Innovative Nukleosid-Lipid-Nanotransporter verbessern Sorafenib-Wirkung und reduzieren Toxizität

Zusammenfassung

Obwohl die Anwendung von Sorafenib, einem kleinen Inhibitor von Tyrosin-Proteinkinasen, in der Krebstherapie weltweit eine Option in der Chemotherapie bleibt, sind neuartige Strategien erforderlich, um die geringe Wasserlöslichkeit (< 5 µM), Toxizität und Nebenwirkungen dieses Medikaments zu adressieren. In diesem Kontext wird der Einsatz von Nanotransportern derzeit untersucht, um diese Nachteile zu überwinden. In diesem Beitrag berichten wir über eine neue Art von Sorafenib-basierten Nanopartikeln, die durch hybride Nukleosid-Lipide stabilisiert werden. Die festen Lipid-Nanopartikel (SLNs) zeigten negative oder positive Zeta-Potenzial-Werte, abhängig von der Ladung des Nukleosid-Lipids. Transmissions-Elektronenmikroskopie von Sorafenib-beladenen SLNs offenbarte parallelepipedförmige Nanopartikel von etwa 200 nm. Biologische Studien an vier verschiedenen Zelllinien, einschließlich Leber- und Brustkrebs, zeigten eine verbesserte antikrebswirksame Aktivität der Sorafenib-basierten SLNs im Vergleich zum freien Wirkstoff. Wichtig: Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen nach Inkubation von Krebszellen in Gegenwart von SLNs bei hoher Sorafenib-Konzentration (> 80 µM) zeigten in allen Fällen einen vollständigen Zelltod der Krebszellen. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial von Nukleosid-Lipid-basierten SLNs als Drug-Delivery-Systeme.

Hintergrund

Sorafenib, vermarktet unter dem Namen Nexavar™, ist ein hydrophobes Kinase-Inhibitor-Medikament [1], zugelassen zur Behandlung verschiedener menschlicher Krebserkrankungen, einschließlich fortgeschrittenem Nierenzellkarzinom (RCC) [2], hepatozellulärem Karzinom (HCC) [3] und fortgeschrittenem Schilddrüsenkarzinom. Sorafenib hat mehrere bekannte Proteinkinase-Ziele, einschließlich Transmembranrezeptoren und intrazellulärer Tyrosin- und Serin-Threonin-Kinasen, und induziert auch Apoptose. Wirkmechanistisch hemmt Sorafenib Tumorwachstum über Multiple Targets, direkt am Tumor und/oder an der Tumorangiogenese (durch Hemmung von VEGFR- und PDGFR-Signalwegen) [4,5]. Die Wirksamkeit bei der Hemmung malignen Zellwachstums wurde in vielen histologischen Krebsarten wie Melanom [6], Schilddrüse [7], Pankreas [5], hepatozellulärem Karzinom und Leukämie [8] demonstriert. Die geringe Wasserlöslichkeit, Toxizität und Nebenwirkungen limitieren jedoch den Einsatz von Sorafenib in vielen klinischen Anwendungen. Um diese Probleme anzugehen, werden derzeit verschiedene Sorafenib-Formulierungen untersucht [9,10], darunter flüssigkristalline Nanopartikel [11], Nanoemulsionen [12], Cyclodextrin-modifizierte poröse Silicium-Nanopartikel [13], medikamentenfreisetzende Nanokomposite [14], Polyelektrolyt-basierte Nanopartikel [15] oder Curcumin-selbstassemblierte Nanopartikel [16]. Lipid-Nanopartikel (LNs), beladen mit Sorafenib, wurden jedoch kaum untersucht [17,18].

Hier berichten wir über das erste Beispiel von Sorafenib-basierten festen Lipid-Nanopartikeln (SLNs) [19], stabilisiert durch Nukleosid-Lipide [20–22]. Chromatographische Untersuchungen an positiv und negativ geladenen Nucleolipiden (DOTAU und diC₁₆dT) zeigen, dass diese Amphiphile die erforderliche Stabilität und Reinheit für den Einsatz in Drug-Delivery-Anwendungen besitzen [23,24]. Ein einfaches Nanofällungsverfahren ermöglicht die Bildung von SLNs mit entweder positiver (SLN⁺) oder negativer Ladung (SLN⁻) (Abb. 1). Bemerkenswert ist, dass alle untersuchten SLNs die zytotoxische Wirkung von Sorafenib auf verschiedene menschliche Karzinome verstärkten, was zeigt, dass SLNs die Limitationen von Sorafenib hinsichtlich wässriger Löslichkeit und antikrebswirksamer Aktivität überwinden können.

