Ferumoxytol reduziert MDSC-Aktivität und lindert LPS-induzierte Immunsuppression bei Sepsis

Zusammenfassung

Sepsis-induzierte Immunsuppression gilt als eines der Hauptmerkmale, die für therapeutische Misserfolge verantwortlich sind. Myeloide supprimierende Zellen (MDSCs), die hauptsächlich durch ihre supprimierenden Eigenschaften charakterisiert sind, werden bei Sepsis erweitert berichtet. Ferumoxytol (FMT), ein von der FDA zugelassenes Eisenpräparat, zeigte immunmodulatorische Eigenschaften in Tumoren. Unklar blieb jedoch, ob FMT die Funktionen von MDSCs verändert, um die späte Sepsis-Immunsuppression zu reduzieren. Hier zeigen wir einen immunmodulatorischen Effekt von FMT auf MDSCs, der die durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Immunsuppression im späten Sepsis-Stadium lindert. Die Trennung von Zellen mit internalisiertem FMT und der Nachweis des intrazellulären Eisengehalts zeigten, dass MDSCs FMT aufnehmen können. Niedrige Dosen von FMT hatten keine Auswirkungen auf die Zellviabilität von MDSCs, aber FMT hemmte die Expansion von MDSCs in vitro. Zudem regulierte FMT die Expressionsniveaus von Arg-1, S100A8, S100A9 und p47phox sowie die ROS-Produktion in MDSCs signifikant herunter. FMT verringerte den Anteil an granulozytären MDSCs (G-MDSCs) und förderte die Differenzierung von MDSCs zu Makrophagen. Weiterhin reduzierte FMT die Rekrutierung weißer Blutkörperchen und die Alveolarwandverdickung in der Lunge sowie Nekroseareale in der Leber und einige biochemische Marker der Leberfunktionsstörung. FMT verringerte den Anteil an G-MDSCs und monozytären MDSCs (M-MDSCs) in den Milzen von LPS-induzierten septischen Mäusen. Besonders wichtig: FMT reduzierte die T-Zell-immunsuppressiven Funktionen sowohl von G-MDSCs als auch von M-MDSCs. Erwartungsgemäß reduzierte FMT auch signifikant die Genexpression von Arg-1 und p47phox in splenischen CD11b⁺Gr-1⁺-Zellen, isoliert von LPS-geforderte Mäusen. Diese Daten deuten darauf hin, dass FMT die immunsuppressiven Funktionen von MDSCs durch Verringerung von Arg-1 und ROS-Produktion verringert, was darauf hindeutet, dass FMT die langfristige Immunsuppression im späten Sepsis-Stadium reduzieren kann.

Einleitung

FMT, ein von der Food and Drug Administration zugelassenes Eisenpräparat, wird zur Behandlung von Eisenmangelanämie bei Erwachsenen mit chronischer Nierenerkrankung (CKD) [1] eingesetzt und ist auch weit verbreitet als Kontrastmittel und Drug-Carrier [2]. Frühere Studien zeigten, dass FMT immunmodulatorische Eigenschaften besitzt, wie die Fähigkeit, einen phänotypischen Wechsel von M2-Makrophagen hin zu einem CD86⁺, TNF-α-positiven M1-Makrophagen-Subtyp zu induzieren [3, 4]. Die Auswirkungen von FMT auf andere Immunzellen wurden jedoch nicht untersucht.

MDSCs sind eine heterogene Population unreifer myeloider Zellen mit starker immunsuppressiver Kapazität [5]. Bei Mäusen sind MDSCs als Gr-1⁺CD11b⁺-Zellen identifizierbar, während menschliche MDSCs den Gr-1-Homolog fehlen und als CD14⁻HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺ oder CD14⁺HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺ definiert werden [6]. MDSCs bestehen aus zwei großen Zellgruppen: granulozytären oder PMN-MDSCs und M-MDSCs, und beide Populationen haben immunsuppressive Funktionen durch Produktion von iNOS, ROS und Arg-1. Die erhöhte Aktivität von Arg-1 entzieht L-Arginin, und der Mangel an L-Arginin inhibiert die T-Zell-Proliferation durch Verringerung der CD3-Zeta-Ketten-Expression. iNOS erzeugt NO, das die Funktionen von JAK3 und STAT6 in T-Zellen sowie die Expression von MHC II inhibiert. ROS induziert posttranslationale Modifikationen von T-Zell-Rezeptoren und kann Antigen-spezifische T-Zell-Unantwortbarkeit verursachen [7]. M-MDSCs entstehen aus Monozyten-Vorläufern und können unter geeigneten Zytokin-Bedingungen in Makrophagen und DCs differenzieren. Unser Wissen über MDSCs stammt größtenteils aus Krebsstudien. In jüngster Zeit wurde eine Expansion von MDSCs auch in akuten und chronischen Entzündungskrankheiten einschließlich Entzündungen, Verbrennungen und Autoimmunerkrankungen beschrieben [8, 9]. Kürzlich wurde eine hohe Aufnahme fluoreszierender Nanopartikel durch MDSCs in Ösophagus und Milz von Mäusen in Bildgebungsstudien berichtet [10]. Unklar blieb jedoch, ob FMT die Funktion von MDSCs verändert, die an der Entwicklung entzündlicher Erkrankungen beteiligt sind.

