Entwicklung eines präzisen lysosomalen pH-Sensors unter Verwendung selbstzerfallender SiO2-Nanopartikel

Zusammenfassung

Der saure pH-Wert von Lysosomen steht in engem Zusammenhang mit Autophagie; daher liefert die präzise Kenntnis lysosomaler pH-Änderungen mehr Informationen über den Autophagieprozess und -status. Bisher konnten jedoch nur pH-Änderungen in einem relativ breiten Bereich angezeigt werden; eine exakte lysosomale pH-Detektion wurde nie erreicht. In unserer Studie etablierten wir einen Endo-/Lysosom-pH-Indikator basierend auf einem selbstzerfallenden SiO₂-Nanopartikelsystem mit spezifischen Syntheseparametern. Das zentral konzentrierte Methylenblau (MB) in den zentral-hohlen Struktur-Nanopartikeln zeigte eine sensible Freisetzung als Funktion von pH-Werten von 4,0–4,8, was genau dem pH-Bereich von Lysosomen entspricht. Die lineare Korrelation der optischen Dichte (OD) Werte und der pH-Werte wurde hergestellt und zur Detektion des lysosomalen pH in 6 verschiedenen Zelllinien genutzt. Zudem gelang es mit diesem System, die durchschnittlichen pH-Änderungen der Lysosomen vor und nach der Endozytose von schwarzem mesoporösem Silizium (BPSi) NPs präzise zu detektieren, was den Mechanismus der Autophagie-Terminierung nach BPSi-Endozytose aufklärte. Somit kann der auf selbstzerfallenden Nanopartikeln basierende luminale pH-Indikator eine neue Methodik und Strategie bieten, um den lysosomalen pH besser zu verstehen und somit mehr Details zum Autophagieprozess oder anderen wichtigen Signalwegen des Stoffwechsels zu erhalten.

Einleitung

Lysosomen dienen als Endstation für Makromoleküle, wo diese durch hydrolytische Enzyme abgebaut werden, die durch niedrigen pH aktiviert sind [1]. Der saure pH-Wert der Lysosomen wird durch die vakuoläre H⁺-ATPase (v-ATPase) [2] aufrechterhalten, die Protonen aus dem Zytoplasma in den lysosomalen Lumen pumpt, um die Aktivität von ~60 Arten hydrolytischer Enzyme [3] zu gewährleisten. Neuere Literatur zeigt, dass der saure pH-Wert der Lysosomen eng mit der Autophagie [4] verknüpft ist, sodass präzise Kenntnis lysosomaler pH-Änderungen mehr Informationen über den Autophagieprozess und -status liefert. Basierend auf unseren Studien und Literaturrecherchen wird die Endozytose von amin-positiv geladenen Nanopartikeln wahrscheinlich den pH-Wert in Endo-/Lysosomen erhöhen, wie bei primären und sekundären Amin-PEG-dekorierten Nanopartikeln oder hydrophilen Dekorationen auf der Partikeloberfläche [5, 6].

Der pH-Anstieg durch Endozytose von Amin-Nanopartikeln wird die Kernlokalisation des Transkriptionsfaktors EB (TFEB) dramatisch erhöhen [7], was nicht nur die transkriptionelle Hochregulierung des Weges bewirkt, sondern auch lysosomale Dysfunktion verursacht, was letztlich zur Blockade des autophagischen Flusses führt [7-9]. Da TFEB die Autophagie reguliert, führt seine Überexpression zu einem signifikanten Anstieg der Autophagosomenproduktion in kultivierten Zellen.

Daher sind zur Vorhersage des Autophagieprozesses und seiner Details die präzise Messung des lysosomalen pH und seiner Änderungen entscheidend. Bisher konnten laut Literaturübersichten zu Endo-/Lysosom-pH-Wert-Indikatoren [10] und kommerziellen Produkten nur pH-Änderungen in einem relativ breiten Bereich angezeigt werden; eine exakte lysosomale pH-Detektion wurde nie erreicht. Daher ist die Etablierung einer präzisen luminale pH-Änderungsdetektionsmethode ein wichtiger Ansatz, um Einblicke in die Autophagie zu gewinnen.

Basierend auf unseren früheren Erfahrungen mit selbstzerfallenden SiO₂-Nanopartikeln etablierten wir in dieser Studie einen präzisen pH-Indikator, der luminale pH-Änderungen detektieren kann. SiO₂-Nanopartikel bieten Vorteile in einstellbarer Größe und Biokompatibilität [11]. Durch Festlegung spezifischer Syntheseparameter konnte der etablierte selbstzerfallende SiO₂-pH-Indikator die Nutzlast Methylenblau (MB) im pH-Bereich 4,0–4,8 sensitiv freisetzen, was genau dem pH-Bereich der Lysosomen entspricht. Zudem zeigte die MB-Freisetzung eine lineare Korrelation mit den pH-Wertänderungen (Schema 1). Anschließend testeten wir die Machbarkeit des pH-Indikators auf Zellebene durch Einführung von 6 verschiedenen Zelllinien und gelangten zur Bestimmung der durchschnittlichen pH-Änderungen der Lysosomen vor und nach der Endozytose von schwarzen mesoporösen Silizium (BPSi) NPs, was den Mechanismus der Autophagie-Terminierung nach BPSi-Endozytose aufklärte. Somit kann der auf selbstzerfallenden Nanopartikeln basierende luminale pH-Indikator eine neue Methodik und Strategie bieten, um den lysosomalen pH besser zu verstehen und mehr Details zum Autophagieprozess oder anderen wichtigen Signalwegen des Stoffwechsels zu erhalten.

Schematische Darstellung der MB@SiO₂-Messung des lysosomalen pH in lebenden Zellen.

Materialien und Methoden

Materialien

Natriumsilicid (NaSi) und Si-Wafer (Durchmesser 20 cm, p+ (100), 0,01–0,02 Ω cm) wurden von SiGNa Chemistry Inc. bzw. Ocmetic Inc. bereitgestellt. Ammoniumbromid (NH₄Br, 99 %), Natriumbromid (NaBr, 99 %), Toluol (anhydrous, 99,8 %), Salzsäure (HCl, 37 %), MB und Tetraethylorthosilikat (TEOS) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. 0,5 kDa Methoxy-PEG-Silan und 2 kDa Methoxy-PEG-Silan wurden von Fluorochem Ltd. bzw. Laysan Bio Inc. gekauft. RPMI 1640 Medium wurde von Life Technologies bereitgestellt. Fetales Kälberserum (FBS) wurde von TianHang Biological Technology gekauft. Natriumbicarbonat, Streptomycinsulfat, Penicillin G, HEPES, Lysozym-Lösung, CellLight Early Endosomes-GFP, LysoTracker™ Red DND-99, Pierce® BCA Protein Assay Kit, Enhanced Chemiluminescence, pHrodo™ Red Transferrin-Konjugat, Live Cell Imaging Solution und Trizol-Reagenz wurden von Thermo Fisher Scientific bezogen. Ethanol und Ammoniakwasser wurden von Sinopharm bereitgestellt. BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis Kit wurde von Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd. gekauft. RIPA-Lysepuffer wurde von Heart Biological Technology Co., Ltd. gekauft. P62, TFEB und β-Aktin-Antikörper wurden von Proteintech Group, Inc. gekauft. LC3B-Antikörper wurde von Abcam bereitgestellt. 2-(4-Pyridyl)-5-((4-(2-Dimethylaminoethyl-aminocarbamoyl) methoxy) phenyl) oxazol (PDMPO) wurde von Yeasen Biotech Co., Ltd. bereitgestellt.

