Wie mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren die laterale Wurzelentwicklung von Tomaten über Stickstoffmonoxid-Signalisierung fördern

Zusammenfassung

Zahlreiche Studien zeigten, dass mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren (MWCNTs) für Pflanzen toxisch sind. Ob und wie MWCNTs die laterale Wurzelbildung (LR) beeinflussen, die eine wichtige Komponente der Anpassungsfähigkeit des Wurzelsystems an verschiedene Umweltreize ist, bleibt jedoch umstritten. In diesem Bericht fanden wir, dass MWCNTs in Tomatensämlingswurzeln eindringen können. Die Verabreichung von MWCNTs förderte die Tomaten-LR-Bildung in einer annähernd dosisabhängigen Weise. Die endogene Stickstoffmonoxid (NO)-Produktion wurde durch MWCNTs ausgelöst, bestätigt durch Griess-Reagenz-Methode, Elektronenparamagnetische Resonanz (EPR) und Laserscanning-Confokalmikroskopie (LSCM), zusammen mit dem NO-Scavenger. Ein Kausalzusammenhang besteht zwischen MWCNTs und NO bei der Induktion der LR-Entwicklung, da MWCNT-induzierte NO-Synthese und LR-Bildung durch die Entfernung von endogenem NO mit seinem Scavenger offensichtlich blockiert wurden. Die Aktivität des NO-erzeugenden Enzyms Nitratreduktase (NR) wurde durch MWCNTs erhöht. Tungstat-Hemmung von NR beeinträchtigte nicht nur die NO-Produktion, sondern beseitigte auch die durch MWCNTs ausgelöste LR-Bildung. Die Zugabe von N^G-Nitro-L-Arginin-Methylester (L-NAME), einem Inhibitor der mammalischen Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS)-ähnlichen Enzyme, beeinflusste die LR-Bildung nicht. Insgesamt schlagen wir vor, dass NO als nachgeschaltetes Signalmolekül in der MWCNT-Kontrolle der LR-Entwicklung wirken könnte, zumindest teilweise über NR.

Einleitung

Es gibt viele biologische und biomedizinische Anwendungen von Kohlenstoffnanoröhren [1, 2]. Aufgrund der einzigartigen Fähigkeit, Zellmembranen leicht zu durchdringen, ist die Biosicherheit von Kohlenstoffnanoröhren immer ein Diskussionsthema [3, 4]. Mittlerweile wird es wichtig, die detaillierten Mechanismen ihrer Zytotoxizität beim Menschen und bei Säugetieren, und kürzlich auch bei Pflanzen, zu charakterisieren, da die Produktion und Verwendung von Kohlenstoffnanoröhren rasant wächst [3,4,5,6,7,8,9]. Es ist bekannt, dass Pflanzen und ihre Gemeinschaften sehr wichtig für Menschen und Umwelt sind und sie ebenfalls dem Risiko einer Kohlenstoffnanoröhren-Exposition ausgesetzt sind, aufgrund von Anreicherung in Böden durch Biosoliddünger-Anwendung [6, 10, 11]. Als wichtige Mitglieder der Kohlenstoffnanoröhren wurde die Toxizität von mehrwandigen Kohlenstoffnanoröhren (MWCNTs), bestehend aus mehreren gerollten Graphenschichten, breit untersucht. Studien an Säugetieren zeigten, dass die Exposition mit sowohl MWCNTs als auch einwandigen Kohlenstoffnanoröhren oxidativen Schaden und NF-κB-Aktivierung in menschlichen Keratinozyten und A549-Zellen induzierte [9, 12]. MWCNTs und einwandige Kohlenstoffnanoröhren können mit der Plasmamembran verschmelzen, was Zellschäden durch Lipidperoxidation und oxidativen Stress verursacht [9, 11, 13, 14]. Zytotoxizität und oxidativer Stress, ausgelöst durch MWCNTs, sowie moderate entzündliche Reaktionen wurden in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen beobachtet [15]. Eine frühere Studie legte nahe, dass die primäre Toxizität von MWCNTs in rotem Spinat hauptsächlich von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)-Überproduktion herrührte, und die toxischen Effekte durch ergänzende Ascorbinsäure umgekehrt werden konnten [7]. In diesem Sinne werden MWCNTs als neuer Stressfaktor für Organismen betrachtet, sei es in Tieren oder Pflanzen.

