Kationische Mizellen-basierte siRNA-Lieferung für eine effiziente Gentherapie bei Dickdarmkrebs

Einführung

Krebs ist ein großes globales Problem der öffentlichen Gesundheit. Dickdarmkrebs ist ein häufiger bösartiger Tumor, von dem jedes Jahr weltweit über eine Million Menschen betroffen sind [1]. Als Methode zur Behandlung von soliden Tumoren und Bluttumoren wurde die Gentherapie eingesetzt [2, 3]. Der Schlüssel zur Gentherapie von Krebs hängt vom sicheren und wirksamen Gen-Delivery-System ab [4, 5]. Nicht-virale Vektoren, darunter kationische Lipide, Lipid-Nanoemulsionen, feste Lipid-Nanopartikel und polymerbasierte Vektoren, haben aufgrund ihrer potenziellen Vorteile bei der Genübertragung mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen als virale Vektoren:einfache Herstellung, geringere Immunantwort, geringere Toxizität und bessere Biokompatibilität [6, 7]. Die Nanotechnologie bietet ein neuartiges Mittel zur Untersuchung nicht-viraler Vektoren mit Vorteilen wie Biokompatibilität, Bioabbaubarkeit, Sicherheit und Targeting-Fähigkeit usw. [2, 8]. Darin kann eine große Anzahl von Nanopartikel-Trägern, die eine hohe positive Ladung aufweisen, durch den elektrischen Ladungseffekt mit dem anionischen Nukleinsäure-Medikament kombiniert werden, was eine breite und glänzende Anwendungsperspektive in der Gentherapie zeigt [9, 10].

Als eine Art Polymercopolymer mit biologischer Abbaubarkeit und Biokompatibilität zeigen PEG/PCL-Copolymere vielversprechende Anwendungen in Wirkstoffabgabesystemen [11,12,13]. Basierend auf MPEG-PCL-Mizellen haben wir amphiphiles DOTAP verwendet, um das MPEG-PCL-Copolymer in einem Schritt zu modifizieren und die kationischen selbstorganisierten DOTAP- und MPEG-PCL-Hybridmizellen (DMP) zu erzeugen [14,15,16,17]. Diese Micellen bieten eine vielversprechende Perspektive für die Verabreichung chemischer Medikamente und Genmedikamente mit ausgezeichneter Stabilität und Sicherheit. Zum Beispiel wurde DMP verwendet, um das SurvivinT34A-Suizidgen und Curcumin für die Darmkrebstherapie zu liefern [14, 18]. Bisherige Studien beschränkten sich jedoch auf die Übertragung von Plasmid-DNA, und es gab bisher keinen Bericht über die Abgabe von DMP-Mizellen für andere Formen der Gentherapie, was die Anwendung von DMP-Mizellen in der Gentherapie einschränkte.

Genetische Interferenzen auf Basis von siRNA sind neben therapeutischen Genen der Plasmid-DNA auch ein wesentlicher Bestandteil der Gentherapie. Als wesentliches Mitglied des Gen-Drugs ist siRNA ein kleines Molekül doppelsträngiger RNA. siRNA-Krebsmedikamente nutzen endogene RNAi-Mechanismen, um die Onkogenexpression zum Schweigen zu bringen. Aufgrund signifikanter Vorteile wie verbesserter Stabilität und Silencing-Wirksamkeit hat siRNA das Potenzial, zu krebstherapeutischen Anwendungen weiterentwickelt zu werden [19]. Verglichen mit dem großen Molekulargewicht von Plasmid-DNA weist siRNA eine höhere Transfektionseffizienz auf, die sich besonders für den spezifischen Gen-Targeting-Punkt in der Gentherapie eignet. Daher könnte es eine gute Wahl für die Gentherapie sein. Derzeit wurden mehrere siRNA-Behandlungsmedikamente auf Basis nicht-viraler Vektoren in klinischen Studien getestet, wie CALAA-01 auf Basis von Cyclodextrin-Kationen-Polypolymer-Nanopartikeln und ALN-TTR02 auf Basis von Lipiden [2]. Allerdings ist eine Gentherapie auf der Grundlage von siRNA noch immer erforderlich, um einen neuen siRNA-Zielpunkt zu entwickeln und sichere, wirksame und hochspezifische Transportträger für siRNA zu suchen.

