Ein neuartiger Mechanismus, der der seitlichen Wurzelbildung von Tomaten durch mehrwandige Kohlenstoff-Nanoröhren zugrunde liegt:die Beteiligung von Stickoxid

Einführung

Es gibt viele biologische und biomedizinische Anwendungen von Kohlenstoffnanoröhren [1, 2]. Aufgrund der einzigartigen Fähigkeit, Zellmembranen leicht zu durchdringen, ist die Biosicherheit von Kohlenstoffnanoröhren immer ein Diskussionsthema [3, 4]. Da die Produktion und Verwendung von Kohlenstoffnanoröhrchen schnell wächst, wird es wichtig, die detaillierten Mechanismen ihrer Zytotoxizität bei Menschen und Säugetieren und neuerdings auch bei Pflanzen zu charakterisieren [3,4,5,6,7,8,9]. Es ist bekannt, dass Pflanzen und ihre Lebensgemeinschaften eine große Bedeutung für Mensch und Umwelt haben und auch durch die Anreicherung in Böden durch die Anwendung von biofestem Dünger der Gefahr einer Exposition gegenüber Kohlenstoffnanoröhren ausgesetzt sind [6, 10, 11]. Als wichtige Mitglieder von Kohlenstoffnanoröhren wurde die Toxizität von mehrwandigen Kohlenstoffnanoröhren (MWCNTs), die aus mehreren gewalzten Graphenschichten bestehen, umfassend untersucht. Studien an Säugetieren zeigten, dass die Exposition sowohl mit MWCNTs als auch mit einwandigen Kohlenstoffnanoröhren oxidative Schäden und NF-κB-Aktivierung in menschlichen Keratinozyten und A549-Zellen induzierte [9, 12]. MWCNTs und einwandige Kohlenstoffnanoröhren können mit der Plasmamembran fusionieren und so Zellschäden durch Lipidperoxidation und oxidativen Stress verursachen [9, 11, 13, 14]. In menschlichen Endothelzellen der Nabelvene wurden Zytotoxizität und oxidativer Stress, ausgelöst durch MWCNTs, sowie mäßige Entzündungsreaktionen beobachtet [15]. Frühere Studien legten nahe, dass die primäre Toxizität von MWCNTs in rotem Spinat hauptsächlich auf eine Überproduktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zurückzuführen ist und die toxischen Wirkungen durch die ergänzte Ascorbinsäure rückgängig gemacht werden könnten [7]. In diesem Sinne gelten MWCNTs als neuer Stressfaktor für Organismen, sei es bei Tieren oder Pflanzen.

Die seitliche Wurzelbildung (LR), eine wichtige Determinante der Wurzelarchitektur, wurde als Indikator für die adaptive Reaktion auf verschiedene Belastungen angesehen [16]. In höheren Pflanzen wird die Bildung von LR durch Phytohormone und eine Vielzahl von Umweltreizen beeinflusst, einschließlich Wasserverfügbarkeit, Nährstoffe und abiotischer Stress, wie Hypoxie und Schwermetallstress [17,18,19]. Inzwischen haben zahlreiche Beweise bestätigt, dass die Bildung von LR nicht nur als physikalische Unterstützung fungiert, sondern auch zur Wasser- und Nährstoffaufnahme für das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung beiträgt [19,20,21]. Verschiedene Umwelthinweise könnten mehrere spezifische Phänotypen der stressinduzierten morphogenen Reaktion (SIMR) auslösen, einschließlich der Förderung der LR-Bildung und einer Hemmung der Wurzelverlängerung [17]. Die Regulation der LR-Bildung wird auch durch Phytohormone wie Auxin, und die Aktivierung von regulatorischen Genen des Zellzyklus als Reaktion auf Auxin wurde vorgeschlagen [19, 22]. Inzwischen wurde die Beteiligung einiger kleiner Moleküle an der durch Auxin ausgelösten Wurzelorganogenese in Gurken-, Tomaten-, Sojabohnen- und Rapspflanzen bestätigt [23,24,25,26,27]. Zu diesen kleinen Molekülen gehört Wasserstoffperoxid (H₂ O₂ ), Stickoxid (NO), Kohlenmonoxid (CO) und Wasserstoffgas (H₂ .) ).

