Bioimaging-Tools basierend auf Polyelektrolyt-Mikrokapseln, die mit fluoreszierenden Halbleiter-Nanopartikeln kodiert sind:Design und Charakterisierung der fluoreszierenden Eigenschaften

Ergebnisse und Diskussion

Entwicklung von QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln

Wir verwendeten die Schicht-für-Schicht-Abscheidungstechnik, um Bioimaging-Agenzien in Form von QD-kodierten fluoreszierenden Mikropartikeln zu erhalten, da die vorgeschlagene Methode keine organischen Lösungsmittel erforderte, die Verwendung biokompatibler Polymere ermöglichte [23, 24] und eine effiziente Immobilisierung von QDs innerhalb der Polymerhülle [21]. Die Herstellung der fluoreszierenden Polyelektrolyt-Mikrokapseln, die mit wasserlöslichen, oberflächenmodifizierten QDs optisch kodiert sind, besteht im ersten Schritt aus dem Auftragen von fünf entgegengesetzt geladenen Polyelektrolytschichten auf die Oberfläche von Calciumcarbonat-Mikropartikeln, die als Matrices dienen, gefolgt von der Kodierung der Polyelektrolythülle mit negativ geladene QDs, Beschichtung der QD-Schicht mit Schutzschichten aus entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten, Auflösung der Kernmatrix des Mikropartikels und schließlich Modifizierung der Mikrokapseloberfläche mit BSA (Abb. 1). Die negative Oberflächenladung der Calciumcarbonat-Mikropartikel gewährleistet die Adsorption von PAH aufgrund der elektrostatischen Wechselwirkung des Polykations mit der Mikropartikeloberfläche. Das positive ζ-Potential der Oberfläche durch die PAH-Adsorption auf den Partikeln ermöglicht die anschließende Applikation des PSS-Polyanions sowie mit HS-PEG modifizierten QDs₁₂ -COOH, die aufgrund der Carboxylgruppe ebenfalls eine negative Oberflächenladung aufweisen und daher an der PAH-Polykationenschicht adsorbiert werden können. Die Einbettung der QDs in die polymere Polyelektrolytmembran erfolgt durch Aufbringen zusätzlicher abdeckender Polyelektrolytschichten (mindestens vier bis sechs davon), wie in Abb. 1a, b gezeigt.

Das Design und die Struktur der mit Quantenpunkten (QDs) kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln:a Ein schematisches Diagramm der Anordnung der Schichten in der Polymer-Mikrokapselmembran. b Veränderungen des ζ-Potentials der Oberfläche der Calciumcarbonat-Mikropartikel während der Schichtung von Polymerelektrolyten und der QD-Kodierung. c Eine fluoreszierende Mikrofotografie der Polyelektrolyt-Mikrokapseln, kodiert mit CdSe/ZnS-QDs, die mit HS-PEG solubilisiert wurden₁₂ -COOH. * Die ζ-Potentiale der Mikrokapseloberfläche, nachdem der Kern entfernt wurde; ** eine zusätzliche Stufe bei der Herstellung von QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln mit einer BSA-modifizierten Oberfläche

Hohle Mikrokapseln, die immobilisierte QDs in ihrer Polymermembran enthalten, werden durch Auflösen der Calciumcarbonat-Mikropartikel mit 0,2 M EDTA (pH 6,5) und Bildung des wasserlöslichen Komplexes des Calciumsalzes der Ethylendiamintetraessigsäure erhalten, dessen Diffusion durch die Polymermembran zur Bildung von Hohlräume in den Mikrokapseln. Um QD-kodierte Polyelektrolyt-Mikrokapseln mit einer BSA-modifizierten Oberfläche zu erhalten, wird das PAA-Polyanion auf die 11. Schicht des PAH-Polykations geschichtet. PAA wird wegen seines Wertes der Dissoziationskonstante bei Wechselwirkung mit der Mikrokapseloberfläche verwendet. Der pKa-Wert von PAA (pKa ≈ 4,7) ist niedriger und damit saurer als der von PSS (pKa ≈ 7,5) [25, 26], was zu einem höheren ζ-Potential der Mikrokapseloberfläche führt. Die Ladung der PAA-modifizierten Oberfläche erleichtert die passive BSA-Adsorption aufgrund der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen BSA und PAA. Der Zusammenbau zwischen PAA und BSA führt jedoch zu einer Abnahme der negativen Oberflächenladung der Mikrokapsel (Abb. 1b). Nach der BSA-Abscheidung auf der Mikrokapseloberfläche erfolgt die Abschirmung der negativ geladenen PAA-Schicht durch elektrostatisch positive Aminogruppen von BSA, daher wird das ζ-Potential der BSA-beschichteten QD-kodierten Mikrokapseln wahrscheinlich primär durch das elektrostatische Verhalten von BSA als äußere Mikrokapselbeschichtung [26].