In dieser Studie haben wir versucht, DMP-Micellen zur Abgabe von siRNA zu verwenden, um die Effizienz und Sicherheit von DMP-Mizellen zur Abgabe von siRNA zu untersuchen. Wir verwendeten Bcl-xl siRNA und Mcl1 siRNA als therapeutisches Ziel, um ihre Antitumorwirkung für die Behandlung von Dickdarmkrebs in vitro und in vivo zu untersuchen. Das Bcl-xl-Gen und das Mcl1-Gen sind Mitglieder der Bcl-2-Familie des anti-apoptotischen Gens und spielten eine entscheidende Rolle bei der Hemmung der Apoptose [20, 21]. Wir vermuten, dass synthetische DMP-Mizellen effektiv und sicher Bcl-xl-siRNA und Mcl1-siRNA abgeben können. Bcl-xl-siRNA und Mcl1-siRNA können die Expression des Bcl-xl-Gens und des Mcl1-Gens hemmen, wodurch die Apoptose von C26-Zellen induziert und dann eine therapeutische Wirkung der Hemmung des Wachstums von C26-Zellen erzielt wird.

Materialien und Methode

Materialien

N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat (DOTAP) wurde von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) bezogen. MPEG-PCL-Diblockcopolymer mit einem designierten Molekulargewicht von 4000 wurde gemäß unseren früheren Berichten synthetisiert [22]. Das Mn des MPEG-PCL-Copolymers betrug 4050. Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wurden von Sigma-Aldrich (USA) bezogen ) und ohne weitere Reinigung verwendet. Dichlormethan und andere organische Lösungsmittel wurden von ChengDu Kelang Chemical Co., Ltd. (Chengdu, VR China) bezogen. C26 (Mäuse-Kolonadenokarzinom)-Zellen und 293 T (HEK 293 T/17)-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erworben. Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, kultiviert und bei 37 °C mit 5 % CO₂ . inkubiert -befeuchtete Luftatmosphäre.

Vorbereitung von DMP-Mizellen

Um ein besseres DMP-Herstellungsverfahren auszuwählen, wurden DMP-Mizellen in drei organischen Lösungsmitteln hergestellt, wobei jedes Lösungsmittel mit drei verschiedenen Dosierungen von DOTAP versehen war. Als Lösungsmittel wurden Dichlormethan, Chloroform und Ethylacetat zur Untersuchung ausgewählt, und die Dosierungen von DOTAP umfassten 5 mg, 10 mg und 20 mg. DOTAP und MPEG-PCL wurden gemeinsam in dem organischen Lösungsmittel gelöst und dann durch eine Vakuumpumpe verdampft, um einen getrockneten Film zu bilden. Der getrocknete Film wurde anschließend in destilliertem Wasser rehydratisiert. Schließlich wurden die hergestellten DMP-Mizellen bei 4 °C gelagert.

Charakterisierung von DMP-Mizellen

Die Partikelgröße und das Zeta-Potential von DMP-Mizellen wurden mit einem Zeta-Sizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) bestimmt und während des Messvorgangs bei 25 °C gehalten. Alle Ergebnisse waren der Mittelwert von drei Durchläufen. Die Stabilität von DMP-Mizellen wurde qualitativ bewertet. Aggregate von DMP-Micellen wurden mit bloßem Auge untersucht. Das Vorhandensein von Ausfällungen deutete auf eine Instabilität der DMP-Micellen hin, während eine gleichmäßig transparente Lösung auf Stabilität hinweist.

Gel verzögernd

DMP-gelieferte Scramble-siRNA (DMP/Scramble-siRNA) wurde mit 2 µl Ladepuffer gemischt, in 1% Agarosegel geladen und durch Elektrophorese bei 140 V für 10 min aufgetrennt. 0,2 µg Scramble siRNA wurden mit 1, 2, 3, 4, 5 und 6 µg DMP-Mizellen kombiniert. Das Gel wurde mit dem Goldviewer gefärbt und die Banden, die der Scramble-siRNA entsprachen, wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht.