Ziel, Design und Setting der Studie

Ziel dieser Studie ist es, (1) den Einfluss von BPSi-Nanopartikeln auf die Autophagie in HepG2-Zellen zu untersuchen, (2) den zugrundeliegenden Mechanismus der lysosomalen pH-Wertänderungen, die die Autophagie beeinflussen, zu ermitteln, (3) einen präzisen lysosomalen pH-Indikator zu etablieren, der den pH-Wert der Lysosomen präzise messen kann, und schließlich (4) den Einfluss von pH-Schwankungen auf die Autophagie anzuzeigen. Um die oben genannten Studienziele zu erreichen, führten wir ein Transkriptom-Sequenzierungsexperiment durch, um Transkriptom-Genänderungen in HepG2-Zellen nach BPSi-Nanopartikelzufuhr zu erforschen und verifizierten dies durch RT-qPCR und Western-Blot-Experimente. Fluoreszente Farbstoffe wie PDMPO wurden verwendet, um die Änderung des lysosomalen pH in HepG2-Zellen nach BPSi-Zufuhr zu messen. Um den pH-Wert der Lysosomen präzise zu messen, entwickelten wir MB@SiO₂-Nanopartikel mit 10 Parametern und testeten die Charakteristika dieser 10 Nanopartikelarten durch Experimente wie DLS und HR-TEM. Die MB-Beladungseffizienz und Freisetzungskinetik der 10 Serien selbstzerfallender Nanopartikelsysteme wurden in verschiedenen pH-Lösungen und HepG2-Zellen getestet. Zur Verifizierung der intrazellulären Lokalisation der Nanopartikel nach Zellaufnahme führten wir Zell-TEM-Experimente und Live-Zell-Konfokalmikroskopie durch. Schließlich maßen wir die lysosomalen pH-Änderungen in 6 Zellarten nach BPSi-Zufuhr, um die Universalität der MB@SiO₂-Nanopartikel zur Messung lysosomaler pH-Änderungen zu verifizieren.

BPSi-Nanopartikelsynthese

Die BPSi-Nanopartikel wurden nach unserer vorherigen Methode [12] hergestellt und von unserem Kooperationspartner (Wujun Xu, Department of Applied Physics, University of Eastern Finland) geliefert. Die Präparation von BPSi, NaSi, Ammoniumsalz und NaBr (NaSi:NH₄Br:NaBr = 1:4:4, w/w/w) wurde in einer Handschuhbox unter Ar-Atmosphäre gemahlen. Sie reagierten in einem Röhrchenofen unter N₂-Atmosphäre bei 240 °C für 5 h (Gleichung 1). Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden die erhaltenen Mikropartikel durch Spülen mit 0,5 M HCl und 1,0 M HF getrennt gereinigt. Die Mikropartikel wurden in Ethanol bei 1000 rpm für 15 min kugelmahlen, und die BPSi-Nanopartikel mit gewünschtem Durchmesser wurden durch Einstellen der Zentrifugengeschwindigkeit gesammelt.

$$ \mathrm{NaSi}+{\mathrm{NH}}_4\mathrm{Br}\to \mathrm{NaBr}+{\mathrm{NH}}_3+\mathrm{Si}/\mathrm{H}+{\mathrm{H}}_2 $$ (1)

Durch Dynamic Light Scattering (DLS) wurden Durchmesserverteilung und Oberflächenladung der Nanopartikel untersucht. Alle NPs wurden unmittelbar vor der Zugabe zu den Zellen nach Sterilisation durch kurze Ultraschallbehandlung (5 s, um sie gleichmäßig in der Lösung zu verteilen, Ultraschallreiniger SB-5200DT, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.) im Medium dispergiert.

Etablierung der 10 Serien selbstzerfallender Nanopartikelsysteme

Die 10 Serien selbstzerfallender Nanopartikel wurden nach unseren zuvor berichteten Methoden [13-16] mit modifizierten Parametern synthetisiert. In einem typischen Verfahren wurde eine bestimmte Menge MB zunächst einer Mischung aus Ethanol (75 mL) und Ammoniakwasserlösung (25 %, 3,4 mL) zugegeben, danach eine bestimmte Menge TEOS hinzugefügt. Die Serien selbstzerfallender MB@SiO₂ NPs wurden nach 24 h Rühren und 3-maligem Waschen vor dem Trocknen erhalten. Die Mengen an MB und TEOS in den Protokollen entsprechen Tabelle 1. Die Bedeutung von 1,0/100 in NPs_1,0/100 repräsentiert die Mengen an MB und TEOS bei der Nanopartikelsynthese: 1,0 mg MB und 100 μl TEOS. Die Bedeutungen von 1,5/100 in NPs_1,5/100 und anderen sind analog.

Zellkultur

Um die Effizienz und Universalität des pH-Indikators basierend auf selbstzerfallenden Nanopartikeln zu testen, wählten wir spezifische tumorentstammte Krebszelllinien. Als Forschungsobjekte dienten Leberkrebs-, Lungenkrebs-, Darmkrebs- und Melanozytom-Zelllinien. Die Zelllinien menschlicher Darmkrebszellen HCT116, HCT8, HCT15; menschlicher Leberkrebszellen HepG-2; menschlicher Lungenkrebszellen A549; und maus Melanomzellen B16 wurden in RPMI 1640 Medium (Life Technologies) mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 2,0 g/L Natriumbicarbonat, 0,1 g/L Streptomycinsulfat, 0,06 g/L Penicillin G und 5,958 g/L HEPES kultiviert. Die Zellen wurden in einem Standard-Zellkulturinkubator bei 37 °C in feuchter Atmosphäre mit 5 % CO₂ gehalten.

Charakterisierung der 10 Serien selbstzerfallender Nanopartikelsysteme

Die Morphologie aller Serien-Nanopartikel wurde mit HR-TEM im STEM-Modus charakterisiert, und Si-Mapping wurde durch EDS-Elementmapping untersucht. Die Nanopartikelgrößenverteilungsanalyse wurde mit ImageJ-Software durch Berechnung der Nanopartikeldurchmesser in zufällig ausgewählten STEM-Bildern durchgeführt. Das Zeta-Potenzial der Nanopartikel und der Polydispersitätsindex (PDI) wurden durch DLS-Studie in Serienpuffern mit spezifischen pH-Werten gemessen. Daten wurden mit SPSS 15.0 analysiert und statistische Ergebnisse als Mittelwert ± SD dargestellt.