Schema der SLN-Formulierung. Chemische Strukturen eines anionischen Nucleotid-Lipids, Thymidin-3′-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphat) (diC₁₆dT), eines kationischen Nukleosid-Lipids DOTAU (2′,3′-Dioleyl-5′-desoxy-5′-trimethyl-ammonium-Uridin) und Sorafenib (links). Schematische Darstellung von SLNs mit parallelepipedförmiger Gestalt nach Nanofällung eines Nucleolipids (entweder diC₁₆dT oder DOTAU, führend zu SLN⁻ und SLN⁺) mit Sorafenib (rechts). Die schematische Darstellung ist angepasst an das TEM-Bild, das DOTAU-Sorafenib-beladene Nanopartikel zeigt (Inset, Balken 500 nm)

Methoden

Chemikalien und Reagenzien

Methanol (MeOH), Ameisensäure (FA) und Ammoniumformiat (AFNH₄) wurden von VWR Chemicals (Frankreich) bezogen und waren alle HPLC-Qualität. HPLC-Wasser (minimaler Widerstand 18,2 MΩ) wurde im Haus durch ein ELGA Millipore-System (Frankreich) hergestellt. DOTAU (CAS: 868226-06-6) und diC₁₆dT (CAS: 1160002-70-9) wurden im Labor nach Protokollen aus Referenzen [23–25] synthetisiert. Sorafenib, 4-[4-[[4-Chlor-3-(trifluormethyl)phenyl]carbamoylamino]phenoxy]-N-methyl-pyridin-2-carboxamid (CAS: 284461-73-0) wurde von SynVec (https://synvec.fr, Ref# D114250414) bezogen.

Chromatographische Studien

Eine umgekehrte-Phasen-UHPLC-Methode (Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) wurde für die Quantifizierung von Nucleolipiden (DOTAU und diC₁₆dT) und Sorafenib in SLNs entwickelt. Vor der Injektion in die HPLC wurden wässrige Nanopartikellösungen mit Ethanol um Faktoren 5 und 10 verdünnt, um Nucleolipide und Sorafenib zu quantifizieren.

Ein chromatographisches System UHPLC UltiMate 3000 von Dionex-Thermo Scientific (USA), bestehend aus einer Pumpe mit Quaternary-Ventilsystem für Säulenselektion, einem thermostatisierten Autosampler und einem thermostatisierten Säulenfach, wurde verwendet. Die Trennung erfolgte mit der Säule Syncronis C18 50 × 2,1 mm, 1,7 µm. Die mobile Phase bestand aus 70/30 MeOH/25 mM Ammoniumacetat (pH = 7,4) (A) und 26,5 mM Ammoniumacetat in MeOH (pH = 7,9) (B). Eine Flussrate von 0,2 ml/min wurde verwendet, und das Gradientprofil war 0–2 min, 0–100 % B; 2–20 min, 100 % B. Die Säulentemperatur wurde auf 25 °C eingestellt. Die Detektion erfolgte bei 267 nm für Sorafenib und diC₁₆dT und 257 nm für DOTAU. Das Injektionsvolumen betrug 1 µl, was Quantifizierungsgrenzen von 0,6 ng für Sorafenib und 15 ng für beide Nucleolipide ergab.

Standardkurven für Sorafenib, DOTAU und diC₁₆dT in Ethanol sind in Zusatzdatei 1: Abbildungen SI1, SI2 und SI3 gezeigt.