Sepsis, eine dysregulierte Wirts-Entzündungsantwort auf schwere Infektion, die lebensbedrohliche Organdysfunktion verursachen kann, ist die häufigste Todesursache auf Intensivstationen. Sepsis initiiert eine überwältigende proinflammatorische Antwort, die, wenn sie nicht früh behandelt wird, rasch in eine langfristige Immunsuppression übergeht. Die Expansion von MDSCs wurde in Milz und Lymphknoten in septischen Tiermodellen [8, 11] sowie bei Sepsis-Patienten [12,13,14] beschrieben. Die Aktivierung immunsuppressiver Zellen wie MDSCs ist entscheidend für die angemessene Kontrolle der Hyperresponsivität des angeborenen Immunsystems, aber ihre übermäßige Expansion kann zu Hyperimmunsuppression führen, die die vorherrschende treibende Kraft für Sekundärinfektionen und Mortalität in der späten Sepsis ist. Erhöhte MDSC-Zahlen korrelieren mit der Suppression der Lymphozyten-Proliferation. Es wurde berichtet, dass MDSCs ihren Phänotyp im Knochenmark erwerben und dann in sekundäre Lymphorgane migrieren, um T-Zell-Antworten zu inhibieren und ihre Proliferation in LPS-immunsupprimierten Mäusen zu unterdrücken [8]. Die meisten Patienten mit langwieriger Sepsis weisen einen immunsuppressiven Status auf, und die meisten Sepsis-Todesfälle sind auf späte Sepsis-Immunsuppression zurückzuführen. Die Elimination von MDSCs könnte in der späten Sepsis vorteilhafte Effekte haben, indem sie die Immunantwort wiederherstellt [15]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass FMT die Funktionen von MDSCs modulieren könnte, um die späte Sepsis-Immunsuppression zu reduzieren.

Hier zeigen wir einen immunmodulatorischen Effekt von FMT auf MDSCs. Wir nutzten die magnetischen Eigenschaften von FMT, um zu zeigen, dass MDSCs in der Lage waren, FMT in vitro zu phagozytieren. Zudem fanden wir, dass FMT die immunsuppressive Funktion von MDSCs durch Herunterregulierung von Arg-1 und ROS abschwächt. In-vivo-Experimente bestätigten, dass FMT das späte Stadium der LPS-induzierten Sepsis bei Mäusen lindert, indem es die Fähigkeit von MDSCs schwächt, T-Zellen zu inhibieren. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die immunmodulatorische Funktion von FMT zur Behandlung der Immunsuppression, die in der späten Sepsis auftritt, genutzt werden kann.

Materialien und Methoden

Mäuse

Männliche C57BL/6-Mäuse (8–10 Wochen alt) wurden vom Model Animal Research Center der Nanjing-Universität (Nanjing, China) bezogen. Die Mäuse wurden unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen an einem 24-h-Licht/Dunkel-Zyklus gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Alle Experimente mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Nanjing-Universität genehmigt.

Preußisch-Blau-Färbung

Die intrazelluläre FMT-Verteilung wurde mit dem Perl'schen Preußisch-Blau-Färbungskit (Solarbio, China) gemäß den Herstellerangaben detektiert. Kurz gesagt, Zellen wurden 15 min in 4% Paraformaldehyd fixiert, dann 25–30 min mit 10% Kaliumferrocyanid inkubiert, gefolgt von Waschen und Gegenfärbung mit Kernschnellrot für 10 min. Zellen mit blauen Partikeln im Zytoplasma waren Preußisch-Blau-positiv.

Generierung knochenmarkabgeleiteter MDSCs

Knochenmarkzellen wurden durch Ausspülen der Femora und Tibien von Wildtyp-Mäusen gefolgt von Erythrozytenlyse gewonnen. Die Knochenmarkzellen wurden in vollem RPMI-1640-Medium mit 10% FBS, 1% v/v Penicillin und Streptomycin (Gibco, CA), 40 ng/mL Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) (Miltenyi Biotech, Deutschland) und 40 ng/mL IL-6 (Miltenyi Biotech, Deutschland) bei 37 °C in einem 5% CO₂-Inkubator für 4 Tage kultiviert. Nicht-adhärente Zellen wurden für weitere Experimente gesammelt.

Zellviabilitätsassay

Die Zellviabilität wurde mit dem Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) gemäß Herstellerangaben analysiert. Kurz gesagt, MDSCs (5 × 10³) wurden in 96-Well-Kulturplatten plattiert und in einer 5% CO₂-Atmosphäre bei 37 °C inkubiert vor der Behandlung. Das Medium wurde dann durch frisches Medium mit verschiedenen FMT-Konzentrationen (250, 500, 1000, 2000 μg/mL) für 24 h ersetzt. Der Überstand wurde anschließend verworfen und frisches Medium mit CCK-8-Lösung hinzugefügt. Nach Inkubation bei 37 °C für 3 h wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Gen5-Mikroplattenleser (BioTek, USA) gemessen.