MB-Beladungseffizienz und Freisetzungskinetik der 10 Serien selbstzerfallender Nanopartikelsysteme

Zur Untersuchung der MB-Beladungseffizienz und Freisetzungskinetik wurde zunächst die Standardkurve von MB in Serienkonzentrationen erstellt. Die Absorption von MB wurde per UV-Vis-Spektrum mit Absorption bei 660 nm durchgeführt, was der λ_max des monomeren MB ist. Die MB-Beladungseffizienz wurde nach folgender Gleichung berechnet: MB-Beladungseffizienz (%) = Menge an eingekapseltem MB / (gesamte MB-Eingabemenge).

Die MB-Freisetzung aus den 10 Serien-Nanopartikeln wurde in reinem Wasser und pH-Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten (pH 4,0, pH 6,86, pH 9,18) und Lysozym-Lösung (Thermo Scientific™ #90082) untersucht. Zudem wurde die MB-Freisetzungskinetik nach bestimmter Dauer in verschiedenen pH-Puffern untersucht. Die OD-Werte bei 660 nm und die MB-Freisetzungsprozente als Funktion der Zeit wurden dann studiert.

Im Detail wurden die MB-Freisetzungsstudien nach folgenden Protokollen durchgeführt: 10 Serien-Nanopartikel in 15 mL Standardpuffer von pH 4,0, 6,86 und 9,18 mit Lysozymlösung gelöst; MB-Freisetzung in einem Hula-Mischer bei 37 °C durchgeführt. Während der folgenden 15 Tage wurde jeweils 1 mL jeder Probe entnommen, dann bei 12000 rpm für 10 min zentrifugiert. Überstand und Niederschlag wurden auf ihre Absorptionsspektren bei 200–800 nm gemessen.

Zusätzlich wurde die MB-Freisetzung in präzisen pH-Puffern mit Lysozymlösung im pH-Bereich 4,1 bis 5,5 mit denselben Protokollen untersucht. Spezifische Zeitpunkte (6 h, 12 h, 24 h) wurden als Beobachtungszeitpunkte festgelegt. Die Absorptionen bei 660 nm wurden in jeder Probe aufgezeichnet. Die lineare Beziehung der Absorption jeder pH-Lösung und die Summe der quadrierten Residuen wurden an jedem Zeitpunkt berechnet.

Um die MB-Freisetzungsprofile in Zellen zu detektieren, wurden HepG-2-Zellen in einer 75 cm² Kulturflasche kultiviert und mit NPs (300 μg/mL) gefüttert, als die Zellen 70 % der Flasche bedeckten. Alle 30 min wurden die Zellen gesammelt. Die Zellen wurden wiederholt eingefroren und aufgetaut, um das MB in den Zellen vollständig freizusetzen. Die Zelllysate wurden bei 12000 r/min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und seine Absorption bei 660 nm gemessen, um die Gesamtmenge des freigesetzten MB zu berechnen. In dieser Studie wurden HepG2-Zellen als Forschungsobjekte gewählt, aufgrund ihrer schnellen Zellproliferation, die die Varianz aller 10 getesteten Gruppen minimieren konnte.

Zelluläre Kolokalisation der 10 Serien-Nanopartikel und Freisetzungsleistung in 6 verschiedenen Zelllinien

Zell-TEM wurde eingesetzt, um die Kolokalisation der Nanopartikel in Endo-/Lysosomen nach standardisierten Zell-TEM-Protokollen zu untersuchen. Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/Flasche ausgesät und 24 h inkubiert, um Zellhaftung zu ermöglichen. Zehn Serien-Nanopartikel im Medium mit gleicher Konzentration (100 μg/mL) wurden für weitere 12 und 24 h mit den Zellen inkubiert. Zellen wurden dann 3-mal mit PBS gewaschen, um überschüssige Nanopartikel zu entfernen, dann in 2,5 % Glutaraldehyd-Lösung für länger als 1 Tag fixiert. Fixierte Zellen wurden gewaschen und mit Osmiumtetroxid (1 % in deionisiertem Wasser) für 1 h gefärbt, gefolgt von Waschen mit PBS (3-mal) und DI-Wasser (2-mal). Klassisches Zell-TEM-Protokoll [17, 18] wurde anschließend durchgeführt, und Schnitte mit 90 nm Dicke wurden für TEM-Beobachtung gesammelt. MB-Freisetzung als Funktion von pH-Werten wurde in 6 Zelllinien mit sowohl NPs_6/100 als auch NPs_7,5/80 untersucht. Auch die OD-Werte aus der MB-Freisetzung und die MB-Freisetzungsprozente wurden für die Datenanalyse aufgezeichnet.

Untersuchung der intrazellulären Aufnahme von MB@SiO₂-Nanopartikeln

Live-Zell-Konfokalmikroskopie wurde verwendet, um die zelluläre Aufnahme und das intrazelluläre Schicksal der MB@SiO₂-Nanopartikel zu bewerten. HepG-2-Zell-Frühendosomen wurden gefärbt (CellLight Early Endosomes-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific C10586, Anregung/Emission ~488/510 nm) für 16 h. Anschließend wurden Zellen mit NPs_6/100 (MB Anregung/Emission: 640/650–700 nm) bei einer Nanopartikelkonzentration von 100 μg/mL zu spezifischen Zeitintervallen (2 h, 2,5 h, 3 h, 5 h, 6 h) inkubiert. Vor der Bildaufnahme wurde LysoTracker mit LysoTracker™ Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific L7528, Anregung/Emission: 577/590 nm) für 40 min gefärbt. Danach wurde die Färbelösung entfernt und die Zellen 2–3-mal in PBS gewaschen. Bilder wurden mit einem Nikon A1R Konfokalmikroskop aufgenommen.

Transkriptom-Sequenzierung zur Bewertung der Genexpressionsänderung nach BPSi-Zufuhr

Totale RNA-Extraktion der Kontrollgruppe und BPSi-behandelten Gruppe erfolgte mit Trizol-Reagenz nach Standardarbeitsanweisungen. Die Qualität der initialen Gesamt-RNA-Probe für das Sequenzierungsexperiment wurde mit einem NanoDrop ND-2000 Spektrophotometer detektiert. Gesamt-RNA, die die Qualitätskontrolle bestand, wurde in nachfolgenden Sequenzierungsexperimenten verwendet. Ein Vergleich der Genexpression wurde durch Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt. Alle Sequenzierungsprogramme wurden von BGI-Shenzhen Corporation (Shenzhen, China) mit der BGISEQ-500-Plattform durchgeführt. Rohdaten aus der Sequenzierung wurden Qualitätskontrollen unterzogen, um zu bestimmen, ob die Sequenzierungsdaten für nachfolgende Analysen geeignet sind. Falls bestanden, wurde quantitative Analyse der Gene basierend auf Genexpressionsniveaus und signifikante Anreicherungsanalyse von Genontologie (GO) Funktionen an den differentiell exprimierten Genen zwischen den ausgewählten Proben durchgeführt.

