Ein neuartiges analytisches System zur Bewertung physikochemischer Eigenschaften von Silbernanopartikeln in menschlicher Haut

Zusammenfassung

Um die sichere Verwendung von Silbernanopartikeln (nAgs) in Kosmetika zu gewährleisten, ist es notwendig, die physikalischen Eigenschaften von nAgs in der Haut aufzuklären, da sich diese Eigenschaften während der perkutanen Absorption ändern können. In dieser Studie zielten wir darauf ab, ein analytisches System basierend auf Einzelpartikel-induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (sp-ICP-MS) zu etablieren, um die physikalischen Eigenschaften von nAgs in der Haut zu bestimmen. Zunächst optimierten wir eine Vorbehandlungsmethode zum Lösen der Hautproben und zeigten dann, dass die meisten nAgs durch Natriumhydroxid-Behandlung zurückgewonnen wurden, während sie in Partikelform blieben. Zur Trennung der Haut in Epidermis und Dermis prüften wir mehrere Bedingungen der Mikrowellenbestrahlung. Die sp-ICP-MS-Analyse zeigte, dass die Anwendung von 200 W für 30 s optimal war, da diese Bedingung eine vollständige Trennung der Hautschichten ohne Veränderung der physikalischen Eigenschaften der meisten nAgs sicherstellte. Schließlich bewerteten wir die in-vivo-Anwendung, indem wir die Menge sowie die physikalischen Eigenschaften von Ag in der Epidermis, Dermis und dem peripheren Blut von Mäusen nach Exposition der Haut gegenüber nAgs oder Ag⁺ analysierten. Die nachfolgende sp-ICP-MS-Analyse zeigte, dass nAgs in ionisierter Form absorbiert und in tiefere Schichten verteilt werden konnten, während Ag⁺ absorbiert und ohne Änderung der physikalischen Eigenschaften verteilt wurde. Diese Studie zeigt, dass für ein umfassendes Verständnis der Reaktion der Haut nach Exposition gegenüber nAgs die Verteilung und Partikelgröße nicht nur von nAgs, sondern auch von Ag⁺, das aus nAgs in die Haut freigesetzt wird, berücksichtigt werden muss.

Einleitung

Jüngste technologische Fortschritte in der Nanotechnologie haben die Entwicklung von technischen Nanopartikeln (ENPs) beschleunigt, die Partikel kleiner als 100 nm sind. Aufgrund ihrer vorteilhaften Eigenschaften, wie verbesserter Gewebedurchdringung und Oberflächenreaktivität im Vergleich zu mikro- oder größeren Materialien, werden ENPs in verschiedenen Produkten, einschließlich Kosmetika, Lebensmitteln und Medikamenten, weit verbreitet eingesetzt [1-3]. Zum Beispiel werden Silbernanopartikel (nAgs), einer der häufigsten ENP-Typen, aufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften, die aus einer stetigen Freisetzung von Silberionen (Ag⁺) resultieren, in Kosmetika eingearbeitet [4, 5]. Die einzigartigen physikochemischen Eigenschaften, die mit der kleinen Partikelgröße von nAgs verbunden sind, können jedoch gefährlich sein. Es ist bekannt, dass diese Partikel ansonsten undurchdringliche Barrieren wie die Blut-Hirn-Schranke durchbrechen und Entzündungen auslösen können [6]. Darüber hinaus haben einige Studien berichtet, dass ENPs die Hautbarriere durchdringen können [7-9]. Daher ist es wichtig, um die Sicherheit der kontinuierlichen Verwendung dieser Partikel zu bestimmen, die toxischen Auswirkungen im Zusammenhang mit ENPs, die nAgs enthalten, zu verstehen, indem die Dynamik dieser Partikel in Geweben wie der Haut untersucht wird.

