Ferumoxytol schwächt die Funktion von MDSCs zur Verbesserung der LPS-induzierten Immunsuppression bei Sepsis

Einführung

FMT, ein von der Food and Drug Administration zugelassenes Eisenpräparat, wurde zur Behandlung von Eisenmangelanämie bei Erwachsenen mit chronischer Nierenerkrankung (CKD) eingesetzt [1], und FMT wird auch häufig als Kontrastmittel und Arzneimittelträger eingesetzt [2]. . Frühere Studien zeigten, dass FMT immunmodulatorische Eigenschaften hat, wie zum Beispiel seine Fähigkeit, eine phänotypische Verschiebung in M2-Makrophagen in Richtung auf einen hohen CD86 ⁺ .-Wert zu induzieren , TNF-α-positiver M1-Makrophagen-Subtyp [3, 4]. Die Auswirkungen von FMT auf andere Immunzellen wurden jedoch nicht untersucht.

MDSCs sind eine heterogene Population von unreifen myeloischen Zellen mit einer starken immunsuppressiven Kapazität [5]. Bei Mäusen sind MDSCs als Gr-1 ⁺ . identifizierbar CD11b ⁺ Zellen, während humanen MDSCs das Gr-1-Homolog fehlt und sie als CD14 ⁻ . definiert sind HLA-DR ⁻ CD11b ⁺ CD33 ⁺ oder CD14 ⁺ HLA-DR ⁻ CD11b ⁺ CD33 ⁺ Zellen [6]. MDSCs bestehen aus zwei großen Zellgruppen, granulozytären oder PMN-MDSCs und M-MDSCs, und beide Populationen haben immunsuppressive Funktionen durch die Produktion von iNOS, ROS und Arg-1. Die erhöhte Aktivität von Arg-1 verbraucht L-Arginin, und der Mangel an L-Arginin hemmt die T-Zell-Proliferation, indem die Expression der CD3-Zeta-Kette verringert wird. INOS erzeugt NO, das die Funktionen von JAK3 und STAT6 in T-Zellen sowie die Expression von MHC II hemmt. ROS induziert die posttranslationale Modifikation von T-Zell-Rezeptoren und kann dazu führen, dass antigenspezifische T-Zellen nicht mehr reagieren [7]. M-MDSCs entstehen aus Monozytenvorläufern und können unter geeigneten Zytokinbedingungen in Makrophagen und DCs differenzieren. Der größte Teil unseres Wissens über MDSCs stammt aus Krebsstudien. In den letzten Jahren wurde auch bei akuten und chronischen entzündlichen Erkrankungen einschließlich Entzündungen, Verbrennungen und Autoimmunerkrankungen eine Ausbreitung von MDSCs beschrieben [8, 9]. Kürzlich wurde in bildgebenden Studien über eine hohe Aufnahme fluoreszierender Nanopartikel durch MDSCs in Speiseröhre und Milz von Mäusen berichtet [10]. Es ist jedoch unklar, ob FMT die Funktion von MDSCs verändert, die an der Entwicklung entzündlicher Erkrankungen beteiligt sind.

Sepsis, eine fehlregulierte Entzündungsreaktion des Wirts auf eine schwere Infektion, die lebensbedrohliche Organdysfunktionen verursachen kann, ist die häufigste Todesursache auf der Intensivstation. Sepsis löst eine überwältigende proinflammatorische Reaktion aus, die, wenn sie nicht frühzeitig behandelt wird, schnell in eine langfristige Immunsuppression übergeht. Die Expansion von MDSCs wurde in septischen Tiermodellen in Milz und Lymphknoten beschrieben [8, 11] sowie bei Patienten mit Sepsis [12, 13, 14]. Die Aktivierung immunsuppressiver Zellen wie MDSCs ist entscheidend für eine angemessene Kontrolle der Überempfindlichkeit des angeborenen Immunsystems, aber ihre übermäßige Expansion kann zu einer Hyperimmunsuppression führen, die die vorherrschende Triebkraft für Sekundärinfektionen und Mortalität bei später Sepsis ist. Eine erhöhte Anzahl von MDSCs korreliert mit der Unterdrückung der Lymphozytenproliferation. Es wurde berichtet, dass MDSCs ihren Phänotyp im Knochenmark erwerben und dann zu sekundären lymphatischen Organen wandern, um T-Zell-Antworten zu hemmen und ihre Proliferation in LPS-immunsupprimierten Mäusen zu unterdrücken [8]. Die meisten Patienten mit protrahierter Sepsis weisen einen immunsuppressiven Status auf, und die meiste Sepsis-Mortalität ist auf eine späte Sepsis-Immunsuppression zurückzuführen. Die Eliminierung von MDSCs kann bei der späten Sepsis positive Auswirkungen haben, indem die Immunantwort wiederhergestellt wird [15]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass FMT die Funktionen von MDSCs modulieren kann, um die Immunsuppression bei später Sepsis zu reduzieren.