Reverse Transkription Quantitative Polymerase Kettenreaktion (RT-qPCR) Assay zur Bestätigung der Aktivierung des TFEB-CLEAR Gen-Netzwerks

Totale RNA wurde aus kultivierten HepG-2-Zellen der Kontroll- und BPSi-behandelten Gruppen mit Trizol-Reagenz extrahiert und mit BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis Kit (Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd.) mit zufälligen Primern in cDNA revers transkribiert. cDNA wurde verwendet, um das TFEB-CLEAR-Gennetzwerk durch quantitative PCR mit dem Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) mit Aktin als Referenzkontrolle zu amplifizieren. Für quantitative RT-PCR verwendete Primer sind in Tabelle S4 aufgeführt.

Western Blot Assay zur Bestätigung, dass Autophagie nach BPSi-Zufuhr aktiviert wird

Zelluläre Proteine der Kontrollgruppe und verschiedener BPSi-Konzentrationsgruppen wurden mit RIPA-Lysepuffer (Heart Biological Technology Co., Ltd.) extrahiert. Proteaseinhibitor wurde dem RIPA-Puffer zugesetzt und auf Eis vorgekuhlt. Zellen wurden 3-mal mit vorgekuhltem PBS gewaschen. Flüssigkeit wurde vollständig entfernt und das Gefäß für 2 min auf Eis gelegt. 400 μl RIPA-Puffer wurden auf die gesamte Gefäßoberfläche gegeben, mehrmals mit einer Pipette pipettiert und 30 min auf Eis inkubiert, wobei das Gefäß mehrmals geschüttelt wurde, um die Zellen vollständig zu lysieren. Der lysierte Zellflüssigkeit wurde in 1 ml Eppendorf-Röhrchen überführt und bei 13000 rpm für 10 min, 4 °C zentrifugiert. Der gewonnene Überstand wurde 10 min in Wasser gekocht und bei –20 °C für spätere Verwendung aufbewahrt. Proteinkonzentration wurde mit Pierce® BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific) quantifiziert.

Zellextrakte mit 25 μg Gesamtprotein wurden direkt SDS-PAGE unterzogen und transferiert. Membranen wurden mit 5 % Magermilch blockiert und mit Primärantikörpern gegen P62 (Proteintech #18420–1-AP), TFEB (Proteintech #13372–1-AP), LC3B (Abcam #ab192890) und β-Aktin (Proteintech #20536–1-AP) inkubiert. Sekundärantikörper wurden gemäß der Herkunftsart der Primärantikörper gewählt und durch Enhanced Chemiluminescence (Pierce) oder Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Gel Imaging System (Bio-Rad, USA) detektiert. Die normalisierte Bandintensität von P62, TFEB und LC3B relativ zu β-Aktin wurde durch Densitometrie mit ImageJ-Software in den BPSi-Gruppen quantifiziert, und die Daten sind Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Experimenten.

Messung des zellulären pH mit PDMPO und pHrodo™ Red Transferrin-Konjugat durch Konfokalmikroskopie

PDMPO-Studie

1 × 10⁵ HepG-2-Zellen wurden über Nacht auf sterilen Konfokalplatten kultiviert und BPSi-Nanopartikel mit einer Konzentration von 100 μg/mL zugefügt. Am nächsten Tag wurden vor der Immunfluoreszenzfärbung die Objektträger dreimal mit 0,01 M Phosphat-gepuffertem Salin (PBS), pH 7,4, gewaschen, dann 1 μM PDMPO-Farbstoff (Ex/Em = 329/440) zugegeben. Nach Waschen mit PBS (3-mal) wurden Zellen mit frischem RPMI-1640-Kulturmedium inkubiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon A1R, Japan) mit CCD-Kamera beobachtet und Bilder innerhalb von 5 min aufgenommen. Das Verhältnis der blauen und grünen Fluoreszenzintensität in den Lysosomen wurde dann gemäß dem Verfahren von Chen et al. [19] berechnet.

pHrodo™ Red Transferrin-Konjugat-Studie

HepG-2-Zellen wurden analog in Konfokalplatten für Zellhaftung 24 h plattiert, dann für 10 min auf Eis gehalten. Zellen wurden mit kaltem Live Cell Imaging Solution (20 mM Glucose, 1 % BSA) gewaschen. pHrodo™ Red Transferrin-Konjugat (Ex/Em = 560/585 nm) wurde zu 25 μg/mL in Live Cell Imaging Solution zugegeben und bei 37 °C für 20 min inkubiert, dann in Live Cell Imaging Solution gewaschen. Die Beobachtung erfolgte ebenfalls per Konfokalmikroskopie. Die quantitative Analyse der Intensität der Mikroskopiebilder wurde mit ImageJ-Software durchgeführt.

Detektion des zellulären lysosomalen pH

Die Zellen A549, HepG-2, HCT8, HCT15, HCT116 und B16 wurden in 75 cm² Kulturflaschen kultiviert und mit NPs gefüttert, als die Zellen 70 % der Flasche bedeckten. 6 h später wurden die Zellen gesammelt. Die Zellen wurden wiederholt eingefroren und aufgetaut, um das MB in den Zellen vollständig freizusetzen. Die Zelllysate wurden bei 12000 r/min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und seine Absorption bei 660 nm gemessen, um die Gesamtmenge des freigesetzten MB zu berechnen. Die Absorption der NPs_6,0/100 bei einem Standard-pH wurde verglichen, um den pH-Wert jeder Zelle zu erhalten.

Statistische Analyse

Statistische Analyse wurde mit SPSS 15.0 Software durch zweifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) für unabhängige Gruppen und Tukey HSD-Verfahren für Mehrfachvergleiche durchgeführt. Statistische Signifikanz basierte auf P < 0,05.

Ergebnisse und Diskussion

Zunächst detektierten wir differentielle Genexpression, als Zellen mit dual PEG-funktionalisierten schwarzen porösen Silica-Nanopartikeln (BPSi NPs) (angeboten von unserem Kooperationslabor [12]) gefüttert wurden. Die Änderung des Zeta-Potenzials von −18,5 auf +2,8 mV zeigte an, dass die Oberflächen-dual-PEGylierung erfolgreich war (Abb. S1a). Der mittlere Durchmesser der BPSi-Nanopartikel betrug 156 nm (Abb. S1b). Basierend auf dem Cluster-Heatmap der differentiellen Genexpression (Abb. S2) wählten wir mehr als 2-fach differentielle Genexpressionen für weitere Untersuchungen. GO und KEGG wurden zur Analyse der differentiellen Gene eingeführt. Aus den GO-Anreicherungs-Blasenkarten (Abb. 1a) wurden metabolische und lysosom-assoziierte Gene einschließlich Phagolysosomen-Assemblage, Phagozytose und Xenobiotika-Stoffwechselprozess für weitere Analysen ausgewählt. Insbesondere TFEB-CLEAR [17]-assoziierte Genexpressionen waren signifikant erhöht. Die RT-PCR-Ergebnisse (Abb. 1b) verifizierten die Gen-Sequenzierungsergebnisse: Gene im TFEB-korrelierten lysosomalen Expressions- und Regulationsweg (CLEAR) stiegen signifikant an, wie CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2, TPP1. Diese Gene wurden im Lysosomenweg markiert (Abb. S3). Ihre Expression war höher als in der Kontrollgruppe und statistisch signifikant (P_{BPSi VS Control} < 0,05). TFEB reguliert positiv die Expression lysosomaler Gene, kontrolliert die Lysosomenpopulation und fördert den zellulären Abbau lysosomaler Substrate.