Um Sicherheit zu gewährleisten, ist es unverzichtbar, die möglichen Risiken im Zusammenhang mit der Verwendung von ENPs zu verstehen, was die integrativen Konzepte von „Gefahren“ (potenzielle Toxizität) und „Expositionsbedingungen“ umfasst. Während die Gefahren von ENPs weltweit analysiert wurden, haben nur wenige Studien die Bedingungen untersucht, die der Exposition gegenüber ENPs zugrunde liegen [10]. Insbesondere wurde berichtet, dass nAgs und Ag⁺ ihre physikalischen Eigenschaften im Körper ändern können. Zum Beispiel führt die Ionisierung von nAgs zur Bildung von nAgs mit kleinerer Partikelgröße und Freisetzung von Ag⁺ [11]. Umgekehrt können nAgs mit kleiner Partikelgröße im Darm-Epithel von Ratten nach oraler Verabreichung von Silberacetat nachgewiesen werden [12]. Darüber hinaus haben wir kürzlich berichtet, dass im Vergleich zu kleineren nAgs und Ag⁺ größere nAgs leichter in der Muttermilch stillender Mäuse gefunden werden, die diesen nAgs ausgesetzt waren [13]. Daher können nAgs ihre physikalischen Eigenschaften im Körper ändern, was wiederum zu einer Änderung der Kinetik führt. Um die beteiligten Risiken zu verstehen, ist es daher notwendig, die physikalischen Eigenschaften wie Partikelgröße dieser Partikel zu bewerten und zwischen diesen Partikeln und Ionen im Körper zu unterscheiden.

In diesem Zusammenhang wandten wir die Einzelpartikel-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (sp-ICP-MS) an, die maximal ein Teilchen pro Verweilzeit in den Analysator einführt. Es ist eine effektive Methode, die verwendet werden kann, um die Partikelgröße durch Analyse der Peak-Intensität und die Partikelkonzentration über Peak-Raten zu bestimmen. Partikel und Ionen können durch Analyse sowohl von Peak- als auch von Hintergrundsignalen unterschieden werden [14]. Wir haben zuvor eine Vorbehandlungsmethode für sp-ICP-MS in biologischen Proben optimiert, um die physikalischen Eigenschaften von ENPs in verschiedenen Organen wie Leber, Herz, Lunge, Nieren und Milz semi-quantitativ zu bestimmen [15].

Die Haut besteht aus der Epidermis, einschließlich des Stratum corneum (SC), und der Dermis, die Blutgefäße, Lymphgefäße und Nerven enthält [16]. Daher kann das Eindringen von ENPs in jede Hautschicht Toxizität in unterschiedlichem Ausmaß auslösen. Zum Beispiel kann die Verteilung von Titandioxid-Nanopartikeln in menschlichen Haut-Keratinozyten der Epidermis die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies stimulieren [17]. Zudem führte dermale Exposition gegenüber Titandioxid-Nanopartikeln über 60 Tage bei haarlosen Mäusen nicht nur zu pathologischen Veränderungen wie einer dünneren Dermis aufgrund lokaler Toxizität, sondern auch zu pathologischen Veränderungen in der Leber, wie Flüssigkeitsnekrose aufgrund systemischer Toxizität, die sich über Blutgefäße in der Dermis ausbreitete [18]. Darüber hinaus können die biologischen Reaktionen in jeder Schicht auch je nach physikalischen Eigenschaften wie Partikelgröße und Unterschieden zwischen Partikeln und Ionen variieren [19]. Um die Sicherheit der Verwendung von nAgs zu verstehen, ist es notwendig, die physikalischen Eigenschaften und Biodistribution von nAgs nach der Exposition der Haut zu verstehen.

Um dieses spezielle Problem zu lösen, ist ein Ansatz erforderlich, der die Haut vorbehandeln und ihre Schichten trennen kann, ohne Verluste bei der Rückgewinnung oder Änderungen der physikalischen Eigenschaften von ENPs zu verursachen. Ein solcher optimaler Ansatz für die Haut wurde jedoch noch nicht entwickelt.

In dieser Studie optimierten wir einen Vorbehandlungsansatz, der die physikalischen Eigenschaften von nAgs, einem Modell-ENP, in jeder Hautschicht semi-quantitativ über sp-ICP-MS bestimmt, und bewerteten anschließend seine Wirksamkeit in vivo.