Laterale Wurzelbildung (LR), ein wichtiger Bestimmungsfaktor der Wurzelarchitektur, wurde als Indikator für adaptive Reaktion auf verschiedene Stresse betrachtet [16]. Bei höheren Pflanzen wird die Bildung von LR durch Phytohormone und eine breite Palette von Umweltreizen beeinflusst, einschließlich Wasserverfügbarkeit, Nährstoffe und abiotischer Stress wie Hypoxie und Schwermetallstress [17,18,19]. Gleichzeitig bestätigten ample Beweise, dass die Bildung von LR nicht nur als physikalische Stütze wirkt, sondern auch zur Wasser- und Nährstoffaufnahme für Pflanzenwachstum und -entwicklung beiträgt [19,20,21]. Verschiedene Umweltreize könnten mehrere spezifische stressinduzierte morphogene Antwort (SIMR) Phänotypen auslösen, einschließlich der Förderung der LR-Bildung und einer Hemmung der Wurzelelngation [17]. Die Regulation der LR-Bildung wird auch eng durch Phytohormone wie Auxin kontrolliert, und die Aktivierung von Zellzyklus-regulierenden Genen in Reaktion auf Auxin wurde vorgeschlagen [19, 22]. Gleichzeitig wurde die Beteiligung einiger kleiner Moleküle an auxin-induzierter Wurzelorganogenese in Gurke, Tomate, Soja und Raps bestätigt [23,24,25,26,27]. Diese kleinen Moleküle umfassen Wasserstoffperoxid (H₂O₂), Stickstoffmonoxid (NO), Kohlenmonoxid (CO) und Wasserstoffgas (H₂).

Unter diesen hat sich NO, ein freies Radikagas, als mehrfach physiologische Funktionen in Pflanzen gezeigt [28, 29]. Neben der Verbesserung der Pflanzenanpassung an Stresse umfassen die Funktionen von NO die Förderung der Wurzelhaarentwicklung, Adventivwurzelbildung und lateraler Wurzelbildung [30,31,32,33], obwohl die enzymatischen Ressourcen der NO-Biosynthese in diesen Prozessen rätselhaft bleiben. In Tieren wird die Synthese von NO aus L-Arginin durch das Häm-enthaltende Enzym Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) katalysiert [34]. Obwohl Gene, die NOS-Enzyme kodieren, in Pflanzen nicht identifiziert wurden, wird die mammalische NOS-ähnliche Aktivität breit detektiert [35, 36], und Inhibitoren der mammalischen NOS, wie N^G-Nitro-L-Arginin-Methylester-Hydrochlorid (L-NAME), können die NO-Generierung in Pflanzen inhibieren [25, 33, 36,37,38,39]. Wichtig ist, dass ample genetische Beweise zeigten, dass NO durch Nitratreduktase (NR), ein bekanntes Enzym, das für den Stickstoffstoffwechsel in Pflanzen verantwortlich ist, produziert werden kann [28]. Die Beteiligung von NR-vermittelter NO-Produktion an Stomata-Schluss und Kälteakklimation wurde genetisch demonstriert [37, 38]. Unsere frühere Studie zeigte, dass NR-abhängige NO-Synthese an auxin-induzierter Wasserstoffgas-vermittelter lateraler Wurzelbildung beteiligt ist [39].

Bislang wurden unterschiedliche Reaktionen in der LR-Bildung, Förderung oder Hemmung, jeweils in verschiedenen Pflanzenarten bei Supplementierung mit Nanomaterialien, einschließlich MWCNTs [40,41,42,43], Gold-Nanopartikeln (Au NP, [44]), Zinkoxid-Nanopartikeln (ZnO NP [45, 46];), Titandioxid-Nanopartikeln (TiO₂ NP [46];) und Graphenoxid (GO [47,48,49];) (Tabelle 1) berichtet, und keine Studie hat bisher definitiven Beweis für eine Rolle von NO in den oben genannten Reaktionen geliefert. In dieser Studie enthüllte die Detektion von endogenem NO durch Griess-Reagenz-Methode, Laserscanning-Confokalmikroskopie (LSCM) und Elektronenparamagnetische Resonanz (EPR) Analysen, dass der NO-Spiegel in MWCNT-behandelten Tomatensämlingen erhöht war. Anschließend wurde LR-Bildung beobachtet. Wir untersuchten weiter die Beteiligung von NO an der durch MWCNTs ausgelösten LR-Bildung, indem wir endogene NO-Spiegel mittels NO-Scavenger und Antagonisten, die NR und mammalische NOS-ähnliche Aktivität inhibieren, manipulierten. Weitere Experimente zeigten, dass NR-abhängiges NO zumindest teilweise essenziell für die LR-Bildung in Reaktion auf MWCNTs sein könnte. Diese Arbeit öffnet somit ein neues Fenster für das Verständnis der biologischen Effekte von Nanomaterialien in Pflanzen.

Materialien und Methoden

Chemikalien

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle anderen Chemikalien von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. MWCNTs, gekauft von Sigma-Aldrich, wurden wie zuvor beschrieben charakterisiert [50]. Der Außendurchmesser, Innendurchmesser und die Länge der MWCNTs betrugen 6–12 nm, 2,5–5 nm und 1–9 µm. Nach Sonikationsbehandlung wurde die erhaltene homogene kolloidale Suspension sterilisiert und verwendet.