Autophagie wird in HepG-2-Zellen nach BPSi-Zufuhr aktiviert. a GO-Anreicherungs-Blasenkarte der differentiell exprimierten Gene aus Transkriptom-Sequenzierung. b Verifikation der Genänderungen im TFEB-CLEAR-Gennetzwerk nach BPSi-Behandlung durch RT-qPCR-Experimente. c P62, TFEB, LC3B II/I Proteinexpression nach BPSi-Behandlung. d Normalisierte Bandgrauintensität von P62, TFEB, LC3B II/I Protein in BPSi-behandelten Gruppen relativ zur Kontrollgruppe. Daten als Mittelwert ± SD.

Zusätzlich reguliert TFEB die Autophagie, und seine Überexpression führt zu einem signifikanten Anstieg der Autophagosomenproduktion in kultivierten Zellen, da die Hauptfunktion des TFEB-Gens die Induktion der Biosynthese von Lysosomen und die Förderung der Autophagie ist [20]. Western-Blot-Analyse wurde ebenfalls eingesetzt, um zu testen, ob Autophagie auftritt, wenn Zellen mit BPSi NPs gefüttert werden. Ziel des Western-Tests war es, weiter zu bestätigen, dass die Expression von TFEB erhöht war und Zellautophagie nach BPSi-Zufuhr auftrat. LC3B und P62 Proteine sind beide Autophagie-Marker. Wenn Autophagie auftritt, steigt die Expression von Mikrotubuli-assoziiertem Protein 1A/1B-light chain 3B (LC3B) II/I. p62 ist ein Rezeptor für Vesikel, die durch Autophagie abgebaut werden, und auch ein Rezeptor für ubiquitinierte Proteinaggregate zur Clearance; seine Expression nimmt ab, wenn Autophagie auftritt. Daher maßen wir die Expression dieser Proteine im Western-Experiment.

Aus den Western-Blot-Ergebnissen (Abb. 1c, d) waren TFEB (P_{80 μg/ml VS control} = 0,000008), LC3B II/I (P_{80 μg/ml VS control} = 0,000297) und p62 (P_{80 μg/ml VS control} = 0,000016) Proteine signifikant hochreguliert. Da die Hochregulierung von TFEB und LC3B II/I Proteinen die Aktivierung der Autophagie anzeigt [18], vermuteten wir, dass BPSi-Endozytose das Auftreten von Autophagie fördert. Allerdings sollte das p62-Protein während des Autophagieprozesses herunterreguliert werden, aufgrund seiner Trägerprotein-Natur, die Endosomen zu Lysosomen bringt und schließlich abgebaut wird. In unserer Studie zeigte die signifikante Hochregulierung von p62 die Beendigung der Degradation während des Endo-Lysosomen-Fusionsprozesses [21], was wahrscheinlich durch pH-Erhöhung in Endo-/Lysosom-Vesikeln verursacht wurde. Daher kann BPSi-Endozytose zunächst das Auftreten von Autophagie induzieren, dann den Autophagieprozess durch Erhöhung der Endo-/Lysosom-pH-Werte inhibieren, aufgrund seiner Amid-Alkalinität.

Um die pH-Erhöhungscharakteristika in Endo-/Lysosomen durch BPSi-Endozytose zu bezeugen, wurden zwei kommerzielle pH-fluoreszente Sonden in unserer Studie eingesetzt: pHrodo™ Red Transferrin Konjugat (Thermo Fisher #P35376) und RatioWorks™ PDMPO.

pHrodo™ Red als kommerzieller intrazellulärer pH-Indikator zeigt normalerweise schwache Fluoreszenz bei neutralem pH, aber zunehmende Fluoreszenz bei sinkendem pH. Er sollte den zytosolischen pH im Bereich 9–4 mit einem pKa von ~6,5 quantifizieren (Anregung/Emission 560/585 nm). Aus 6 Zelllinienbestimmungen konnten wir eine qualitative Schlussfolgerung ziehen, dass die Endozytose von BPSi NPs die Fähigkeit hat, pH-Werte in Endo-/Lysosomen zu erhöhen, aufgrund der schwächeren roten Fluoreszenzsignale (Abb. S4, S5). Nach mehrfacher Wiederholung der Experimente gemäß Produktprotokollen konnten wir jedoch den exakten pH-Wert, der zwischen verschiedenen Zelllinien vor oder nach BPSi-NP-Zufuhr abfiel, kaum quantitativ analysieren, da keine Korrelation zwischen Intensität und pH-Werten etabliert war.

PDMPO wurde dann als bessere Lösung für die Anzeige der pH-Wertänderungen nach BPSi-Endozytose eingesetzt, da es Ratiometrie-Techniken in der quantitativen pH-Messung einführt. PDMPO [2-(4-Pyridyl)-5-((4-(2-Dimethylaminoethyl-aminocarbamoyl) methoxy) phenyl) oxazol] ist als säuretroper Dual-Excitations- und Dual-Emissions-pH-Sonde charakterisiert. Es emittiert intensive grüne Fluoreszenz bei niedrigerem pH und intensive blaue Fluoreszenz bei höherem pH. Diese einzigartige pH-abhängige Fluoreszenz macht PDMPO zu einem idealen pH-Sonden für saure Organellen mit pKa = 4,47. PDMPO markiert selektiv saure Organellen (wie Lysosomen) lebender Zellen, und die zwei distincten Emissionspeaks können zur Überwachung von pH-Schwankungen lebender Zellen in Ratiomessungen verwendet werden. Dennoch gelang es uns nicht, die pH-Werte in 6 Zelllinien vor und nach BPSi-Zufuhr zu messen. Wie die Ergebnisse in Abb. S6 zeigen, wurden in allen 6 Zelllinien vor und nach BPSi-Zufuhr keine signifikanten Unterschiede beobachtet. Obwohl eine Korrelation zwischen Blue/Green-Ratio und pH-Werten etabliert wurde (Abb. S7), machte die nichtlineare Korrelation von pH 4–5 die PDMPO-Methode in der quantitativen Analyse von Endo-/Lysosomen vor und nach BPSi-Zufuhr unbrauchbar.