Methoden

Mäuse

Slc:ICR-Mäuse (weiblich, 8 Wochen alt) wurden von Japan SLC (Shizuoka, Japan) bezogen. Die Mäuse wurden in einem Raum mit folgendem Hell-Dunkel-Zyklus gehalten: Licht an um 8 Uhr morgens und aus um 20 Uhr abends. Futter und Wasser waren in Form von Futterpellets und einem Wasserversorgungssystem, das oben auf dem Käfig angebracht war, verfügbar. Alle experimentellen Protokolle wurden unter Bedingungen durchgeführt, die vom Tierschutzkomitee der Universität Osaka, Japan, genehmigt wurden.

nAgs und Ag⁺

Suspensionen von Citrat-ligand-beschichteten nAgs mit Durchmessern von 100 nm (nAg100) wurden von nanoComposix (San Diego, CA, USA) in Form von Vorratsdispersionen (1 mg/ml) gekauft. Silbernitrat (AgNO₃) wurde von Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan), ebenfalls in Form von Vorratsdispersionen (1 mg/ml), gekauft. RM8013, als Standard für die Berechnung der Transporteffizienz verwendet, wurde vom National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, USA) bezogen. Jede Art von Nanopartikeln wurde 10 min vor Gebrauch soniziert. Nanopartikel und Ionen wurden auch 10 s vor Gebrauch gewirbelt.

Reagenzien

Natriumhydroxid (NaOH, 0,1 mol/l) wurde von Nacalai Tesque Company (Osaka, Japan) und Salpetersäure (HNO₃, 70 %) von Kanto Kagaku Chemical Industries (Tokyo, Japan) bezogen. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7, wurde hergestellt.

Optimierung der Vorbehandlungsmethoden

Die Epidermis und Dermis jeder Maus wurden getrennt, mit PBS (Gewichts/Volumen-Verhältnis 1:10) vermischt und homogenisiert. Das Homogenat wurde mit einer 100 ng/ml nAg100-Lösung vermischt. Das Gemisch wurde dann mit einem der folgenden Reagenzien im Volumenverhältnis 1:1 behandelt: 0,1 mol/l NaOH, 70 % HNO₃ oder PBS. Die Proben wurden 3 h bei 37 °C inkubiert und anschließend sp-ICP-MS unterzogen.

Hauttrennung durch Mikrowellenbestrahlung

Jede Maus wurde mit Isofluran (Wako) euthanasiert, wonach eine 2 cm² (2 cm × 1 cm) große dorsale Hautprobe mit chirurgischen Scheren und Pinzetten entnommen wurde. Besondere Sorgfalt wurde darauf verwendet, Gewebeschäden während der Exzision zu vermeiden. Ein Mikrowellenherd (RE-SW-20-H, Sharp, Japan) wurde verwendet, um die Haut mit einer Frequenz von 2450 MHz zu bestrahlen. Hautproben wurden auf einen Teller gelegt und in die Mitte des Mikrowellenherds gestellt. Entsprechend den Testanforderungen wurden Hautproben für 10, 30 und 60 s bei 200, 600 und 900 W bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Proben schnell entfernt und jede Epidermis und Dermis durch vorsichtiges Abkratzen mit chirurgischen Pinzetten schnell getrennt. Eine 100 ng/ml nAg100-Lösung wurde für die Analyse der Rückgewinnungsrate und des durchschnittlichen Durchmessers von nAg nach der Bestrahlung (200 W, 30 s) verwendet.

Transdermale Verabreichung von nAg100 und Ag⁺

Neun Wochen alte weibliche Slc:ICR-Mäuse wurden entsprechend ihrem Körpergewicht in 6 Gruppen zu je 3 Mäusen eingeteilt. Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt. Das Fell auf ihrem Rücken wurde mit einer Haarschneidemaschine (Panasonic®, Osaka, Japan) und einem Handrasierer (Gillette®, Deutschland) entfernt. Anschließend wurden nAg100 und Ag⁺ (20 μg/cm²) direkt auf eine Fläche von 2,25 cm² (1,5 cm × 1,5 cm) der dorsalen Haut aufgetragen und dicht mit nicht absorbierender Kunststofffolie abgedeckt. Ein Stück Gaze gleicher Größe wurde auf die Kunststofffolie gelegt. Ein selbstklebendes elastisches Band wurde verwendet, um die Gaze zu bedecken, indem es um die Haut gewickelt wurde, und die Haut wurde 5 Tage lang bedeckt gelassen.

