Überexpression hob MVD-Steigerung durch miR-301 auf. Daten: miR-301-Inhibition oder PTEN-Überexpression reprimierte Tumorwachstum und Angiogenese in ESCC; miR-301-Erhöhung oder PTEN-Stilllegung hatte umgekehrte Effekte.

Abb. 6: Inhibierte miR-301/überexprimiertes PTEN hemmt Tumorwachstum; erhöhte miR-301/reduziertes PTEN steigert Tumorwachstum. a Repräsentative Tumorbilder KYSE-30; b-d Tumorvolumen-Veränderungen KYSE-30; e Tumorgewichts-Veränderungen KYSE-30; f Repräsentative Tumorbilder Eca109; g-i Tumorvolumen-Veränderungen Eca109; j Tumorgewichts-Veränderungen Eca109. Signifikanz wie Abb. 2. n=3 Mäuse, ANOVA.

Abb. 7: Inhibierte miR-301/überexprimiertes PTEN hemmt Angiogenese; erhöhte miR-301/reduziertes PTEN steigert Angiogenese. a Repräsentative Immunhistochemie-Bilder KYSE-30; b MVD-Vergleich KYSE-30; c Repräsentative Bilder Eca109; d MVD-Vergleich Eca109. Signifikanz wie Abb. 2. n=3 Mäuse, ANOVA.

Diskussion

EC ist invasive Malignität im GI-Trakt. Als Haupttyp von EC ist ESCC ein maligner Tumor in Ösophagus-Epithelzellen. miRNAs, kleine nicht-kodierende RNAs, funktionieren als bedeutende Rollen in RNA-Silencing. Unsere Forschung untersuchte Effekte von miR-301 und Target-Gen PTEN auf ESCC-Progression: inhibierte miR-301 unterdrückte Angiogenese und Zellwachstum in ESCC durch Erhöhung von PTEN.

miR-301-Expression: hoch in ESCC-Zellen vs. HEEC; auch in ESCC-Geweben vs. angrenzenden Normalgeweben hoch. Ähnlich: Li et al. fanden hohe miR-301-Expression in Myokardinfarkt-Geweben. PTEN als Target von miR-301 bestätigt, durch existierende Literatur gestützt. PTEN herunterreguliert in ESCC-Geweben und -Zellen. Frühere Forschung: PTEN niedrig in ESCC vs. nicht-tumoralem Ösophagus-Epithel. Ma et al.: PTEN-Expression degradiert in Eca109-Zelllinie (in unserer Studie verwendet). Diese Studien belegen hohe miR-301- und niedrige PTEN-Expression in ESCC.

Wichtiges Ergebnis: inhibierte miR-301 reprimierte Koloniebildung und Zellproliferation via PTEN-Erhöhung; erhöhte miR-301 oder reduziertes PTEN gegenteilige Effekte. Han et al.: Downregulation von miR-301 durch Luteolin hemmt Zellproliferation im Prostatakrebs. Aktuelle Literatur: PTEN-Überexpression unterdrückt Pankreaskrebs-Zellproliferation; ähnlich im Prostatakrebs. Downregulation von miR-301 oder Erhöhung von PTEN hemmte Migration/Invasion von ESCC-Zellen; Erhöhung von miR-301 oder Reduktion von PTEN gegenteilige Trends. Shi et al.: Inhibierte miR-301 attenuierte Migration/Invasion in Brustkrebs. Migration/Invasion von ESCC-Zellen reprimiert durch Inhibition von miR-130b und Erhöhung von PTEN. Diese Publikationen verifizieren onkogene Rolle von miR-301 und tumorsuppressive Wirkung von PTEN in diversen Krebserkrankungen.

Ein weiteres Ergebnis: inhibierte miR-301/überexprimiertes PTEN förderte Zellapoptose und induzierte Zellzyklusarrest in G0/G1 in ESCC-Zellen; erhöhte miR-301 oder reduziertes PTEN inverse Ergebnisse. Aktuelle Literatur: Aktiviertes PTEN induziert Zellzyklusarrest und Apoptose in ESCC. Tian et al.: PTEN-Erhöhung hemmte Angiogenese durch Reduktion von VEGF in Hepatozellulärem Karzinom. Basierend auf obigen Daten wurden Rollen von miR-301 und PTEN in Zellapoptose und Angiogenese in diversen Erkrankungen weiter bestätigt. Schlussfolgerung: Downregulation von miR-301 hemmt Tumorwachstum in ESCC durch hohe PTEN-Expression; ähnlich in Brust- und Prostatakrebs. Umgekehrt induzierten miR-301-Erhöhung oder PTEN-Reduktion Tumorwachstum in ESCC. miR-301 und PTEN partizipieren an in-vivo-Krebszellwachstum.

Fazit

In dieser Studie zeigten wir, dass Repression von miR-301 Angiogenese, Zellproliferation, Migration und Invasion hemmt, aber Apoptose in ESCC-Zellen durch Upregulation von PTEN fördert. Diese Forschung vertieft das Verständnis potenzieller molekularer Mechanismen von ESCC und liefert neue Targets für ESCC-Therapie.

Abkürzungen

ESCC:

Plattenepithelkarzinom des Ösophagus

PTEN:

Phosphatase und Tensin-Homolog

MVD:

Mikrogefäßdichte

EC:

Ösophaguskrebs

miRNAs:

MicroRNAs

LNM:

Lymphknotenmetastase

UICC:

Union for International Cancer Control

RT-qPCR:

Reverse-Transkriptions-Quantitative PCR

3'UTR:

3'-Untranslatierte Region

WT:

Wildtyp

MUT:

Mutantentyp

HRP:

Horseradish Peroxidase

FBS:

Fetales Rinderserum

OE:

Überexprimiert

NC:

Negativkontrolle

CCK-8:

Cell Counting Kit

DMEM:

Dulbecco's Modified Eagle Medium

PI:

Propidiumiodid

FITC:

Fluorescein-Isothiocyanat

MVD:

Mikrogefäßdichte

ANOVA:

Varianzanalyse