Entwicklung und Evaluation eines Systems zur semiquantitativen Bestimmung der physikalischen Eigenschaften der Haut nach Exposition mit Silbernanopartikeln

Einführung

Die jüngsten technologischen Fortschritte in der Nanotechnologie haben die Entwicklung von technisch hergestellten Nanopartikeln (ENPs) beschleunigt, bei denen es sich um Partikel mit einer Größe von weniger als 100 nm handelt. Aufgrund ihrer vorteilhaften Eigenschaften, wie einer verbesserten Gewebepenetration und Oberflächenreaktion im Vergleich zu mikro- oder größeren Materialien, werden ENPs häufig in verschiedenen Produkten verwendet, darunter Kosmetika, Lebensmittel und Medizin [1,2,3]. Beispielsweise werden Silber-Nanopartikel (nAgs), eine der am häufigsten vorkommenden ENP-Typen, aufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften, die aus einer stetigen Freisetzung von Silberionen (Ag ⁺ ) [4, 5]. Die einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften, die mit der kleinen Partikelgröße von nAgs verbunden sind, können jedoch gefährlich sein. Es ist bekannt, dass diese Partikel ansonsten undurchdringliche Barrieren wie die Blut-Hirn-Schranke durchbrechen und Entzündungen auslösen können [6]. Darüber hinaus haben einige Studien berichtet, dass ENPs die Hautbarriere durchdringen können [7,8,9]. Um die Sicherheit der kontinuierlichen Verwendung dieser Partikel zu bestimmen, ist es daher wichtig, die toxischen Wirkungen von ENPs, die nAgs enthalten, zu verstehen, indem die Dynamik dieser Partikel in Geweben wie der Haut untersucht wird.

Um die Sicherheit zu gewährleisten, ist es unabdingbar, die möglichen Risiken im Zusammenhang mit der Verwendung von ENPs zu verstehen, die die integrativen Konzepte von „Hazards“ (potenzielle Toxizität) und „Expositionsbedingungen“ beinhalten. Während die Gefahren von ENPs weltweit analysiert wurden, haben nur wenige Studien die Bedingungen der Exposition gegenüber ENPs untersucht [10]. Insbesondere wurde berichtet, dass nAgs und Ag ⁺ können ihre physikalischen Eigenschaften im Körper verändern. Beispielsweise führt die Ionisierung von nAgs zur Bildung von nAgs mit einer kleineren Partikelgröße und zur Freisetzung von Ag ⁺ [11]. Umgekehrt lassen sich nAgs mit geringer Partikelgröße im Darmepithel von Ratten nach oraler Gabe von Silberacetat nachweisen [12]. Darüber hinaus haben wir kürzlich berichtet, dass im Vergleich zu kleineren nAgs und Ag ⁺ , werden größere nAgs leichter in der Muttermilch von laktierenden Mäusen gefunden, die diesen nAgs ausgesetzt waren [13]. Daher können nAgs seine physikalischen Eigenschaften im Körper verändern, was wiederum zu einer Änderung der Kinetik führt. Um die damit verbundenen Risiken zu verstehen, ist es daher notwendig, die physikalischen Eigenschaften dieser Partikel wie die Partikelgröße zu bewerten und zwischen diesen Partikeln und Ionen im Körper zu unterscheiden.

In diesem Zusammenhang haben wir Einzelpartikel-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (sp-ICP-MS) angewendet, die pro Verweilzeit maximal ein Partikel in den Analysator einbringt. Es ist eine effektive Methode, die verwendet werden kann, um die Partikelgröße zu bestimmen, indem die Spitzenintensität und die Partikelkonzentration über die Spitzenraten analysiert werden. Partikel und Ionen können durch die Analyse von Peak- und Hintergrundsignalen unterschieden werden [14]. Wir haben zuvor eine Vorbehandlungsmethode für sp-ICP-MS in biologischen Proben optimiert, um die physikalischen Eigenschaften von ENPs in verschiedenen Organen wie Leber, Herz, Lunge, Niere und Milz semiquantitativ zu bestimmen [15].