Herstellung von Sorafenib-Nanopartikeln

Zehn Milligramm Sorafenib wurden in 1 ml Ethanol gelöst, und 10 mg Nucleolipide (entweder diC₁₆dT oder DOTAU) wurden in 1 ml Ethanol gelöst. 100 µl Nucleolipide, 100 µl Sorafenib-Lösung und 800 µl Ethanol wurden bei Raumtemperatur vermischt und tropfenweise in 10 ml destilliertes Wasser unter magnetischem Rühren gegeben. Die Lösung wurde 90 min bei 25 °C in einem Ultraschallbad behandelt. Ethanol wurde bei 30 °C unter Vakuum entfernt, und das Volumen wurde auf 1 ml eingestellt. Diese Lösung wurde zweimal mit einer Ultraschallsonde von 6 mm (Vibracell 75186) für 10 min bei 100 % Amplitude mit Puls von 2 s alle 5 s sonifiziert. 1 ml wurde gegen 30 ml destilliertes Wasser für 3 × 15 min dialysiert. Das Volumen wurde auf 2 ml eingestellt und für Charakterisierung, Quantifizierung und Stabilitätsstudien aufbewahrt. Auch Kontrollexperimente wurden mit dem gleichen Protokoll ohne Nucleolipide durchgeführt.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM und EDX)

Nanopartikel wurden durch Negativkontrast-Mikroskopie visualisiert. 10 µl Nanopartikel wurden für 10 min auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter gegeben. Die Probe wurde dann getrocknet und mit 2,5 % (Gew./Gew.) Uranylacetat in Wasser für 2 min gefärbt. Die Proben wurden mit einem Hitachi H 7650 Elektronenmikroskop beobachtet. Energiedispersive Röntgenspektroskopie wurde mit einem TECNAI Transmissionselektronenmikroskop gekoppelt mit Quantax-X-Flash SVE 6 durchgeführt.

Partikelgröße und Zeta-Potenzial-Bestimmung

Partikel-Zeta und -Größe wurden mit einem Zetasizer NanoZS, Malvern bestimmt. Experimente wurden mit 40 µl Nanopartikel, verdünnt in 400 µl Wasser, bei 25 °C durchgeführt.

Zytotoxizitätsanalyse

HuH7 und HepG2 wurden in Monolayer in DMEM-Glutamax mit 10 % fötalem Kälberserum kultiviert. MDA-MB-134 und T-47D wurden in Monolayer in RPMI mit 10 % fötalem Kälberserum kultiviert (für T-47D zusätzlich nicht-essentielle AA 1X, Glucose 0,45 %, Insulin 10 mg L⁻¹, Natriumpyruvat 1X). Alle Kulturreagenzien stammten von Invitrogen. 10⁴ Zellen/Well in 90 µl vollem Kulturmedium wurden in eine 96-Well-Platte gegeben und 24 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert, bevor 10 µl entweder SLN oder Sorafenib im Kulturmedium hinzugefügt wurden. Sorafenib (CAS: 284461-73-0) wurde in Kulturmedium mit 0,1 % DMSO gelöst. Beachten Sie, dass unter diesen Bedingungen die maximale Konzentration von Sorafenib ohne Ausfällung 5 µM betrug, während für SLNs mit Sorafenib die maximal getestete Konzentration 120 µM ohne DMSO betrug. Nach 4 Tagen Inkubation wurde die Zelllebensfähigkeit mit dem Formazan-basierten Proliferationsassay (CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit, Promega) bewertet, indem 20 µl/Well Reagenzlösung hinzugefügt wurden. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C, 5 % CO₂, wurde die Absorption jedes Wells bei 492 nm mit einem Berthold-Spektrophotometer gemessen. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz von (OD₄₉₂ behandelte Zellen − OD₄₉₂ Blank) / (OD₄₉₂ unbehandelte Zellen − OD₄₉₂ Blank) ausgedrückt.