Andere Kohlenstoffnanopartikel wurden von Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd. bezogen, einschließlich einwandiger Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs, XFS22; Reinheit > 95 %, Durchmesser 1–2 nm, Länge 5–30 µm, spezifische Oberfläche > 1075 m²/g), Graphen (XF001W; Reinheit ~ 99 %, Durchmesser 0,5–5 µm, Dicke ~ 0,8 nm, Einzelschichtverhältnis ~ 80 %, BET-Oberfläche 500–1000 m²/g; elektrischer Widerstand ≦ 0,30 Ω·cm) und Aktivkohle (AC, XFP06; Reinheit > 95 %, Teilchengröße 5 ± 1 µm, Porenvolumen 1–1,2 cm³/g, Porenöffnung 2,0–2,2 nm, spezifische Oberfläche ~ 1500–1700 m²/g).

Zusätzlich wurde Natriumnitroprussid (SNP) als NO-freisetzende Verbindung [30,31,32,33] verwendet. 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid Kaliumsalz (cPTIO) wurde als Scavenger von NO [51,52,53,54] betrachtet. Tungstat (Tg; ein Inhibitor von NR [28, 33, 37, 55,56,57];) und N^G-Nitro-L-Arginin-Methylester-Hydrochlorid (NAME; ein Inhibitor der mammalischen NOS-ähnlichen Enzyme [25, 33, 36,37,38,39];) wurden ebenfalls angewendet. In dieser Studie wurden die Konzentrationen der oben genannten Chemikalien in Vorversuchen bestimmt, aus denen signifikante Reaktionen beobachtet wurden.

Pflanzenmaterial, Wachstumsbedingungen und Bestimmung der LR-Bildung

Tomaten (Solanum lycopersicum L.) Samen "Jiangshu 14" wurden freundlicherweise vom Jiangsu Agricultural Institutes, Nanjing, Provinz Jiangsu, China, bereitgestellt. Ausgewählte Samen gleicher Größe wurden in destilliertem Wasser bei 25 ± 1 °C im Dunkeln für 3 Tage gekeimt. Die ausgewählten identischen Sämlinge mit Wurzeln von 2–3 mm wurden dann in 6 ml Behandlungslösungen übertragen, die die angegebenen Konzentrationen von MWCNTs, 200 nM 1-Naphthylessigsäure (NAA; ein bekanntes Auxin), 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, 20 µM Tungstat (Tg), 0,2 mM NAME und andere Kohlenstoffnanopartikel, einschließlich 5 mg/ml einwandige Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs), Graphen und Aktivkohle (AC), allein oder in Kombination für die angegebenen Zeitpunkte enthielten. Sämlinge wurden in einem Beleuchtungsinkubator (25 ± 1 °C) mit einer Lichtintensität von 200 µmol m⁻² s⁻¹ bei 14/10 h (Licht/Dunkel) Photoperiode kultiviert.

Nach den Behandlungen wurden Bilder aufgenommen, und die Anzahl und Länge der entstandenen lateralen Wurzeln (> 1 mm) pro Sämling wurden dann mit der Image J Software (https://rsb.info.nih.gov/ij/) [39, 58] bestimmt. Wie zuvor beschrieben, wurden nur die lateralen Wurzel-induzierbaren Segmente für die nachfolgende Analyse verwendet.

Bildgebung der MWCNT-Verteilung durch Transmissionselektronenmikroskopie

Die Verteilung von MWCNTs in Tomatensämlingswurzeln wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; JEOL, JEM-200CX, Tokyo, Japan) charakterisiert. Die Probenvorbereitung für TEM-Analyse erfolgte gemäß dem vorherigen Protokoll [59].

Bildgebung von endogenem NO durch Laserscanning-Confokalmikroskop

NO-Bildgebung wurde durch Verwendung eines ziemlich spezifischen NO-fluoreszierenden Sonden 4-Amino-5-methylamino-2′,7′-difluorofluorescein-diacetat (DAF-FM DA) durchgeführt. Nachdem die Sonde gründlich gewaschen wurde, wurden die Bilder mit dem Zeiss LSM 710 Confokalmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland, Anregung bei 488 nm, Emission bei 500–530 nm für NO-Analyse) aufgenommen. In unserem Experiment wurden 20 individuelle Proben zufällig ausgewählt und pro Behandlung gemessen. Fotografien sind repräsentativ für identische Ergebnisse.

NO-Gehalt bestimmt durch Griess-Reagenz-Assay

Entsprechend den zuvor beschriebenen Methoden [50] wurde der NO-Gehalt mit dem Griess-Reagenz-Assay bestimmt. Wichtig ist, dass für das Entgehen der durch konzentrierte Nitrat- und Nitritgehalte in Pflanzen verursachten Interferenz die identischen Proben, die 30 min in 200 µM cPTIO (dem Scavenger von NO) vorinkubiert wurden, als Blankoproben betrachtet wurden. Nach Zugabe von Griess-Reagenz für 30 min wurde die Absorption bei 540 nm aufgezeichnet, und der NO-Gehalt wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve von NaNO₂ bestimmt.

Bestimmung von NO mit Elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR)

Entsprechend unseren vorherigen Methoden [39, 55, 60] wurde die Bestimmung des NO-Spiegels mit Elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR) durchgeführt. Die organische Lösungsmittelschicht wurde verwendet, um NO an einem Bruker A300 Spektrometer (Bruker Instrument, Karlsruhe, Deutschland) unter folgenden Bedingungen zu bestimmen: Raumtemperatur; Mikrowellenfrequenz 9,85 GHz; Mikrowellenleistung 63,49 mW; und Modulationsfrequenz 100,00 kHz.

Bestimmung der Nitratreduktase (NR) Aktivität

Die NR-Aktivität wurde spektrophotometrisch bei 540 nm gemäß der vorherigen Methode [57] detektiert. Das produzierte Nitrit wurde spektrophotometrisch bei 540 nm durch Zugabe von 1 ml 1 % (Gew./Vol.) Sulfenilamid in 3 M HCl zusammen mit 1 ml 0,02 % (Vol./Vol.) n-(1-Naphthyl)-ethylendiamin bestimmt.

Statistische Analyse

Wo angegeben, wurden Ergebnisse als Mittelwerte ± SE von drei unabhängigen Experimenten mit drei biologischen Replikaten für jedes ausgedrückt. Statistische Analyse wurde mit SPSS Statistics 17.0 Software durchgeführt. Für die statistische Analyse wurde Duncans Mehrfachtest (p < 0,05) als angemessen gewählt.

Ergebnisse

MWCNTs gelangen nicht nur in Wurzelzellen, sondern fördern auch LR-Bildung

LR-Bildung ist ein Hauptbestimmungsfaktor der Wurzelsystemarchitektur. Um den Effekt von MWCNTs auf LR-Bildung zu untersuchen, wurden 3 Tage alte Tomatensämlinge mit einer Reihe von MWCNT-Konzentrationen (0,05, 0,5, 5 und 50 mg/ml) für 3 Tage inkubiert. Die Applikation von 1-Naphthylessigsäure (NAA) wurde als Positivkontrolle betrachtet. In unserem Experiment wurden sowohl LR-Anzahl als auch -Länge als zwei Parameter der LR-Bildung bestimmt. Wie in Abb. 1 gezeigt, induzierten exogene MWCNTs im Vergleich zu den Kontrollproben die LR-Bildung in einer annähernd dosisabhängigen Weise signifikant, mit einem maximalen Effekt bei 5 und 50 mg/ml. Eine ähnliche induzierbare Reaktion wurde beobachtet, als 200 nM NAA verabreicht wurde. In Anbetracht der Kosten von MWCNTs und der induzierbaren Reaktion in der LR-Bildung wurde 5 mg/ml MWCNTs in den folgenden Experimenten angewendet.

MWCNT-induzierte Tomaten-LR-Bildung war in einer annähernd dosisabhängigen Weise. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit 200 nM NAA und den angegebenen Konzentrationen von MWCNTs behandelt. Die Anzahl und Länge der entstandenen lateralen Wurzeln (> 1 mm) pro Sämling wurden nach 3 Tagen Behandlung bestimmt. Es gab 30 (10 × 3) Pflanzen in drei biologischen Replikaten, und die Experimente wurden 3 Mal durchgeführt. Daten sind Mittelwerte ± SE. Innerhalb jedes Experimentsatzes unterschieden sich Balken, die mit demselben Buchstaben bezeichnet sind, nicht signifikant auf p < 0,05 Niveau gemäß Duncans Mehrfachtest

Um die spezifische Funktion von MWCNTs in der Induktion der LR-Bildung zu validieren, untersuchten wir weiter, ob die anderen Allotropien von MWCNTs auch solche induzierbaren Effekte haben. Wie in Abb. 2a gezeigt, zeigten all diese Kohlenstoffnanomaterialien toxische Effekte auf Sprosswachstum (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise konnten die Applikation von MWCNTs, einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs), Graphen und Aktivkohle mit identischer Konzentration (5 mg/ml) differentiell zu Zunahmen in LR-Anzahl und -Länge führen, im Vergleich zu chemikalienfreien Kontrollpflanzen (Abb. 2b). Unter diesen Chemikalien wurde die maximale induzierbare Reaktion in MWCNT-inkubierten Tomatensämlingen entdeckt.