Aus den Daten der beiden kommerziellen pH-Indikatoren oben haben wir erstmals demonstriert, dass PEG-dekorierte Nanopartikel mit Amidgruppen auf der PEG-Kette den Endo-/Lysosom-pH aufgrund der alkalischen Natur des Amids erhöhen können. Ohne quantitative Analyse präziser pH-Änderungen (0,1 pH-Bereich) konnten wir jedoch die Korrelationen zwischen Autophagie-Status und Endo-/Lysosom-pH-Werten nicht herstellen, was die Autophagie-Vorhersage verfehlte.

Basierend auf unserer vorherigen Studie zu selbstzerfallenden Nanopartikeln [13, 14, 15, 22] behielten wir die gleiche Ammoniumhydroxid-Konzentration in 75 % Ethanol bei, passten aber MB- und TEOS-Konzentrationen an. Zwei TEOS-Mengen wurden als 100 μl und 80 μl festgelegt, um unterschiedliche Schalenstärken und Porengrößen zu erhalten. Zehn MB-Mengen wurden festgelegt, um unterschiedliche Größen der zentral-hohlen Struktur und MB-Beladungseffizienzen zu erhalten.

Die in den Protokollen hinzugefügten MB- und TEOS-Mengen entsprachen Tabelle 1.

Wie in Abb. 2a, b gezeigt, nahm die Nanopartikelgröße mit steigender MB-Menge zu, bei beiden TEOS-Konzentrationen (100 μl und 80 μl). Bei gleicher MB-Konzentration stieg die Partikelgröße mit steigender TEOS-Menge. Zudem wuchs mit steigender TEOS-Menge die Schalendicke, was durch Elementmapping belegt wurde (Abb. 2c). Der Polydispersitätsindex (PDI) und die Oberflächenladung der Nanopartikel sind in Abb. S8 und Tabelle S1 dargestellt. Die Morphologiestudien sagten voraus, dass mit steigender MB-Menge die Beladungseffizienz zunimmt, was zu schnellerem Freisetzungsprofil führt, während mit steigender TEOS-Menge die Freisetzung verlangsamt wird. Wir mussten die geeignete MB- und TEOS-Konzentration finden, mit der wir das optimierte Nanopartikelsystem erhalten, das ein linear mit pH-Änderungen korreliertes MB-Freisetzungsprofil ermöglicht.

Morphologiecharakterisierung von 10 verschiedenen selbstzerfallenden Nanopartikeln mit spezifischen MB- oder TEOS-Mengen. a STEM-Abbildungen. b Nanopartikelgrößenverteilungsanalyse. c Si-Mapping von 10 selbstzerfallenden Nanopartikeln. Maßstäbe in allen Abbildungen 100 nm. Die Größenverteilungsanalyse wurde durch zufällige Auswahl von 100 Nanopartikeln aus STEM-Abbildungen und Messung mit ImageJ-Software durchgeführt. Daten als Mittelwert ± SD.

Die MB-Beladungseffizienz wurde per UV-Vis-Spektrum bestimmt. Die Standardkurve (Abb. S9) von MB wurde zunächst mit Serienkonzentrationen von MB-Lösung (6,25 bis 46,88 μg/mL) erstellt, mit der Gleichung y = 67,63x + 0,10919, R² = 0,9987. Mit der obigen Gleichung berechneten wir die MB-Beladungseffizienz der 10 selbstzerfallenden Nanopartikel mit spezifischen Parametern; detaillierte Daten in Abb. S10.

Vor der Untersuchung der MB-Freisetzungsprofile in verschiedenen pH-Lösungen wurden die Freisetzungsprofile in reinem Wasser untersucht. Wie in Abb. S11 und S12 gezeigt, präsentierten alle Nanopartikel mit TEOS-Menge 80 μl erhöhte MB-Freisetzung mit zunehmender Dauer, reflektiert durch UV-Vis-Absorption. Zudem wurde mit steigender eingekapselter MB-Menge der Wachstumstrend der MB-Freisetzung signifikanter, und die Freisetzungsgeschwindigkeit wuchs schneller. Bei Erhöhung der TEOS-Menge auf 100 μl wurde die Partikeloberfläche dichter und die Freisetzung langsamer, wenn die MB-Menge unter 3,0 mg lag; in 14 Tagen Freisetzung in Wasser war kaum ein Anstieg zu beobachten. Sobald die MB-Menge über 4,0 mg stieg, war ein offensichtlicher Anstiegstrend der MB-Freisetzung zu beobachten. Bemerkenswert ist, dass die Nanopartikelparameter NPs_7,5/80 und NPs_6,0/100 beide ein solides Wachstum mit Zeitverlauf zeigten, fast linear in den ersten 7 Tagen, dann Plateau erreichten.

Dann konzentrierten wir uns auf das MB-Freisetzungsverhalten in verschiedenen pH-Puffern, um herauszufinden, ob selbstzerfallende Nanopartikel mit spezifischen Parametern ein linear pH-abhängiges MB-Freisetzungsprofil haben.

Zunächst führten wir MB-Freisetzungsexperimente bei pH 4,0 Pufferlösung durch. Aus Abb. S13 ließ sich leicht schließen, dass bei gleicher TEOS-Menge von 100 μl die MB-Freisetzungsgeschwindigkeit einen ähnlichen Trend aufwies wie bei den 5 Nanopartikelsystemen mit TEOS 80 μl (Abb. S14), wobei eine zentrale positive Korrelation mit der eingekapselten MB-Menge bestand.

Konzentriertes MB diffundiert aufgrund des Konzentrationsgradienten in die umgebende Lösung. Ein größerer Konzentrationsgradient beschleunigt die MB-Freisetzung. Im Vergleich zur MB-Freisetzung in reinem Wasser fanden wir, dass die saure Umgebung die MB-Freisetzung beschleunigte (Abb. S13, S14 vs. S11, S12), was zeigt, dass die MB-Freisetzung nicht nur durch Diffusion getrieben wird; in sauren Lösungen ist auch elektrostatische Abstoßung eine wichtige Treibkraft aufgrund der positiven Ladung von MB. Wir berechneten dann den Freisetzungsprozentsatz jedes Nanopartikelparameters gemäß MB-Beladungseffizienz, MB-Standardkurve und Verdünnungsverhältnis bei Messungen. Der Freisetzungsprozentsatz reflektierte die Freisetzungsgeschwindigkeit von MB in pH 4,0 saurer Lösung, und die Ergebnisse (Abb. 3) zeigten, dass nur der Freisetzungsprozentsatz von NPs_7,5/80 in pH 4,0 Lösung linear verlief. Andere Nanopartikelsysteme mit spezifischen MB- und TEOS-Parametern zeigten ähnliche Freisetzungstrends, und der Freisetzungsprozentsatz wies kein lineares Wachstum auf. Eine Ausnahme war NPs_6/100, dessen MB-Freisetzung in nur 72 h das Plateau erreichte; somit war es schwer zu sagen, ob die MB-Freisetzung vor dieser Dauer linear hätte wachsen können.