Unter diesen hat NO, ein Gas mit freien Radikalen, mehrere physiologische Funktionen in Pflanzen gezeigt [28, 29]. Neben der Verbesserung der Pflanzenadaptation gegen Stress gehören zu den Funktionen von NO die Förderung der Wurzelhaarentwicklung, Adventivwurzelung und Seitenwurzelbildung [30,31,32,33], obwohl die enzymatische(n) Ressource(n) der NO-Biosynthese in diesen oben genannten Prozesse bleibt schwer fassbar. Bei Tieren wird die Synthese von NO aus L-Arginin durch das hämhaltige Enzym Stickoxid-Synthase (NOS) katalysiert [34]. Obwohl für NOS-Enzyme kodierende Gene nicht in Pflanzen identifiziert wurden, wird die NOS-ähnliche Aktivität von Säugetieren weithin nachgewiesen [35, 36] und die Inhibitoren der NOS von Säugetieren, wie N ^G -Nitro-l-arginin-methylester-hydrochlorid (l-NAME), kann die NO-Bildung in Pflanzen hemmen [25, 33, 36, 37, 38, 39]. Wichtig ist, dass zahlreiche genetische Beweise zeigten, dass NO durch Nitratreduktase (NR) produziert werden kann, ein bekanntes Enzym, das für den Stickstoffmetabolismus in Pflanzen verantwortlich ist [28]. Die Beteiligung der NR-vermittelten NO-Produktion am Stomaverschluss und an der Kälteakklimatisierung wurde genetisch nachgewiesen [37, 38]. Unsere vorherige Studie zeigte, dass die NR-abhängige NO-Synthese an der durch Auxin induzierten Wasserstoffgas-vermittelten Seitenwurzelbildung beteiligt ist [39].

Bisher wurden bei verschiedenen Pflanzenarten unterschiedliche Reaktionen bei der Bildung, Förderung oder Hemmung von LR berichtet, wenn sie mit Nanomaterialien ergänzt wurden, darunter MWCNTs [40,41,42,43], Goldnanopartikel (Au NP, [44]), Zinkoxid Nanopartikel (ZnO NP [45, 46];), Titandioxid-Nanopartikel (TiO₂ NP [46];) und Graphenoxid (GO [47,48,49];) (Tabelle 1), und noch keine Studie hat einen definitiven Beweis für eine Rolle von NO bei den obigen Reaktionen erbracht. In dieser Studie zeigte der Nachweis von endogenem NO durch die Greiss-Reagenzmethode, konfokale Laserscanning-Mikroskopie (LSCM) und elektronenparamagnetische Resonanz (EPR)-Analysen, dass der NO-Spiegel in MWCNT-behandelten Tomatensämlingen erhöht war. Danach wurde die LR-Bildung beobachtet. Wir untersuchen weiterhin die Beteiligung von NO an der durch MWCNTs ausgelösten LR-Bildung, indem wir die endogenen NO-Spiegel mit NO-Fängern und Antagonisten manipulieren, die die NR- und säugerähnliche NOS-Aktivität hemmen. Weitere Experimente zeigten, dass NR-abhängiges NO zumindest teilweise essentiell für die LR-Bildung als Reaktion auf MWCNTs sein könnte. Diese Arbeit öffnet somit ein neues Fenster zum Verständnis der biologischen Wirkungen von Nanomaterialien in Pflanzen.

Materialien und Methoden

Chemikalien

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle anderen Chemikalien von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. MWCNTs, bezogen von Sigma-Aldrich, wurden wie zuvor beschrieben charakterisiert [50]. Der Außendurchmesser, der Zwischendurchmesser und die Länge der MWCNTs betrugen 6–12 nm, 2,5–5 nm bzw. 1–9 μm. Nach der Ultraschallbehandlung wurde die erhaltene kolloidale Homogenatsuspension sterilisiert und verwendet.

Andere Kohlenstoffnanopartikel wurden von Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd. bezogen, einschließlich einwandiger Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs, XFS22; Reinheit> 95%, Durchmesser 1–2 nm, Länge 5–30 μm, spezielle Oberfläche> 1075 m ² /g), Graphen (XF001W; Reinheit ~ 99%, Durchmesser 0.5–5 μm, Dicke ~ 0.8 nm, Einzelschichtverhältnis ~ 80%, BET-Oberfläche 500~1000 m ² /g; spezifischer elektrischer Widerstand ≦ 0.30 Ω.cm) und Aktivkohle (AC, XFP06; Reinheit> 95%, Partikelgröße 5 ± 1 μm, Porenvolumen 1–1.2 cm ³ /g, Apertur 2,0–2,2 nm, spezielle Oberfläche ~ 1500–1700 m ² /g).

Darüber hinaus wurde Natriumnitroprussid (SNP) als NO-freisetzende Verbindung verwendet [30,31,32,33]. 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid-Kaliumsalz (cPTIO) wurde als NO-Fänger angesehen [51,52,53,54]. Wolframat (Tg; ein Inhibitor von NR [28, 33, 37, 55,56,57];) und N ^G -Nitro-L-Arginin-Methylester-Hydrochlorid (NAME; ein Inhibitor des NOS-ähnlichen Enzyms bei Säugetieren [25, 33, 36, 37, 38, 39];) wurden ebenfalls angewendet. In dieser Studie wurden die Konzentrationen der oben genannten Chemikalien in den Pilotversuchen bestimmt, aus denen die signifikanten Reaktionen beobachtet wurden.

Pflanzenmaterial und Wachstumsbedingungen und Bestimmung der LR-Bildung

Tomate (Solanum lycopersicum L.) Saatgut „Jiangshu 14“ wurde freundlicherweise von den Jiangsu Agricultural Institutes, Nanjing, Provinz Jiangsu, China, zur Verfügung gestellt. Ausgewählte Samen gleicher Größe wurden in destilliertem Wasser bei 25 ± 1 °C im Dunkeln für 3 Tage zum Keimen gebracht. Die ausgewählten identischen Sämlinge mit Keimwurzeln von 2–3 mm wurden dann in 6 ml Behandlungslösungen überführt, die die angegebenen Konzentrationen an MWCNTs, 200 nm 1-Naphthylessigsäure (NAA; ein bekanntes Auxin), 0,1 mm SNP, 0,2 mm cPTIO, 20 °C enthielten μM Wolframat (Tg), 0,2 µM NAME und andere Kohlenstoff-Nanopartikel, einschließlich 5 µM/ml einwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen (SWCNTs), Graphen und Aktivkohle (AC), allein oder in Kombination für die angegebenen Zeitpunkte. Sämlinge wurden in einem Beleuchtungsbrutschrank (25 ± 1 °C) mit einer Lichtintensität von 200 μmol m ⁻² . gezüchtet s ⁻¹ bei 14/10 h (hell/dunkel) Photoperiode.

Nach den Behandlungen wurden Bilder aufgenommen und die Anzahl und Länge der ausgetretenen Seitenwurzeln (> 1 mm) pro Sämling wurden dann unter Verwendung der Image J-Software (http://rsb.info.nih.gov/ij/) bestimmt [39 , 58]. Wie zuvor beschrieben, wurden für die anschließende Analyse nur die seitlichen Wurzel-induzierbaren Segmente verwendet.

Bildgebung der MWCNT-Verteilung durch Transmissionselektronenmikroskopie

Die Verteilung von MWCNTs in der Wurzel von Tomatensämlingen wurde unter Verwendung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; JEOL, JEM-200CX, Tokio, Japan) charakterisiert. Die Probenvorbereitung für die TEM-Analyse erfolgte nach dem vorherigen Protokoll [59].

Bildgebung von endogenem NO durch konfokales Laserscanning-Mikroskop

Die NO-Bildgebung wurde unter Verwendung einer ziemlich spezifischen NO-Fluoreszenzsonde 4-Amino-5-methylamino-2',7'-difluorfluoresceindiacetat (DAF-FM DA) durchgeführt. Nach gründlichem Waschen der Sonde wurden die Bilder mit dem konfokalen Mikroskop Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland, Anregung bei 488 nm, Emission bei 500–530 nm für die NO-Analyse) aufgenommen. In unserem Experiment wurden pro Behandlung 20 Einzelproben zufällig ausgewählt und vermessen. Fotos sind repräsentativ für identische Ergebnisse.

KEIN Inhalt durch Griess-Reagenztest bestimmt

Nach den zuvor beschriebenen Methoden [50] wurde der NO-Gehalt mit dem Griess-Reagenz-Assay bestimmt. Wichtig ist, dass zur Vermeidung der durch die konzentrierten Nitrat- und Nitritgehalte in Pflanzen verursachten Störungen die identischen Proben, die in 200 µM cPTIO (dem NO-Fänger) für 30 Minuten vorinkubiert wurden, als Blindproben angesehen wurden. Nach Zugabe von Griess-Reagenz für 30 Minuten wurde die Absorption bei 540 nm aufgezeichnet und der NO-Gehalt durch Vergleich mit einer Standardkurve von NaNO₂ . bestimmt .

Bestimmung von NO mit paramagnetischer Elektronenresonanz (EPR)

Nach unseren bisherigen Methoden [39, 55, 60] wurde die Bestimmung des NO-Gehalts mittels Elektronen-Paramagnetischer Resonanz (EPR) durchgeführt. Die organische Lösungsmittelschicht wurde verwendet, um NO auf einem Bruker A300-Spektrometer (Bruker Instrument, Karlsruhe, Deutschland) unter den folgenden Bedingungen zu bestimmen:Raumtemperatur; Mikrowellenfrequenz, 9,85 GHz; Mikrowellenleistung, 63,49  mW; und Modulationsfrequenz, 100,00 kHz.

Bestimmung der Nitratreduktase (NR)-Aktivität

Die NR-Aktivität wurde spektrophotometrisch bei 540 nm nach der vorherigen Methode nachgewiesen [57]. Das produzierte Nitrit wurde spektrophotometrisch bei 540 nm durch Zugabe von 1 ml 1% (Gew./Vol.) Sulfenilamid in 3 M HCl zusammen mit 1 ml 0,02% (Vol./Vol.) n-(1-Naphthyl)-Ethylendiamin bestimmt.

Statistische Analyse

Wo angegeben, wurden die Ergebnisse als Mittelwerte  ± SE von drei unabhängigen Experimenten mit jeweils drei biologischen Replikaten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit der Software SPSS Statistics 17.0 durchgeführt. Für die statistische Analyse ist Duncans multipler Test (p < 0.05) wurde entsprechend gewählt.

Ergebnisse

MWCNTs dringen nicht nur in Wurzelzellen ein, sondern fördern auch die LR-Bildung

Die LR-Bildung ist eine wichtige Determinante der Root-Systemarchitektur. Um die Wirkung von MWCNTs auf die LR-Bildung zu untersuchen, wurden 3 Tage alte Tomatensetzlinge mit einer Reihe von Konzentrationen von MWCNTs (0,05, 0,5, 5 und 50 mg/ml) 3 Tage lang inkubiert. Als Positivkontrolle galt die Applikation von 1-Naphthylessigsäure (NAA). In unserem Experiment wurden sowohl die LR-Zahl als auch die Länge als zwei Parameter der LR-Bildung bestimmt. Wie in Fig. 1 gezeigt, induzierten exogene MWCNTs im Vergleich zu den Kontrollproben signifikant die LR-Bildung auf ungefähr dosisabhängige Weise mit einer maximalen Wirkung bei 5 und 50 &mgr;mg/ml. Eine ähnliche induzierbare Reaktion wurde beobachtet, wenn 200 &mgr;nM NAA verabreicht wurde. In Anbetracht der Kosten von MWCNTs und der induzierbaren Reaktion bei der LR-Bildung wurden 5 mg/ml MWCNTs in den folgenden Experimenten verwendet.

Die MWCNT-induzierte Tomaten-LR-Bildung war ungefähr dosisabhängig. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit 200 &mgr;nM NAA bzw. den angegebenen Konzentrationen an MWCNTs behandelt. Die Anzahl und Länge der ausgetretenen Seitenwurzeln (> 1 mm) pro Sämling wurden dann nach 3 Tagen Behandlung bestimmt. Es gab 30 (10 × 3) Pflanzen in drei biologischen Replikaten und die Experimente wurden dreimal durchgeführt. Daten sind die Mittel ± SE. Innerhalb jeder Versuchsreihe unterschieden sich die mit demselben Buchstaben bezeichneten Balken bei p . nicht signifikant < 0,05 Level gemäß Duncans multiplem Test

Um die spezifische Funktion von MWCNTs bei der Induktion der LR-Bildung zu validieren, untersuchen wir weiter, ob die anderen Allotropien von MWCNTs ebenfalls solche induzierbaren Effekte haben. Wie in Abb. 2a gezeigt, zeigten alle diese Kohlenstoff-Nanomaterialien toxische Wirkungen auf das Sprosswachstum (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise könnte die Anwendung von MWCNTs, einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs), Graphen und Aktivkohle mit identischer Konzentration (5 mg/ml) unterschiedlich zu einer Zunahme der LR-Zahl und -Länge im Vergleich zu den chemikalienfreien Kontrollpflanzen führen (Abb. 2b). Unter diesen Chemikalien wurde die maximal induzierbare Reaktion in mit MWCNT inkubierten Tomatensämlingen entdeckt.

Veränderungen der Seitenwurzelbildung als Reaktion auf verschiedene Kohlenstoff-Nanopartikel. Drei Tage alte Tomatensetzlinge wurden mit destilliertem Wasser (Con), 5 mg/ml MWCNT, einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs), Graphen bzw. Aktivkohle (AC) weitere 3 Tage behandelt. a Anschließend wurden repräsentative Fotos gemacht. b Die Anzahl und Länge der ausgetretenen Seitenwurzeln (> 1 mm) pro Sämling wurden dann ebenfalls bestimmt. Maßstabsbalken = 50 mm. Es gab 30 (10 × 3) Pflanzen in drei biologischen Replikaten und die Experimente wurden dreimal durchgeführt. Daten sind die Mittel ± SE. Innerhalb jeder Versuchsreihe unterschieden sich die mit demselben Buchstaben bezeichneten Balken bei p . nicht signifikant < 0,05 Level gemäß Duncans multiplem Test

Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) lässt sich die Verteilung von MWCNTs leicht auswerten. Die in 3 gezeigten Ergebnisse zeigten, dass MWCNTs bei exogener Anwendung von Tomatensämlingen absorbiert werden konnten, und es wurde gefunden, dass die MWCNTs in Wurzelzellen verteilt sind. Dieses Ergebnis ist nachvollziehbar, da Keimlingswurzeln direkt in flüssiger Lösung mit MWCNTs kultiviert werden.

Verteilung von MWCNTs in Tomatenwurzeln. TEM-Bilder von 3 Tage alten Tomatensetzlingen, die mit destilliertem Wasser behandelt wurden (Con; a ) oder 5 mg/ml MWCNTs (b ) für 1 Tag wurden genommen. Roter Pfeil zeigt Zellwand an, während weißer Pfeil MWCNTs anzeigt

MWCNT-induzierte NO-Synthese und danach LR-Bildung waren empfindlich gegenüber cPTIO, einem Fänger von NO

Um zu untersuchen, ob NO auch an der MWCNT-induzierten LR-Bildung beteiligt ist, wurde die Funktion von NO bei der durch MWCNTs ausgelösten LR-Bildung durch Manipulation endogener NO-Spiegel mit NO-freisetzender Verbindung und dem Scavenger bewertet. Ähnlich wie bei den vorherigen Ergebnissen [31] konnte die Verabreichung von Natriumnitroprussid (SNP) zur Induktion der LR-Bildung führen, und es wurde eine additive Reaktion beobachtet, wenn SNP und MWCNTs zusammen verabreicht wurden (Abb. 4). Bei Zugabe von 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid-Kaliumsalz (cPTIO; ein Fänger von NO) waren die durch MWCNTs verursachten Förderungsreaktionen bei der LR-Bildung signifikant beeinträchtigte. Allein cPTIO könnte die LR-Entwicklung im Vergleich zur chemikalienfreien Kontrolle hemmen, was auf die wichtige Rolle von endogenem NO bei der Wurzelorganogenese hinweist.

Die MWCNT-induzierte LR-Bildung reagierte empfindlich auf die Entfernung von endogenem NO mit cPTIO, seinem Radikalfänger. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit destilliertem Wasser, 5 mg/ml MWCNT, 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, allein oder in Kombination für 3 Tage behandelt. Anschließend wurden Anzahl und Länge der ausgetretenen Seitenwurzeln (> 1 mm) pro Sämling bestimmt. Es gab 30 (10 × 3) Pflanzen in drei biologischen Replikaten und die Experimente wurden dreimal durchgeführt. Daten sind die Mittel ± SE. Innerhalb jeder Versuchsreihe unterschieden sich die mit demselben Buchstaben bezeichneten Balken bei p . nicht signifikant < 0,05 Level gemäß Duncans multiplem Test

Um die wichtige Rolle von endogenem NO bei der MWCNT-Reaktion weiter zu bewerten, wurde zunächst ein zeitlicher Verlauf der NO-Produktion in vivo mit der Greiss-Reagenzmethode nachgewiesen. Während der obigen Bestimmung wurde das identische Filtrat, das mit cPTIO vorbehandelt wurde, als Blindwert für die genauen Ergebnisse angesehen. Es wurde beobachtet, dass die NO-Produktion in den Wurzeln von Tomatensämlingen bis 24 h nach der MWCNT-Behandlung dramatisch angestiegen war und sich dann auf die anfänglichen Werte erholte (48 h; Fig. 5a). Über dem maximalen Niveau von endogenem NO, das 24 Stunden lang durch MWCNTs ausgelöst wurde, wurde offensichtlich von cPTIO, einem Fänger von NO, abgeschafft, was auf die spezifische Rolle von NO hinweist.

Die MWCNT-induzierte NO-Produktion wurde durch cPTIO, den Fänger von NO, blockiert. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit destilliertem Wasser und 5 µg/ml MWCNTs mit oder ohne 0,2 µM cPTIO behandelt. a Änderungen der NR-Aktivität (links) und der NO-Produktion (rechts), bestimmt mit der Greiss-Reagenzmethode. b Nach 24 h Behandlung wurde das NO-Signal mit LSCM (links) und EPR (rechts) analysiert. Maßstabsbalken = 0,1 mm. Daten sind die Mittel ± SE. Balken mit demselben Buchstaben unterschieden sich bei p . nicht signifikant < 0,05 Level gemäß Ducans multiplem Test

Um die obigen Ergebnisse zu bestätigen, wurden sowohl LSCM als auch ESR übernommen. Zunächst wurden die Veränderungen der endogenen NO-Spiegel in Keimlingswurzeln von Tomaten durch Markierung von NO unter Verwendung der zelldurchlässigen, ziemlich NO-spezifischen Fluoreszenzsonde DAF-FM DA und Bildgebung mit LSCM überwacht. Ähnlich wie bei den vorherigen Ergebnissen (Abb. 5a) wurde in Gegenwart von cPTIO die durch MWCNTs ausgelöste erhöhte DAF-FM-abhängige Fluoreszenzintensität stark aufgehoben (Abb. 5b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DAF-FM-getriggerte Fluoreszenz mit den endogenen NO-Spiegeln in den Wurzeln von Tomatensämlingen zusammenhängt.

Die MWCNT-induzierte NO-Produktion wurde durch EPR-Spektroskopie bestätigt. Wie erwartet zeigten Keimlingswurzeln, die 24 Stunden lang mit MWCNTs behandelt wurden, das typische Hyperfeinstrukturtriplett des NO-Komplexes. Die Zugabe von cPTIO beseitigte jedoch das obige Signal, was darauf hindeutet, dass die MWCNT-Exposition zu einer starken NO-Produktion führte (Fig. 5b). Zusammenfassend legten diese Daten nahe, dass eine NO-Synthese für die MWCNT-getriggerte LR-Bildung in Tomatensämlingen erforderlich sein könnte.

NR könnte für die MWCNT-induzierte NO-Produktion und die anschließende LR-Bildung verantwortlich sein

Da NR und Säuger-ähnliche NOS zwei Hauptenzyme sind, die mit der NO-Synthese in Pflanzen in Verbindung stehen, wurden im nachfolgenden Experiment sowohl Wolframat (ein NR-Inhibitor) als auch NAME (ein Säuger-NOS-Inhibitor) verwendet. Hier unterdrückte die Wolframatbehandlung die Förderung der LR-Bildung in MWCNT-behandelten Tomatensämlingswurzeln im Wesentlichen (Abb. 6). Im Vergleich dazu wurde die durch MWCNTs ausgelöste Induktion der LR-Bildung durch die Zugabe von NAME nicht stark gehemmt, was darauf hindeutet, dass Säuger-ähnliche NOS möglicherweise nicht das synthetische Zielenzym von NO ist, das für die von MWCNTs ausgelöste NO-Produktion verantwortlich ist. Es wurde auch beobachtet, dass bei Tomatensämlingen eine leichte, aber keine signifikante Abnahme der LR-Bildung beobachtet wurde, wenn entweder Wolframat oder NAME separat aufgetragen wurden.

Veränderungen der LR-Bildung als Reaktion auf MWCNTs und zwei Inhibitoren der NO-Synthese. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit 5 µg/ml MWCNT, 20 µM Wolframat (Tg), 0,2 µM NAME allein oder in Kombination für 3 Tage behandelt. Anschließend wurden Anzahl und Länge der ausgetretenen Seitenwurzeln (> 1 mm) pro Sämling bestimmt. Es gab 30 (10 × 3) Pflanzen in drei biologischen Replikaten und die Experimente wurden dreimal durchgeführt. Daten sind die Mittel ± SE. Innerhalb jeder Versuchsreihe unterschieden sich die mit demselben Buchstaben bezeichneten Balken bei p . nicht signifikant < 0,05 Level gemäß Duncans multiplem Test

Die Rolle von NR bei der MWCNT-getriggerten LR-Bildung wurde weiter untersucht, indem die NO-Produktion als Reaktion auf applizierte MWCNTs mit oder ohne Wolframat überwacht wurde. Im Vergleich zu den Veränderungen der endogenen NO-Produktion (Fig. 5a) zeigte die Zeitverlaufsanalyse der NR-Aktivität eine ähnliche Tendenz (Fig. 7a), die ebenfalls 24 h nach Behandlung mit MWCNTs ihren Höhepunkt erreichte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der MWCNT-induzierte Anstieg der NO-Produktion hauptsächlich aus einer erhöhten Aktivität von NR resultieren kann. Konsequenterweise wurde die Hemmung der NR-abhängigen NO-Produktion durch Wolframat mit der Greiss-Reagenzmethode (Abb. 7b), LSCM und EPR (Zusatzdatei 1:Abbildung S1) bestätigt.

Die MWCNT-induzierte NO-Produktion wurde durch Wolframat, einen Inhibitor von NR, blockiert. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit destilliertem Wasser und 5 µg/ml MWCNTs mit oder ohne 20 µM Wolframat (Tg) behandelt. Änderungen der NR-Aktivität (a ) und NO-Produktion (b ) bestimmt nach der Greiss-Reagenzmethode. Daten sind die Mittel ± SE. Balken mit demselben Buchstaben unterschieden sich bei p . nicht signifikant < 0,05 Level gemäß Ducans multiplem Test

Diskussion

Phytotoxizität ist ein wichtiger Aspekt beim Verständnis der potenziellen Umweltauswirkungen von Nanopartikeln [4, 7, 61, 62, 63]. Zahlreiche Beweise zeigten, dass MWCNTs für Pflanzen toxisch sind, einschließlich der Induktion oxidativer Schäden, Hemmung der Samenkeimung, des Wurzelwachstums und der Entwicklung [11, 63, 64]. Als Phänotyp der SIMR ist jedoch die Wurzelverzweigung durch Seitenwurzelbildung eine wichtige Komponente der Anpassungsfähigkeit des Wurzelsystems an verschiedene Umwelteinflüsse [17]. In dieser Arbeit haben wir biologische, pharmakologische und biochemische Analysen integriert, um die Beteiligung der NR-vermittelten NO-Produktion an der MWCNT-induzierten LR-Bildung zumindest teilweise unter unseren experimentellen Bedingungen zu zeigen. Auch die Funktion von NO bei der Wurzelorganogenese, die durch MWCNTs stimuliert wird, unterstreicht die zentrale Rolle dieses zweiten Botenstoffes, der am Entwicklungsprozess der Pflanzen und der Anpassung an Stress beteiligt ist [29,30,31,32,33, 37, 38].

Zuerst bestätigten wir, dass MWCNTs von 5 mg/ml (OD 6–12 nm) in das Wurzelgewebe eindringen können (Abb. 3). Danach wurde die Induktion der Tomaten-LR-Bildung beobachtet (Abb. 1), die die Induktionsrollen von NAA und SNP (Abb. 4), einer wohlbekannten NO-freisetzenden Verbindung, nachahmt [30, 31]. Ähnliche induzierende Reaktionen wurden bei harzigen Bäumen [41], Salat [42] und Arabidopsis [43] entdeckt, wenn sie mit MWCNTs (OD 6–13 nm, ca. 9,5 nm bzw. 30–40 nm) herausgefordert wurden. Beispielsweise könnte die Anwendung entweder mit unberührtem MWCNT (p-MWCNT) oder carboxylfunktionalisiertem MWCNT (c-MWCNT) (durchschnittlicher Durchmesser 9,5 nm) die Entwicklung von LR in Salatsetzlingen fördern [42]. Im Gegensatz dazu wurde in Sojabohnenpflanzen gleichzeitig eine Hemmung der Primärwurzel- und sogar LR-Bildung gefunden, wenn sie MWCNTs ausgesetzt wurden (OD 20–70 nm [40];). Durch Vergleich mit den Daten zum Außendurchmesser von MWCNTs (Tabelle 1) nahmen wir an, dass die MWCNT-ausgewiesenen Effekte auf die LR-Bildung mit ihrem Durchmesser variierten, was die Förderung bei geringerem Durchmesser und die Hemmung bei höherem Durchmesser zeigt. Sicherlich sollten verwandte Mechanismen sorgfältig untersucht werden. Ein ähnliches Phänomen wurde bei der Salinitätstoleranz von Pflanzen bestätigt [50]. In Kombination mit den obigen Ergebnissen wurde weiter abgeleitet, dass die Funktion von Nanomaterialien von Spezies zu Spezies variieren kann und umgekehrt verschiedene Arten von Nanomaterialien verschiedene biologische Wirkungen haben können. Andere Einflussfaktoren, wie unterschiedliche Dosierungen von MWCNTs [48] und sogar Pflanzenwachstumsbedingungen, konnten jedoch nicht ohne weiteres ausgeschlossen werden.

Im Vergleich zu anderen Nanomaterialien, einschließlich SWCNT, Graphen und AC mit identischer Konzentration, wurden bei MWCNTs die maximale Induktion der LR-Bildung und sogar toxische Effekte auf das Sprosswachstum beobachtet (Abb. 2). Diese könnten mit den besonderen physikalischen Eigenschaften von MWCNTs zusammenhängen, einer Art von Nanomaterialien mit hoher elektrischer Leitfähigkeit, großer spezifischer Oberfläche, hohem Aspektverhältnis und bemerkenswerter thermischer Stabilität [65]. Über die toxischen Wirkungen von Nanomaterialien wurde in Gurken, Kohl, Karotten, Zwiebeln usw. häufig berichtet [66, 67].

Zahlreiche Beweise zeigten, dass NO als Signalmolekül eine breite Palette von Pflanzenprozessen von der Anpassung an die Umwelt bis zur Entwicklung regulieren kann, darunter die Samenkeimung und die Wurzelorganogenese [29, 68, 69, 70, 71, 72, 73 ]. Unser anschließendes Experiment zeigte, dass NO an der MWCNT-induzierten LR-Bildung beteiligt sein könnte. Obwohl mehrere Methoden zur Abbildung der NO-Produktion in Pflanzenzellen angewendet wurden, können die Nachteile, einschließlich der fehlenden Empfindlichkeit und der Störung durch NO-unabhängige Moleküle, bei jeder Methode bestehen [74]. Daher wurden drei Methoden, die für die NO-Bildgebung und -Bestimmung verantwortlich sind, einschließlich der Greiss-Reagensmethode, LSCM und EPR, zusammen mit der Anwendung von cPTIO, einem Fänger von NO, unter unseren experimentellen Bedingungen angewendet. Durch die Verwendung von drei Methoden beobachteten wir, dass eine durch MWCNTs in Tomatensämlingen induzierte erhöhte endogene NO-Produktion durch cPTIO (Abb. 5), einem Fänger von NO, aufgehoben wurde [30,31,32]. Wichtig ist, dass dieser Prozess mit der biologischen Reaktion der MWCNT-induzierten LR-Entwicklung korreliert, die bei gleichzeitiger Anwendung von cPTIO stark blockiert wurde (Abb. 4).

Eine weitere Auswertung dieser Reaktionen und der potentiellen Quelle(n) von NO, die durch exogen applizierte MWCNTs induziert wurden, ergab, dass die NO-Produktion und die anschließende LR-Bildung der NR-Aktivität zugeschrieben werden können. In Pflanzen wird die NO-Produktion hauptsächlich aus NR und NOS-ähnlichem Protein von Säugetieren generiert [28]. Das pflanzliche NOS-Gen ist jedoch immer noch nicht identifiziert [35, 75, 76], obwohl einige Experimente mit den Inhibitoren des Säugetier-NOS-Enzyms einige Hinweise auf einen L-Arginin-abhängigen Weg der NO-Produktion lieferten [36, 76]. NR ist die wichtigste NO-Quelle in Pflanzen [28]. Frühere Studien zeigten, dass die NR-abhängige NO-Produktion als nitratbezogenes Signal fungiert, das an der Regulierung der Wurzelarchitektur beteiligt ist [32, 33]. Außerdem war die NR-abhängige NO-Produktion eng mit der Kälteakklimatisierung [38], der Salztoleranz [50] und dem Abscisinsäure-induzierten Stomaverschluss [77] verbunden. Unsere Ergebnisse zeigten weiterhin, dass Wolframat (ein Inhibitor von NR) offensichtlich die MWCNT-induzierte LR-Bildung beeinträchtigte, insbesondere in der LR-Länge (Abb. 6). Im Gegensatz dazu gab es nur eine leichte Abnahme der LR-Länge und es wurde kein signifikanter Unterschied in der LR-Zahl beobachtet, wenn l-NAME (ein Inhibitor der NOS von Säugetieren) verwendet wurde. Konsequenterweise zeigte der biochemische Assay, dass die NR-Aktivität offensichtlich durch MWCNTs erhöht wurde ( 7a ), parallel zu den Veränderungen in der NO-Produktion ( 5a ). Obige Reaktionen könnten durch Wolframat vollständig blockiert werden (Abb. 7a, Zusatzdatei 1:Abbildung S1). Daraus schlossen wir, dass die durch MWCNTs induzierte erhöhte endogene NO-Produktion hauptsächlich auf den NR-Weg zurückzuführen ist. Sicherlich sollten weitere genetische Beweise untersucht werden.

Schlussfolgerung

In summary, we provide evidence to show that MWCNT-induced NO production via NR might be required for tomato lateral root formation and this was summarized in Fig. 8. Importantly, above findings provide insights into the intricate molecular mechanism of MWCNTs functions in plants.

Schematic representation of the proposed MWCNT-induced tomato lateral root formation mainly via NR-dependent NO production. The role of mammalian NOS-like enzyme was preliminarily ruled out

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind uneingeschränkt verfügbar.

Abkürzungen

CO:

Carbon monoxide

cPTIO:

2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt

DAF-FM DA:

4-Amino-5-methylamino-2′,7′-difluorofluorescein diacetate

EPR:

Electron paramagnetic resonance

GO:

Graphenoxid

H₂ :

Hydrogen gas

H₂ O₂ :

Hydrogen peroxide

l-NAME:

N ^G -Nitro-l-arginine methyl ester

LR:

Lateral root

LSCM:

Laser scanning confocal microscopy

MWCNTs:

Mehrwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen

NAA:

1-Naphthylacetic acid

NO:

Nitric oxide

NOS:

Nitric oxide synthase

NR:

Nitrate reductase

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

SIMR:

Stress-induced morphogenic response

SNP:

Sodium nitroprusside

SWCNTs:

Einwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

Tg:

Tungstate