Hier zeigten wir eine immunmodulatorische Wirkung von FMT auf MDSCs. Wir nutzten die magnetischen Eigenschaften von FMT, um zu zeigen, dass MDSCs FMT in vitro phagozytieren können. Darüber hinaus fanden wir, dass FMT die immunsuppressive Funktion von MDSCs durch Herunterregulierung von Arg-1 und ROS abschwächte. Darüber hinaus bestätigten In-vivo-Experimente, dass FMT das späte Stadium der LPS-induzierten Sepsis bei Mäusen verbessert, indem es die Fähigkeit von MDSCs schwächt, T-Zellen zu hemmen. Unsere Daten legen nahe, dass die immunmodulatorische Funktion der FMT zur Behandlung der Immunsuppression, die bei einer späten Sepsis auftritt, verwendet werden kann.

Materialien und Methoden

Mäuse

Männliche C57BL/6-Mäuse (8–10 Wochen alt) wurden vom Model Animal Research Center der Nanjing University (Nanjing, China) gekauft. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in einem 24-h-Hell-Dunkel-Zyklus aufgezogen und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Alle Experimente mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Nanjing University genehmigt.

Preußische Blaufärbung

Die intrazelluläre FMT-Verteilung wurde mit dem Preußischblau-Färbekit von Perl (Solarbio, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Kurz gesagt wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd für 15 min fixiert und dann mit 10% Kaliumferrocyanid für 25–30 min inkubiert, gefolgt von Waschen und Gegenfärben mit Kernechtrot für 10 min. Zellen, die blaue Partikel im Zytoplasma enthielten, waren positiv für die Preußischblau-Färbung.

Erzeugung von aus Knochenmark abgeleiteten MDSCs

Knochenmarkzellen wurden durch Spülen der Oberschenkelknochen und Schienbeine von Wildtyp-Mäusen, gefolgt von RBC-Lyse, erhalten. Die Knochenmarkzellen wurden in komplettem RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS, 1 % v/v Penicillin und Streptomycin (Gibco, CA), 40 ng/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) (Miltenyi Biotech, Deutschland) und 40 ng/ml IL-6 (Miltenyi Biotech, Deutschland) bei 37 °C in 5% CO₂ Inkubator für 4  Tage. Nicht anhaftende Zellen wurden für weitere Experimente gesammelt.

Zelllebensfähigkeitstest

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des Cell Counting Kit-8 (Dojino, Kumamoto, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert. Kurz gesagt, MDSCs (5 × 10 ³ ) wurden in 96-Well-Kulturplatten ausplattiert und in einem 5% CO₂ . inkubiert Atmosphäre bei 37 °C vor der Behandlung. Das Medium wurde dann für 24 Stunden durch frisches Medium ersetzt, das verschiedene Konzentrationen von FMT (250, 500, 1000, 2000 µg/ml) enthielt. Der Überstand wurde anschließend verworfen und frisches Medium, das CCK-8-Lösung enthielt, wurde zugegeben. Nach 3 h Inkubation bei 37 °C wurde die Extinktion bei 450 nm mit einem Gen5-Mikroplattenlesegerät (BioTek, USA) gemessen.

Isolierung von Gesamt-RNA und Echtzeit-PCR

Gesamt-RNA wurde mit dem TRIzol-Reagenz (Invitrogen, USA) aus Zellen extrahiert und mit einem Nanodrop-Spektrophotometer (Thermo Scientific, USA) quantifiziert, bevor sie mit dem HiScript II 1st Strang cDNA Synthesis Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) revers transkribiert wurde. nach Herstellerangaben. Eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung des SYBR Green PCR-Kits (Bio-Rad, Hercules, CA) auf einem StepOne-Plus-Echtzeit-qPCR-System von Applied Biosystems (Applied Biosystems, Forster City, CA) durchgeführt. Die Genexpression wurde unter Verwendung des 2 ^−ΔΔCt . auf GAPDH normalisiert Methode. Die Primersequenzen sind in Zusatzdatei 1:Tabelle S1 aufgeführt.