Isolierung von Gesamt-RNA und Echtzeit-PCR

Gesamt-RNA wurde aus Zellen mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen, USA) extrahiert und mit einem Nanodrop-Spektrophotometer (Thermo Scientific, USA) quantifiziert, bevor sie mit dem HiScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) gemäß Herstellerangaben revers transkribiert wurde. Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit dem SYBR Green PCR Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) auf einem Applied Biosystems StepOne-Plus Echtzeit-qPCR-System (Applied Biosystems, Forster City, CA) durchgeführt. Die Genexpression wurde mit der 2^−ΔΔCt-Methode auf GAPDH normalisiert. Die Primersequenzen sind in Additional file 1: Table S1 aufgeführt.

Durchflusszytometrie

Gewebe wurden als Einzelzellsuspensionen mit Kollagenase Typ D (1 mg/mL) und DNase I (0,1 mg/mL) in Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) bei 37 °C für 30 min hergestellt, dann wurden die roten Zellen der Milz lysiert. Die Zellsuspensionen wurden durch 70-µm-Zellsiebe filtriert, und die Lymphozyten wurden durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei 4 °C gesammelt. Nach dem Waschen wurden die Zellen sofort für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung vorbereitet. Einzelne Zellen wurden 10 min mit FcR-Blockierungsreagenz (Miltenyi Biotech, Deutschland) inkubiert, gefolgt von Färbung mit folgenden Antikörperkonjugaten für 20 min: FITC-markiertes anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD4 und anti-CD8; PE-markiertes anti-Ly6G; APC-markiertes anti-Ly6C, anti-CD3, anti-F4/80 und anti-MHC II (BioLegend, CA). Nach dem Waschen wurden die Zellen mit einem FACS Calibur (BD, CA) detektiert und die Daten mit FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., USA) analysiert.

H&E-Färbung

Leber- und Lungengewebe wurden in 4% phosphatgepuffertem Formaldehyd fixiert. Fixiertes Gewebe wurde in Paraffin eingebettet, und 5-µm-dicke Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin für die Lichtmikroskopie gefärbt.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Serumspiegel von TNFα, MCP-1 und IL-1β wurden mit spezifischen ELISA-Kits (Dakewe, China) gemäß Herstellerangaben bestimmt. Jede Probe wurde in Duplikat durchgeführt.

Nachweis von ROS

Intrazelluläres ROS wurde mit dem 2,7-Dichlordihydrofluorescein-diacetat (DCFH-DA) Kit (Beyotime, China) gemäß Herstellerangaben gemessen. Kurz gesagt, die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit 5 µM DCFH-DA bei 37 °C im Dunkeln für 30 min inkubiert, dann mit RPMI-1640-Medium gewaschen und in PBS resuspendiert. Zellen wurden auf intrazelluläre grüne Fluoreszenz mit einem Durchflusszytometer (BD, CA) analysiert.

T-Zell-Proliferationsassay

Gesamte CD3⁺ T-Zellen wurden aus den Milzen von Wildtyp-Mäusen mit einem CD3ε MicroBead Kit (Miltenyi Biotech, Deutschland) angereichert und mit CFSE-Färbung (Invitrogen, USA) inkubiert. Für anti-CD3/CD28-Antikörper-induzierte T-Zell-Proliferation wurden T-Zellen mit anti-CD3-Antikörper (1 μg/mL) und anti-CD28-Antikörper (1 μg/mL) aktiviert. G-MDSCs (Gr-1^highLy-6G⁺) und M-MDSCs (Gr-1^dimLy-6G⁻) wurden aus den Milzen von FMT-behandelten oder fahrzeugbehandelten Mäusen mit einem Myeloid-Derived Suppressor Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotech, Deutschland) gemäß Herstellerangaben isoliert. MDSCs wurden im 1:1-Verhältnis mit CFSE-markierten CD3⁺ T-Zellen in 96-Well-Flachbodenplatten für 3 Tage ko-kultiviert. CFSE wird bei jeder Teilung gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt; daher wurde die Proliferation durch Durchflusszytometrie bestimmt. Die Reinheit der Zellen nach Sortierung betrug > 90%.