Zytotoxizität von DMP-Mizellen

Die Zytotoxizität von DMP-Mizellen auf den 293 T-Zellen und C26-Zellen wurde mit der MTT-Methode bewertet. Kurz gesagt wurden 293T-Zellen und C26-Zellen mit einer Dichte von 1,2 × 10 ³ . ausplattiert Zellen pro Well in 100 µl DMEM-Medium mit 10 % FBS (fetales Rinderserum) in 96-Well-Platten und 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden dann 72 Stunden einer Reihe von DMP-Mizellen oder PEI25K in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung eines MTT-Assays gemessen. Die Ergebnisse waren der Mittelwert von sechs Testläufen.

In-vitro-Transfektion

24 Stunden vor der Transfektion wurden C26-Zellen in einer 24-Well-Platte mit einer Dichte von 5 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Vertiefung in 0,5 ml DMEM-Medium, das 10 % FBS (fötales Rinderserum) enthält. Zum Zeitpunkt der Transfektion wurde das Medium in jeder Vertiefung durch 0,5 µl Medium ersetzt, das 0 %, 10 %, 20 % und 30 % FBS und DMP-gelieferte FAM (Carboxyfluorescein) siRNA (DMP/FAM siRNA) und PEI enthielt. gelieferte FAM-siRNA (PEI/FAM-siRNA), die 1 µg siRNA in serumfreiem Medium enthielt, wurden in jede Vertiefung pipettiert, und das Massenverhältnis von DMP/FAM-siRNA und PEI25K/FAM-siRNA betrug 30:1 und 2:1. 24 Stunden später wurden die transferierten Zellen unter dem Mikroskop beobachtet und die Luciferase-Aktivität durch Durchflusszytometrie (Epics Elite ESP, USA) gemessen.

In vivo Gen-Silencing

siRNA-zielende Maus-Bcl-xl, Mcl1-1, Scramble-siRNA und FAM-markierte Negativkontroll-siRNA wurden von GenePharma Co., Ltd (Shanghai, P. R. China) in ungeschützter, entsalzter, angelagerter Form bezogen.

Um den Bcl-xl-mRNA-Spiegel zu bestimmen, wurde Gesamt-RNA aus C26-Zellen unter Verwendung von TRIzol TM -Reagenz (Thermo Fisher Scientific, USA) extrahiert und einzelne cDNAs wurden mit einem SuperScript II-Reverse-Transkriptase-Assay (Invitrogen) synthetisiert. Die quantitative Echtzeit-PCR wurde mit einem quantitativen SYBR GreenER-PCR SuperMix Universal-Kit (Invitrogen) durchgeführt. Die PCR-Primer wurden von TSINGKE Biological Technology (Chengdu, P. R. China) synthetisiert.

Studie zur Bekämpfung der Verbreitung

Die antiproliferativen Fähigkeiten von DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 gegen C26-Zellen wurden durch das MTT-Verfahren bewertet. Kurz gesagt, C26-Zellen wurden mit einer Dichte von 1,2 × 10 ³ . ausplattiert Zellen pro Well in 100 µl DMEM mit 10 % FBS in 96-Well-Platten und 24 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden dann 72 h einer Reihe von DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung der MTT-Methode gemessen. Die Ergebnisse waren der Mittelwert von sechs Testläufen.

Studie zur Klonbildung

C26-Zellen wurden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 10 ³ . ausgesät Zellen pro Vertiefung in 2 ml DMEM-Medium, das 10 % FBS enthält. 24 Stunden später wurden die Zellen dann einer Reihe von DMP-Micellen oder DMP/Scramble-siRNA und DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt. Wenn die Zellen zu einem mit bloßem Auge sichtbaren Klon wuchsen, wurde die Kultur beendet und anschließend gespült, fixiert und gefärbt. Die Anzahl der Klone wurde direkt gezählt und die Hemmungsrate wurde berechnet.

In vitro Apoptose-Studie

Die zelluläre Apoptose wurde über Annexin V-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Propidiumiodid-Färbung beobachtet. Kurz gesagt wurden C26-Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät und 72 Stunden einer Reihe von DMP-Mizellen, DMP/Scramble-siRNA, DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 ausgesetzt. Die Zellen wurden dann einer Annexin-V-FITC- und Propidiumiodid-Färbung unterzogen.