Durchflusszytometrie

Die Gewebe wurden als Einzelzellsuspensionen mit Kollagenase Typ D (1 µg/ml) und DNase I (0,1 µg/ml) in Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) bei 37 °C für 30 Minuten hergestellt und dann die roten Blutkörperchen von die Milz wurde lysiert. Die Zellsuspensionen wurden durch 70-μm-Zellsiebe filtriert und die Lymphozyten wurden durch Zentrifugation bei 300 µg für 5 Minuten bei 4 °C gesammelt. Nach dem Waschen wurden die Zellen sofort für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung vorbereitet. Einzelzellen wurden mit FcR-Blockierungsreagenz (Miltenyi Biotech, Deutschland) 10&supmin; inkubiert, gefolgt von einer Färbung mit den folgenden Antikörper-Konjugaten für 20&supmin;:FITC-markierte Anti-CD11b, Anti-CD11c, Anti-CD4 und Anti-CD8; PE-markiertes Anti-Ly6G; APC-markiertes Anti-Ly6C, Anti-CD3, Anti-F4/80 und Anti-MHC II (BioLegend, CA). Nach dem Waschen wurden die Zellen mit einem FACS Calibur (BD, CA) nachgewiesen und die Daten wurden mit FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., USA) analysiert

H&E-Färbung

Leber- und Lungengewebe wurden in 4% phosphatgepuffertem Formaldehyd fixiert. Fixiertes Gewebe wurde in Paraffin eingebettet und 5 µm dicke Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin für die Lichtmikroskopie gefärbt.

Enzym-Linked Immunosorbent Assay

Die Serumspiegel von TNFα, MCP-1 und IL-1β wurden mit spezifischen ELISA-Kits (Dakewe, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Jede Probe wurde in zweifacher Ausführung durchgeführt.

Erkennung von ROS

Die intrazelluläre ROS wurde mit dem 2,7-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)-Kit (Beyotime, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 5 µM DCFH-DA bei 37 °C im Dunkeln für 30 Minuten inkubiert, dann mit RPMI-1640-Medium gewaschen und in PBS resuspendiert. Die Zellen wurden auf intrazelluläre grüne Fluoreszenz unter Verwendung eines Durchflusszytometers (BD, CA) analysiert.

T-Zell-Proliferations-Assay

Gesamt CD3 ⁺ T-Zellen wurden aus der Milz von Wildtyp-Mäusen unter Verwendung eines CD3&spplus;-MicroBead-Kits (Miltenyi Biotech, Deutschland) und inkubierter CFSE-Färbung (Invitrogen, USA) angereichert. Für die Anti-CD3/CD28-Antikörper-induzierte T-Zell-Proliferation wurden T-Zellen mit Anti-CD3-Antikörper (1 µg/ml) und Anti-CD28-Antikörper (1 µg/ml) aktiviert. G-MDSCs (Gr-1 ^hoch Ly-6G ⁺ ) und M-MDSCs (Gr-1 ^dim Ly-6G ⁻ ) isoliert aus Milzen von FMT-behandelten oder Vehikel-behandelten Mäusen unter Verwendung eines Myeloid-Derived Suppressor Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotech, Deutschland) gemäß den Herstelleranweisungen. MDSCs wurden im Verhältnis 1:1 mit CFSE-markiertem CD3 ⁺ . cokultiviert T-Zellen in 96-Well-Platten mit flachem Boden für 3 Tage. CFSE wird bei jeder Teilung gleichmäßig auf die Tochterzellen aufgeteilt; daher wurde die Proliferation durch Durchflusszytometrie bestimmt. Die Reinheit der Zellen nach der Sortierung betrug> 90 %.

Statistik und Datenanalyse

Alle Statistiken wurden unter Verwendung der GraphPad Prism 6-Software (GraphPad Software, CA) berechnet und sind als Mittelwerte ± Standardabweichungen (SD) dargestellt. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden von Mann-Whitney U . analysiert Test oder ungepaartes, zweiseitiges t des Schülers Prüfung. Für den Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine Einweg-ANOVA verwendet. Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt. Unterschiede zu p Werte <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Eine große Anzahl von MDSCs nehmen FMT auf

Um zu überprüfen, ob Zellen mit internalisiertem FMT durch MACS MicroBeads getrennt werden, verwendeten wir Preußisch-Blau-Färbung, um den intrazellulären Eisengehalt in Makrophagen nachzuweisen, die 24 Stunden lang mit FMT (1000 ng/ml) behandelt wurden. Die Zellen wurden in drei Gruppen eingeteilt:vor der magnetischen Trennung FMT-positive Zellen, die magnetisch selektiert wurden (FMT+) und solche, die nicht magnetisch isoliert wurden (FMT-). Die Preußisch-Blau-Färbung zeigte, dass die Mehrheit der magnetisch selektierten Zellen Preußisch-Blau-positiv war (Fig. 1a). Um die Fähigkeit zur Phagozytose von FMT zwischen MDSCs, Makrophagen und DCs zu vergleichen, isolierten wir Splenozyten aus naiven C57BL/6-Mäusen, die 6 h, 12 h, 24 h und 48 h mit FMT behandelt wurden. Splenozyten wurden in zwei Untergruppen unterteilt:vor der magnetischen Trennung und FMT-positive Zellen. Die durchflusszytometrische Analyse ergab, dass nach 12–48 h fast 60 % der MDSCs und mehr als 60 % der Makrophagen FMT akkumulierten (Abb. 1b, c). Nur etwa 40% der DCs waren nach 24 h FMT-positiv. Diese Daten zeigten, dass MDSCs wie Makrophagen FMT aufnehmen können und legten nahe, dass FMT die MDSC-Funktion beeinflussen kann.