Statistik und Datenanalyse

Alle Statistiken wurden mit GraphPad Prism 6 Software (GraphPad Software, CA) berechnet und als Mittelwerte ± Standardabweichungen (SD) dargestellt. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test oder dem ungepaarten, zweiseitigen Student'schen t-Test analysiert. Einfaktorielle ANOVA wurde für den Vergleich mehrerer Gruppen verwendet. Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt. Unterschiede mit p-Werten < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Eine große Anzahl von MDSCs nimmt FMT auf

Um zu überprüfen, ob Zellen mit internalisiertem FMT durch MACS MicroBeads getrennt werden, verwendeten wir Preußisch-Blau-Färbung, um den intrazellulären Eisengehalt in Makrophagen nachzuweisen, die 24 h mit FMT (1000 ng/mL) behandelt wurden. Die Zellen wurden in drei Gruppen unterteilt: vor magnetischer Separation, magnetisch selektierte FMT-positive Zellen (FMT+), und nicht magnetisch isolierte Zellen (FMT-). Die Preußisch-Blau-Färbung zeigte, dass die Mehrheit der magnetisch selektierten Zellen Preußisch-Blau-positiv war (Abb. 1a). Um die Fähigkeit zur Phagozytose von FMT zwischen MDSCs, Makrophagen und DCs zu vergleichen, isolierten wir Splenozyten von naiven C57BL/6-Mäusen, die 6 h, 12 h, 24 h und 48 h mit FMT behandelt wurden. Splenozyten wurden in zwei Subsets unterteilt: vor magnetischer Separation und FMT-positive Zellen. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass fast 60% der MDSCs und mehr als 60% der Makrophagen nach 12–48 h FMT akkumulierten (Abb. 1b, c). Nur etwa 40% der DCs waren nach 24 h FMT-positiv. Diese Daten zeigten, dass MDSCs wie Makrophagen FMT aufnehmen können und suggerierten, dass FMT die MDSC-Funktion beeinflussen könnte.

Fähigkeiten von MDSCs, Makrophagen und DCs zur FMT-Aufnahme. a Makrophagen wurden 24 h mit FMT (1000 ng/mL) behandelt, dann mit Preußisch Blau gefärbt, um die zelluläre Anwesenheit und Ablagerung von Eisen in drei Gruppen zu ermitteln: vor magnetischer Separation, magnetisch selektiert (FMT+), nicht magnetisch isoliert (FMT-). b Splenozyten von naiven C57BL/6-Mäusen wurden 6 h, 12 h, 24 h und 48 h mit FMT inkubiert. FACS-Analyse der Prozentsätze von MDSCs, Makrophagen und DCs in zwei Subsets: vor magnetischer Separation, FMT-positive Zellen. c Verhältnis von FMT-positiven Zellen zu Zellen vor magnetischer Separation. Alle Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente pro Experimentiergruppe und als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt.

FMT inhibiert die Expansion von MDSCs in vitro

Es wurde berichtet, dass FMT einen phänotypischen Wechsel von M2-Makrophagen hin zu einem CD86⁺, TNF-α-positiven M1-Makrophagen-Subtyp induziert [3]. Da eine große Anzahl von MDSCs FMT aufnehmen kann, vermuteten wir, dass FMT die Funktion von MDSCs verändern könnte. Zunächst wurden die zytotoxischen Effekte von FMT bei 250, 500, 1000 und 2000 μg/mL auf MDSCs durch den CCK8-Zellviabilitätsassay bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass FMT bei niedrigen Dosen keine Auswirkungen auf die Zellviabilität hatte und nur bei der Maximaldosis von 2000 μg/mL moderate Zytotoxizität aufwies (Abb. 2a). Anschließend testeten wir, ob FMT bei verschiedenen Konzentrationen die Generierung von MDSCs beeinflusst. Knochenmarkzellen, isoliert von naiven C57BL/6-Mäusen, wurden 4 Tage mit Medium oder verschiedenen FMT-Konzentrationen (250, 500, 1000 und 2000 μg/mL) behandelt, gefolgt von Charakterisierung durch Durchflusszytometrie am Tag 4. GM-CSF und IL-6 wurden am Tag 0 hinzugefügt. Die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten zeigten, dass FMT bei 1000 und 2000 μg/mL die Expansion von MDSCs signifikant verringerte (Abb. 2b, c).

Durchflusszytometrische Quantifizierung des Prozentsatzes von CD11b⁺Gr-1⁺-Zellen nach Behandlung mit FMT bei 250, 500, 1000, 2000 μg/mL in vitro. a MDSC-Zellviabilität wurde nach Behandlung mit verschiedenen FMT-Konzentrationen für 24 h mit CCK8-Assays detektiert. b, c Knochenmarkzellen von C57BL/6-Mäusen wurden 4 Tage mit GM-CSF und IL-6 in Gegenwart verschiedener FMT-Konzentrationen kultiviert, und die Zellphänotypen wurden durch Durchflusszytometrie bewertet. Alle Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente pro Experimentiergruppe und als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, bestimmt durch ungepaarten Student'schen t-Test versus Zellen, die nur mit Fahrzeug behandelt wurden.