Die wasserlöslichen PEGylierten QDs zeichnen sich durch eine enge Größenverteilung, das Fehlen von Aggregationen in der Dispersion und eine hohe kolloidale Stabilität aus. Dies stellt wahrscheinlich eine homogene Adsorption von QDs auf der Mikrokügelchenoberfläche sicher und erleichtert eine effektive Codierung und somit den Erhalt heller fluoreszierender Mikrokapseln (Abb. 1c).

Die Verwendung von Proteinen, wie BSA, zur Oberflächenmodifizierung macht die Polymermikrokapseln biokompatibel und widerstandsfähiger gegen eine Adhäsion aneinander. Dies gewährleistet auch eine vorübergehende Passivierung der Mikrokapseloberfläche, die für die anschließende Untersuchung der Mikrokapseln, die durch PAH-PSS- oder PAH-PAA-Interpolymerkomplexe gebildet werden, hinsichtlich der in vitro-Interaktion mit Zellen und des in vivo-Verhaltens wichtig ist [27,28,29] .

Die erhaltenen QD-kodierten Mikrokapseln sind kugelförmig (Abb. 1c) und zeichnen sich durch eine enge Größenverteilung (Abb. 2) mit einer mittleren Größe von 4,45 ± 0,65 μm aus. Diese Größe ist mit der von roten Blutkörperchen vergleichbar, sie ist sogar noch kleiner [30]. Darüber hinaus ist die Polymermembran der Mikrokapseln, wie bereits gezeigt, eine flexible Struktur, die anfällig für Verformungen ist. Bei intravenöser Injektion können Mikrokapseln dieser Größe keine Blut-Gewebe-Schranken überwinden, wodurch der Transport und die Verteilung optisch kodierter Mikrokapseln im Körper verfolgt werden können [31, 32]. In Lokalisationen mit erhöhter Permeabilität der Blutgefäßwand, z. B. in Entzündungs- und Tumorwachstumsbereichen, können jedoch Mikrokapseln in den extravaskulären Raum eindringen, was die Bildgebung und Überwachung einer gezielten Abgabe sicherstellen soll [33,34,35 ,36].

Größenverteilung der mit Quantenpunkten optisch codierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln, wobei die Anzahl der analysierten Mikrokapseln 600 betrug

Die Fluoreszenz- und Strukturmerkmale der QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln

Die hergestellten Mikrokapseln zeichnen sich durch einen Fluoreszenzpeak bei einer Wellenlänge von 590 nm aus, der dem der ursprünglichen wasserlöslichen QDs entspricht, die für die optische Kodierung der Mikrokapseln verwendet wurden. Dies weist darauf hin, dass die polymeren Polyelektrolyte, die die Mikrokapselmembran bilden, die Fluoreszenzeigenschaften, insbesondere das Fluoreszenzmaximum, der QDs in den Mikrokügelchen und den daraus hergestellten Mikrokapseln nicht beeinflussen (Abb. 3).

Der Einfluss des Quantenpunkt-(QD-)Einbaus in die Polymermembran der Mikrobeads (MCBs) und Mikrokapseln (MCCs) auf ihre Fluoreszenzeigenschaften:Das Fluoreszenzspektrum einer QD-Lösung mit 2,241 mg QDs wird gezeigt; dies entspricht der Menge an QDs, die für die optische Kodierung der MCBs verwendet werden

Abbildung 4 zeigt die Verteilungshistogramme für die Intensität der Signale aus den Populationen von QD-kodierten Mikrokapseln sowie Placebo-Mikrokapseln im Fluoreszenzkanal PE (575/25 nm) und FSC-A und SSC-A (488/10 nm .). ) Kanäle des Durchflusszytometers. Die Daten weisen auf eine effektive Differenzierung zwischen Placebo und optisch kodierten Mikrokapseln im PE-Kanal (575/25 nm) hin (Abb. 4a, b). Die Intensität des Fluoreszenzsignals der Mikrokapseln im PE-Kanal (575/25 nm) beträgt ~ 10 ⁴ , die eine hohe Fluoreszenzkapazität der QD-kodierten Mikrokapseln demonstriert. In den FSC-A- und SSC-A-Kanälen (488/10 nm) überlappen sich die Verteilungen für die beiden Mikrokapselpopulationen, was auf ähnliche relative Größen und Granularitätsparameter des Placebos und der kodierten Mikrokapseln hinweist (Abb. 4c, d) und daher , Homogenität der Bevölkerung. Dies liegt offenbar daran, dass die Mikrokapselmembranen aus gleich vielen Polymerschichten bestehen, wobei die Membran der kodierten Mikrokapseln nur eine Schicht QDs enthält. Somit zeichnen sich die erhaltenen Mikrokapseln durch eine homogene Größenverteilung und optimale Fluoreszenzeigenschaften aus, die ihre Detektion in den entsprechenden Kanälen eines Durchflusszytometers gewährleisten.