In-vivo-Tumor-Xenograft-Studie

BALB/c-Mäuse im Alter von 6–8  Wochen wurden mit 5 × 10 ⁶ . geimpft C26-Zellen auf der rechten Flanke. DMP/siRNA-Komplexe entsprechend 10 µg siRNA wurden jeden zweiten Tag für 5 Behandlungen intratumoral injiziert, da das Tumorvolumen 100 µm ³ . erreichte . Mäuse, die eine äquivalente Menge an normaler Kochsalzlösung oder DMP erhielten, wurden als Kontrollgruppe angesehen. Die Tumorgröße wurde gemessen und das Tiergewicht wurde alle 2 Tage überwacht, bis alle Tiere getötet wurden. Das Tumorvolumen wurde berechnet als (1/2 × Länge × Breite [2]).

Histologische Analyse

Die ausgeschnittenen Gewebe wurden in 4% neutraler Formalinlösung für mehr als 24 Stunden fixiert und in Paraffin eingebettet. Gewebeschnitte (3–5 µm) wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Diese Analyse wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt und die Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (× 400) untersucht.

Ein kommerziell erhältlicher TUNEL-Kit (Promega, Madison, WI) wurde verwendet, um die apoptotischen Wirkungen in C26-Maus-Melanom-Xenotransplantat-Tumorgeweben zu analysieren. Diese Analyse wurde nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung der SPSS-Software durchgeführt. Für alle Ergebnisse P ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Studie zum Vorbereitungsprozess

Um eine effektive Transfektionseffizienz und eine geringe Zytotoxizität für die Bereitstellung von siRNA zu erzielen, haben wir verschiedene Herstellungsverfahren für DMP-Mizellen untersucht, wie in Tabelle 1 gezeigt. In unserer Studie waren die mit Ethylacetat hergestellten DMP-Mizellen in Bezug auf Lösungsmittel sehr instabil und die stabile Zeit von DMP-Mizellen war nicht länger als 10 min. Und aus Dichlormethan und Chloroform hergestellte DMP-Mizellen hatten beide eine ausgezeichnete Stabilität und konnten über 96 Stunden stabil bleiben, außer DMP, hergestellt aus Chloroform mit einer 20-mg-Dosierung von DOTAP. Noch wichtiger war, dass sie auch die richtige Größe, das richtige Zeta-Potenzial und den richtigen PDI hatten. Beim Vergleich der anfänglichen Transfektionseffizienz war jedoch die Transfektionseffizienz von DMP-Mizellen, die mit Dichlormethan hergestellt wurden, höher als die von DMP-Mizellen, die mit Chloroform hergestellt wurden. Also haben wir Dichlormethan ausgewählt, um DMP-Mizellen herzustellen.

DMP-Mizellen, die mit drei Dosierungen von DOTAP hergestellt wurden, wiesen keine offensichtlichen Unterschiede in Größe, Zeta-Potential und PDI auf, aber DMP-Mizellen, die mit einer 20-mg-Dosierung von DOTAP hergestellt wurden, hatten die höchste Transfektionseffizienz in drei Dosierungen von DOTAP. Durch die obigen Vergleiche haben wir ein Herstellungsverfahren basierend auf DOTAP und MPEG-PCL (Abb. 1a) ausgewählt, um DMP-Mizellen mit ausgezeichneter Stabilität und hoher Transfektionseffizienz herzustellen. Das Herstellungsschema von DMP-Mizellen ist in Abb. 1b dargestellt.

a Molekülstruktur von DOTAP und MPEG-PCL. b Herstellungsschema von DMP-Mizellen. c Größenverteilungsspektrum von DMP-Mizellen. d Zetapotentialspektrum von DMP-Mizellen. e siRNA-Verzögerungsassay. f Zytotoxizität von DMP-Mizellen auf 293T-Zellen. g Zytotoxizität von DMP-Mizellen auf C26-Zellen

Charakterisierung von DMP-Mizellen

Wie in 1c dargestellt, zeigte das Partikelgrößenverteilungsspektrum, dass DMP-Mizellen eine Nanogröße (PDI =0,315) mit einer mittleren Partikelgröße von 144,8 nm aufwiesen, was darauf hindeutet, dass sie eine sehr enge Partikelgrößenverteilung aufwiesen. Das Zetapotentialspektrum von DMP wurde in Fig. 1d mit einem Zetapotential von 46,4 mV dargestellt. Die Stabilität von DMP-Mizellen wurde qualitativ bewertet.