Vorbehandlung von Hautproben und Blut

Fünf Tage nach der Behandlung wurden peripheres Blut aus dem retroorbitalen Venengeflecht und die dorsale Haut zur Analyse entnommen. Anschließend wurden 2,25 cm² (1,5 cm × 1,5 cm) große dorsale Hautproben mit chirurgischen Scheren und Pinzetten entnommen. Besondere Sorgfalt wurde darauf verwendet, Gewebeschäden während der Exzision zu vermeiden. SC-Schichten wurden sequenziell mit 2-cm-Stücken Klebeband (Scotch®, 3M) entfernt, bevor die Epidermis von der Dermis getrennt wurde. Die Klebebandstücke wurden auf den behandelten Bereich der dorsalen Haut gedrückt, woraufhin 10 s lang konstanter Druck ausgeübt wurde. Zwanzig Klebebandstücke waren erforderlich, um das gesamte SC jeder Maus zu entfernen. Anschließend wurden Dermis und Epidermis mit Mikrowellenbestrahlung getrennt und mit PBS (Gewichts/Volumen-Verhältnis 1:10) homogenisiert. Das gesammelte Blut sowie die Dermis- und Epidermis-Homogenate wurden mit 0,1 mol/l NaOH im Volumenverhältnis 1:1 behandelt und getrennt 3 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die gesamte Silbermasse im Blut, in der Epidermis- und Dermis-Mischung mit induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) analysiert. Quantifizierung und Bewertung der physikalischen Eigenschaften von nAgs und Ag⁺ wurden mit sp-ICP-MS durchgeführt.

Messung der Gesamtmasse von Silber

Um die Gesamtsilberkonzentration im Blut, SC, Epidermis- und Dermis-Proben zu messen, wurde ein Agilent 7700x ICP-MS-System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) verwendet. Die Analysebedingungen waren wie folgt: HF-Leistung 1550 W; Trägergas 1,05 l/min Ar; und Verweilzeit 100 ms. Messungen wurden im MS-Modus dreimal wiederholt. Rhodium wurde als interner Standard für Ag verwendet. Die Ziellemente der ICP-MS-Analysen waren ¹⁰³Rh und ¹⁰⁷Ag. Ag- und Rhodium-Standardlösungen wurden von Wako bezogen.

sp-ICP-MS-Analyse und Berechnung

Ein Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies) wurde für die sp-ICP-MS-Analyse verwendet. Analysebedingungen waren: HF-Leistung 1550 W; Trägergas 1,05 l/min Ar; Verweilzeit 10 ms; und Analysezeit 30 s. Einzelpartikel-Berechnungstools – RIKILT, veröffentlicht von Wagenen Food Safety Research (Wageningen University, Wageningen, Niederlande) – wurden zur Berechnung der Partikelgröße verwendet [20].

Statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Prism Software Version 5.0 für Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt.

Ergebnisse und Diskussion

Strategien zum Aufbau einer Methode zur Bestimmung der Menge und physikalischen Eigenschaften von nAgs in jeder Hautschicht

Um die Menge und physikalischen Eigenschaften von nAg in jeder Hautschicht zu bestimmen, ist es notwendig, die Hautproben vollständig zu lösen und für die sp-ICP-MS-Analyse geeignete Proben vorzubereiten. Es ist auch essenziell, die Epidermis und Dermis ohne Verluste bei der Rückgewinnung oder Änderungen der physikalischen Eigenschaften des nAg zu trennen, da nicht transdermal absorbiertes nAg manchmal während der Entfernung des SC durch Tape-Stripping eliminiert werden kann [21].

Hinsichtlich des Lösens der Hautproben haben wir zuvor berichtet, dass die NaOH-Vorbehandlung eine Technik ist, die optimal für die Quantifizierung sowie die Analyse der physikalischen Eigenschaften von nAg in tierischen Geweben wie Leber, Herz, Lunge, Nieren und Milz ist [16]. Daher wurde die NaOH-Vorbehandlung auf die in dieser Studie verwendeten Hautproben angewendet.