Veränderungen in der lateralen Wurzelbildung in Reaktion auf verschiedene Kohlenstoffnanopartikel. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit destilliertem Wasser (Con), 5 mg/ml MWCNT, einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs), Graphen und Aktivkohle (AC) jeweils für weitere 3 Tage behandelt. a Repräsentative Fotos wurden dann aufgenommen. b Die Anzahl und Länge der entstandenen lateralen Wurzeln (> 1 mm) pro Sämling wurden dann ebenfalls bestimmt. Skalenbalken = 50 mm. Es gab 30 (10 × 3) Pflanzen in drei biologischen Replikaten, und die Experimente wurden 3 Mal durchgeführt. Daten sind Mittelwerte ± SE. Innerhalb jedes Experimentsatzes unterschieden sich Balken, die mit demselben Buchstaben bezeichnet sind, nicht signifikant auf p < 0,05 Niveau gemäß Duncans Mehrfachtest

Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) kann die Verteilung von MWCNTs leicht evaluiert werden. Die in Abb. 3 gezeigten Ergebnisse enthüllten, dass MWCNTs, wenn exogen appliziert, von Tomatensämlingen absorbiert werden konnten, und die Verteilung von MWCNTs wurde in Wurzelzellen gefunden. Dieses Ergebnis kann verstanden werden, da Sämlingswurzeln direkt in Flüssiglösung mit MWCNTs kultiviert werden.

Verteilung von MWCNTs in Tomatenwurzeln. TEM-Bilder von 3 Tage alten Tomatensämlingen, behandelt mit destilliertem Wasser (Con; a) oder 5 mg/ml MWCNTs (b) für 1 Tag. Roter Pfeil zeigt Zellwand, während weißer Pfeil MWCNTs anzeigt

MWCNT-induzierte NO-Synthese und nachfolgende LR-Bildung waren empfindlich gegenüber cPTIO, einem Scavenger von NO

Um zu untersuchen, ob NO auch an MWCNT-induzierter LR-Bildung beteiligt ist, wurde die Funktion von NO in der durch MWCNTs ausgelösten LR-Bildung durch Manipulation endogener NO-Spiegel mittels NO-freisetzender Verbindung und Scavenger bewertet. Ähnlich wie frühere Ergebnisse [31] konnte die Verabreichung von Natriumnitroprussid (SNP) die Induktion der LR-Bildung bewirken, und eine additive Reaktion wurde beobachtet, als SNP und MWCNTs zusammen appliziert wurden (Abb. 4). Als 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid Kaliumsalz (cPTIO; ein Scavenger von NO) hinzugefügt wurde, wurden die Förderreaktionen in der LR-Bildung, verursacht durch MWCNTs, signifikant beeinträchtigt. Allein konnte cPTIO die LR-Entwicklung im Vergleich zur chemikalienfreien Kontrolle inhibieren, was die wichtige Rolle von endogenem NO in der Wurzelorganogenese anzeigt.

MWCNT-induzierte LR-Bildung war empfindlich gegenüber der Entfernung von endogenem NO mit cPTIO, seinem Scavenger. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit destilliertem Wasser, 5 mg/ml MWCNT, 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, allein oder in Kombination für 3 Tage behandelt. Anschließend wurden die Anzahl und Länge der entstandenen lateralen Wurzeln (> 1 mm) pro Sämling bestimmt. Es gab 30 (10 × 3) Pflanzen in drei biologischen Replikaten, und die Experimente wurden 3 Mal durchgeführt. Daten sind Mittelwerte ± SE. Innerhalb jedes Experimentsatzes unterschieden sich Balken, die mit demselben Buchstaben bezeichnet sind, nicht signifikant auf p < 0,05 Niveau gemäß Duncans Mehrfachtest

Um die wichtige Rolle von endogenem NO in der MWCNT-Reaktion weiter zu evaluieren, wurde zunächst ein Zeitverlauf der NO-Produktion in vivo mit der Griess-Reagenz-Methode detektiert. Während der obigen Bestimmung wurde das identische Filtrat, das mit cPTIO vorbehandelt wurde, als Blanko für genaue Ergebnisse betrachtet. Es wurde beobachtet, dass die NO-Produktion in Tomatensämlingswurzeln dramatisch bis 24 h nach MWCNT-Behandlung zunahm und dann auf die initialen Werte zurückging (48 h; Abb. 5a). Der oben genannte maximale endogene NO-Spiegel, ausgelöst durch MWCNTs für 24 h, wurde offensichtlich durch cPTIO, einen Scavenger von NO, abolished, was die spezifische Rolle von NO suggeriert.