FMT reduziert die immunsuppressive Fähigkeit von MDSCs

MDSCs nutzen mehrere Mechanismen, um die Proliferation und Effektorfunktion von T-Zellen zu inhibieren, wobei die Produktion von ROS und Arg-1 am besten beschrieben sind. Die Expression der p47phox-Komponente des Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat-Oxidase (NOX)-Komplexes ist für die ROS-Produktion in MDSCs verantwortlich [5]. Es wurde berichtet, dass S100A8/A9 von MDSCs in einem autokrinen Entzündungskreislauf synthetisiert und sezerniert wird und dass dies für die Suppression der dendritischen Zellfunktion in Mausmodellen wichtig ist [16]. Um zu bestimmen, ob FMT die Funktion von MDSCs verändern könnte, erhielten wir BM-abgeleitete MDSCs wie zuvor beschrieben und verwendeten RT-PCR, um die mRNA-Expression in FMT-behandelten MDSCs versus unbehandelten Kontrollen zu messen. Die Ergebnisse zeigten, dass FMT-behandelte MDSCs die Expressionsniveaus von Arg-1, S100A8, S100A9 und p47phox signifikant herunterregulierten im Vergleich zu unbehandelten MDSCs (Abb. 3a–h). Als Nächstes bewerteten wir die ROS-Niveaus in Kontroll-MDSCs und FMT-behandelten MDSCs. Die Ergebnisse zeigten, dass FMT-behandelte MDSCs ein signifikant niedrigeres ROS-Niveau aufwiesen als Kontrollzellen (Abb. 3i, j). Anschließend verglichen wir die Veränderungen in den MDSC-Subpopulationen in den FMT-behandelten und unbehandelten Gruppen. Die Ergebnisse zeigten, dass FMT den Anteil an G-MDSCs verringerte, mit einem leichten Anstieg von M-MDSCs (Abb. 3k, l).

FMT verändert die Funktion von MDSCs in vitro. Knochenmarkabgeleitete MDSCs, 24 h mit Fahrzeug oder FMT behandelt. a–h Arg-1, S100A8, S100A9 und p47phox Genexpression aus behandelten MDSCs, gemessen durch quantitative RT-PCR. i BM-abgeleitete MDSCs wurden 24 h mit FMT inkubiert und ROS-Produktion wurde per FCM detektiert. j Quantitative Daten von i. k Subpopulationen von MDSCs in der FMT-behandelten und Kontrollgruppe. l FACS-Analyse der Prozentsätze von G-MDSCs und M-MDSCs. Alle Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente pro Experimentiergruppe und als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, bestimmt durch ungepaarten Student'schen t-Test versus Zellen, die nur mit Fahrzeug behandelt wurden.

FMT fördert die Differenzierung von MDSCs zu Makrophagen

Um zu bestimmen, ob FMT die finale Differenzierung von MDSCs zu Makrophagen stimuliert, behandelten wir Zellen mit 1000 μg/mL FMT am Tag 0 und führten Durchflusszytometrie für die makrophagen-assoziierten Marker CD11b und F4/80 an den Tagen 1, 3 und 5 durch. Die Ergebnisse zeigten, dass 1 Tag nach Zugabe von 1000 μg/mL FMT der Anteil an Makrophagen signifikant um mehr als das 2-fache im Vergleich zu unbehandelten Zellen anstieg. Ebenso waren 3 Tage und 5 Tage nach Behandlung mit FMT die Anteile an Makrophagen ebenfalls signifikant erhöht (Abb. 4a, b).

Einfluss von FMT auf die Differenzierung von MDSCs. a, b Knochenmarkabgeleitete MDSCs wurden mit oder ohne 1000 μg/mL FMT behandelt und die Anzahl der Makrophagen nach 1 Tag, 3 Tagen und 5 Tagen per FACS bestimmt. Alle Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente pro Experimentiergruppe und als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05 versus Zellen, die nur mit Fahrzeug behandelt wurden.

FMT lindert Symptome bei LPS-induzierten septischen Mäusen

Es wurde berichtet, dass Sepsis mit Gewebeschäden assoziiert ist und zu Organversagen und Endotheldysfunktion führt [17]. Um zu untersuchen, ob FMT späte Sepsis-Symptome reduziert, wurde das Ausmaß der Organschäden in den Versuchsmäusen nach 10 Tagen evaluiert. Eine histopathologische Untersuchung der Lunge bei LPS-induzierter Sepsis zeigte, dass FMT die Rekrutierung weißer Blutkörperchen und die Alveolarwandverdickung im Vergleich zu fahrzeugbehandelten Mäusen reduzierte. H&E-Färbung ergab zudem, dass der Lebernekrosebereich in FMT-behandelten Mäusen kleiner war als in fahrzeugbehandelten Mäusen (Abb. 5a, b). Zudem waren die Serumspiegel von Aspartat-Aminotransferase, als biochemischer Marker der Leberfunktionsstörung in diesen Tieren, in den Lebern von FMT-behandelten Mäusen signifikant niedriger als in der Kontrolle (Abb. 5c). FMT beeinflusste jedoch nicht die Alanin-Aminotransferase-Spiegel (Abb. 5d). Darüber hinaus wird Sepsis mit ungünstigen Outcomes wie erhöhter Produktion proinflammatorischer Zytokine assoziiert; daher bewerteten wir Veränderungen in den Spiegeln proinflammatorischer Zytokine im Serum. Der TNF-α-Spiegel im Serum war 3 h nach LPS-Injektion in FMT-behandelten Mäusen leicht, aber nicht signifikant niedriger, und es wurden keine Unterschiede in MCP-1- oder IL-1β-Spiegeln zwischen FMT-behandelten und fahrzeugbehandelten Mäusen beobachtet (Abb. 5e–g).

FMT lindert Leberschäden bei LPS-induzierten septischen Mäusen. a Mäuse erhielten entweder PBS oder eine i.p. Injektion von 5 mg/kg Körpergewicht bakteriellem LPS am Tag 0. Nach 1 h und 5 Tagen wurde FMT in einer Dosis von 10 mg/kg oder 100 µL Kochsalzlösung über die Schwanzvene verabreicht. Mäuse wurden in vier Gruppen unterteilt (n = 6): Kontrolle, Erhalt von Fahrzeug; LPS, Erhalt von nur LPS; FMT, Erhalt von nur FMT; und LPS + FMT, Erhalt von LPS und FMT. b Lungen- und Lebergewebe wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. c-d Serum-Transaminasen (ALT und AST) wurden gemessen (n = 6). Zytokin-Spiegel (TNF-α, IL-1β und MCP-1) wurden per ELISA gemessen. e-g Auswirkungen von LPS-induzierter Sepsis auf Zytokin-Produktion in fahrzeug- oder ferumoxytol-behandelten Mäusen. Zytokin-Spiegel, gemessen per ELISA im Serum von fahrzeug- oder ferumoxytol-behandelten Mäusen nach i.p. LPS-Challenge (50 mg/kg). **p < 0,01, bestimmt durch ungepaarten Student'schen t-Test.

FMT verringert die Anzahl der MDSCs in der Milz von LPS-induzierten septischen Mäusen

Zunehmende Evidenz stützt, dass sepsis-assoziierte Immunsuppression die Mortalität erhöht [18], und MDSCs gelten als Hauptbestandteil des immunsuppressiven Netzwerks [8]. Es wurde berichtet, dass G-MDSCs in septischen Patienten spezifischer expandiert sind und als Hauptakteure der sepsis-induzierten Immunsuppression erscheinen [12]. Um zu bestimmen, ob FMT MDSC-Populationen in Wildtyp-Mäusen moduliert, erhielten C57BL/6-Mäuse FMT über die Schwanzvene an Stunde 1 und Tag 5. Die Ergebnisse zeigten, dass keine signifikanten Unterschiede im Prozentsatz der MDSCs in Milz oder Knochenmark zwischen Kontroll- und FMT-behandelten Mäusen detektiert wurden (Abb. 6a, e). Bemerkenswert: FMT verringerte die LPS-abhängige Expansion von CD11b⁺Gr-1⁺-Zellen sowohl im Knochenmark als auch in der Milz (Abb. 6a, e), was mit In-vitro-Studien konsistent ist. Zudem verringerte FMT auch den Prozentsatz von G-MDSCs und M-MDSCs in der Milz, während nur der Prozentsatz von G-MDSCs im Knochenmark verringert wurde (Abb. 6c, g). Diese Daten deuten darauf hin, dass FMT die Anzahl der MDSCs in der Milz von LPS-induzierten septischen Mäusen verringert.

FMT verringert die Anzahl der MDSCs bei LPS-induzierten septischen Mäusen. Mäuse wurden in vier Gruppen unterteilt (n = 6): Kontrolle, Erhalt von Fahrzeug; LPS, Erhalt von nur LPS; FMT, Erhalt von nur FMT; und LPS + FMT, Erhalt von LPS und FMT. a CD11b⁺Gr-1⁺-Zellpopulationen im Knochenmark wurden per FACS detektiert. b Quantitative Daten von a. c Durchflusszytometrie-Punktdiagramm der Ly6C- und Ly6G-Expression in den gated CD11b⁺-Zellen aus Milzen. d Quantifizierung der Prozentsätze der granulozytären und monozytären Subsets. e CD11b⁺Gr-1⁺-Zellpopulationen in den Milzen wurden per FCM detektiert. f Quantitative Daten von e. g Durchflusszytometrie-Punktdiagramm der Ly6C- und Ly6G-Expression in den gated CD11b⁺-Zellen aus Milzen. h Quantifizierung der Prozentsätze der granulozytären und monozytären Subsets. *p < 0,05, bestimmt durch ungepaarten Student'schen t-Test.