Zelllebensfähigkeitsstudien

HuH7 wurden wie zuvor im Abschnitt „Zytotoxizitätsanalyse“ beschrieben kultiviert. Die Zelllebensfähigkeit wurde nach 4 Tagen Inkubation mit SLN⁺ beladen mit Sorafenib bei verschiedenen Konzentrationen (0, 1, 5, 10, 25, 50 und 100 µM) mittels Live/Dead-Zelllebensfähigkeitsassay (Invitrogen) durchgeführt. Kurz: Das Kulturmedium wurde entfernt, und anhaftende Zellen wurden einmal mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) gewaschen. 200 µl HBSS mit 2 µM Calcein-Acetoxymethylester und 4 µM Ethidiumhomodimer-1 wurden jedem Well zugegeben und 45 min bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Nach Färbung wurden die Zellen einmal mit HBSS gewaschen und auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mikroskopisch abgebildet. Der Prozentsatz toter Zellen wurde durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) analysiert. Nach Färbung mit 4 µM Ethidiumhomodimer-1-Lösung wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Zentrifugation bei 1000 U/min für 5 min gewaschen. Daten wurden auf einem LSRFortessa-Durchflusszytometer von Becton Dickinson erfasst und mit DIVA-Software analysiert. Eine Probe toter Zellen wurde mit 70 % Methanol als Kontrolle hergestellt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung der SLNs

Die Ungiftigkeit und die Selbstorganisationseigenschaften der Nucleolipide machen sie zu idealen amphiphilen Adjuvantien für die Einkapselung hydrophober Medikamente wie Sorafenib. In dieser Studie wurde ein einfaches Nanofällungsverfahren entwickelt, um die geringe Wasserlöslichkeit von Sorafenib zu adressieren und seine antikrebswirksame Aktivität zu verbessern, die in vielen Fällen die klinische Anwendung limitiert. Hinsichtlich der Wasserlöslichkeit vermuteten wir, dass der hydrophobe Charakter, die Heterocyclen und die Wasserstoffbrückenfunktionen von Sorafenib die Wechselwirkungen mit Nucleolipiden und die Bildung von Nanoobjekten begünstigen. Zudem wurde erwartet, dass SLNs mit Sorafenib die antitumorale Aktivität durch verbesserte zelluläre Aufnahme von Sorafenib steigern. In einer unserer früheren Studien an Cisplatin-Nanopartikeln zeigten wir, dass die Steigerung der antitumorale Aktivität von Cisplatin auf eine erhöhte Menge des in Krebszellen internalisierten Wirkstoffs zurückzuführen war [23]. Unser Nanofällungsprozess umfasst drei Schritte: (i) Lösung von Sorafenib in Ethanol bei 40 °C (10 mg/ml Sorafenib, 100 µl) und Zugabe eines Äquivalents Nucleolipid (entweder ein anionisches Nucleotid-Lipid, diC₁₆-3′-dT [Thymidin-3′-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphat)] oder ein kationisches Nukleosid-Lipid DOTAU [23] [2′,3′-Dioleyl-5′-desoxy-5′-trimethyl-ammonium-Uridin], 100 µl einer 10 mg/ml Lösung in Ethanol); (ii) 1 ml der Ethanollösung werden bei Raumtemperatur tropfenweise zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben; (iii) die resultierende Suspension wird verdampft, um überschüssiges Ethanol zu entfernen, und sonifiziert.

Chromatographische Studien

Um die Beladungskapazitäten der neuartigen Formulierungen zu bewerten, wurde eine umgekehrte-Phasen-UHPLC-Methode entwickelt. Mit dieser HPLC-Methode wurde die simultane Trennung von Sorafenib und Nucleolipiden in 12 min erreicht, was die individuelle Quantifizierung der Verbindungen in SLNs ermöglichte (Zusatzdatei 1: Abbildungen SI1–4).

Beladungsverhältnisse (Massenverhältnisse von Sorafenib/Nucleolipiden in Nanopartikeln) von 50 und 80 % sowie Einkapselungsausbeuten von Sorafenib von ca. 55 und 75 % wurden für Formulierungen aus Sorafenib/DOTAU (SLN⁺) und Sorafenib/diC₁₆dT (SLN⁻) erzielt. Im Kontrollexperiment ohne Nucleolipid gingen etwa 90 % des Sorafenibs während der verschiedenen Formulierungsschritte verloren, wahrscheinlich aufgrund der geringen Löslichkeit von Sorafenib in Wasser. Dieses Ergebnis zeigt, dass Nucleolipide notwendig sind, um Sorafenib zu lösen und die SLNs zu stabilisieren.