MWCNT-induzierte NO-Produktion wurde durch cPTIO, den Scavenger von NO, blockiert. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit destilliertem Wasser und 5 mg/ml MWCNTs mit oder ohne 0,2 mM cPTIO jeweils behandelt. a Veränderungen in NR-Aktivität (links) und NO-Produktion (rechts) bestimmt mit Griess-Reagenz-Methode. b Nach Behandlung für 24 h wurde das NO-Signal durch LSCM (links) und EPR (rechts) analysiert. Skalenbalken = 0,1 mm. Daten sind Mittelwerte ± SE. Balken, die mit demselben Buchstaben bezeichnet sind, unterschieden sich nicht signifikant auf p < 0,05 Niveau gemäß Ducans Mehrfachtest

Um die obigen Ergebnisse zu bestätigen, wurden sowohl LSCM als auch ESR angewendet. Zunächst wurden die Veränderungen in endogenen NO-Spiegeln in Sämlingswurzeln von Tomaten durch Markierung von NO mit der zellpermeablen, ziemlich NO-spezifischen fluoreszierenden Sonde DAF-FM DA und Bildgebung mit LSCM überwacht. Ähnlich wie die vorherigen Ergebnisse (Abb. 5a) wurde die erhöhte DAF-FM-abhängige Fluoreszenzintensität, ausgelöst durch MWCNTs, in Gegenwart von cPTIO stark abolished (Abb. 5b). Diese Ergebnisse implizierten, dass die DAF-FM-induzierte Fluoreszenz mit endogenen NO-Spiegeln in Tomatensämlingswurzeln zusammenhängt.

MWCNT-induzierte NO-Produktion wurde durch EPR-Spektroskopie bestätigt. Wie erwartet, präsentierten Sämlingswurzeln, die 24 h mit MWCNTs behandelt wurden, die typische Hyperfeinstruktur-Triplett des NO-Komplexes. Allerdings abolierte die Zugabe von cPTIO das obige Signal, was anzeigte, dass MWCNT-Exposition tatsächlich zu starker NO-Produktion führte (Abb. 5b). Kollektiv deuteten diese Daten darauf hin, dass NO-Synthese für MWCNT-induzierte LR-Bildung in Tomatensämlingen erforderlich sein könnte.

NR könnte für MWCNT-induzierte NO-Produktion und nachfolgende LR-Bildung verantwortlich sein

Da NR und mammalische NOS-ähnliche Enzyme zwei Hauptenzyme im Zusammenhang mit NO-Synthese in Pflanzen sind, wurden sowohl Tungstat (ein NR-Inhibitor) als auch NAME (ein mammalischer NOS-Inhibitor) in den nachfolgenden Experimenten angewendet. Hier unterdrückte Tungstat-Behandlung die Förderung der LR-Bildung in MWCNT-behandelten Tomatensämlingswurzeln substanziell (Abb. 6). Vergleichsweise wurde die Induktion der LR-Bildung, ausgelöst durch MWCNTs, durch die Zugabe von NAME nicht stark inhibiert, was anzeigte, dass mammalische NOS-ähnliche Enzyme möglicherweise nicht das Ziel-NO-synthetisierende Enzym sind, das für die durch MWCNTs ausgelöste NO-Produktion verantwortlich ist. Es wurde auch beobachtet, dass ein leichter, aber nicht signifikanter Rückgang in der LR-Bildung in Tomatensämlingen beobachtet wurde, wenn entweder Tungstat oder NAME separat angewendet wurde.

Veränderungen in der LR-Bildung in Reaktion auf MWCNTs und zwei Inhibitoren der NO-Synthese. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit 5 mg/ml MWCNT, 20 µM Tungstat (Tg), 0,2 mM NAME, allein oder in Kombination für 3 Tage behandelt. Anschließend wurden die Anzahl und Länge der entstandenen lateralen Wurzeln (> 1 mm) pro Sämling bestimmt. Es gab 30 (10 × 3) Pflanzen in drei biologischen Replikaten, und die Experimente wurden 3 Mal durchgeführt. Daten sind Mittelwerte ± SE. Innerhalb jedes Experimentsatzes unterschieden sich Balken, die mit demselben Buchstaben bezeichnet sind, nicht signifikant auf p < 0,05 Niveau gemäß Duncans Mehrfachtest

Die Rolle von NR in MWCNT-induzierter LR-Bildung wurde weiter durch Überwachung der NO-Produktion in Reaktion auf applizierte MWCNTs mit oder ohne Tungstat untersucht. Im Vergleich zu den Veränderungen in der endogenen NO-Produktion (Abb. 5a) zeigte die Zeitverlaufsanalyse der NR-Aktivität eine ähnliche Tendenz (Abb. 7a), die ebenfalls nach 24 h Behandlung mit MWCNTs ihren Peak erreichte. Diese Ergebnisse legten nahe, dass der MWCNT-induzierte Anstieg in der NO-Produktion hauptsächlich aus der gesteigerten Aktivität von NR resultieren könnte. Konsistent wurde die Hemmung der NR-abhängigen NO-Produktion durch Tungstat durch Griess-Reagenz-Methode (Abb. 7b), LSCM und EPR (Zusatzdatei 1: Abbildung S1) bestätigt.