Fähigkeit von MDSCs, Makrophagen und DCs zur Aufnahme von FMT. a Makrophagen wurden 24 Stunden lang mit FMT (1000 ng/ml) behandelt und dann mit Preußischblau gefärbt, um das zelluläre Vorhandensein und die Ablagerung von Eisen in drei Gruppen festzustellen:vor der magnetischen Trennung magnetisch selektiert (FMT+), nicht magnetisch isoliert (FMT-) . b Splenozyten von naiven C57BL/6-Mäusen wurden 6 h, 12 h, 24 h und 48 h mit FMT inkubiert. FACS-Analyse der Prozentsätze von MDSCs, Makrophagen und DCs in zwei Untergruppen:vor der magnetischen Trennung FMT-positive Zellen. c Das Verhältnis von FMT-positiven Zellen zu Zellen vor der magnetischen Trennung. Alle Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente für jede experimentelle Gruppe und werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt

FMT verhindert die In-vitro-Erweiterung von MDSCs

Es wurde berichtet, dass FMT eine phänotypische Verschiebung in M2-Makrophagen in Richtung auf einen hohen CD86 ⁺ .-Wert induziert , TNF-α-positiver M1-Makrophagen-Subtyp [3]. Da es eine große Anzahl von MDSCs gibt, die FMT aufnehmen können, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass FMT die Funktion von MDSCs verändern kann. Zuerst wurden die zytotoxischen Wirkungen von FMT bei 250, 500, 1000 und 2000 µg/ml auf MDSCs mit dem CCK8-Zelllebensfähigkeitsassay bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass FMT bei niedrigen Dosen keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen hatte und bei der maximalen Dosis von 2000 µg/ml nur eine mäßige Zytotoxizität aufwies (Abb. 2a). Wir testeten dann, ob FMT in verschiedenen Konzentrationen die Bildung von MDSCs beeinflussen würde. Knochenmarkzellen, die aus naiven C57BL/6-Mäusen isoliert wurden, wurden 4 Tage lang mit mittleren oder verschiedenen Konzentrationen von FMT (250, 500, 1000 und 2000 µg/ml) behandelt, gefolgt von einer Charakterisierung durch Durchflusszytometrie an Tag 4. GM-CSF und IL-6 wurde am Tag 0 hinzugefügt. Die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten zeigten, dass FMT bei 1000 und 2000 µg/ml die Expansion von MDSCs signifikant verringerte (Abb. 2b, c).

Durchflusszytometrische Quantifizierung des Prozentsatzes von CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ Zellen nach Behandlung mit FMT bei 250, 500, 1000, 2000 µg/ml in vitro. a Die Lebensfähigkeit von MDSC-Zellen wurde unter Verwendung von CCK8-Assays nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von FMT für 24 Stunden nachgewiesen. b , c Aus C57BL/6-Mäusen isolierte Knochenmarkszellen wurden 4 Tage lang mit GM-CSF und IL-6 in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von FMT kultiviert und die Zellphänotypen wurden durch Durchflusszytometrie bewertet. Alle Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente für jede experimentelle Gruppe und werden als Mittelwerte ± Standardabweichung angezeigt. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 gemäß t . eines ungepaarten Schülers Test gegen Zellen, die nur mit Vehikel behandelt wurden