Die Haut besteht aus der Epidermis einschließlich des Stratum corneum (SC) und der Dermis, die Blutgefäße, Lymphgefäße und Nerven enthält [16]. Daher kann das Eindringen von ENPs in jede Hautschicht in unterschiedlichem Ausmaß zu Toxizität führen. Beispielsweise kann die Verteilung von Titandioxid-Nanopartikeln in menschlichen Hautkeratinozytenzellen der Epidermis die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies stimulieren [17]. Darüber hinaus führte die dermale Exposition gegenüber Titandioxid-Nanopartikeln für 60 Tage bei haarlosen Mäusen nicht nur zu pathologischen Veränderungen, wie einer dünneren Dermis aufgrund lokaler Toxizität, sondern auch zu pathologischen Veränderungen in der Leber, wie Verflüssigungsnekrose aufgrund systemischer Toxizität, die Ausbreitung über Blutgefäße in der Dermis [18]. Darüber hinaus können die biologischen Reaktionen in jeder Schicht auch in Abhängigkeit von physikalischen Eigenschaften wie Partikelgröße und Unterschieden zwischen Partikeln und Ionen variieren [19]. Um die Sicherheit der Verwendung von nAgs zu verstehen, ist es notwendig, die physikalischen Eigenschaften und die biologische Verteilung von nAgs zu verstehen, nachdem es der Haut ausgesetzt wurde.

Um dieses spezielle Problem zu lösen, ist ein Ansatz erforderlich, der die Haut vorbehandeln und ihre Schichten trennen kann, ohne Verluste während der Erholung oder Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von ENPs zu verursachen. Ein so optimaler Ansatz für die Haut wurde jedoch nicht entwickelt.

In dieser Studie haben wir einen Vorbehandlungsansatz optimiert, der die physikalischen Eigenschaften von nAgs, einem Modell-ENP, in jeder Hautschicht mittels sp-ICP-MS semiquantitativ bestimmt und anschließend seine Wirksamkeit in vivo evaluiert.

Methoden

Mäuse

Slc:ICR-Mäuse (weiblich, 8 Wochen alt) wurden von Japan SLC (Shizuoka, Japan) gekauft. Mäuse wurden in einem Raum mit folgendem Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht:Licht an um 8:00 Uhr und aus um 20:00 Uhr. Futter und Wasser wurden in Form von Futterpellets und einem oben auf dem Käfig befindlichen Wasserversorgungssystem zur Verfügung gestellt. Alle Versuchsprotokolle wurden unter Bedingungen durchgeführt, die vom Tierforschungsausschuss der Universität Osaka, Japan, genehmigt wurden.

nAgs und Ag ⁺

Suspensionen von Citrat-Ligand-verkappten nAgs mit Durchmessern von 100 nm (nAg100) wurden von nanoComposix (San Diego, CA, USA) in Form von Stammdispersionen (1 mg/ml) bezogen. Silbernitrat (AgNO₃ .) ) wurde von Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan) ebenfalls in Form von Stammdispersionen (1 mg/ml) bezogen. RM8013, das als Standard zur Berechnung der Transporteffizienz verwendet wird, wurde vom National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, USA) erworben. Jeder Nanopartikeltyp wurde vor der Verwendung 10 Minuten lang beschallt. Nanopartikel und Ionen wurden vor der Verwendung auch 10 s lang gevortext.

Reagenzien

Natriumhydroxid (NaOH, 0,1 mol/L) wurde von Nacalai Tesque Company (Osaka, Japan) und Salpetersäure (HNO₃ .) bezogen , 70%) wurde von Kanto Kagaku Chemical Industries (Tokyo, Japan) bezogen. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7, wurde hergestellt.

Optimierung der Vorbehandlungsmethoden

Die Epidermis und die Dermis jeder Maus wurden getrennt, mit PBS (w/v Verhältnis von 1:10) und homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit einer 100 ng/ml nAg100-Lösung gemischt. Die Mischung wurde dann mit einem der folgenden Reagenzien bei einem v/v . behandelt Verhältnis von 1:1; 0,1 mol/L NaOH, 70 % HNO₃ , oder PBS. Die Proben wurden 3 h bei 37 °C inkubiert und einer sp-ICP-MS unterzogen.

Hauttrennung durch Mikrowellenbestrahlung

Jede Maus wurde mit Isofluran (Wako) euthanasiert, wonach eine 2 cm ² (2 cm × 1 cm) dorsale Hautprobe wurde unter Verwendung einer chirurgischen Schere und einer Pinzette herausgeschnitten. Besondere Sorgfalt wurde darauf verwendet, Gewebeschäden während des Exzisionsverfahrens zu vermeiden. Ein Mikrowellenofen (RE-SW-20-H, Sharp, Japan) wurde verwendet, um die Haut mit einer Frequenz von 2450 MHz zu bestrahlen. Hautproben wurden auf eine Platte gelegt und in die Mitte des Mikrowellenofens gelegt. Entsprechend den Testanforderungen wurden Hautproben 10, 30 bzw. 60 s mit 200, 600 bzw. 900 W bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Proben schnell entfernt und jede Epidermis und Dermis wurden schnell durch leichtes Abkratzen mit einer chirurgischen Pinzette getrennt. Zur Analyse der Wiederfindungsrate und des durchschnittlichen Durchmessers von nAg nach der Bestrahlung (200 W, 30 s) wurde eine 100 ng/mL nAg100-Lösung verwendet.

Transdermale Verabreichung von nAg100 und Ag ⁺

Neun Wochen alte weibliche Slc:ICR-Mäuse wurden entsprechend ihrem Körpergewicht in 6 Gruppen von 3 Mäusen pro Gruppe eingeteilt. Die Mäuse wurden mit Isofluran anästhesiert. Die Rückenhaare wurden mit einem Haarschneider (Panasonic®, Osaka, Japan) und einem Handrasierer (Gillette®, Deutschland) rasiert. Als nächstes nAg100 und Ag ⁺ (20 μg/cm ² ) wurden direkt auf eine Fläche von 2,25 cm ² . aufgetragen (1,5 cm × 1,5 cm) der Rückenhaut und fest mit einer nicht saugfähigen Plastikfolie bedeckt. Auf die Plastikfolie wurde ein Stück Gaze gleicher Größe gelegt. Ein selbstklebender elastischer Verband wurde verwendet, um die Gaze zu bedecken, indem sie um die Haut gewickelt wurde, und die Haut wurde 5 Tage lang bedeckt belassen.

Vorbehandlung von Hautproben und Blut

Fünf Tage nach der Behandlung wurde peripheres Blut aus dem retroorbitalen Venenplexus und der Rückenhaut zur Analyse entnommen. Als nächstes 2,25 cm ² (1,5 cm × 1,5 cm) dorsale Hautproben wurden unter Verwendung einer chirurgischen Schere und einer Pinzette herausgeschnitten. Besondere Sorgfalt wurde darauf verwendet, Gewebeschäden während der Exzision zu vermeiden. SC-Schichten wurden nacheinander unter Verwendung von 2-cm-Klebebandstücken (Scotch®, 3M) entfernt, bevor die Epidermis von der Dermis getrennt wurde. Die Tapestücke wurden auf den behandelten Bereich der Rückenhaut gedrückt und anschließend 10 s lang konstanter Druck ausgeübt. Zwanzig Klebebandstücke waren erforderlich, um das gesamte SC jeder Maus zu entfernen. Als nächstes wurden Dermis und Epidermis mit Mikrowellenbestrahlung getrennt und mit PBS homogenisiert (w/v Verhältnis von 1:10). Abgenommenes Blut sowie Dermis- und Epidermishomogenate wurden mit 0,1 mol/L NaOH mit einem v/v . behandelt Verhältnis von 1:1 und separat für 3 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Bruttosilbermasse in den Mischungen von Blut, Epidermis und Dermis mit induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) analysiert. Quantifizierung und Bewertung der physikalischen Eigenschaften von nAgs und Ag ⁺ wurden mit sp-ICP-MS durchgeführt.