FMT reduziert die T-Zell-immunsuppressiven Eigenschaften von MDSCs in vivo

Die numerische Reduktion mehrerer Immunzellpopulationen, einschließlich CD4- und CD8-T-Zellen, ist ein Hauptmerkmal der adaptiven Immunantwort nach Sepsis. Sie ist mit einem erhöhten Todesrisiko sowie anderen schlechten Outcomes assoziiert [19, 20]. Es wurde gezeigt, dass MDSCs die T-Zell-Proliferation durch Beeinträchtigung der T-Zell-Zeta-Ketten-Expression bei Sepsis-Patienten unterdrücken [21]. Um den Anteil an Lymphozyten im späten Sepsis-Stadium zu bewerten, maßen wir den Anteil an CD4- und CD8-T-Zellen in einem murinen Sepsis-Modell. Die Ergebnisse zeigten, dass FMT eine Zunahme von CD4- und CD8-T-Zellen in den Milzen der LPS-induzierten Mäuse bewirkte (Abb. 7a, b). Es gab keine Unterschiede in den Prozentsätzen von CD4- und CD8-T-Zellen in der Milz von FMT-behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen (Abb. 7a, b). Um die Rolle von MDSCs bei der Suppression der T-Zell-Proliferation in vivo weiter zu bestätigen, wurden G-MDSCs und M-MDSCs aus den Milzen von fahrzeug- oder FMT-behandelten LPS-geforderten Mäusen per MACS isoliert und im 1:1-Verhältnis mit CD3 T-Zellen ko-kultiviert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass FMT-Behandlung die T-Zell-immunsuppressiven Funktionen sowohl von G-MDSCs als auch von M-MDSCs reduzierte (Abb. 7e, f). Darüber hinaus maßen wir auch die Expressionsniveaus von Arg-1 und p47phox in MDSCs, isoliert aus den Milzen der Mäuse. Erwartungsgemäß war die Genexpression von Arg-1 und p47phox in splenischen CD11b⁺Gr-1⁺-Zellen, isoliert von FMT-behandelten LPS-geforderten Mäusen, signifikant reduziert im Vergleich zu LPS-geforderten Mäusen (Abb. 7g, h). Diese Daten deuten darauf hin, dass FMT die immunsuppressiven Funktionen von MDSCs durch Verringerung von Arg-1 und ROS-Produktion verringert, was darauf hindeutet, dass FMT die langfristige Immunsuppression in der späten Sepsis reduzieren kann.

FMT reduziert die immunsuppressiven Eigenschaften von MDSCs. a CD3⁺CD4⁺-Zellpopulationen in Milzen wurden per FACS detektiert. b Quantitative Daten von a. c CD3⁺CD8⁺-Zellpopulationen in Milzen wurden per FACS detektiert. d Quantitative Daten von a. e Fähigkeit von G-MDSCs aus Mäusen, die T-Zell-Proliferation induziert durch anti-CD3/CD28-Stimulation zu unterdrücken, wurde per FACS gemessen (n = 3 pro Gruppe). Ein repräsentatives Histogramm ist gezeigt. f Fähigkeit von M-MDSCs aus fahrzeug- oder FMT-behandelten LPS-geforderten Mäusen, die T-Zell-Proliferation induziert durch anti-CD3/CD28-Stimulation zu unterdrücken, wurde per FACS gemessen (n = 3 pro Gruppe). Ein repräsentatives Histogramm ist gezeigt. g, h Arg-1 und p47phox mRNA-Expression in MDSCs aus fahrzeug- oder FMT-behandelten LPS-geforderten Mäusen.

Diskussion

Das von der FDA zugelassene Eisenpräparat FMT wurde weit verbreitet als Drug-Carrier und Kontrastmittel in der MRT-Untersuchung eingesetzt. Es wurde festgestellt, dass FMT das Krebswachstum durch Induktion einer proinflammatorischen Immunantwort mit M1-Makrophagen-Polarisation inhibiert [3], was darauf hindeutet, dass FMT immunmodulatorische Funktionen hat. In dieser Studie bewerteten wir den Effekt von FMT auf MDSCs, indem wir den Phänotyp und die Funktion von FMT-behandelten MDSCs mit Kontroll-unbehandelten MDSCs verglichen. Frühere Studien zeigten, dass MDSCs magnetische Nanopartikel aufnehmen können [10], und unsere Daten demonstrierten weiter, dass FMT die immunsuppressiven Funktionen von MDSCs in der Milz durch Herunterregulierung von Arg-1 und ROS abschwächt. Unsere Daten wiesen auch darauf hin, dass FMT einen direkten Effekt auf die MDSC-Differenzierung hat, wobei etwa ein Fünftel der Zellen nach 5 Tagen in In-vitro-Experimenten gleichmäßig in Makrophagen differenzierte. Obwohl wir den Phänotyp von Makrophagen, die FMT ausgesetzt waren, nicht untersuchten, vermuteten wir, dass sie den proinflammatorischen M1-Subtyp aufwiesen. Die Ergebnisse demonstrierten klar, dass FMT die Differenzierung und Reifung von MDSCs verbessert, und deuten darauf hin, dass dies der beobachteten Reduktion der MDSC-Population während der späten Sepsis zugrunde liegt.

Sepsis initiiert eine komplexe Immunantwort, die sich im Zeitverlauf ändert und sowohl proinflammatorische als auch antiinflammatorische Antworten begleitet. Frühere Studien zeigten, dass der Tod in den frühen Stadien der Sepsis auf übermäßige Entzündung zurückzuführen ist. Derive und Kollegen berichteten, dass der adoptive Transfer von Tag-10-MDSCs in septische Mäuse die peritoneale Zytokin-Produktion abschwächte und die Überlebensrate verbesserte [22]. Kürzlich beobachteten Namkoog et al., dass Clarithromycin-Vorbehandlung das Überleben in einem Mausmodell des LPS-induzierten Schocks durch Expansion der CD11b⁺Gr-1⁺-Zellpopulation verbesserte [23]. Sie beschrieben, dass MDSCs eine schützende Rolle in der Sepsis spielen, jedoch sollte beachtet werden, dass sie sich auf die frühen Stadien der Sepsis bezogen. Die meisten Sepsis-Patienten zeigen rasche Anzeichen tiefer Immunsuppression, und Todesfälle in dieser Phase sind typischerweise auf den Erwerb einer sekundären, im Krankenhaus erworbenen Infektion zurückzuführen, oft mit opportunistischen Erregern [24]. Übermäßige MDSC-Proliferation kann ein physiologisches Syndrom persistierender Immunsuppression begünstigen, was zu schlechten Outcomes führt [25]. McClure et al. berichteten, dass sie keine schützenden Effekte vom MDSC-Transfer beobachteten, sobald die Mäuse den späten immunsuppressiven Zustand erreicht hatten [26]. Sie hatten zuvor gezeigt, dass MDSCs massiv im Knochenmark, in der Milz und in Lymphknoten von Mäusen mit anhaltenden septischen Prozessen expandieren und zur sepsis-induzierten T-Zell-Suppression beitragen [11]. Zusätzlich berichtete Uhel, dass M-MDSCs und G-MDSCs stark zur T-Zell-Dysfunktion bei Sepsis-Patienten beitragen [12]. Unsere Daten demonstrierten, dass FMT den Prozentsatz der MDSCs signifikant verringerte und die Funktionen von MDSCs abschwächte, um die Anzahl der T-Zellen in Mäusen während der späten Sepsis wiederherzustellen. Daher ist es bei der Untersuchung der Rolle von MDSCs in der Sepsis entscheidend, die frühen und späten Stadien der Sepsis klar zu unterscheiden.

Mohus et al. schlugen vor, dass Eisenmangel mit erhöhtem Risiko für zukünftige Blutstrominfektionen, die Sepsis verursachen, assoziiert war, was darauf hindeutet, dass Immunabwehrmechanismen im Vergleich zur bakteriellen Eisen-Sequestrierung in eisenarmen Umgebungen depressiv sein könnten [27]. Kontroversen in Eisen-Supplementierungsstudien zeigten, dass intravenöse Eisen-Therapie mit erhöhtem Infektionsrisiko assoziiert war [28]. Es sollte beachtet werden, dass Eisenpräparate sich erheblich in ihren physikochemischen Eigenschaften unterscheiden, was ihnen unterschiedliche biologische Eigenschaften verleiht [29]. Bei FMT ist ein Eisenkern in eine Kohlenhydrathülle eingehüllt, was zu niedriger Toxizität, lysosomaler Aufnahme und Abbau führt [30, 31]. Es wurde berichtet, dass FMT keine Lebertoxizität bei Patienten oder Tiermodellen verursacht und typischerweise innerhalb von 2 Monaten metabolisiert wird [32]. Unsere Daten zeigten, dass FMT die Produktion proinflammatorischer Zytokine in der frühen Sepsis nicht erhöht, was darauf hindeutet, dass FMT in der Sepsis verabreicht werden kann.

Fazit

Diese Studie demonstrierte eine neuartige immunmodulatorische Eigenschaft von FMT; jedoch sind weitere Studien erforderlich, um den Mechanismus der FMT-Unterdrückung von MDSCs zu elucidieren. Darüber hinaus bieten wir einen attraktiven therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Sepsis-assoziierter Immunsuppression, und die Targetierung von MDSCs könnte eine vielversprechende neue Option zur Wiederherstellung der Immunantwort während der Sepsis darstellen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf angemessene Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

ALT:

Alanin-Aminotransferase

Arg1:

Arginase 1

AST:

Aspartat-Aminotransferase

FMT:

Ferumoxytol

G-MDSCs/PMN-MDSCs:

Polymorphonukleäre MDSCs/granulozytäre MDSCs

HE:

Hämatoxylin-Eosin

IL-1β:

Interleukin-1β

iNOS:

Induzierbare Stickoxid-Synthase

LPS:

Lipopolysaccharid

MCP 1:

Monozyten-Chemotaktisches Protein 1

MDSC:

Myeloide supprimierende Zelle

MHC II:

Major Histokompatibilitätskomplex

M-MDSCs:

Monozytäre MDSCs

PBS:

Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

TLR:

Toll-ähnlicher Rezeptor

TNF-α:

Tumor-Nekrose-Faktor α