Physikochemische Studien

Dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde durchgeführt, um die Bildung der SLNs zu charakterisieren. Sowohl negative als auch positive Nucleolipide (diC₁₆dT und DOTAU) bilden ähnliche nicht-kugelförmige Nanopartikel mit parallelepipedförmiger Gestalt in wässriger Lösung mit Monodispersität (Polydispersitätsindex PDI = 0,202 und 0,289; Größe = 335,2 und 304,4 nm, jeweils, Abb. 2 und Zusatzdatei 1: Abbildung SI7). Wie erwartet hängen die Zeta-Potenziale der SLN-basierten Objekte von den polaren Köpfen der Nucleolipide ab (ζ = +59,1 und −54,9 mV für SLN⁺ und SLN⁻, siehe Zusatzdatei 1: Abbildung SI10). Das Vorhandensein von Sorafenib in den NPs wurde durch TEM-Bildgebung und EDX-Akquisitionen an einer SLN⁻ validiert. Abb. 2e,f zeigt die Spots I und II. Spot I in Abb. 2f zeigt die Emission von Chloratomen (Spot I, Abb. 2e,f), was das Vorhandensein von Sorafenib anzeigt (siehe chemische Struktur Abb. 2f). Beachten Sie, dass Chlor nur in Spot I und nicht in Spot II vorhanden ist (Abb. 2f).

SLN-Charakterisierung. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) Bilder zeigen die Morphologie von Sorafenib-Nanopartikeln mit DOTAU (a) und Inset (b). Beispiel eines DOTAU-basierten SLN mit einer Größe von 327 mal 172 nm (Pfeile), was eine durchschnittliche Größe von 304 nm bestätigt, wie durch DLS gemessen (d). c Beispiel eines TEM-Bildes, das diC₁₆dT-SLNs zeigt (Pfeile 330 mal 500 nm). (e) TEM-Bild einer SLN⁻. I & II Spots sind die Lokalisationen, an denen EDX-Akquisitionen durchgeführt wurden. (f) EDX-Spektren an den Positionen I & II. Gestrichelte Linie betont die Emission des Chloratoms, das nur in I vorhanden ist. Chemische Struktur des Sorafenib-Moleküls ist ebenfalls dargestellt. Beide Spektren wurden mit der Cu-Atom-Emission bei 8 keV normalisiert (durch TEM-Cu-Gitter)

Wichtig: In Kontrollexperimenten führte die Nanofällung von Sorafenib ohne Nucleolipide zu keinem Nanoobjekt, was zeigt, dass die Nucleolipide die Bildung und Stabilisierung der SLNs ermöglichen.

Stabilitätsstudien

Kolloidale Stabilitäten von SLN⁺ und SLN⁻ wurden durch DLS und Zeta-Potenzial bei zwei Temperaturen gemessen (Abb. 3a und Zusatzdatei 1: Abbildung SI10). Im Fall diC₁₆dT-basierter Formulierungen wurde die Größe von SLN⁻ nach 30 Tagen bei sowohl 4 als auch 37 °C nicht verändert, was eine hohe Stabilität dieser Nanopartikel anzeigt (Zusatzdatei 1: Abbildung SI9). Diese Stabilität kann durch die Art der Wechselwirkungen (Wasserstoffbrücken, π-π-Stapelung, Ladungs-/Ladungswechselwirkungen) zwischen diC₁₆dT und Sorafenib erklärt werden. Für DOTAU-basierte Formulierungen waren SLN⁺ jedoch nur bei 4 °C für 30 Tage stabil, wie DLS-Studien zeigten (Abb. 3a), während bei 37 °C ein Anstieg sowohl der Größe als auch des PDI beobachtet wurde (Abb. 3a). Diese relative Instabilität von SLN⁺ bei 37 °C könnte durch abstoßende Coulomb-Wechselwirkungen zwischen den positiven Ladungen sowohl von Sorafenib als auch DOTAU erklärt werden. Interessanterweise zeigen die kolloidalen Stabilitätsstudien, dass es möglich ist, die Stabilität und damit die Freisetzung von Sorafenib aus den SLNs in die physiologische Umgebung zu modulieren, abhängig vom verwendeten Nucleolipid zur Stabilisierung der SLNs. Diese Stabilitätsmodulation könnte attraktiv sein, je nach benötigter Freisetzungskinetik.