MB-Freisetzungsprozentsatz von 10 Serien selbstzerfallender Nanopartikel nach spezifischer Dauer in pH 4,0 Puffer. Alle Experimente wurden dreifach wiederholt, Daten als Mittelwert ± SD.

Gleichzeitig testeten wir die MB-Freisetzungsprofile in nahe-neutralen und alkalischen Puffern (pH 6,86 und pH 9,18). Die Ergebnisse in Abb. S15, S16, S17, S18 zeigten, dass die MB-Freisetzung mit steigendem Lösungs-pH auf 6,86 verlangsamte; zudem nahm mit steigender zentraler MB-Konzentration der MB-Freisetzungsprozentsatz ab. Bei pH 9,18 präsentierten alle Nanopartikel mit 10 spezifischen Parametern eine sehr langsame MB-Freisetzung (Abb. S19, S20); der Trend war ähnlich wie in pH 6,86 Puffer, aber mit noch niedrigerem Freisetzungsprozentsatz. Es war klar, dass selbstzerfallende Nanopartikel nur in sauren Lösungen ein lineares MB-Freisetzungswachstum zeigten. Wir dachten an den Endo-/Lysosom-pH von 4 bis 5, was genau dem pH-Bereich des linearen MB-Wachstums als Funktion der Zeit in einem spezifischen MB/TEOS-Parameter entspricht. Damit waren wir zuversichtlicher, dass das selbstzerfallende Nanopartikelsystem ein präzises Messwerkzeug für die quantitative Bestimmung des durchschnittlichen Endo-/Lysosom-pH sein könnte, was Evidenz für den exakten pH-Wert des Autophagie-Status liefert.

Die Vorbedingung für die Verwendung spezifischer selbstzerfallender Nanopartikel als Endo-/Lysosom-pH-Indikator ist, dass die Nanopartikel während des gesamten Messprozesses stabil im Endo-/Lysosom verbleiben. Zweitens sollte die MB-Freisetzung im Endo-/Lysosom reibungslos erfolgen, wenn die Messung durchgeführt wird.

Die Kolokalisation der Nanopartikel in Endo-/Lysosomen durch Zell-TEM-Studie und die MB-Freisetzung in 6 verschiedenen Zelllinien wurden untersucht. Aus den Zell-TEM-Ergebnissen blieben alle 10 Serien-Nanopartikel nach 24-h-Inkubation mit HepG-2-Zellen in Endo-/Lysosomen ohne Entweichen (Abb. 4). Da der Durchmesser der in Abb. 4 verwendeten HepG2-Zellen etwa 10–20 μm beträgt und der Durchmesser der MB@SiO₂-Nanopartikel zwischen 75 und 200 nm liegt, ist es sehr schwierig, die Nanopartikelmorphologien mit niedriger Vergrößerung zu klären (wie in Abb. S21 gezeigt). Wir untersuchten auch die intrazelluläre Lokalisation der Nanopartikel in den anderen 5 Zelllinien, und 4 Nanopartikel wurden zufällig ausgewählt, um zu demonstrieren, dass die Nanopartikel in Endo-/Lysosomen eingeschlossen waren (Abb. S22). Nanopartikel mit allen Parametern zeigten eine zentral-hohle Struktur in allen anderen 5 Zelllinien nach 24-h-Inkubation, was die MB-Freisetzung anzeigte. Unter präziserer Beobachtung fiel auf, dass die MB-Freisetzung aufgrund unterschiedlicher Hohlraumgrößen variieren könnte, was darauf hindeutet, dass (1) der Endo-/Lysosom-pH in verschiedenen Zellen unterschiedlich ist und (2) die MB-Freisetzung aus den Nanopartikeln sehr empfindlich auf den Endo-/Lysosom-pH reagiert, besonders für NPs_6/100 und NPs_7,5/80. Aus Abb. S23 ist ersichtlich, dass Nanopartikel bereits 2 h nach Zufuhr endozytiert wurden und in Vesikeln blieben, dann sich allmählich in Lysosomen anreicherten.

Kolokalisation der Nanopartikel in Endo-/Lysosomen durch Zell-TEM-Studie nach 12 und 24 h Inkubation mit den 10 Serien-Nanopartikeln. Der Maßstab beträgt 200 nm in den TEM-Bildern.

Wir untersuchten dann die Korrelation zwischen pH-Werten und OD-Werten im pH 4,0–4,8. Aus den Ergebnissen in Abb. 5 und Abb. S24 zeigten die NPs_6/100 und NPs_7,5/80 Nanopartikelsysteme eine lineare Abnahme der MB-Freisetzung als Funktion des pH im Bereich 4,0 bis 4,8.

MB-Freisetzung als Funktion von pH-Werten in NPs_6/100 und NPs_7,5/80 nach spezifischer Inkubationsdauer (6 h, 12 h, 24 h). Die linearen Korrelationsgleichungen wurden für 6 h und 12 h für MB-Freisetzung aus sowohl NPs_6/100 als auch NPs_7,5/80 als Funktion der pH-Werte berechnet. Alle Experimente wurden tripliziert, Daten als Mittelwert ± SD.

Wir wandelten dann den OD-Wert in MB-Freisetzungsprozentsatz gemäß MB-Beladungseffizienz und Fütterungsmenge um. Wie in Abb. S25 gezeigt, präsentierten sich in den ersten 6 h der MB-Freisetzungsprozentsatz in NPs_6/100 und NPs_7,5/80 Nanopartikelsystemen ebenfalls als Funktion der pH-Werte. Wir berechneten dann die Residuenquadratsumme und Pearsons Korrelationskoeffizient bei 6 h und 12 h Freisetzungsdauer. Die Residuenquadratsumme zeigt negative Korrelation mit der Güte des linearen Fits, während der absolute Wert von Pearsons Korrelationskoeffizient näher an 1 umso linearer ist. Wie in Tabelle S2 und S3 gezeigt, ist der höchste Linearitätsgrad der Fit von NPs_6,0/100 Nanopartikelsystemen, gefolgt von NPs_7,5/80 bei 6 h Freisetzung.

Bis dahin waren wir von den Ergebnissen begeistert, dass die Methode zur präzisen Überwachung der pH-Werte etabliert wurde, besonders mit Genauigkeit ≤ 0,1 pH-Wert-Intervall. Das bedeutet, wir haben große Möglichkeiten, die Korrelation zwischen Endo-/Lysosom-pH-Werten und Autophagie-Status zu ermitteln, was von großer Bedeutung für das bessere Studium des Autophagie-Mechanismus und die Vorhersage des Autophagieprozesses ist. Wie in Abb. S26 zu sehen, hatte die MB-Freisetzung in HepG-2-Zellen nach 4 h Inkubation bereits das Plateau erreicht. Daher wählten wir 6 h als Beobachtungszeitpunkt.