MWCNT-induzierte NO-Produktion wurde durch Tungstat, einen Inhibitor von NR, blockiert. Drei Tage alte Tomatensämlinge wurden mit destilliertem Wasser und 5 mg/ml MWCNTs mit oder ohne 20 µM Tungstat (Tg) behandelt. Veränderungen in NR-Aktivität (a) und NO-Produktion (b) bestimmt mit Griess-Reagenz-Methode. Daten sind Mittelwerte ± SE. Balken, die mit demselben Buchstaben bezeichnet sind, unterschieden sich nicht signifikant auf p < 0,05 Niveau gemäß Ducans Mehrfachtest

Diskussion

Phytotoxizität ist eine bedeutende Überlegung beim Verständnis der potenziellen Umweltauswirkungen von Nanopartikeln [4, 7, 61,62,63]. Ample Beweise zeigten, dass MWCNTs für Pflanzen toxisch sind, einschließlich der Induktion von oxidativem Schaden, Hemmung der Keimung, Wurzelwachstum und -entwicklung [11, 63, 64]. Allerdings, als Phänotyp von SIMR, ist Wurzelverzweigung durch laterale Wurzelbildung eine wichtige Komponente der Anpassungsfähigkeit des Wurzelsystems an verschiedene Umweltreize [17]. In dieser Arbeit integrierten wir biologische, pharmakologische und biochemische Analysen, um die Beteiligung von NR-vermittelter NO-Produktion an MWCNT-induzierter LR-Bildung, zumindest teilweise in unseren experimentellen Bedingungen, zu zeigen. Auch die Funktion von NO in der durch MWCNTs stimulierten Wurzelorganogenese betonte die zentralen Rollen dieses Second Messengers in Pflanzenentwicklungsprozessen und Anpassung an Stress [29,30,31,32,33, 37, 38].

Zunächst bestätigten wir, dass 5 mg/ml MWCNTs (AD 6–12 nm) in Wurzelgewebe eindringen konnten (Abb. 3). Anschließend wurde die Induktion der Tomaten-LR-Bildung beobachtet (Abb. 1), die die Induktionsrollen von NAA und SNP (Abb. 4), einer bekannten NO-freisetzenden Verbindung [30, 31], nachahmte. Ähnliche induzierbare Reaktionen wurden in harzigen Bäumen [41], Salat [42] und Arabidopsis [43] entdeckt, wenn sie mit MWCNTs (AD 6–13 nm, ca. 9,5 nm und 30–40 nm) herausgefordert wurden. Zum Beispiel konnte die Applikation mit entweder pristinen MWCNT (p-MWCNT) oder carboxyl-funktionalisierten MWCNT (c-MWCNT) (durchschnittlicher Durchmesser 9,5 nm) die Entwicklung von LR in Salatsämlingen fördern [42]. Im Gegensatz dazu wurden Hemmung der Primärwurzel und sogar LR-Bildung gleichzeitig in Sojabohnenpflanzen gefunden, wenn sie MWCNTs (AD 20–70 nm [40];) ausgesetzt waren. Durch Vergleich mit den Daten im Außendurchmesser von MWCNTs (Tabelle 1) vermuteten wir, dass MWCNT-gezeigte Effekte auf LR-Bildung mit ihren Durchmessern variierten, zeigend Förderung bei niedrigerem Durchmesser und Hemmung bei höherem Durchmesser. Sicherlich sollte der zugehörige Mechanismus sorgfältig untersucht werden. Ein ähnliches Phänomen wurde in Pflanzen-Salztoleranz [50] bestätigt. Kombiniert mit den obigen Ergebnissen wurde weiter deduziert, dass die Funktion von Nanomaterialien von der Art variieren kann, und umgekehrt, verschiedene Arten von Nanomaterialien können verschiedene biologische Effekte verursachen. Allerdings könnten andere beeinflussende Faktoren, wie unterschiedliche Dosen von MWCNTs [48] und sogar Pflanzenwachstumsbedingungen, nicht leicht ausgeschlossen werden.

Verglichen mit anderen Nanomaterialien, einschließlich SWCNT, Graphen und AC mit identischer Konzentration, wurden die maximale Induktion in der LR-Bildung und sogar toxische Effekte auf Sprosswachstum in MWCNTs beobachtet (Abb. 2). Dies könnte mit den besonderen physikalischen Eigenschaften von MWCNTs zusammenhängen, einer Art von Nanomaterialien, die hohe elektrische Leitfähigkeit, große spezifische Oberfläche, hohes Aspektverhältnis und bemerkenswerte thermische Stabilität aufweisen [65]. Die toxischen Effekte von Nanomaterialien wurden breit in Gurke, Kohl, Karotte, Zwiebel etc. berichtet [66, 67].