Hydrothermale Behandlung, die zur Erweichung von Kollagenfasern und verbesserter Enzymverdauung führt, was die Trennung an der epidermalen-dermalen Grenzfläche (EDJ) fördert, wird häufig verwendet, um die Haut in epidermale und dermale Schichten zu trennen [22]. Obwohl diese Behandlungen die Hautschichten effizient trennen, können nAgs in den Schichten in wässriger Lösung ionisiert werden, was zu einer Änderung ihrer physikalischen Eigenschaften führt. Es wurde berichtet, dass ein kurzer Impuls der Mikrowellenbestrahlung die Haut durch Wärmeerzeugung, die die EDJ stört, in epidermale und dermale Schichten trennen kann [23, 24]. Daher wandten wir Mikrowellenbestrahlung ohne Inkubation in der Lösung für kurze Zeit an.

Kollektiv schlugen wir eine Strategie vor (in Abb. 1 illustriert), die durch Analyse der Rückgewinnungsraten und physikalischen Eigenschaftsänderungen von nAg in jeder Hautschicht validiert wurde.

Optimierung der Vorbehandlungsmethoden zum Nachweis von nAg100 in Epidermis und Dermis

Wir bezogen uns auf unsere frühere Studie, um eine Vorbehandlungsmethode zum Lösen von Hautproben zu optimieren. Ishizaka et al. [15] berichteten, dass unter verschiedenen Arten von Lösungsreagenzien wie NaOH und HNO₃ die NaOH-Vorbehandlung optimal war. Daher testeten wir HNO₃ und NaOH als saure bzw. alkalische Lösungsreagenzien. Die Epidermis- und Dermis-Homogenate, die von Maushautproben getrennt wurden, wurden mit nAg100 vermischt, um eine finale Ag-Konzentration von 100 ng/ml zu erhalten, gefolgt von Behandlung mit jedem Lösungsreagenz bei 37 °C. Zunächst bewerteten wir die Rückgewinnungsrate von Ag nach Behandlung mit diesen Reagenzien. Die ICP-MS-Analyse zeigte, dass eine fast 100 %ige Rückgewinnungsrate nur durch NaOH- und HNO₃-Behandlung erreicht wurde (Abb. 2a). Als Nächstes bewerteten wir zur Beurteilung von Änderungen der physikalischen Eigenschaften durch jede Behandlung die Rückgewinnungskonzentrationen jedes Partikels und Ions. Die sp-ICP-MS-Analyse zeigte, dass nAg100 durch HNO₃ fast vollständig ionisiert wurde. Dies legte nahe, dass HNO₃ als saures Reagenz die Partikel auflöste und in Ionen umwandelte, wie auch in einer früheren Studie berichtet [15]. Im Gegensatz dazu blieb die Mehrheit der mit NaOH behandelten nAg100 als Partikel und nicht als Ionen erhalten (Abb. 2b). Somit ermöglichte NaOH, dass die Mehrheit der nAg100 in Partikelform blieb. Schließlich wurden die Verteilungen der Partikeldurchmesser bewertet, um die physikalischen Eigenschaften detailliert zu analysieren. Die HNO₃-Behandlung änderte den durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 100 nm auf 40 nm, was der Ionisierung von nAg100 entsprach. Im Gegensatz dazu betrug der durchschnittliche Partikeldurchmesser nach NaOH-Behandlung etwa 100 nm, was der ursprünglichen Partikelgröße entsprach (Abb. 2c). Dies legte nahe, dass die NaOH-Vorbehandlung optimal für den Nachweis von nAg100 in Maushaut war.

Trennung von Hautproben in Epidermis und Dermis durch Mikrowellenbestrahlung und Bewertung der Rückgewinnungsraten und Änderungen der physikalischen Eigenschaften von nAgs

Um Hautproben in epidermale und dermale Schichten zu trennen, wandten wir verschiedene Bedingungen der Mikrowellenbestrahlung an, die für unsere Studie relevant waren und zuvor als erfolgreich berichtet wurden [24], und verglichen ihre Leistung hinsichtlich der Trennbarkeit der Haut und Änderungen der physikalischen Eigenschaften. Es wurde beobachtet, dass unter den Bedingungen von 200 W für 10 s, 600 W für 30 s, 600 W für 60 s, 950 W für 30 s und 950 W für 60 s die Haut nicht in epidermale und dermale Schichten getrennt werden konnte (Abb. 3a). Zudem war die Haut nur teilweise in epidermale und dermale Schichten unter den Bedingungen von 200 W für 60 s, 600 W für 10 s und 950 W für 10 s getrennt. Im Gegensatz dazu wurde die Haut nur nach Bestrahlung bei 200 W für 30 s vollständig in epidermale und dermale Schichten getrennt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Bestrahlung bei 200 W für 30 s optimal für die Hautschichttrennung ist.

Um zu überprüfen, ob diese Mikrowellenbestrahlung bei 200 W für 30 s die physikalischen Eigenschaften von nAg100 beeinflusste, bestimmten wir die physikalischen Eigenschaften von Ag in epidermalen und dermalen Schichten. Die Epidermis- und Dermis-Homogenate, jeweils vermischt mit 100 ng/ml nAg100, wurden mit NaOH lysiert und bei 200 W für 30 s bestrahlt. Die sp-ICP-MS-Analyse ergab, dass die Mehrheit der mit Mikrowellenbestrahlung behandelten nAg100 als Partikel verblieben, genauso wie die der unbehandelten Gruppe (Abb. 3b). Um die physikalischen Eigenschaften detailliert zu analysieren, wurden auch die Partikeldurchmesser-Verteilungen bewertet. Der durchschnittliche Partikel war fast 100 nm im Durchmesser, was der ursprünglichen Partikelgröße entsprach (Abb. 3c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mikrowellenbestrahlung von Hautproben bei 200 W für 30 s ein vielversprechender Ansatz ist, um die Haut effizient in epidermale und dermale Schichten zu trennen, ohne die physikalischen Eigenschaften von nAg100 zu verändern.

Kollektiv zeigen diese Ergebnisse, dass wir erfolgreich ein System entwickelt haben, um die physikalischen Eigenschaften von nAg100 in jeder Hautschicht semi-quantitativ zu bestimmen. Spezifisch umfasst die Methode Folgendes: (i) Entfernung von nicht transdermal absorbiertem nAg100 durch Entfernen des SC mit der Tape-Stripping-Methode [21]; (ii) Trennung der Haut in epidermale und dermale Schichten durch Mikrowellenbestrahlung; (iii) Lösung der Epidermis und Dermis mit NaOH-Behandlung; und (iv) semi-quantitative Bestimmung der physikalischen Eigenschaften von Ag in jeder Hautschicht mit sp-ICP-MS.

Praktische Bewertung durch Bestimmung der Menge und physikalischen Eigenschaften von nAg100 und Ag⁺ in Maushautschichten in vivo

Um die praktische Anwendung dieses Ansatzes zu bewerten, analysierten wir die Menge und physikalischen Eigenschaften von Ag in der Epidermis und Dermis sowie im peripheren Blut, nachdem Maushaut in vivo nAg100 und Ag⁺ ausgesetzt war. Fünf Tage nach der Exposition trennten wir die Haut unter optimierten Bedingungen für Mikrowellenbestrahlung in Epidermis und Dermis und lösten diese mit NaOH auf, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Die ICP-MS-Analyse zeigte, dass Ag in allen Geweben (wie Epidermis, Dermis und Blut) aller Gruppen vorhanden war. In der Dermis und im Blut tended Ag in der Ag⁺-exponierten Gruppe dazu, erhöht zu sein im Vergleich zur nAg100-exponierten Gruppe (Abb. 4a). Die Daten legten nahe, dass obwohl sowohl die Ionen- als auch die Partikelform perkutan absorbiert und verteilt wurden, wie zuvor berichtet [8, 9], es für die ionischen Formen einfacher war, in tiefere Gewebeschichten einzudringen als für die Partikelformen.

