Graphenoxid-integrierte nHAC/PLGA-Gerüste fördern Osteoblasten-Proliferation und Knochenregeneration

Zusammenfassung

Bioabbaubare poröse Gerüste sind zentral für die Knochengewebetechnik. In dieser Studie wurden nano-Hydroxylapatit/Kollagen (nHAC) gemischt mit Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA) und variierenden Mengen Graphenoxid (GO) durch Gefriertrocknung hergestellt. Die resultierenden Komposite wiesen ein kontinuierliches dreidimensionales Porennetzwerk auf. GO erhöhte die Hydrophilie leicht und steigerte den Youngschen Modul signifikant, wobei die Probe mit 1,5 Gew.-% GO 10,20 ± 1,28 GPa erreichte im Vergleich zu 7,53 ± 1,25 GPa für das GO-freie Gerüst. In vitro zeigten MC3T3-E1 Osteoblasten auf dem 1,5 Gew.-% GO-Gerüst deutlich höhere Adhäsion und Proliferation, bestätigt durch CCK-8-Assays und SEM-Bildgebung. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass nHAC/PLGA/GO-Gerüste ausgezeichnete Zytokompatibilität mit überlegener mechanischer Leistung verbinden und somit vielversprechende Kandidaten für Knochenregenerationsanwendungen sind.

Hintergrund

Dreidimensionale poröse Gerüste, die die extrazelluläre Knochenmatrix nachahmen, sind essenziell für erfolgreiche Knochenreparatur. Konventionelle Fertigungstechniken – Elektrospinnen, computergestütztes Topologie-Design (CTD) kombiniert mit Solid Free-Form Fabrication (SFF) und Gefriertrocknung – bieten unterschiedliche Grade an struktureller Kontrolle und Skalierbarkeit. Gefriertrocknung bietet insbesondere einen direkten Weg, hochvernetzte Poren durch Sublimation eines gefrorenen Lösungsmittels unter Vakuum zu erzeugen.

Natürlicher Knochen besteht aus einer hierarchischen Anordnung von Kollagen und Hydroxylapatit (HA). Nano-Hydroxylapatit/Kollagen (nHAC) Komposite ahmen diese natürliche Architektur nach und liefern günstige Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit. Allerdings begrenzen die inhärente Sprödigkeit von Kollagen und seine schnelle Degradation den Einsatz. Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA) bringt mechanische Robustheit und einstellbare Degradationsraten ein, während GO einzigartige physikochemische Eigenschaften bietet – hohe Oberfläche, mechanische Verstärkung und funktionelle Gruppen, die das Zellverhalten modulieren können.

Frühere Arbeiten zeigten, dass GO-verstärkte Gerüste osteogene Differenzierung und Zellproliferation verbessern. Hier untersuchten wir systematisch, wie inkrementelle GO-Beladung (0,0, 0,5, 1,0 und 1,5 Gew.-%) die strukturellen, mechanischen, hydrophilen und biologischen Eigenschaften von nHAC/PLGA-Kompositen beeinflusst.

Ergebnisse und Diskussion

Struktur der nHAC/PLGA/GO-Kompositgerüste

Der Herstellungsprozess umfasste das Lösen von Typ-I-Kollagen in Essigsäure, Co-Fällung von Ca- und P-Ionen zur Bildung von nHAC, Mischen mit PLGA und dispersem GO, gefolgt von Gefriertrocknung. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) zeigte eine hochporöse Architektur mit vernetzten Poren von 0 bis 200 nm. Die Porenverteilung wurde durch einen automatischen Oberflächenanalysator quantifiziert (Abb. 2f), was eine Vorherrschaft von Poren < 100 nm bestätigte, ein Größenbereich, der für Osteoblasten-Infiltration günstig ist.

Schematische Darstellung der Gerüstherstellung durch Gefriertrocknung.

Physikochemische und mechanische Charakterisierung

Pulver-Röntgenbeugung (XRD) bestätigte das Vorhandensein von hexagonalem HA; GO-Signale waren aufgrund der geringen Beladung nicht nachweisbar. FT-IR-Spektren zeigten charakteristische Kollagen-Amide-Bänder und Phosphat-Peaks, mit subtilen Verschiebungen, die chemische Wechselwirkungen zwischen Kollagen, HA, PLGA und GO anzeigen.

Quantitative nano-mechanische AFM-Messungen (QNM-AFM) ergaben einen monotonen Anstieg des Youngschen Moduls mit GO-Gehalt: 7,53 ± 1,25 GPa (0 Gew.-%), 8,34 ± 1,00 GPa (0,5 Gew.-%), 9,15 ± 0,85 GPa (1,0 Gew.-%) und 10,20 ± 1,28 GPa (1,5 Gew.-%). Das 1,5 Gew.-% GO-Gerüst zeigte einen statistisch signifikanten Steifigkeitsvorteil gegenüber dem GO-freien Gegenstück, was den verstärkenden Effekt von GO widerspiegelt.