Ample Beweise zeigten, dass NO, als Signalmolekül wirkend, eine breite Palette von Pflanzenprozessen von Umweltanpassung bis Entwicklung regulieren kann, letztere einschließlich Keimung und Wurzelorganogenese [29, 68,69,70,71,72,73]. Unsere nachfolgenden Experimente enthüllten, dass NO an MWCNT-induzierter LR-Bildung beteiligt sein könnte. Obwohl mehrere Methoden für die Bildgebung von NO-Produktion in Pflanzenzellen angewendet wurden, können Nachteile, einschließlich mangelnder Sensitivität und Interferenz durch NO-unabhängige Moleküle, in jeder Methode existieren [74]. Daher wurden drei Methoden, verantwortlich für NO-Bildgebung und -Bestimmung, einschließlich Griess-Reagenz-Methode, LSCM und EPR, zusammen mit der Applikation von cPTIO, einem Scavenger von NO, in unseren experimentellen Bedingungen angewendet. Durch Verwendung von drei Methoden beobachteten wir, dass eine erhöhte endogene NO-Produktion, induziert durch MWCNTs in Tomatensämlingen, durch cPTIO abolished wurde (Abb. 5), einem Scavenger von NO [30,31,32]. Wichtig ist, dass dieser Prozess mit der biologischen Reaktion der MWCNT-induzierten LR-Entwicklung korrelierte, die schwer blockiert wurde, als cPTIO simultan appliziert wurde (Abb. 4).

Weitere Evaluierung dieser Reaktionen und der potenziellen Quelle(n) von NO, induziert durch exogen applizierte MWCNTs, enthüllte, dass NO-Produktion und nachfolgende LR-Bildung auf NR-Aktivität zurückgeführt werden konnten. In Pflanzen generiert sich NO-Produktion hauptsächlich aus NR und mammalischen NOS-ähnlichen Proteinen [28]. Allerdings ist das Pflanzen-NOS-Gen noch nicht identifiziert [35, 75, 76], obwohl einige Experimente mit Inhibitoren des mammalischen NOS-Enzyms einige Beweise für den L-Arginin-abhängigen Weg in der NO-Produktion lieferten [36, 76]. NR ist bestätigt als die wichtigste Quelle von NO in Pflanzen [28]. Frühere Studien zeigten, dass NR-abhängige NO-Produktion als nitrat-bezogenes Signal in der Regulation der Wurzelarchitektur fungiert [32, 33]. Außerdem war NR-abhängige NO-Produktion eng mit Kälteakklimation [38], Salztoleranz [50] und Abscisinsäure-induziertem Stomata-Schluss [77] assoziiert. Unsere Ergebnisse enthüllten weiter, dass Tungstat (ein Inhibitor von NR) die MWCNT-induzierte LR-Bildung offensichtlich beeinträchtigte, besonders in der LR-Länge (Abb. 6). Im Gegensatz dazu wurde nur ein leichter Rückgang in der LR-Länge beobachtet, und kein signifikanter Unterschied in der LR-Anzahl, als L-NAME (ein Inhibitor der mammalischen NOS) verwendet wurde. Konsistent zeigte der biochemische Assay, dass NR-Aktivität offensichtlich durch MWCNTs erhöht wurde (Abb. 7a), parallel zu den Veränderungen in der NO-Produktion (Abb. 5a). Obige Reaktionen konnten vollständig durch Tungstat blockiert werden (Abb. 7a, Zusatzdatei 1: Abbildung S1). Wir deduzierten somit, dass die erhöhte endogene NO-Produktion, induziert durch MWCNTs, hauptsächlich dem NR-Weg zuzuschreiben war. Sicherlich sollten weitere genetische Beweise untersucht werden.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend liefern wir Beweise, dass MWCNT-induzierte NO-Produktion über NR für die Tomaten-Lateralwurzelbildung erforderlich sein könnte und dies in Abb. 8 zusammengefasst wurde. Wichtig ist, dass die obigen Ergebnisse Einblicke in den komplexen molekularen Mechanismus der MWCNT-Funktionen in Pflanzen geben.

Schematische Darstellung der vorgeschlagenen MWCNT-induzierten Tomaten-Lateralwurzelbildung hauptsächlich über NR-abhängige NO-Produktion. Die Rolle der mammalischen NOS-ähnlichen Enzyme wurde vorläufig ausgeschlossen

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind uneingeschränkt vollständig verfügbar.

Abkürzungen

CO:

Kohlenmonoxid

cPTIO:

2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid Kaliumsalz

DAF-FM DA:

4-Amino-5-methylamino-2′,7′-difluorofluorescein-diacetat

EPR:

Elektronenparamagnetische Resonanz

GO:

Graphenoxid

H₂:

Wasserstoffgas

H₂O₂:

Wasserstoffperoxid

L-NAME:

N^G-Nitro-L-Arginin-Methylester

LR:

Laterale Wurzel

LSCM:

Laserscanning-Confokalmikroskopie

MWCNTs:

Mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren

NAA:

1-Naphthylessigsäure

NO:

Stickstoffmonoxid

NOS:

Stickstoffmonoxid-Synthase

NR:

Nitratreduktase

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

SIMR:

Stressinduzierte morphogene Reaktion

SNP:

Natriumnitroprussid

SWCNTs:

Einwandige Kohlenstoffnanoröhren

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

Tg:

Tungstat