Als Nächstes bewerteten wir das Verhältnis von nAg und Ag⁺ in jeder Probe. In der Ag⁺-exponierten Gruppe wurde fast das gesamte Ag in ionischer Form in der Epidermis, der Dermis und dem Blut detektiert, was darauf hindeutet, dass Ag⁺ perkutan absorbiert und ohne Änderung der physikalischen Eigenschaften verteilt wurde. Im Gegensatz dazu war in der nAg100-exponierten Gruppe etwa 70 % des Ag in der Epidermis und Dermis in Partikelform vorhanden, während der verbleibende Ag ionisiert war. Darüber hinaus war das im peripheren Blut detektierte Ag fast vollständig ionisiert, und die Partikelform war kaum nachweisbar (Abb. 4b). Schließlich bewerteten wir die Partikelgröße in der epidermalen und dermalen Schicht, wo hauptsächlich Partikelformen detektiert wurden. Die sp-ICP-MS-Analyse zeigte, dass die in beiden Schichten detektierten Partikelgrößen etwa 70–80 nm betrugen, was der Rate entspricht, mit der nAg100 ionisiert wird (Abb. 4c). Diese Daten deuten darauf hin, dass bei Exposition der Haut gegenüber nAg100 dieses absorbiert und verteilt werden kann, während es ionisiert wird.

Wie zuvor berichtet, beeinflussten die Oberflächenliganden von Nanopartikeln ihre Absorption in die Haut [25, 26]. Zum Beispiel wurden Goldnanopartikel, die mit einer Aminogruppe modifiziert waren, in Ex-vivo-Experimenten stärker in Maus- und menschliche Haut absorbiert als Goldnanopartikel, die mit einer Carboxylgruppe modifiziert waren [25]. Zudem zeigte die Molekulardynamik-Analyse, dass die Hautdurchdringungsfähigkeit in der Reihenfolge neutral hydrophob > kationisch > anionisch bei Goldnanopartikeln abnahm [26]. In diesem Zusammenhang wurde in dieser Studie geschlossen, dass nAg100 aufgrund der Citrat-Modifikation und negativen Ladung weniger wahrscheinlich in das SC der Epidermis, die anfängliche Hautbarriere, eindringen konnte. Daher könnte der Grund für das Vorhandensein der Partikel in der Dermis und im Blut darin liegen, dass die Partikel durch die Poren sowie durch die Epidermis eindrangen.

Es wurde auch berichtet, dass die Penetrationsfähigkeit von Goldnanopartikeln durch Modifikation mit zellpenetrierenden Peptiden wie Tat und R7 verbessert wurde [25]. Daher können in Zukunft ähnliche Modifikationen für nAgs in Betracht gezogen werden, um sie tiefer in die Haut zu liefern. Darüber hinaus kann es notwendig sein, die Größe der nAgs zu reduzieren, da der Effekt der Oberflächenmodifikation bei größerer spezifischer Oberfläche größer ist.

Schlussfolgerungen

In dieser Studie entwickelten wir einen Vorbehandlungsansatz, um die physikalischen Eigenschaften von nAg100 in jeder Hautschicht semi-quantitativ mit sp-ICP-MS zu bestimmen. Mit diesem Ansatz zeigten wir, dass die Exposition der Haut gegenüber nAg100 dazu führen kann, dass nAg100 ionisiert, absorbiert und in tiefere Schichten verteilt wird. Daher ist es, um biologische Reaktionen oder Toxizität im Zusammenhang mit der Exposition der Haut gegenüber nAg100 zu verstehen, möglicherweise notwendig, nicht nur die Verteilung von nAg100 und seine Partikelgröße, sondern auch die von Ag⁺ aus nAg100 zu berücksichtigen, das in Hautgewebe übergeht. Daher zeigt dieser Ansatz vielversprechend als grundlegende Technik, die für Risikoanalysen verwendet werden kann.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Datenaustausch ist nicht auf diesen Artikel anwendbar, da während der aktuellen Studie keine Datensätze generiert oder analysiert wurden.

Abkürzungen

ENPs:

Technische Nanopartikel (Engineered nanoparticles)

nAg:

Silbernanopartikel

Ag⁺:

Silberionen

sp-ICP-MS:

Einzelpartikel-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie

SC:

Stratum corneum

nAg100:

Silbernanopartikel mit Durchmesser von 100 nm

AgNO₃:

Silbernitrat

NaOH:

Natriumhydroxid

HNO₃:

Salpetersäure

PBS:

Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

ICP-MS:

Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie

EDJ:

Epidermale-dermale Grenzfläche