Kontaktwinkelmessungen zeigten einen allmählichen Abfall von 125,1° (GO-frei) auf 101,4° (1,5 Gew.-%), was auf verbesserte Oberflächenbenetzbarkeit durch GO's hydrophile funktionelle Gruppen hinweist (Abb. 4f).

AFM-Bilder (a-d) und Steifigkeitskarten (i) der vier Gerüstvarianten; Kontaktwinkel (k) gemessen mit Sessile-Drop-Methode.

Zellkultur und Zytotoxizität

MC3T3-E1 Osteoblasten, auf den Gerüsten ausgesät, zeigten über 7 Tage steigende metabolische Aktivität (CCK-8-Assay). Während die frühe Proliferation auf den 0,5 und 1,0 Gew.-% GO-Gerüsten leicht niedriger war als die GO-freie Kontrolle, glich das 1,5 Gew.-% GO-Gerüst die Kontrolle an den Tagen 3, 5 und 7 aus und übertraf sie (Abb. 5). SEM-Bilder bestätigten ausgedehntes Zellausbreiten und Netzwerkbildung, wobei Zellen auf GO-beladenen Gerüsten größere, flachere Morphologien aufwiesen (Abb. 6).

NIH-3T3 Fibroblasten, 24 h Gerüst-Suspensionen ausgesetzt, zeigten keine signifikante Zytotoxizität; die Lebensfähigkeit blieb über 97 % bei allen GO-Beladungen, was die Biokompatibilität der Komposite bestätigt (Abb. 7).

Zelllebensfähigkeit von MC3T3-E1 auf den vier Gerüstvarianten (*** p < 0,01).

SEM-Bilder von MC3T3-E1 Zellen nach 1, 3, 5 und 7 Tagen auf den vier Gerüsttypen.

Relative Lebensfähigkeit von NIH-3T3 Zellen nach 24 h Exposition gegenüber Gerüst-Suspensionen.

Schlussfolgerungen

Gefriertrocknung ermöglichte die Herstellung von nHAC/PLGA/GO-Gerüsten mit vernetzter Porosität, erhöhter mechanischer Steifigkeit und verbesserter Hydrophilie. Das 1,5 Gew.-% GO-Gerüst demonstrierte überlegene Osteoblasten-Adhäsion und -Proliferation bei ausgezeichneter Zytokompatibilität, was sein Potenzial als Knochengewebetechnik-Gerüst unterstreicht.

Methoden

Materialien

Typ-I-Kollagen, PLGA (75:25, Mw = 95 kDa), GO und Zellkultur-Reagenzien wurden von etablierten Lieferanten bezogen. MC3T3-E1 Osteoblasten und NIH-3T3 Fibroblasten stammten von renommierten Zellbanken.

Gerüstherstellung

Kollagen wurde in 0,5 M Essigsäure (4 g L⁻¹) gelöst. Calcium- und Phosphatlösungen (Ca/P = 1,66) wurden tropfenweise zugegeben (100 Tropfen min⁻¹), gerührt und mit Ammoniak auf pH 9 bei 37 °C titriert. Nach 24 h wurde der Niederschlag gesammelt, gefriertrocknet und gemahlen, um nHAC-Pulver zu erhalten.

GO wurde in Dioxan (0,0, 0,5, 1,0, 1,5 g L⁻¹) via Ultraschall dispergiert, dann mit PLGA (10 % m/v) gemischt und 12 h gerührt. nHAC wurde im 1:1 Gewichtsverhältnis zu PLGA hinzugefügt, gefolgt von 4 h Ultraschall. Die Mischung wurde über Nacht bei –20 °C gefroren und lyophilisiert, um die finalen Gerüste zu erhalten.

Charakterisierung

SEM, AFM (QNM-Modus), FT-IR, XRD, Kontaktwinkel und Porositätsmessungen wurden nach Standardprotokollen durchgeführt. Alle Daten wurden in Triplikaten erhoben.

Zellkultur und Assays

MC3T3-E1 Zellen wurden mit 2,5 × 10⁴ Zellen ml⁻¹ auf Gerüstscheiben ausgesät und in DMEM +10 % FBS +3 % Antibiotika bei 37 °C, 5 % CO₂ kultiviert. Proliferation wurde an Tagen 1, 3, 5 und 7 durch CCK-8 bewertet. Für SEM wurden Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, dehydriert, kritisch-punkt-getrocknet und mit Gold gesputtert.

Zytotoxizitätstest

NIH-3T3 Zellen wurden 24 h lang 100 mg ml⁻¹ Gerüst-Suspensionen ausgesetzt, gefolgt von CCK-8-Assay. Zelllebensfähigkeit wurde relativ zu Kontrollkulturen berechnet.

Statistische Analyse

Daten werden als Mittelwert ± SD angegeben. Student's t-Test wurde angewendet; p < 0,05 galt als signifikant.