FMT reduziert die immunsuppressive Fähigkeit von MDSCs

MDSCs verwenden mehrere Mechanismen, um die Proliferation und Effektorfunktion von T-Zellen zu hemmen, wobei der am besten beschriebene die Produktion von ROS und Arg-1 ist. Die Expression der p47phox-Komponente des Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Oxidase (NOX)-Komplexes ist für die ROS-Produktion in MDSCs verantwortlich [5]. Es wurde berichtet, dass S100A8/A9 von MDSCs in einer autokrinen Entzündungsschleife synthetisiert und sezerniert wird und dass dies bei der Unterdrückung der dendritischen Zellfunktion in Mausmodellen wichtig ist [16]. Um zu bestimmen, ob FMT die Funktion von MDSCs verändern könnte, erhielten wir BM-abgeleitete MDSCs wie zuvor beschrieben und verwendeten RT-PCR, um die mRNA-Expression in FMT-behandelten MDSCs im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zu messen. Die Ergebnisse zeigten, dass FMT-behandelte MDSCs die Expressionsniveaus von Arg-1, S100A8, S100A9 und p47phox im Vergleich zu unbehandelten MDSCs signifikant herunterregulierten (Abb. 3a–h). Als nächstes bewerteten wir die ROS-Spiegel in Kontroll-MDSCs und FMT-behandelten MDSCs. Die Ergebnisse zeigten, dass FMT-behandelte MDSCs einen signifikant niedrigeren ROS-Spiegel zeigten als Kontrollzellen (Abb. 3i, j). Anschließend verglichen wir die Veränderungen in den MDSC-Subpopulationen in den mit FMT behandelten und unbehandelten Gruppen. Die Ergebnisse zeigten, dass FMT den Prozentsatz von G-MDSCs verringerte, wobei auch ein leichter Anstieg von M-MDSCs beobachtet wurde (Abb. 3k, l).

FMT verändert die Funktion von MDSCs in vitro. Aus Knochenmark abgeleitete MDSCs, die 24 Stunden lang mit Vehikel oder FMT behandelt wurden. a –h Arg-1-, S100A8-, S100A9- und p47phox-Genexpression von behandelten MDSCs, gemessen durch quantitative RT-PCR. ich BM-abgeleitete MDSCs wurden mit FMT für 24 h inkubiert und die ROS-Produktion wurde durch FCM nachgewiesen. j Quantitative Daten von i . k Subpopulationen von MDSCs in den FMT-behandelten und Kontrollgruppen. l FACS-Analyse der Prozentsätze von G-MDSCs und M-MDSCs. Alle Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente für jede experimentelle Gruppe und werden als Mittelwerte ± Standardabweichung angezeigt. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 gemäß t . eines ungepaarten Schülers Test gegen Zellen, die nur mit Vehikel behandelt wurden

FMT fördert die Differenzierung von MDSCs in Makrophagen

Um zu bestimmen, ob FMT die endgültige Differenzierung von MDSCs in Makrophagen stimuliert, behandelten wir Zellen am Tag 0 mit 1000 µg/ml FMT und führten an den Tagen 1, 3 und 5 eine Durchflusszytometrie für die Makrophagen-assoziierten Marker CD11b und F4/80 durch Die Ergebnisse zeigten, dass 1 Tag nach Zugabe von 1000 µg/ml FMT der Anteil der Makrophagen im Vergleich zu unbehandelten Zellen um mehr als das 2-fache anstieg. In ähnlicher Weise waren 3 Tage und 5 Tage nach der Behandlung mit FMT auch die Anteile an Makrophagen signifikant erhöht (Abb. 4a, b).

Wirkung von FMT auf die Differenzierung von MDSCs. a , b Aus Knochenmark stammende MDSCs wurden mit oder ohne 1000 µg/ml FMT behandelt und die Anzahl der Makrophagen wurde nach 1 Tag, 3 Tagen und 5 Tagen durch FACS bestimmt. Alle Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente für jede experimentelle Gruppe und werden als Mittelwerte ± Standardabweichung angezeigt. *p <0,05 im Vergleich zu Zellen, die nur mit Vehikel behandelt wurden

FMT verbessert die Symptome bei LPS-induzierten septischen Mäusen

Es wurde berichtet, dass Sepsis mit Gewebeschäden einhergeht und zu Organversagen und endothelialer Dysfunktion führt [17]. Um zu untersuchen, ob FMT späte Sepsis-Symptome reduziert, wurde das Ausmaß der Organschädigung bei den Versuchsmäusen nach 10 Tagen bewertet. Eine histopathologische Untersuchung der Lunge bei LPS-induzierter Sepsis zeigte, dass FMT die Rekrutierung weißer Blutkörperchen und die Verdickung der Alveolarwand im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Mäusen reduzierte. Die H&E-Färbung zeigte auch, dass die Fläche der Lebernekrose bei den FMT-behandelten Mäusen im Vergleich zu den Vehikel-behandelten Mäusen kleiner war (Fig. 5a, b). Darüber hinaus waren die Aspartat-Transaminase-Serumspiegel, die bei diesen Tieren als biochemischer Marker für Leberfunktionsstörungen verwendet wurden, in den Lebern von FMT-behandelten Mäusen im Vergleich zur Kontrolle signifikant niedriger (Fig. 5c). FMT hatte jedoch keinen Einfluss auf die Alanin-Aminotransferase-Spiegel (Fig. 5d). Darüber hinaus wird angenommen, dass Sepsis mit unerwünschten Folgen wie einer erhöhten Produktion von inflammatorischen Zytokinen verbunden ist; Daher untersuchten wir Veränderungen in den Spiegeln proinflammatorischer Zytokine im Serum. Der TNF-α-Spiegel im Serum war bei FMT-behandelten Mäusen 3 h nach der LPS-Injektion leicht, aber nicht signifikant niedriger, und es wurden keine Unterschiede in den MCP-1- oder IL-1β-Spiegeln zwischen FMT-behandelten Mäusen und Vehikel beobachtet -behandelte Mäuse (Abb. 5e–g).