Wir untersuchten dann sorgfältig die MB-Freisetzung von NPs_6,0/100 in 6 Zelllinien bei einer Nanopartikel-Zell-Interaktionsdauer von 6 h, einschließlich Leberkrebs HepG-2, Darmkrebs HCT8, HCT15, HCT116, Lungenkrebs A549 und Myomelanozytom B16.

Wie in Tabelle 2 gezeigt, differenzierten wir die Endo-/Lysosomen in 6 Krebszelllinien klar mit einer Genauigkeit von 0,01 pH-Werten, was mit kommerziellen intrazellulären pH-Indikator-Kits unmöglich ist.

Zudem werteten wir die pH-Werte in Endo-/Lysosomen der HepG2-Zellen vor und nach Kultivierung mit BPSi-Nanopartikeln neu aus. Wir kamen zum Schluss, dass BPSi-Aufnahme die Endo-/Lysosom-pH-Werte signifikant erhöht, von 4,70 ± 0,09 auf 5,59 ± 0,05, was den Grund für BPSi-induzierte initiale Autophagie und anschließende Terminierung des Autophagie-Flusses perfekt illustriert. Die intrazelluläre Aufnahme von BPSi erhöht die Anzahl der Endo-/Lysosomen, was mit den Gen-Sequenzierungsergebnissen konsistent war, dass autophagiebezogene Gene (TFEB-CLEAR) aktiviert wurden. Gleichzeitig stimmt die Autophagie-Terminierung durch erhöhte pH-Werte in Endo-/Lysosomen mit den Ergebnissen der p62-Protein-Hochregulierung in der Western-Blot-Studie überein.

Diskussion

Nanopartikel können allgemein Autophagie in Zellen auslösen [23], und Studien zeigten, dass die autophagische Antwort auf Nanopartikel mit neutraler oder anionischer Oberfläche eine verstärkte Clearance von autophagischem Frachtgut beinhaltet. Zellexposition gegenüber Nanopartikeln mit kationischer Oberfläche führt hingegen zu transkriptioneller Hochregulierung des TFEB-Wegs, verursacht aber auch lysosomale Dysfunktion, was letztlich zur Blockade des autophagischen Flusses führt [7]. Unsere Ergebnisse stimmen mit diesen früheren Schlussfolgerungen überein. In unserer Studie fanden wir, dass die Expression von autophagiebezogenen Genen und Proteinen in HepG2-Zellen nach BPSi-Nanopartikelzufuhr durch Transkriptom-Sequenzierung, RT-qPCR und Western-Experimente erhöht wurde. Allerdings nimmt die Expression des autophagiebezogenen P62-Proteins nicht ab, wie bei aktivierter Autophagie erwartet. Wir vermuten, dass das PEG-Amin an der Oberfläche der BPSi-Nanopartikel den pH-Wert des Lysosoms erhöht, was die Degradation von P62 inhibiert. Bestehende lysosomale pH-Indikatoren können unsere Vermutung nicht verifizieren. Um den lysosomalen pH lebender Zellen präzise zu messen, etablierten wir eine neue Methode für die qualitative Bestimmung des Endo-/Lysosom-pH basierend auf selbstzerfallenden Nanopartikelsystemen. Zehn Nanopartikelsysteme mit spezifischen MB/TEOS-Parametern wurden für die Erlangung einer optimierten pH-sensitiv responsiven Messmethode eingesetzt. Der radiale MB-Konzentrationsgradient von innen nach außen diente als Haupttreibkraft für die MB-Freisetzung. Die Arzneimittelfreisetzung erfolgte gleichzeitig mit Trägerzerfall, getrieben durch einen diffusionskontrollierten Mechanismus. Zudem fördert mit abnehmendem pH-Wert die steigende Wasserstoffionenkonzentration die elektrostatische Wechselwirkung, was inneres MB schneller freisetzt als in neutraler Lösung [24]. Das optimierte zentral-hohle Nanopartikelsystem konnte das zentral konzentrierte MB als lineare Funktion präziser pH-Werte im Bereich pH 4,0–4,8 freisetzen, was genau dem pH der Lysosomen entspricht. Schließlich gelang es mit diesem qualitativen pH-Indikator basierend auf selbstzerfallenden Nanopartikeln, die durchschnittlichen pH-Werte der Lysosomen in 6 Zelllinien zu detektieren. Zudem konnten wir mit diesem System die pH-Änderungen der Lysosomen vor und nach BPSi-Nanopartikel-Endozytose durch HepG-2-Zellen qualitativ differenzieren, was den Mechanismus des Autophagie-Auftretens und der anschließenden Terminierung nach BPSi-Endozytose aufklärte. Die selbstzerfallenden Nanopartikelsysteme ebnen einen völlig neuen Weg für die Untersuchung luminaler pH-Werte, bieten neue Werkzeuge, um Zellsignale und Stoffwechsel besser zu verstehen, und eröffnen neue Wege und Methoden für die Krebstherapie [25, 26].

Schlussfolgerung

In dieser Studie fanden wir, dass BPSi die Zellautophagie durch Transkriptom-Sequenzierung fördern kann, aber die Aminogruppen an der Nanopartikeloberfläche den pH-Wert des Lysosoms erhöhen und die Degradation des autophagischen Flusses inhibieren können. Daher beeinflusst der lysosomale pH die Autophagiephasen erheblich. Und das präzise Erlangen der Informationen zum lysosomalen pH wird das Verständnis der Autophagie fördern. Allerdings konnten existierende fluoreszente lysosomale pH-Indikatoren nur einen weiten Bereich des lysosomalen pH bestimmen; daher etablierten wir einen präzisen lysosomalen pH-Indikator basierend auf dem Selbst-Dissociationssystem. Durch Anpassung der Syntheseparameter von MB@SiO₂ war die Freisetzung des auf den Nanopartikeln geladenen MB linear und negativ mit dem pH korreliert. Und die Nanopartikel blieben hauptsächlich im Lysosom nach Zellaufnahme. Durch Messung der im Zellinneren freigesetzten MB-Menge kann der pH-Wert des Lysosoms genau gemäß der linearen Funktion berechnet werden. Der etablierte präzise pH-Indikator lieferte ein brandneues Werkzeug und Methodik, um lysosomale pH-Werte präzise zu untersuchen und weitere Informationen zur Autophagie zu erhalten.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Abkürzungen

BPSi:

Schwarzes mesoporöses Silizium

FBS:

Fetales Kälberserum

GO:

Genontologie

HCl:

Salzsäure

KEGG:

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

MB:

Methylenblau

NaBr:

Natriumbromid

NaSi:

Natriumsilicid

NH4Br:

Ammoniumbromid

NPs:

Nanopartikel

OD:

Optische Dichte

PBS:

Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

PDMPO:

2-(4-Pyridyl)-5-((4-(2-Dimethylaminoethyl-aminocarbamoyl) methoxy) phenyl) oxazol

RT-qPCR:

Reverse Transkription Quantitative Polymerase Kettenreaktion

TEOS:

Tetraethylorthosilikat