Um die Bindungsfähigkeit von DMP mit siRNA zu bewerten, wurde ein Gelretardationsassay durchgeführt und die Ergebnisse sind in 1e gezeigt. Wenn das Massenverhältnis von DMP zu siRNA 30 war, wurde eine vollständige Retardierung von Scramble siRNA erreicht. Die anionische Scramble-siRNA wurde aufgrund elektrostatischer Wechselwirkung an der Oberfläche von DMP absorbiert und bildete einen DMP/siRNA-Komplex.

Die Zytotoxizität von DMP-Mizellen auf C26-Zellen und 293T-Zellen wurde mit der MTT-Methode bewertet. Wie in Abb. 1f und g gezeigt, zeigte PEI25K eine hohe Toxizität auf 293T-Zellen mit IC₅₀ 0,83 µg/ml. Die DMP-Mizellen waren jedoch viel weniger toxisch und der IC₅₀ von DMP betrug 3,7 µg/ml. Der IC₅₀ der DMP-Micellen betrug 0,497 mg/ml auf C26-Zellen. PEI25K zeigte jedoch eine enorme Toxizität mit IC₅₀ <0,1 µg. Somit hatten DMP-Mizellen eine geringere Zytotoxizität als PEI25K und konnten verwendet werden, um siRNA sicher an C26-Zellen zu transportieren.

In vitro Transfektion

Neben der biophysikalischen Charakterisierung verglichen wir die Transfektionseffizienz von DMP-Mizellen mit der von PEI25K („Goldstandard“-Transfektionsmittel) in vitro . Wie in 2 gezeigt, hatten DMP-Micellen in Medium, das 0 %, 10 %, 20 % und 30 % FBS-Transfektion enthielt, eine Transfektionseffizienz von 85,47 ± 1,01 %, 81,57 ± 2,04 %, 75,29 ± 1,20 % und 71,64 ± 1,59 % und PEI hatte eine Transfektionswirksamkeit von 86,38 ± 2,92 %. Es gab einen geringen Unterschied in der Transfektionseffizienz zwischen der Serumgruppe und der Nicht-Serumgruppe. Und die Transfektionseffizienzen der Serumgruppe und der Nicht-Serumgruppe waren ähnlich der Transfektionseffizienz von PEI. Außerdem zeigen die Bilder in Fig. 2a eine direkte Beobachtung der Transfektionsfähigkeit von DMP-Mizellen mit einem FAM-basierten Reportergen. Aus dem Bild geht hervor, dass sich die Kellermorphologie der PEI-Gruppe im Vergleich zu den DMP-Gruppen verändert hatte, was bewies, dass PEI eine hohe Zytotoxizität aufwies, während DMP-Mizellen eine niedrige Zytotoxizität aufwiesen.

Transfektionseffizienz von DMP-Mizellen. a Bild transfizierter C26-Zellen (b , c ) Transfektionseffizienz von DMP-Mizellen in Medium mit 0 %, 10 %, 20 % und 30 % FBS und PEI25K, gezählt durch Durchflusszytometrie

Antikrebsaktivität in vitro

Im Prozess der Gentherapie spielt siRNA eine entscheidende Rolle. Aus diesem Grund haben wir eine auf Bcl-xl gerichtete siRNA und eine auf Mcl1 gerichtete siRNA entwickelt, um ihre Antikrebsaktivität zu untersuchen. Um die Interferenzfähigkeit von Bcl-xl-siRNA und Mcl1-siRNA zu bewerten, haben wir die Interferenzfähigkeit von Bcl-xl-siRNA und Mcl1-siRNA durch qPCR bestätigt. Nach unseren Ergebnissen (Abb. 3) war der mRNA-Spiegel der DMP/siMcl1-Gruppe niedriger als der der Kontrollgruppen (Abb. 3a). Und der mRNA-Spiegel der DMP/siBcl-xl-Gruppen war niedriger als der der Kontrollgruppen (Fig. 3b). Es wurde gut gezeigt, dass DMP/siBcl-xl und DMP/siMCL1 die relevanten mRNA-Spiegel effizient reduzieren.