Messung der Bruttomasse von Silber

Um die Gesamtsilberkonzentration in Blut-, SC-, Epidermis- und Dermisproben zu messen, wurde ein Agilent 7700x ICP-MS-System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) verwendet. Die Bedingungen, unter denen die Analyse durchgeführt wurde, waren wie folgt:HF-Leistung 1550 W; Trägergas 1,05 L/min Ar; und Verweilzeit 100 ms. Die Messungen wurden dreimal im MS-Modus wiederholt. Als interner Standard für Ag wurde Rhodium verwendet. Die Zielelemente der ICP-MS-Analysen waren ¹⁰³ Rh und ¹⁰⁷ Ag. Ag- und Rhodium-Standardlösungen wurden von Wako bezogen.

sp-ICP-MS-Analyse und -Berechnung

Für die sp-ICP-MS-Analyse wurde ein Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies) verwendet. Die Analysebedingungen waren wie folgt:HF-Leistung 1550 W; Trägergas 1,05 L/min Ar; Verweilzeit 10 ms; und Analysezeit 30 s. Zur Berechnung der Partikelgröße wurden Einzelpartikel-Berechnungstools – RIKILT, veröffentlicht von Wagenen Food Safety Research (Wageningen University, Wageningen, Niederlande) – verwendet [20].

Statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung der GraphPad Prism Software Version 5.0 für Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde auf P festgelegt <0.05.

Ergebnisse und Diskussion

Strategien zur Konstruktion einer Methode zur Bestimmung der Menge und physikalischen Eigenschaften von nAgs in jeder Hautschicht

Um die Menge und die physikalischen Eigenschaften von nAg in jeder Hautschicht zu bestimmen, ist es notwendig, die Hautproben vollständig zu solubilisieren und Proben vorzubereiten, die einer sp-ICP-MS-Analyse zugänglich sind. Es ist auch wichtig, Epidermis und Dermis zu trennen, ohne Verluste bei der Erholung oder Veränderungen der physikalischen Eigenschaften des nAg, da nicht transdermal resorbiertes nAg bei der Entfernung des SC teilweise durch Tape-Stripping eliminiert werden kann [21].

Bezüglich der Solubilisierung der Hautproben haben wir bereits berichtet, dass die NaOH-Vorbehandlung eine optimale Technik für die Quantifizierung sowie die Analyse der physikalischen Eigenschaften von nAg in tierischen Geweben wie Leber, Herz, Lunge, Nieren und Milz [16]. Daher wurde eine NaOH-Vorbehandlung auf die in dieser Studie verwendeten Hautproben angewendet.

Die hydrothermale Behandlung, die zur Erweichung der Kollagenfasern und zur verbesserten Enzymverdauung führt, die die Trennung an der epidermal-dermalen Verbindung (EDJ) fördert, wird häufig verwendet, um die Haut in die epidermale und dermale Schicht zu trennen [22]. Obwohl diese Behandlungen die Hautschichten effizient trennen, kann nAg in den Schichten in einer wässrigen Lösung ionisiert werden, was zu einer Änderung seiner physikalischen Eigenschaften führt. Es wird berichtet, dass ein kurzer Mikrowellenpuls die Trennung der Haut in epidermale und dermale Schichten durch Wärmeentwicklung ermöglicht, die den EDJ stört [23, 24]. Daher haben wir die Lösung für kurze Zeit ohne Inkubation mit Mikrowellen bestrahlt.

Zusammen haben wir eine Strategie vorgeschlagen (in Abb. 1 dargestellt), die durch die Analyse der Rückgewinnungsraten und der Änderungen der physikalischen Eigenschaften von nAg in jeder Hautschicht validiert wurde.

Strategie zur Bestimmung der Menge und physikalischen Eigenschaften von nAg100 in jeder Hautgewebeschicht. Um die Menge und die physikalischen Eigenschaften von nAg100 in jeder Schicht des Hautgewebes zu bestimmen, ist es notwendig, (1) das Hautgewebe vollständig zu solubilisieren und (2) die Haut in epidermales und dermales Gewebe zu trennen, ohne Gewebeverlust während der Erholung oder Veränderungen des Hautgewebes physikalische Eigenschaften von nAg100. In dieser Hinsicht konzentrierten wir uns auf (1) NaOH-Vorbehandlung und (2) Mikrowellenbestrahlung

Optimierung der Vorbehandlungsmethoden zum Nachweis von nAg100 in der Epidermis und Dermis

Wir haben auf unsere vorherige Studie zurückgegriffen, um eine Vorbehandlungsmethode zur Solubilisierung von Hautproben zu optimieren. Ishizakaet al. [15] berichteten, dass unter verschiedenen Arten von Löslichkeitsreagenzien, wie NaOH und HNO_3, Die Vorbehandlung mit NaOH war optimal. Daher haben wir HNO₃ . getestet und NaOH als saure bzw. alkalische Löslichkeitsreagenzien. Die von den Mäusehautproben abgetrennten Epidermis- und Dermishomogenate wurden mit nAg100 gemischt, um eine Ag-Endkonzentration von 100 ng/ml zu erhalten, gefolgt von einer Behandlung mit jedem Solubilisierungsreagenz bei 37 °C. Zuerst haben wir die Wiederfindungsrate von Ag nach der Behandlung mit diesen Reagenzien bewertet. Die ICP-MS-Analyse zeigte, dass mit NaOH und HNO₃ . eine fast 100-prozentige Wiederfindungsrate erreicht wurde nur Behandlung (Abb. 2a). Als nächstes analysierten wir die Rückgewinnungskonzentrationen jedes Partikels und Ions, um Änderungen der physikalischen Eigenschaften aufgrund jeder Behandlung zu bewerten. Die sp-ICP-MS-Analyse zeigte, dass nAg100 durch HNO₃ . fast vollständig ionisiert wurde . Dies deutete darauf hin, dass HNO_3, als saures Reagens löste die Partikel auf und wandelte sie in Ionen um, wie auch in einer früheren Studie [15] berichtet wurde. Im Gegensatz dazu verblieb ein Großteil des mit NaOH behandelten nAg100 als Partikel und nicht als Ionen (Abb. 2b). Somit ermöglichte NaOH, dass der Großteil des nAg100 in Partikelform verbleibt. Schließlich wurden Verteilungen der Partikeldurchmesser ausgewertet, um die physikalischen Eigenschaften im Detail zu analysieren. HNO₃ Behandlung änderte den durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 100 nm auf 40 nm, was der Ionisierung von nAg100 entsprach. Umgekehrt betrug der durchschnittliche Partikeldurchmesser nach der NaOH-Behandlung ca. 100 nm, entsprechend der anfänglichen Partikelgröße (Abb. 2c). Dies deutete darauf hin, dass die NaOH-Vorbehandlung optimal war, um nAg100 in Mäusehaut nachzuweisen.

Die Vorbehandlung mit NaOH ist die optimale Methode zum Nachweis von nAg100 in Dermis und Epidermis. Zwei löslich machende Reagenzien (HNO₃ und NaOH) wurden als Vorbehandlungslösungsmittel gescreent, um Gewebe zu lysieren. Die Homogenisate aus Epidermis (E) und Dermis (D) wurden mit nAg100 gemischt, um eine Ag-Endkonzentration von 100 ng/ml zu erhalten, und mit jedem löslichmachenden Reagens bei 37 °C behandelt. Nach 3 h wurden alle Proben mittels ICP-MS und sp-ICP-MS analysiert. Die a Wiederfindungsrate von Ag, b nAg (schwarze Balken) und Ag ⁺ (schattierte Balken) Erholungsrate und c durchschnittliche Partikeldurchmesser sind angegeben. Die gestrichelte Linie repräsentiert die anfängliche Partikelgröße. Die Daten wurden als Mittelwert ± S.D. ausgedrückt. (n =3)

Trennung von Hautproben in Epidermis und Dermis durch Mikrowellenbestrahlung und Bewertung der Wiederfindungsraten und Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von nAgs

Um Hautproben in epidermale und dermale Schichten zu trennen, wendeten wir verschiedene Bedingungen der Mikrowellenbestrahlung an, die für unsere Studie relevant waren und zuvor als erfolgreich beschrieben wurden [24] und verglichen deren Leistung in Bezug auf die Abtrennbarkeit der Haut und Veränderungen der physikalische Eigenschaften. Es wurde beobachtet, dass sich die Haut unter den Bedingungen von 200 W für 10 s, 600 W für 30 s, 600 W für 60 s, 950 W für 30 s und 950 W für 60 s nicht in epidermale und dermale Schichten auftrennt ( Abb. 3a). Außerdem wurde die Haut unter den Bedingungen von 200 W für 60 s, 600 W für 10 s und 950 W für 10 s nur teilweise in epidermale und dermale Schichten getrennt. Im Gegensatz dazu war die Haut erst nach einer Bestrahlung mit 200 W für 30 s vollständig in epidermale und dermale Schichten getrennt. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Bestrahlung mit 200 W für 30 s optimal für die Trennung der Hautschicht ist.

Screening und Bewertung der Bedingungen für die Trennung der Haut in Epidermis und Dermis durch Mikrowellenbestrahlung. a Hautgewebe wurde unter neun Bedingungen mit Mikrowellen bestrahlt und in epidermales und dermales Gewebe getrennt. Die linken und rechten Felder zeigen Hautproben vor bzw. nach der Bestrahlung. Im rechten Feld zeigen einzelne, doppelte und dreifache weiße Kreise nicht trennbare, teilweise trennbare bzw. vollständig trennbare Zustände. Maßstabsleisten:1 cm. Hauthomogenisate wurden mit nAg100 gemischt, um eine Ag-Endkonzentration von 100 ng/ml zu erhalten, und 30 s lang mit 200 W bestrahlt und mittels sp-ICP-MS analysiert. b Die nAg (schwarze Balken) und Ag ⁺ (schattierte Balken) Wiederfindungsraten und c durchschnittliche Partikeldurchmesser sind angegeben. Die gestrichelte Linie repräsentiert die anfängliche Partikelgröße. Die Daten wurden als Mittelwert ± S.D. ausgedrückt. (n =3)

Um zu überprüfen, ob diese Mikrowellenbestrahlung mit 200 W für 30 s die physikalischen Eigenschaften von nAg100 beeinflusst, haben wir die physikalischen Eigenschaften von Ag in epidermalen und dermalen Schichten bestimmt. Die Epidermis- und Dermishomogenate, jeweils gemischt mit 100 ng/ml nAg100, wurden mit NaOH lysiert und 30 s mit 200 W bestrahlt. Die Sp-ICP-MS-Analyse zeigte, dass die Mehrheit des mit Mikrowellenbestrahlung behandelten nAg100 als Partikel verblieb, ebenso wie die der nicht behandelten Gruppe ( 3b ). Um die physikalischen Eigenschaften im Detail zu analysieren, wurden auch Partikeldurchmesserverteilungen ausgewertet. Der durchschnittliche Partikeldurchmesser betrug fast 100 nm, was der anfänglichen Partikelgröße entsprach (Abb. 3c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Mikrowellenbestrahlung von Hautproben mit 200 W für 30 s ein vielversprechender Ansatz ist, um die Haut effizient in epidermale und dermale Schichten zu trennen, ohne die physikalischen Eigenschaften von nAg100 zu verändern.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass wir erfolgreich ein System entwickelt hatten, um die physikalischen Eigenschaften von nAg100 in jeder Hautschicht halbquantitativ zu bestimmen. Insbesondere beinhaltet das Verfahren Folgendes:(i) Entfernen von nicht transdermal absorbiertem nAg100 durch Entfernen des SC mit dem Tape-Stripping-Verfahren [21]; (ii) Trennung der Haut in epidermale und dermale Schichten durch Mikrowellenbestrahlung; (iii) Solubilisierung der Epidermis und Dermis mit NaOH-Behandlung; und (iv) die semiquantitative Bestimmung der physikalischen Eigenschaften von Ag in jeder Hautschicht unter Verwendung von sp-ICP-MS.

Praktische Bewertung durch Bestimmung der Menge und physikalischen Eigenschaften von nAg100 und Ag ⁺ in Mäusehautschichten in Vivo

Um die praktische Anwendung dieses Ansatzes zu bewerten, analysierten wir die Menge und die physikalischen Eigenschaften von Ag in der Epidermis und Dermis sowie im peripheren Blut, nachdem die Haut der Maus nAg100 und Ag ⁺ . ausgesetzt wurde in vivo. Fünf Tage nach der Exposition trennten wir die Haut unter optimierten Bedingungen für Mikrowellenbestrahlung in Epidermis und Dermis und solubilisierten diese mit NaOH, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Die ICP-MS-Analyse zeigte, dass Ag in allen Geweben (wie der Epidermis, Dermis und dem Blut) aller Gruppen vorhanden war. In der Dermis und im Blut, Ag im Ag ⁺ -exponierte Gruppe tendenziell erhöht, verglichen mit der in der nAg100-exponierten Gruppe (Abb. 4a). Die Daten legten nahe, dass, obwohl sowohl die Ionen- als auch die Partikelform perkutan absorbiert und verteilt wurden, wie bereits berichtet [8, 9], es für die ionischen Formen jedoch leichter war, in tiefe Gewebeschichten einzudringen als für die Partikelformen.

Semiquantitative Analyse der physikalischen Eigenschaften von nAg100 und Ag ⁺ in vivo auf Mäusehaut aufgetragen. Zuerst wurde die Haut der Maus nAg100 und Ag ⁺ . ausgesetzt (20 μg Ag/cm ² ). Fünf Tage nach der Exposition wurden die Quantifizierung und Bewertung der physikalischen Eigenschaften von Ag in Epidermis, Dermis und Blut mittels ICP-MS bzw. sp-ICP-MS durchgeführt. a Ag-Konzentrationen und b Partikelraten in der Epidermis, Dermis und im Blut nachgewiesen. c Der durchschnittliche Durchmesser der in der Epidermis und Dermis nachgewiesenen Partikel. Die gestrichelte Linie repräsentiert die anfängliche Partikelgröße. Alle Daten wurden als Mittelwert ± S.E. ausgedrückt. (n =3). *p <0,05 (Schüler t testen)

Als nächstes haben wir das Verhältnis von nAg und Ag ⁺ . ausgewertet in jeder Probe. In der Ag ⁺ -exponierte Gruppe wurde fast das gesamte Ag in ionischer Form in der Epidermis, der Dermis und dem Blut nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass Ag ⁺ wurde perkutan resorbiert und ohne Veränderung der physikalischen Eigenschaften verteilt. Umgekehrt lagen in der nAg100-exponierten Gruppe etwa 70 % des Ag in der Epidermis und Dermis in Partikelform vor, während das restliche Ag ionisiert war. Darüber hinaus war das im peripheren Blut nachgewiesene Ag fast vollständig ionisiert und die Partikelform wurde kaum nachgewiesen (Fig. 4b). Schließlich haben wir die Partikelgröße in den epidermalen und dermalen Schichten bewertet, wo hauptsächlich Partikelformen nachgewiesen wurden. Die sp-ICP-MS-Analyse ergab, dass die Partikelgrößen in beiden Schichten etwa 70–80 nm betrugen, entsprechend der Ionisierungsrate von nAg100 (Abb. 4c). Diese Daten deuten darauf hin, dass nAg100, wenn es der Haut ausgesetzt ist, absorbiert und verteilt wird, während es ionisiert wird.

Wie bereits berichtet, beeinflussten die Oberflächenliganden von Nanopartikeln ihre Aufnahme in die Haut [25, 26]. Beispielsweise wurden in Ex-vivo-Experimenten mit einer Aminogruppe modifizierte Goldnanopartikel stärker in die Haut von Mäusen und Menschen aufgenommen als mit Carboxylgruppen modifizierte Goldnanopartikel [25]. Darüber hinaus zeigte die molekulardynamische Analyse, dass die Hautpenetrationsfähigkeit in dieser Reihenfolge von neutral hydrophoben über kationische zu anionischen Goldnanopartikeln abnahm [26]. Diesbezüglich wurde in dieser Studie gefolgert, dass nAg100 weniger wahrscheinlich in das SC in der Epidermis, der anfänglichen Hautbarriere, durchdringt, da nAg100 mit Citrat modifiziert und negativ geladen wurde. Der Grund für die Beobachtung der Partikel in der Dermis und im Blut könnte daher sein, dass die Partikel sowohl durch die Poren als auch durch die Epidermis eingedrungen sind.

Es wurde auch berichtet, dass die Durchdringbarkeit von Goldnanopartikeln durch Modifikation mit zellpenetrierenden Peptiden wie Tat und R7 verbessert wurde [25]. Daher können in Zukunft ähnliche Modifikationen für nAgs in Betracht gezogen werden, um sie tiefer in die Haut einzubringen. Darüber hinaus kann es erforderlich sein, die Größe der nAgs zu reduzieren, da der Effekt der Oberflächenmodifikation mit einer größeren spezifischen Oberfläche größer ist.

Schlussfolgerungen

In dieser Studie haben wir einen Vorbehandlungsansatz entwickelt, um die physikalischen Eigenschaften von nAg100 in jeder Hautschicht mit sp-ICP-MS semiquantitativ zu bestimmen. Mit diesem Ansatz zeigten wir, dass die Exposition der Haut gegenüber nAg100 dazu führen kann, dass nAg100 ionisiert, absorbiert und in tieferen Schichten verteilt wird. Um biologische Reaktionen oder Toxizität im Zusammenhang mit der Exposition der Haut gegenüber nAg100 zu verstehen, ist es daher möglicherweise erforderlich, nicht nur die Verteilung von nAg100 und seine Partikelgröße, sondern auch die von Ag ⁺ . zu berücksichtigen aus nAg100, das mit dem Hautgewebe verschmilzt. Daher ist dieser Ansatz vielversprechend als grundlegende Technik, die für die Risikoanalyse verwendet werden kann.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die gemeinsame Nutzung von Daten gilt für diesen Artikel nicht, da während der aktuellen Studie keine Datensätze generiert oder analysiert wurden.

Abkürzungen

ENPs:

Technisch hergestellte Nanopartikel

nAg::

Silbernanopartikel

Ag ⁺ :

Silberionen

sp-ICP-MS:

Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Einzelpartikelplasma

SC:

Hornschicht

nAg100:

Silbernanopartikel mit einem Durchmesser von 100 nm

AgNO₃ :

Silbernitrat

NaOH:

Natriumhydroxid

HNO₃ :

Salpetersäure

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

ICP-MS:

Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma

EDJ:

Epidermal-dermaler Übergang