FMT verbessert die Leberschädigung bei LPS-induzierten septischen Mäusen. a Mäuse erhielten entweder PBS oder eine i.p. Injektion von 5 mg/kg Körpergewicht bakteriellen LPS am Tag 0. Nach 1 h und 5 Tagen wurde FMT in einer Dosis von 10 mg/kg oder 100 µl Kochsalzlösung über die Schwanzvene verabreicht. Mäuse wurden in vier Gruppen eingeteilt (n =6):Kontrolle, empfangendes Fahrzeug; LPS, nur LPS empfangen; FMT, nur FMT empfangen; und LPS + FMT, die LPS und FMT empfangen. b Lungen- und Lebergewebe wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. c-d Serumtransaminasen (ALT und AST) wurden gemessen (n =6). Zytokinspiegel (TNF-a, IL-1β und MCP-1) wurden durch ELISA gemessen. e -g Auswirkungen von LPS-induzierter Sepsis auf die Zytokinproduktion bei Vehikel- oder Ferumoxytol-behandelten Mäusen. Zytokinspiegel, gemessen durch ELISA im Serum von Vehikel- oder Ferumoxytol-behandelten Mäusen nach i.p. LPS-Herausforderung (50 mg/kg). **p <0,01, bestimmt durch das t . eines ungepaarten Schülers testen

FMT verringert die Anzahl der MDSCs in der Milz von LPS-induzierten septischen Mäusen

Immer mehr Beweise belegen, dass eine Sepsis-assoziierte Immunsuppression die Mortalität erhöht [18], und MDSCs werden als Hauptbestandteil des immunsuppressiven Netzwerks angesehen [8]. Es wurde berichtet, dass G-MDSCs bei septischen Patienten spezifischer vermehrt werden und scheinen Hauptakteure der Sepsis-induzierten Immunsuppression zu sein [12]. Um zu bestimmen, ob FMT die MDSC-Populationen bei Wildtyp-Mäusen moduliert, wurde C57BL/6-Mäusen an Stunde 1 und Tag 5 FMT über die Schwanzvene verabreicht Knochenmark zwischen den Kontroll- und FMT-behandelten Mäusen (Fig. 6a, e). Bemerkenswert ist, dass FMT die LPS-abhängige Expansion von CD11b ⁺ . verringerte Gr-1 ⁺ Zellen sowohl im Knochenmark als auch in der Milz (Fig. 6a, e), was mit In-vitro-Studien übereinstimmt. Darüber hinaus verringerte FMT auch den Prozentsatz von G-MDSCs und M-MDSCs in der Milz, während nur der Prozentsatz von G-MDSCs im Knochenmark verringert war (Abb. 6c, g). Diese Daten zeigen, dass FMT die Anzahl der MDSCs in der Milz von LPS-induzierten septischen Mäusen verringert.

FMT verringert die Anzahl der MDSCs bei LPS-induzierten septischen Mäusen. Mäuse wurden in vier Gruppen eingeteilt (n =6):Kontrolle, empfangendes Fahrzeug; LPS, nur LPS empfangen; FMT, nur FMT empfangen; und LPS + FMT, die LPS und FMT empfangen. a CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ Zellpopulationen im Knochenmark wurden durch FACS nachgewiesen. b Quantitative Daten von a . c Durchflusszytometrie-Dot-Plot der Ly6C- und Ly6G-Expression im gesteuerten CD11b ⁺ Zellen aus der Milz. d Quantifizierung der Prozentsätze der Granulozyten- und Monozyten-Untergruppen. e CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ Zellpopulationen in der Milz wurden durch FCM nachgewiesen. f Quantitative Daten von e . g Durchflusszytometrie-Punktdiagramm der Ly6C- und Ly6G-Expression in den Gated CD11b+-Zellen aus Milz. h Quantifizierung der Prozentsätze der Granulozyten- und Monozyten-Untergruppen. *p <0,05 gemäß t . eines ungepaarten Schülers testen