Nachweisbarkeit von QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln durch Durchflusszytometrie:a Mikrokapsel-Dot-Plot-Profil in SSC-PE-Kanälen; b Mikrokapselverteilungshistogramm im PE-Kanal; c Mikrokapsel-Dot-Plot-Profil in SSC-FSC-Kanälen; d Mikrokapselverteilungshistogramm im FSC-Kanal. QD-freie Mikrokapseln (Placebo) wurden als Kontrolle verwendet und sind grau dargestellt, während diejenigen, die mit CdSe/ZnS-Quantenpunkten (Fluoreszenzemissionsmaximum bei 590 nm) codiert sind, orange dargestellt sind. Die Anzahl der analysierten Ereignisse betrug 2500. Die Punktdiagramme und Histogrammachsen werden als SSC-A, FSC-A, PE-A angezeigt, wobei A bedeutet, dass die Daten durch den Signalbereich dargestellt werden

Die Mikrofotografien von Schnitten der QD-kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln, die in Fig. 5 gezeigt sind, zeigen, dass die Mikrokapseln hohl sind und das detektierte helle Fluoreszenzsignal von den QDs enthaltenden Polymermembranen emittiert wird. Diese Daten bestätigen die Effizienz des Verfahrens zum Auflösen des Kerns und zeigen ein helles Fluoreszenzsignal der hergestellten Mikrokapseln, das mit den entsprechenden Filtern Texas Red und PE bei Fluoreszenzmikroskopie bzw. Durchflusszytometrie nachgewiesen werden kann. Die hergestellten Polyelektrolyt-Mikrokapseln, die QDs in ihrer Polymerhülle enthalten, besitzen im Vergleich zu Polyelektrolyt-Mikrokapseln, die mit herkömmlichen Farbstoffen wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Aminofluorescein markiert sind, höhere Fluoreszenzeigenschaften [14, 37]. Ansonsten haben die mit QDs kodierten Mikrokapseln unter Verwendung des Schicht-für-Schicht-Ansatzes eine vergleichbare oder sogar schlechtere Helligkeit als die der mit organischen Farbstoffen unter Verwendung der Quelltechnik kodierten Mikrokügelchen. Die Helligkeit wird durch das Produkt aus Extinktionskoeffizient und Quantenausbeute bestimmt. Die Quantenausbeuten wasserlöslicher QDs bei Raumtemperatur liegen bei etwa 40%, was mit denen organischer Farbstoffe vergleichbar ist [22, 38, 39], während die Extinktionen von QDs fast 100-mal größer sind als die von organischen Farbstoffen. Andernfalls können aufgrund der großen Größe von QDs ihre Mengen innerhalb der Mikrokapselhülle nicht mit denen organischer Farbstoffmoleküle vergleichbar gemacht werden. Somit können die Mengen an kodierenden organischen Farbstoffmolekülen viel besser gemacht werden als die für QDs, wodurch eine vergleichbare Helligkeit gewährleistet wird. Auf der anderen Seite bietet die Kodierung der Mikrokapseln mit den QDs einen so wichtigen komparativen Vorteil wie das vollständige Fehlen des Photobleichens. Außerdem können die QDs unterschiedlicher Farben (Größen) mit der gleichen Wellenlängen-Anregung angeregt werden. Somit kann die Verwendung von QDs verschiedener Farben für die Mikrokapselkodierung eine praktisch unbegrenzte Anzahl spektral aufgelöster optischer Codes bereitstellen [21].

Mikrofotografien von Schnitten der mit Quantenpunkten kodierten Polyelektrolyt-Mikrokapseln. Die Pfeile in (a ) geben die in (b gezeigten Bereiche an , c ) bei höherer Vergrößerung

Schlussfolgerungen

Die entwickelte Technik zum Erhalten QD-kodierter Polyelektrolyt-Mikrokapseln gewährleistet eine effektive optische Kodierung. Die hergestellten Polymer-Mikrokapseln zeichnen sich durch eine optimale Größenverteilung und hohe Fluoreszenzintensität aus, die für ihre effiziente Detektion durch kommerzielle Durchflusszytometer und konfokale Mikroskope verwendet werden können. Daher sind die entworfenen Mikrokapseln potentielle fluoreszierende Mittel für die in vitro- und in vivo-Biobildgebung. Die Weiterentwicklung der vielseitigen mikrokapselbasierten Plattform würde darauf abzielen, neuartige Bioimaging- und Theranostik-Tools vorzuschlagen, die auf fluoreszierenden QD-kodierten Mikropartikeln basieren, die auf verschiedene externe physikalische oder chemische Stimuli zusammen mit Photoanregung ansprechen.

Abkürzungen

BSA:

Rinderserumalbumin

EDTA:

Dinatriumethylendiamintetraacetat

PAA:

Polyacrylsäure

PAK:

Polykation Poly(allylaminhydrochlorid)

PEG:

Polyethylenglykol

PSS:

Polyanion poly(natrium-4-styrolsulfonat)

QD:

Quantenpunkt

TOPO:

Trioctylphosphinoxid