a mRNA-Spiegel von Bcl-xl offensichtlich durch DMP/siMcl1 reduziert. b mRNA-Spiegel von Mcl1 offensichtlich durch DMP/siBcl-xl reduziert. c Bilder der Klonbildung nach Behandlung mit DMP/siBcl-xl oder DMP/siMcl1 in verschiedenen Konzentrationen. d Die Anzahl der Klone nach Behandlung mit DMP/siBcl-xl unterschiedlicher Konzentration von siRNA. e Anti-Krebs-Fähigkeit von DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 mit 50-nM- und 100-nM-Konzentration von siRNA auf C26-Zellen in vitro. f Die Hemmungsrate der Klonbildung nach Behandlung mit DMP/siMcl1 unterschiedlicher Konzentrationen von siMcl1. g die Hemmungsrate der Klonbildung nach Behandlung mit DMP/ siBcl-xl unterschiedlicher Konzentration von siBcl-xl

Darüber hinaus wurden DMP-Mizellen verwendet, um siRNA in C26-Zellen zu transportieren, um zu untersuchen, dass DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 das Wachstum von C26-Zellen hemmen können. Die Lebensfähigkeit der C26-Zellen wurde nach der MTT-Methode bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellüberlebensraten von DMP/siBcl-xl (50 nM und 100 nM) 69,6 % ± 3,3 % und 56,3 % ± 1,9 % betrugen und die Zellüberlebensraten von DMP/siMcl1 (50 nM und 100 nM) 82,8 . betrugen % ± 3,1 % und 56,3 % ± 3,2 % (Abb. 3e).

Um die Antikrebsaktivität von DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 weiter zu untersuchen, wurde ein Klonbildungsassay durchgeführt. Es wurde offensichtlich gezeigt, dass in Fig. 3c und d, verglichen mit der Kontrollgruppe, die Anzahl der Klone in DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 (50 &mgr;nM und 100 &mgr;nM) geringer war. Diese Ergebnisse legten nahe, dass DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 eine offensichtliche Antiproliferationswirkung auf C26-Zellen hatten. Somit zeigten die Ergebnisse der Kombination der Ergebnisse des MTT-Assays, dass DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 die Proliferation von C26-Zellen hemmen und eine herausragende Antikrebsaktivität auf C26-Zellen aufweisen könnten.

Um zu bestimmen, ob der DMP/siBcl-xl- und DMP/siMcl1-induzierte Verlust der Proliferationskapazität und Zelllebensfähigkeit von DMP-Mizellen mit der Induktion von Apoptose verbunden war, wurde die Anzahl der apoptotischen Zellen durch Durchflusszytometrie bestimmt. Wie in 3f gezeigt, betrugen die Apoptoseraten der DMP/siMcl1-Gruppe 37,9% ± 4,7%, was höher war als die der Kontrollgruppe und der DMP-Gruppe und der DMP/Scramble-siRNA-Gruppe. Wie in 3g gezeigt, betrug die Apoptoserate der DMP/siBcl-xl-Gruppe 33,0 % ± 3,8 %, was ebenfalls höher war als die der anderen Kontrollgruppen. Diese Apoptose-Daten zeigten, dass DMP/siMcl1 und DMP/siBcl-xl eine starke Apoptose-induzierende Fähigkeit aufwiesen. Die Ergebnisse des Apoptose-Assays stimmten mit den MTT-Ergebnissen und den zuvor beschriebenen Klonbildungsergebnissen überein, was darauf hindeutet, dass die Induktion der Apoptose ein möglicher Mechanismus zur Hemmung der Proliferation und Lebensfähigkeit von C26-Zellen ist.

DMP/siRNA-Komplex hemmt das Wachstum von C26-Tumoren in vivo

Ein C26-Xenotransplantat-Tiermodell wurde auch verwendet, um die Antitumor-Wirksamkeit des DMP/siRNA-Komplexes in vivo zu testen. Die Tumorwachstumskurven und Bilder von C26-Xenotransplantat-Tumoren jeder Gruppe sind in 4a und b dargestellt. Nach unseren Ergebnissen führte die intratumorale Injektion von DMP/siMcl1 und DMP/siBcl-xl zu einer signifikanten Hemmung des Xenotransplantat-Tumorwachstums im Vergleich zu Kontrollgruppen. Das Gewicht der Tumoren in jeder Gruppe ist in 4b dargestellt. Im Vergleich mit der NS-Behandlungsgruppe (0,85 ± 0,09 µg) und der DMP-Gruppe (0,76 ± 0,11 µg) verursachte der DMP/siMcl1-Komplex eine statistisch signifikante Reduktion des Tumorgewichts (0,34 ± 0,06 µg, P <0,01) und der DMP/siBcl-xl-Komplex verursachte eine statistisch signifikante Verringerung des Tumorgewichts (0,42 ± 0,08 µg, P <0,01). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die intratumorale Injektion des DMP/siRNA-Komplexes das Wachstum des subkutanen Xenotransplantats des C26-Kolonkrebsmodells effizient hemmen könnte. Die in-vivo-Nebenwirkungen des DMP/siRNA-Komplexes auf andere Organe wurden durch HE-Analyse untersucht. Wie in Abb. 4 gezeigt, wurden keine signifikant pathologischen Veränderungen in Herz, Leber, Milz, Lunge oder Niere beobachtet.

Antikrebswirkung und Sicherheit von DMP/siRNA im C26-Maus-Xenotransplantatmodell. a Tumorentwicklungskurve, berechnet nach Tumorvolumen. b Durchschnittliches Gewicht der Tumoren in jeder Gruppe. Im Vergleich zu anderen Behandlungsgruppen erzielten die DMP/siMcl1-Gruppe und die DMP/siBcl-xl-Gruppe eine statistisch signifikante Reduktion des Tumorgewichts (***P , 0,001). c Repräsentative Bilder von Tumoren des C26-Kolonkarzinoms. d Apoptose in Tumorgeweben, nachgewiesen durch den TUNEL-Assay. e HE-Analyse der Hauptorgane jeder Behandlungsgruppe in beiden Modellen. In Herz, Leber, Milz, Lunge oder Niere wurden keine signifikant pathologischen Veränderungen beobachtet

Diskussion

In dieser Studie wurden kationische selbstorganisierte DOTAP- und MPEG-PCL-Hybridmizellen hergestellt, um Bcl-xl-siRNA und Mcl1-siRNA zur Behandlung von C26-Darmkrebs zu liefern. Diese DMP-Mizellen hatten eine ausgezeichnete Stabilität und waren in der Lage, Bcl-xl-siRNA und Mcl1-siRNA effektiv zu kombinieren und an C26-Zellen zu übertragen. Noch wichtiger ist, dass DMP-Mizellen in noch nie da gewesener Weise siRNA (Bcl-xl siRNA und Mcl1 siRNA) lieferten und die Apoptose von C26-Zellen effektiv induzieren konnten, was zu einer Hemmung des Wachstums von C26-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo mit hoher Sicherheit führte. Insgesamt legte unsere Studie nahe, dass DMP ein potenzieller Gentransportträger für siRNA ist.

Es gibt Berichte darüber, dass das kationische Lipid DOTAP weit verbreitet für den Transport von siRNA verwendet wurde, aber es erzeugt starke positive Ladungen, die eine Hämolyse auslösen, und weist eine hohe Zytotoxizität auf. Basierend auf kationischen DOTAP-Liposomen mit hoher Transfektionseffizienz, aber ihre positiven Ladungen würden Toxizität erzeugen, kann der Grund dafür sein, dass der quaternäre Ammoniumsalzkopf von DMP mit positiven Ladungen auf der Oberfläche der Liposom-Phospholipid-Doppelschicht exponiert war. DMP-Mizellen auf Basis von DOTAP-Lipid wiesen jedoch eine hohe Transfektion und eine geringe Zytotoxizität auf. Wir spekulierten, dass DOTAP beim Selbstorganisationsprozess von Micellen in die Polymernanopartikel eingebettet war, von denen der quartäre Ammoniumsalzkopf nicht vollständig an der Oberfläche exponiert war. Somit wurden die partiellen positiven Ladungen maskiert; Inzwischen zeigen unsere Ergebnisse auch, dass die Transfektionseffizienz von DMP-Mizellen im Vergleich zur Transfektionseffizienz von PEI25K nicht gering war. Es deutete darauf hin, dass die positiven Ladungen von DOTAP nach dem Bedecken noch teilweise exponiert waren und das richtige Potenzial zeigten, und dieses Potenzial erwies sich als ausreichend, um siRNA zu kombinieren und zu übertragen. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass DMP-Mizellen auf Basis von MPEG-PCL ein effektiver und sicherer Gentransportträger sind, der für die Zytotoxizität von DOTAP optimiert wurde und die Genübertragungskapazität von DOTAP beibehält. Und eine ähnliche Studie hatte berichtet, dass die Zytotoxizität von DOTAP nach Kombination mit anderen Materialien reduziert wurde [23]. Kürzlich hatte ein neuer Vektor bestehend aus DOTAP und SWNT eine geringere Zytotoxizität bei der siRNA-Lieferung im Vergleich zu Lipofectamin [8]. LPNs, die DOTAP-PLGA-Mizellen unter Verwendung eines Doppelemulsions-Lösungsmittelverdampfungsverfahrens (DESE) hergestellt wurden, führten zu Trägern in Nanogröße [24, 25, 26]. Diese Studien stimmten gut mit den in unserer Forschung beschriebenen überein und machten unsere Vermutung bis zu einem gewissen Grad überzeugender.