FMT reduziert die T-Zell-immunsuppressiven Eigenschaften von MDSCs in vivo

Die zahlenmäßige Verringerung mehrerer Immunzellpopulationen, einschließlich CD4- und CD8-T-Zellen, ist ein Hauptmerkmal der adaptiven Immunantwort nach Sepsis. Sie ist mit einem erhöhten Sterberisiko sowie anderen schlechten Outcomes verbunden [19, 20]. Es wurde gezeigt, dass MDSCs die T-Zell-Proliferation unterdrücken, indem sie die T-Zell-Zetaketten-Expression bei Sepsis-Patienten beeinträchtigen [21]. Um den Anteil von Lymphozyten bei einer Sepsis im Spätstadium zu bewerten, haben wir den Anteil von CD4- und CD8-T-Zellen in einem Maus-Sepsis-Modell gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die FMT eine Zunahme von CD4- und CD8-T-Zellen in der Milz der LPS-induzierten Mäuse verursacht (Abb. 7a, b). Es gab keine Unterschiede in den Prozentsätzen von CD4- und CD8-T-Zellen in der Milz von FMT-behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen ( 7a , b). Um die Rolle von MDSCs bei der Unterdrückung der T-Zell-Proliferation in vivo weiter zu bestätigen, wurden G-MDSCs und M-MDSCs aus der Milz von Vehikel- oder FMT-behandelten LPS-herausgeforderten Mäusen durch MACS isoliert und mit CD3-T-Zellen im Verhältnis 1:1 . cokultiviert Verhältnis. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die FMT-Behandlung die immunsuppressiven Funktionen von T-Zellen sowohl von G-MDSCs als auch von M-MDSCs reduzierte ( 7e , f). Darüber hinaus haben wir auch die Niveaus der Arg-1- und p47phox-Expression in MDSCs gemessen, die aus der Milz von Mäusen isoliert wurden. Wie erwartet war die Arg-1- und p47phox-Genexpression bei Milz-CD11b ⁺ . signifikant reduziert Gr-1 ⁺ Zellen, die aus FMT-behandelten Mäusen mit LPS-Herausforderung isoliert wurden, im Vergleich zu Mäusen mit LPS-Herausforderung (Fig. 7g, h). Diese Daten deuten darauf hin, dass FMT die immunsuppressiven Funktionen von MDSCs durch Verringerung der Arg-1- und ROS-Produktion verringerte, was darauf hindeutet, dass FMT die langfristige Immunsuppression bei Sepsis im Spätstadium reduzieren kann.

FMT reduziert die immunsuppressiven Eigenschaften von MDSCs. a CD3 ⁺ CD4 ⁺ Zellpopulationen in der Milz wurden durch FACS nachgewiesen. b Quantitative Daten von a . c CD3 ⁺ CD8 ⁺ Zellpopulationen in der Milz wurden durch FACS nachgewiesen. d Quantitative Daten von a . e Die Fähigkeit von G-MDSCs aus Mäusen, die durch Anti-CD3/CD28-Stimulation induzierte T-Zell-Proliferation zu unterdrücken, wurde durch FACS gemessen (n =3 pro Gruppe). Ein repräsentatives Histogramm wird angezeigt. f Die Fähigkeit von M-MDSCs von Vehikel- oder FMT-behandelten LPS-herausgeforderten Mäusen, die durch Anti-CD3/CD28-Stimulation induzierte T-Zell-Proliferation zu unterdrücken, wurde durch FACS gemessen (n =3 pro Gruppe). Ein repräsentatives Histogramm wird angezeigt. g , h Arg-1- und p47phox-mRNA-Expression in MDSCs von Vehikel- oder FMT-behandelten LPS-infizierten Mäusen

Diskussion

Das von der FDA zugelassene Eisenpräparat FMT wird häufig als Arzneimittelträger und Kontrastmittel bei MRT-Untersuchungen verwendet. Es wurde festgestellt, dass FMT das Krebswachstum hemmt, indem es eine proinflammatorische Immunantwort mit M1-Makrophagen-Polarisation induziert [3], was darauf hindeutet, dass FMT immunmodulatorische Funktionen hat. In dieser Studie haben wir die Wirkung von FMT auf MDSCs untersucht, indem wir den Phänotyp und die Funktion von FMT-behandelten MDSCs mit unbehandelten Kontroll-MDSCs verglichen. Frühere Studien haben gezeigt, dass MDSCs magnetische Nanopartikel aufnehmen können [10], und unsere Daten zeigten weiter, dass FMT die immunsuppressiven Funktionen von MDSCs in der Milz durch Herunterregulierung von Arg-1 und ROS abschwächt. Unsere Daten zeigten auch, dass FMT einen direkten Einfluss auf die MDSC-Differenzierung hat, wobei etwa ein Fünftel der Zellen in In-vitro-Experimenten nach 5 Tagen gleichmäßig zu Makrophagen differenzieren. Obwohl wir den Phänotyp von Makrophagen, die FMT ausgesetzt waren, nicht untersuchten, nahmen wir an, dass sie vom proinflammatorischen M1-Subtyp waren. Die Ergebnisse zeigten eindeutig, dass FMT die Differenzierung und Reifung von MDSCs verbessert und legt somit nahe, dass dies der Reduktion der MDSC-Population zugrunde liegt, die wir während der späten Sepsis beobachtet haben.