Stabilitätsstudien der SLNs. Kolloidale Stabilität von SLN⁺ (a) und chemische Stabilität von Sorafenib und DOTAU in SLN⁺ über Zeit bei 4 und 37 °C (b). PDI, Polydispersitätsindex

Parallel zur kolloidalen Stabilität wurde die chemische Stabilität von Sorafenib, DOTAU und diC₁₆dT in den SLN-basierten Formulierungen als Funktion der Zeit bei 4 und 37 °C mit einer neuen chromatographischen Methode untersucht (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung SI4). Kinetische Studien bei beiden Temperaturen sind in Abb. 3b und Zusatzdatei 1: SI5 für DOTAU-SLNs und diC₁₆dT-SLNs gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Sorafenib- und diC₁₆dT-Moleküle in Formulierungen über mindestens 1 Monat stabil bleiben, was eine langfristige chemische Stabilität bei beiden Temperaturen für SLN⁻ anzeigt. Für SLN⁺-Formulierungen wurde jedoch ein Abfall von DOTAU über die Zeit beobachtet. Zunächst bei 4 °C: Verluste von ca. 12 % über 7 Tage und 20 % über 30 Tage. Bei Erhöhung der Temperatur nahm die DOTAU-Stabilität ab mit einem Verlust von 55 % über 7 Tage und bis zu 95 % über 30 Tage bei 37 °C. Solche Unterschiede in der chemischen Stabilität zwischen Nucleolipiden wurden bereits in früheren Stabilitätsstudien belegt (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung SI6).

Biologische Studien

Die SLN-Zytotoxizität wurde durch Stoffwechselaktivitäten und Zellmorphologien bewertet. Der MTT-Assay ermöglichte den Vergleich von freiem Sorafenib (in 0,1 % DMSO) und SLNs mit dem Wirkstoff (Abb. 4) an vier Zelllinien, darunter zwei Hepatozelluläre Karzinome (HuH7 und HepG2) und zwei luminale Brustkrebslinien (MDA-MB-134 und T-47D). Erstens, bei Konzentrationen nahe der maximalen Löslichkeit von freiem Sorafenib (5 µM Sorafenib in 0,1 % DMSO, 2,8 µM für Sorafenib/DOTAU und 4 µM für Sorafenib/diC₁₆dT Nanopartikel) inhibierten beide SLNs die Zelllebensfähigkeit besser als freies Sorafenib. Wie in Abb. 4b gezeigt, zeigte eine Zelllebensfähigkeitsstudie an MDA-MB-134-Zellen, dass die Aktivität von freiem Sorafenib durch seine Wasserlöslichkeit limitiert ist (100 % Zelllebensfähigkeit bei [Sorafenib] = 5 µM), während IC₅₀-Werte von 15 und 50 µM für SLN⁺ und SLN⁻ beobachtet wurden (Abb. 4b). In einer FACS-Studie an HuH7 wurde ein IC₅₀ von ca. 50 µM ermittelt (Zusatzdatei 1: Abbildungen SI12 und SI13). Phasenkontrast-Mikroskopie-Bilder zeigen tatsächlich eine reduzierte Dichte der Zellschichten, behandelt mit entweder SLN⁻ und SLN⁺ im Vergleich zu unbehandelten oder Sorafenib-behandelten Zellen, ohne Veränderung der Zellmorphologie (Zusatzdatei 1: Abbildung SI11). Zweitens wurden ähnliche Experimente bei höheren SLN-Konzentrationen ([Sorafenib] = 120 und 84 µM für SLN⁻ und SLN⁺) durchgeführt und mit freiem Sorafenib an seiner Löslichkeitsgrenze (5 µM) verglichen. Unter diesen Bedingungen zeigten beide SLNs eine starke zytotoxische Wirkung auf die vier Krebszelllinien (Abb. 5). Wie auf den Phasenkontrast-Mikroskopie-Bildern zu sehen, wurden Zelltrümmer für beide SLN⁻ (Abb. 5C1–4) und SLN⁺ (Abb. 5D1–4) beobachtet, was Zelltod belegt, während Zellen im Fall von freiem Sorafenib am Leben blieben (Abb. 5B1–4). Bemerkenswert ist, dass starke zytotoxische Effekte für beide SLNs im Fall von luminalem B-Brustkrebs beobachtet wurden (Abb. 5C1–2 und D1–2). Ein solcher antitumoraler Effekt, der bisher nicht berichtet wurde, eröffnet neue mögliche therapeutische Anwendungen von Sorafenib dank der SLNs.