Die Liefereffizienz des Gentransfervektors wird stark durch Serum beeinflusst. Die Serumproteine ​​im Serum konnten die positiven Ladungen auf der Oberfläche der Nanocarrier/siRNA-Komplexe neutralisieren, die durch die elektrostatischen Effekte auf der Oberfläche von Zellen mit negativen Ladungen beeinflusst wurden [27,28,29].

In unserer Studie, als wir die Transfektionseffizienz von DMP-Mizellen untersuchten, stellten wir eine Reihe von DMEM-Medien mit 0 %, 10 %, 20 % und 30 % FBS für die Transfektion her und untersuchten die Wirkung von Serum auf die Transfektionseffizienz von beladenen FAM-siRNA-Nanopartikel. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Anwesenheit von FBS einen geringen Einfluss auf die Transfektionseffizienz hatte. In diesem Artikel haben wir MPEG-PCL verwendet, um DOTAP abzudecken, und DOTAP wurde in MP eingebettet, wobei einige Teile im richtigen Verhältnis auf der Oberfläche belassen wurden. Basierend auf dieser Struktur spekulierten wir, dass die positiven Ladungen des DOTAP aufgrund der Abdeckung von MPEG-PCL teilweise verborgen waren, was die Exposition gegenüber Serumproteinen verringerte, so dass die Wirkung von Serum auf die Transfektion vermieden wurde. Dies implizierte, dass neben den verringerten Oberflächenladungen der kationischen Träger nach der Modifizierung die Anwesenheit der Serumtransfektion einen geringen Einfluss auf die Effizienz des kationischen Polymerträgers hatte. Aufgrund der ausgezeichneten Transfektionskapazität in der Serumumgebung, die von DMP-Mizellen in vitro gezeigt wurde, deutete dies darauf hin, dass das Serum in vitro-Zellexperimenten wenig Einfluss auf die DMP-vermittelte siRNA-Lieferung hatte.

Schlussfolgerung

In dieser Studie hatten die präparierten DMP-Mizellen die Fähigkeit, siRNA zu liefern. Und DMP-Mizellen wurden verwendet, um Bcl-xl-siRNA und Mcl1-siRNA in C26-Zellen für eine in vitro-Studie der Anti-Krebs-Aktivität zu liefern. Wir untersuchten den Herstellungsprozess für DMP-Mizellen und wählten einen ausgezeichneten Herstellungsprozess aus, um DMP-Mizellen mit geringer Größe, gutem Zetapotential und ausgezeichneter Stabilität herzustellen. Außerdem wurden die hergestellten DMP-Mizellen durch das Vorhandensein von Serum in vitro-Transfektionsexperimenten nicht beeinflusst. Noch wichtiger ist, dass DMP/siBcl-xl und DMP/siMcl1 die Expression des Bcl-xl-Gens und des Mcl1-Gens hemmen können, wodurch die Apoptose von C26-Zellen induziert wird und dann eine therapeutische Wirkung der Hemmung des Wachstums von C26-Zellen erreicht wird. Die intratumorale Injektion des DMP/siRNA-Komplexes könnte das Wachstum des subkutanen Xenotransplantats des C26-Kolonkrebsmodells effizient hemmen. Es wurden keine signifikant pathologischen Veränderungen in Herz, Leber, Milz, Lunge oder Niere beobachtet. Es wird angenommen, dass DMP-Mizellen als wirksamer Träger zur Abgabe von siRNA zur Behandlung von Dickdarmkrebs angesehen werden können.

Abkürzungen

DOTAP:

N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat

mPEG-PCL:

Methoxypoly (Ethylenglykol) Poly (Caprolacton)

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

siRNA:

Kleine störende RNA