Sepsis löst eine komplexe Immunantwort aus, die im Laufe der Zeit variiert und von sowohl proinflammatorischen als auch entzündungshemmenden Reaktionen begleitet wird. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Tod in den frühen Stadien der Sepsis auf eine übermäßige Entzündung zurückzuführen ist. Derive und Kollegen berichteten, dass der adoptive Transfer von MDSCs am Tag 10 in septische Mäuse die peritoneale Zytokinproduktion abschwächte und die Überlebensrate verbesserte [22]. In jüngerer Zeit haben Namkoog et al. beobachteten, dass die Vorbehandlung mit Clarithromycin das Überleben in einem Mausmodell des LPS-induzierten Schocks durch die Erweiterung des CD11b ⁺ . verbessert Gr-1 ⁺ cell population [23]. They described that MDSCs play a protective role in sepsis, however, it should be noted that they were concerned about the early stages of sepsis. Most patients with sepsis display rapid signs of profound immunosuppression, and deaths in this phase are typically due to the acquisition of a secondary hospital-acquired infection, often with opportunistic pathogens [24]. Overzealous MDSC proliferation may facilitate a physiological syndrome of persistent immunosuppression, causing poor outcomes [25]. McClure et al. reported that they did not observe any protective effects from MDSC transfer once the mice entered the late immunosuppressive state [26]. They had previously shown that MDSCs massively expand in the bone marrow, spleen, and lymph nodes of mice with ongoing septic processes and contribute to sepsis-induced T cell suppression [11]. Additionally, Uhel reported that M-MDSCs and G-MDSCs strongly contribute to T cell dysfunction in patients with sepsis [12]. Our data demonstrated that FMT significantly decreased the percentage of MDSCs and attenuated the functions of MDSCs to restore the number of T cells present in mice during late sepsis. Therefore, when studying the role of MDSCs in sepsis, it is crucial to clearly distinguish the early and late stages of sepsis.

Mohus et al. suggested that iron deficiency was associated with increased risk of future bloodstream infections that cause sepsis, indicating that the immune defense mechanisms may be depressed compared to bacterial iron sequestration in low iron environments [27]. Controversies shown in iron supplemental studies reported that intravenous iron therapy was associated with an increased risk of infection [28]. It should be noted the iron supplements differ significantly in their physicochemical properties, which give them different biological properties [29]. With FMT, an iron core is wrapped in a carbohydrate shell, which leads to low toxicity, lysosomal uptake and degradation [30, 31]. It has been reported that FMT does not cause liver toxicity in patients or animal models and is typically metabolized within 2 months [32]. Our data showed that FMT does not increase the production of inflammatory cytokines in early sepsis, indicating that FMT can be administered in sepsis.

Conclusion

This study demonstrated a novel immune-modulatory property of FMT; however, further studies are needed to elucidate the mechanism of FMT suppression of MDSCs. Furthermore, we provide an attractive therapeutic approach for the treatment of sepsis-associated immunosuppression and targeting MDSCs may provide a promising new option for restoring the immune response during sepsis.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

ALT:

Alanine aminotransferase

Arg1:

Arginase 1

AST:

Aspartate aminotransferase

FMT:

Ferumoxytol

G-MDSCs/PMN-MDSCs:

Polymorphonuclear MDSCs/granulocytic MDSCs

HE:

Hematoxylin–eosin

IL-1β:

Interleukin-1β

iNOS:

Inducible nitric oxide synthase

LPS:

Lipopolysaccharide

MCP 1:

Monocyte chemotactic protein 1

MDSC:

Myeloid-derived suppressor cell

MHC II:

Major histocompatibility complex

M-MDSCs:

Monocytic MDSCs

PBS:

Phosphate-buffered saline solution

ROS:

Reactive oxygen species

TLR:

Toll-like receptor

TNF-α:

Tumor necrosis factor α