Zytotoxizitätseffekt von Sorafenib oder SLNs. a) Vergleich der Zytotoxizität mit freiem Sorafenib oder SLNs von Sorafenib in 4 Zelllinien (2 luminal B Brustkrebs und 2 Hepatozelluläre Karzinome) nach Quantifizierung mit MTS-Assay an 3 Wells bei 5 µM freiem Sorafenib, 2,8 µM NPs Sorafenib/DOTAU (SLN+) und 4 µM NPs Sorafenib/diC16dT (SLN-). b) Zelllebensfähigkeitsassay (MDA-MB-134 Zellen) in Gegenwart von freiem Sorafenib (Löslichkeitslimit), SLN+ (grau) oder SLN- (schwarz)

Vergleich der Zellmorphologien zwischen Kontrolle, freiem Sorafenib oder SLNs. Phasenkontrast-Mikroskopie-Bilder zeigen Zytotoxizität unter verschiedenen Bedingungen an vier menschlichen Karzinom-Zelllinien (Hepatozelluläre Karzinome HuH7, HepG2 und luminale Brustkarzinome MDA-MB-134, T-47D). A) Ohne Sorafenib (Kontrollexperimente, A1–A4 für MDA-MB-134, T-47D, HuH7, HepG2). B) Zellen wurden 4 Tage in Gegenwart von 5 µM freiem Sorafenib inkubiert. C und D) Zellen inkubiert in Gegenwart von SLN⁻ und SLN⁺ bei 84 und 120 µM Sorafenib-Konzentration

Schlussfolgerung

Wir berichten über einen neuartigen Ansatz basierend auf Nucleolipiden, der eine effiziente Einkapselung und Freisetzung von Sorafenib ermöglicht. Unsere Untersuchungen demonstrieren die Bildung von zwei Arten fester Lipid-Nanopartikel (SLNs), hochbeladen mit Sorafenib. Diese SLNs, die entweder negative oder positive Zeta-Potenziale aufweisen, besitzen parallelepipedförmige Gestalt. Wie durch DLS- und HPLC-Studien gezeigt, kann die Stabilität der SLNs durch das verwendete Nucleolipid moduliert werden. Wichtig: Beide SLN⁺- und SLN⁻-Formulierungen steigern die Wasserlöslichkeit von Sorafenib dramatisch (Konzentrationen > 120 µM). Solche SLNs zeigen bessere antitumorale Aktivitäten an vier Krebszelllinien (Leber- und Brustkrebs) im Vergleich zu freiem Sorafenib, das durch seine mangelnde Wasserlöslichkeit limitiert ist. Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen an den vier Krebszelllinien zeigen eine drastische Zellsterblichkeit bei Inkubation mit 120 µM SLN⁻ oder 84 µM SLN⁺. Daher könnte dieses Medikament als neue therapeutische Option bei Leberkrebs (z. B. intra-arterielle Chemotherapie mit Sorafenib) oder Brustkrebs eingesetzt werden. Soweit uns bekannt, ist dies der erste Bericht einer Studie, die Sorafenib gegen luminale B-Brustkrebs einsetzt und die Nützlichkeit des SLN-Ansatzes demonstriert. Insgesamt unterstreichen die in diesem Beitrag berichteten Ergebnisse das Potenzial von Nukleosid-Lipid-basierten SLNs als Drug-Delivery-Systeme.

Abkürzungen

AFNH₄:

Ammoniumformiat

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

FA:

Ameisensäure

HCC:

Hepatozelluläres Karzinom

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

LNs:

Lipid-Nanopartikel

MeOH:

Methanol

PDI:

Polydispersitätsindex

RCC:

Nierenzellkarzinom

SLNs:

Feste Lipid-Nanopartikel

UHPLC:

Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie