Neuartige chemo-photothermische Therapie bei Brustkrebs mit Methotrexat-beladenen Folsäure-konjugierten Au@SiO2-Nanopartikeln

Einführung

Brustkrebs (BC), als die häufigste Krebserkrankung bei Frauen, hat in letzter Zeit mit 1,7 Millionen neuen Fällen weltweit gemeldet [1]. Aufgrund seiner komplizierten Ätiologie und des schlechten Ansprechens auf die Behandlung ist es allgemein bekannt, dass es die zentrale Ursache für krebsassoziierte Todesfälle bei Frauen ist [2,3,4,5]. Es war vorhersehbar, dass im Jahr 2014 etwa 40.000 Frauen in den USA an BC starben [2, 6, 7] „(www.cancer.org)“. Mit insgesamt 522.000 Todesfällen ist es die fünfte Todesursache durch Krebs mit rund 800.000 Fällen in weniger entwickelten und etwa gleich häufig in entwickelten Regionen [1]. In asiatischen Ländern liegt das höchste Eintrittsalter bei Erwachsenen im Alter von 40 oder 50 Jahren im Vergleich zu den westlichen Ländern, das häufig zwischen 60 und 70 Jahren liegt [8]. Die Hauptrisikofaktoren von BC sind weibliches Geschlecht, Familienanamnese, Alter und unterschiedliche generative Neigungen, wie erste Geburt im Alter von mehr als 30 Jahren, frühe Menarche und spätere Menopause sowie Nulliparität [9].

Das Hauptziel im Kampf gegen Krebs ist die Entwicklung wirksamer Therapiepläne mit geringen Toxizitäten und hohen Spezifitäten, um Tumore, hauptsächlich ihre Metastasen, zu eliminieren und ihre Rezidivprophylaxe zu fördern. Aber derzeit angewandte Ansätze zur Krebsbehandlung, wie Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie, zeigten verschiedene Nebenwirkungen [10,11,12] und alle verfehlen dieses Ziel [13, 14]

In den letzten Jahrzehnten wurden große Kämpfe bei der Behandlung von Krebs beobachtet [15, 16]. Zwischen den derzeit populären Therapieansätzen hat sich die Thermotherapie als prospektive Behandlungsmethode herausgebildet [17]. In letzter Zeit hat die photothermische Therapie (PTT) als potenziell wirksame und nicht-invasive Krebstherapie große Aufmerksamkeit auf sich gezogen [18, 19]. PTT basierend auf photoabsorbierenden Nanostrukturen ist ein anderer Weg geworden als die allgemeinen Methoden [20, 21]. Bei einer typischen PTT, die PTT-Mittel verwendet, um den Tumor zu zerstören, indem sie genügend Hyperthermie (42°C) unter Laserbestrahlung (nahes Infrarot (NIR)-Licht im Bereich von 700–1100 nm) erhält, wurde dies als sehr präzise und vernachlässigbar invasive Methode der Krebsbehandlung [22,23,24,25,26,27,28].

Eine Reihe von Nanopartikeln wurde umfassend als bildgebende Kontrastmittel, Wirkstoffträger und Wandler von Energiemodalitäten wie Laser, Radiowellen und Ultraschall in thermische Phänomene untersucht, die für therapeutische Wirkungen verantwortlich sind [29,30,31,32,33 ,34,35,36,37,38,39].

Goldnanopartikel haben in den letzten zehn Jahren aufgrund ihrer hohen lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) und ihrer leichten Oberflächenkonjugation mit Biomolekülen große Aufmerksamkeit auf sich gezogen [40]. Sie haben eine leistungsstarke photothermische Umwandlungskapazität im NIR-Bereich [41,42,43] ohne schädliche Nebenwirkungen in biologischen Systemen nachgewiesen [44].

Obwohl Goldnanopartikel als vielversprechende Photosynthesegeräte erkannt wurden, verlieren Goldnanopartikel aufgrund ihrer geringen photothermischen Stabilität bei wiederholter NIR-Bestrahlung allmählich ihre photothermische Umwandlungsfähigkeit, was ihre Verwendung in der klinischen Praxis einschränkte. Darüber hinaus sind Goldnanopartikel aufgrund ihrer schlechten Wirkstoffbeladungskapazität und ihres kontrollierten Wirkstofffreisetzungsprofils auch keine guten Wirkstoffträger [45, 46]. Alternativ war bekannt, dass mesoporöse Siliziumdioxid-Nanopartikel (MSN) aufgrund seiner höheren Fähigkeit zur Wirkstoffbeladung und des Fehlens toxischer Inhaltsstoffe, die durch seinen Abbau erzeugt werden, ein geeigneter Wirkstoff-, DNA- und Proteinträger sind. Sie haben auch eine große Oberfläche, kontrollierbare Größe, ein hochverfügbares Porenvolumen und gewünschte Oberflächenmerkmale können modifiziert werden [47].

Nanopartikel nach Konjugation an ein Chemotherapeutikum und einen auf Krebs abzielenden Liganden können Nachteile der routinemäßigen Chemotherapie, wie unspezifische Abgabe, schlechte Wasserlöslichkeit und niedrige therapeutische Indizes, verhindern [48, 49].

Wirkstoffe mit chemotherapeutischen Eigenschaften wie Doxorubicin, Cyclophosphamid, Methotrexat, Fluorouracil und Docetaxel werden einzeln oder in Kombination als Hauptbehandlungen verwendet oder mit anderen Behandlungen wie PTT unterstützt. Bei den meisten Krebspatienten treten Nebenwirkungen von Chemotherapeutika aufgrund ihrer ungenauen Verteilung im Körper des Patienten auf, die alle Organe betrifft. Diese Medikamente verletzen einige der schnell wachsenden normalen Zellen, zum Beispiel Blutzellen, Schleimhautzellen, die die inneren Organe bedecken, und Haarfollikel [50,51,52,53].

Methotrexat (MTX) ist das am häufigsten verwendete Medikament gegen rheumatoide Arthritis und verschiedene Arten von Tumoren wie Haut, Lunge, Kopf und Hals und Brust [54, 55]. Es hemmt die Dihydrofolatreduktase (DHFR), das Enzym, das zur Produktion von Tetrahydrofolat und seinen Nebenprodukten beiträgt, die für die Thymidylat- und Purinsynthese notwendig sind und beide für das Zellwachstum und die Zellproliferation lebenswichtig sind. Daher verhindert die Blockierung von DHFR Methotrexat die Synthese von 4 basischen Makromolekülen DNA, RNA, Thymidylate und Proteine ​​[56].

Leider besteht die Hauptherausforderung wie bei den meisten herkömmlichen PTT-Mitteln darin, nach systemischer Injektion eine selektive Akkumulation von GNPs im Zielgewebe zu erreichen [57,58,59]. Eine gezielte Krebstherapie ermöglicht die Abgabe eines Chemotherapeutikums an spezifische Krebszellen, während die Exposition normaler gesunder Zellen verringert wird. Dies führte dazu, dass wir Krebszellen eine höhere Dosis des Arzneimittels mit geringerer systemischer Toxizität verabreichen. Auf Liganden ausgerichtete Nanopartikel sind präzise identifizierte Krebszellmarker, die auf der Krebszelloberfläche stark exprimiert werden [40].

Folsäure (Folat oder Vitamin B9) ist ein Schlüsselstoff für das Zellwachstum und den Stoffwechsel. Aufgrund der großen Affinität von Folat zu den Folatrezeptorproteinen wird es als Element für die Krebsbekämpfung verwendet. Der Folatrezeptor als Tumorbiomarker wird in bestimmten malignen Zellen wie Brust-, Eierstock-, Lungen-, Nieren-, Gehirn- und Dickdarmkrebs überexprimiert [60]. Folat-konjugierte Arzneimittelabgabesysteme verbessern die zelluläre Aufnahme des Arzneimittels durch Endozytose [61].

Materialien und Methode

Reagenzien und Materialien

Für unsere Experimente verwendeten wir doppelt destilliertes Wasser (Ghazi Company, Tabriz, Iran) und chemische Reagenzien von analytischer Qualität. Eine Reihe von Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich Company bezogen, einschließlich:Tetraethylorthosilicat (TEOS, 98%), (3-Mercaptopropyl) Trimethoxysilan (MPTES, 95% Reinheit), Folsäure und Rhodamin B. Eine Gruppe von Materialien wurde von Merck gekauft Co:Salzsäure (HCl, 37%), Ammoniaklösung (25%), Toluol Natriumhydroxid (NaOH, 98%) und weitere Lösungsmittel. MTX wurde von Zahravi Farma Company, Tabriz, Iran gekauft.

Instrumentierung

In dieser Studie wurde zur Analyse der Partikelgröße und -morphologie die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (LEO 906, Deutschland) eingesetzt. Wir haben etwa 100 μL unserer Nanopartikel hergestellt, die in wässriger Lösung bei Raumtemperatur suspendiert sind. Die Lösung wurde auf einen auf einem Kupfergitter von TEM beschichteten Kohlenstoffilm mit anschließender Gefriertrocknung übertragen und bei 80 kV beobachtet. Die Bestimmung der Partikelgröße wurde durch DLS-Messung (dynamische Lichtstreuung) bei 25 °C unter Verwendung eines Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, UK, durchgeführt. Die Messungen des Zeta-Potentials für die präparierten NPs wurden durch Photonenkorrelationsspektroskopie (Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, UK) durchgeführt. Ein Doppelstrahl-UV-Vis-Spektrophotometer (UV-1601 PC Modell SHIMADZU, Kyoto, Japan) wurde zur Absorptionsmessung mit einer 700 &mgr;L Quarzküvette mit 10 mm Weglänge verwendet. Die Fourier-Transformations-Infrarot-(FTIR)-Spektroskopie vom Bruker Tensor 27-Spektrometer, Deutschland, wurde für die Durchführung des KBr-Pellet-Verfahrens verwendet. Die pH-Messungen wurden mit einem Metrohm 713 pH-Meter (Herisau, Schweiz) durchgeführt. Zum Rühren wurde der mechanische Rührer Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Deutschland) verwendet. Die Einkapselungseffizienz von FA und MTX wurde unter Verwendung des HPLC-Systems berechnet, das aus einem Waters 2690-Trennmodul bestand, das mit einem UV-Vis-Detektor Waters 2500 Pump 1000 Detektoren (Waters, Milford, MA) ausgestattet war. Die chromatographische Trennung wurde bei Umgebungstemperatur unter Verwendung von C18 m Bondapak (250 mm 4,6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Irland) Chromatographiesäulen durchgeführt.

Vorbereitung von Au@SiO₂ Nanopartikel

Das SiO₂ NPs wurden basierend auf der Sol-Gel-Methode synthetisiert, über die zuvor berichtet wurde [62, 63]. Im nächsten Schritt wurden Thiol-funktionalisierte Silica-beschichtete Nanopartikel (TFSNPs) nach der in unserer vorherigen Studie erwähnten Methode hergestellt [64]. Die Au-Nanopartikel wurden durch eine Citrat-Reduktionsmethode (Turkevich-Methode) hergestellt [65]. Schließlich wurde die Oberfläche von TFSNPs mit AuNPs bedeckt. Zunächst wurden TFSNPs mit Hilfe des Badbeschallers für mindestens eine Stunde in Wasser dispergiert und der AuNPs-Lösung zugesetzt und weitere 30 min beschallt. Die Reaktion wurde unter dunklen Bedingungen für zwei Tage unter dynamischem Rühren bei 25 °C durchgeführt. Das Au@SiO₂ Nanopartikel mit violettem Aussehen wurden durch Zentrifugation (10000 U/min, 10 min) gesammelt und in einem Vakuumofen getrocknet.

MTX- und FA-Laden

Sowohl MTX als auch FA wurden in das Au@SiO₂ . geladen Nanocarrier wie folgt:MTX (10 mg) wurde zu einer 10 ml gut dispergierten Suspension von Nanocarrier in PBS (5 mg/ml, pH 7,4) gegeben und einen Tag bei Raumtemperatur im Dunkeln mäßig gerührt. Das mit MTX geladene Au@SiO₂ Nanocarrier wurde durch Zentrifugation gesammelt. Der Überstand wurde zur Messung von unbeladenem MTX gesammelt. Dann hat MTX Au@SiO₂ geladen nanocarrier wurde in PBS (5 mg/ml, pH 7,4) dispergiert und FA (10 mg) wurde zu der Lösung gegeben und bei Raumtemperatur für einen weiteren Tag im Dunkeln mäßig gerührt. Das FA-MTX geladene Au@SiO₂ Nanocarrier wurde durch Zentrifugation gesammelt und der Überstand wurde für die Berechnung von ungebundenem FA im letzten Schritt abgetrennt. Das FA-MTX geladene Au@SiO₂ Nanocarrier wurde gefriergetrocknet und für die nächsten Experimente gelagert. Die Mengen an ungebundenem MTX und FA wurden unter Verwendung der HPLC-Methode nach dem zuvor berichteten Protokoll berechnet [66]. Folsäure wurde in Ammoniumhydroxid (10 Gew.-%) gelöst und mit der mobilen Phase verdünnt. Die Retentionszeit für MTX und Folsäure betrug 10,5 bzw. 5,95 min. Dreifachproben wurden aufgetragen. Die Wirkstoffbeladungseffizienz (DLE) wurde nach den folgenden Formeln berechnet:

Zelllinienauswahl und -kultur

Zwei interessierende Brustkrebszelllinien mit berichteten Oberflächenexpressionsgraden des Folatrezeptors (FR) [67] einschließlich MCF-7 und MDA-MB-231 wurden ausgewählt und von der Pasteur Cell Bank (Teheran, Iran) für die Zytotoxizitätsuntersuchungen gekauft. Die ausgewählten Zelllinien wurden in Vollmedium mit RPMI1640 (Thermowissenschaftlich), 10 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penstrep (Thermowissenschaftlich) unter thermischen und atmosphärischen Bedingungen von 37 °C, 5 % CO_{2 , und 95% Luftfeuchtigkeit.}

Zellzytotoxizitätsassay

Zelllebensfähigkeitsassays wurden durchgeführt, um die Zellproliferation nach verschiedenen NP-Behandlungen ohne Laserbestrahlung zu messen. Kurz gesagt:die MCF-7- oder MDA-MB-231-Zellen wurden in 96 Mikrotiterplatten mit einer Zelldichte von 1,5×10 ⁴ . ausplattiert 24 h lang, dann wurden die Zellen mit MTX, Au@SiO₂ . behandelt und FA-MTX beladenes Au@SiO₂ NPs. Die Zellen ohne Behandlung wurden als Kontrolle betrachtet. Im nächsten Schritt wurde der Tetrazoliumfarbstoff MTT (Sigma) in Endkonzentrationen von 5 µg/ml zu den Zellen gegeben und 4 h bei 37 °C inkubiert. Dann wurde die MTT-Lösung entfernt und die abgesetzten Furmazan-Kristalle wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) (BioIdea, Iran) unter leichtem Schütteln für 10 min gelöst. Schließlich wurde die Extinktion bei 570 nm mit einem ELISA-Lesegerät gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auf Kontrollzellen normalisiert und der Hintergrund wurde durch Subtraktion der Leerwerte entfernt.

In-vitro-Lasertherapie

Für die Low Level Laser Therapy (LLLT) wurde ein NIR-Laser mit einer Wellenlänge von 810 nm (Diodenlaser Mustang 2000, Russland) mit einer Ausgangsleistungsdosis von 185 mW zur Zerstörung von Krebszellen verwendet. Zuerst MCF-7 und MDA-MB 231 Zellen mit einer Zelldichte von 1,5×10 ⁴ behandelt mit Au@SiO₂ und FA-MTX beladenes Au@SiO₂ Die NPs wurden dann einer Laserbestrahlung mit unterschiedlichen Laserdosen (30, 60, 75, 90 und 105 J/cm ² . ausgesetzt ) und feste Belichtungszeit (139 Sek.). Die Zellen, die nur einer Laserbestrahlung (ohne NPs) ausgesetzt waren, und die Zellen ohne jegliche NPs und Laserbehandlungen gelten als positive bzw. negative Kontrolle. Nach 24 h Laserbestrahlung wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch das MTT-Assay-Verfahren gemessen [64].

Zellulärer Aufnahmetest für Nanopartikel

Eine detaillierte Überprüfung der NPs-Zellinternalisierung ist unerlässlich, um die spezifische Wirkung von oberflächenmodifizierten Nanoträgern für jede Zelllinie zu bestätigen. In der vorliegenden Arbeit haben wir sowohl Durchflusszytometrie als quantitative als auch Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Aufnahme von NPs durch MCF-7- und MDA-MB-231-Zelllinien qualitativ zu überprüfen.

Zur Suspension von NPs wurde die Rhodamin B (RhoD)-Lösung in PBS unter Rühren für 24 h bei Raumtemperatur und Dunkelkammer zugegeben (Verhinderung des Bleichens). Dann wurden RhoD-beladene NPs durch Amicon Filter mit einer nominellen Molekulargewichtsgrenze (NMWL) von 30 kDa abgetrennt und für 15 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert und mit PBS-Puffer gewaschen, um das ungebundene RhoD zu entfernen. Die Zellen wurden in Platten mit einer Dichte von 5×10 ⁵ . ausgesät pro Brunnen und lassen Sie den Zusammenfluss erreichen. Die Zellen wurden mit Rhodamin B-beladenen NPs für 30, 90 und 180 Minuten behandelt, wobei unbehandelte Zellen als Kontrolle verwendet wurden. Danach wurden die Zellen trypsiniert und mit PBS gewaschen, und dann wurde die Fluoreszenz mit durchflusszytometrischer Analyse (BD Biosciences FCASCalibur Durchflusszytometer; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) quantifiziert. Die intrazelluläre Aufnahme von Rhodamin B-markiertem NP oder NPD wurde weiter durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. MCF-7- und MDA-MB-231-Zellen wurden auf Deckgläsern gezüchtet und nach 24 h wurden die Zellen mit freiem Au@SiO₂ . behandelt NPs und MTX-FA geladenes Au@SiO₂ NPs. Nach 30, 90 und 180 Minuten Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und die Aufnahme von Rhodamin B-markierten Nanoträgern wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Olympus-Mikroskop Bh2-FCA, Japan) beobachtet.

Apoptose-Studie durch Fluoreszenzmikroskopie

Ein Verfahren zur nuklearen qualitativen Untersuchung der Apoptose ist ein Fluoreszenzfarbstoff DAPI, der an DNA bindet und durch geeignete Mikroskopie nachweisbar ist. Wir verwendeten ein Protokoll, wie es zuvor für die DAPI-Färbung [68] beschrieben wurde, kurz:die MCF-7- oder MDA-MB-231-Zellen wurden in Gefäßen im 6-Well-Format mit einer Dichte von 5 × 10 ⁵ . ausplattiert und lassen Sie sie 24 Stunden lang anhaften und wachsen. Nach der Behandlung mit MTX, Au@SiO₂ NPs und MTX-FA geladenes Au@SiO₂ Bei NPs mit und ohne Laserbehandlung wurden die Zellen mit PBS (Sigma) gewaschen und dann einer Fixierung mit 10 % Formaldehyd (Merck) unterzogen. Als nächstes wurden die Zellen mit Triton X-100 (Sigma) für 15 Minuten permeabilisiert. Nach dem richtigen Waschen wurden die Zellen mit DAPI (Sigma) für 5 Minuten gefärbt. Schließlich wurden die apoptotischen Kerne (fragmentiert oder faltig) mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus) sichtbar gemacht. Die Zellen ohne jegliche Behandlung wurden als Negativkontrolle betrachtet und die Zellen erhielten nur Laserbestrahlung als Positivkontrolle.

Untersuchungen von Zellzyklusstörungen

Die Zellzyklusverteilungen von MCF-7 und MDA-MB-231 wurden durch Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt. Auf diese Weise wurden die Zellen mit Startpopulationen von 5 × 10 ⁵ . ausgesät und erlaubt, 80 % Konfluenz zu erreichen. Anschließend wurden die mit MTX, Au@SiO₂ . behandelten Zellen NPs und MTX-FA geladenes Au@SiO₂ Es wurden NPs mit und ohne Laserbestrahlung durchgeführt. Die Zellen ohne jegliche Behandlung wurden als Negativkontrolle betrachtet und die Zellen erhielten nur Laserbestrahlung als Positivkontrolle. Dann wurden die Zellen durch Trypsinierung geerntet, gefolgt von geeigneten PBS-Waschungen. Als nächstes wurden die Zellen 48 Stunden lang mit Ethanol (Merck) fixiert. Im nächsten Schritt wurden die fixierten Zellen gewaschen, dann mit Ribonuklease A (Cinaclon) mit anschließender Zugabe von Propidiumiodid (PI) (Sigma) im Dunkeln behandelt. Die Fluoreszenzsignale wurden mit einem FACS-Set von Beckton Dicinson Company detektiert.

Statistik der Studie

Die Experimente für jeden Schritt wurden in drei Wiederholungen durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die ANOVA wurde zum Vergleich der Signifikanz zwischen den Gruppen verwendet. Die Unterschiede waren reflektierte Signifikanzen, bei denen der Wahrscheinlichkeitswert <0,05 von der SPSS-Software berechnet wurde.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung synthetisierter NPs

Das Au@SiO₂ NPs wurde in vier Schritten hergestellt:1-Synthese von SiO₂ Nanopartikel, 2-Addition eines Thiol-haltigen Linkers an SiO2-NPs, 3-Synthese von Gold-Nanopartikeln und 4-Anheften der Gold-Nanopartikel an die Oberfläche von SiO2-Linker-Komplexen (Abb. 1). Die erfolgreiche Synthese von Au@SiO₂ wurde durch FTIR bestätigt (Abb. 2a). Der Si-O-Si-Peak erschien bei etwa 1088 cm ^-1 . Ein breiter Peak bei 3000–3700 und 803 cm ^–1 wird der Dehnung bzw. der Biegung außerhalb der Ebene von freien Silanol-OH-Gruppen zugeschrieben. Die aliphatische C-H-Streckschwingung zeigte sich als starker Peak bei 2950 cm ^–1 . Das C–O von drei Methoxysilangruppen wurde durch einen Peak bei 1191 cm ^–1 . gezeigt .

Das schrittweise Syntheseschema zur Herstellung von Folat- und Methotrexat-beladenem biokompatiblem Au@SiO₂ NPs Nanopartikel

a ) FTIR-Spektren von Au@SiO₂ Nanopartikel, b ) Größenverteilung von FA-MTX konjugiertem Au@SiO₂ NPs gemessen durch dynamische Lichtstreuung (DLS) c ) Das Zetapotential von Au@SiO₂ und FA-MTX-konjugiertes Au@SiO₂ NPs gemessen durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bei pH=7.4 und T=25 °C, d ) Chromatogramm von unbeladenem MTX und FA getrennt von FA-MTX-konjugiertem Au@SiO₂ NP gleichzeitig mit HPLC-Methode gemessen

Messungen der dynamischen Lichtstreuung (DLS) zeigten, dass FA-MTX-konjugiertes Au@SiO₂ Die Größe der NP lag im Nanometerbereich (105 ± 2,3 nm) mit enger Größenverteilung (Abb. 2b).

Das Zetapotential ist ein wichtiger physikalisch-chemischer Parameter, der die Stabilität von Nanosuspensionen beeinflusst. Extrem positive oder negative Zetapotentialwerte verursachen größere Abstoßungskräfte. Andererseits führt die hohe Ladung der Partikel, egal ob positiv oder negativ, dazu, dass die NPs von den Fresszellen der Leber aufgenommen und vom Körper entsorgt werden. Bei kombinierter elektrostatischer und sterischer Stabilisierung ist ein minimales Zetapotential von ± 20 mV wünschenswert [69,70,71]. Die Zetapotentialdaten von NPs wurden vor und nach der Beladung mit MTX-FA bei pH=7.4 und T=25 °C verglichen (Abb. 2c). Die erhaltenen Zetapotentiale von Au@SiO₂ Die NPs betrugen +13,3 mV, die nach dualer Arzneimittelbeladung auf -19,7 mV sanken, was im wünschenswerten Bereich lag. MTX und FA hatten eine negative Nettoladung bei pH (7,4) über ihrem pka (3,8 und 4,8, 3,5 und 4,3) aufgrund der Deprotonierung zweier Carbonsäuregruppen in ihrer Struktur ([72], https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.). Daher nach gleichzeitigem Laden von MTX und FA auf Au@SiO₂ NPs, die Nettoladung wurde negativ.

Die TEM-Analyse liefert die definitive individuelle Partikelgröße. Au-Nanopartikel wurden als dunkle Kugeln gesehen, die auf den SiO2-NPs als graue Bettschicht dispergiert waren. TEM-Bilder bestätigten, dass die Au@SiO2-NPs mit homogener Kugelform synthetisiert wurden, wobei die durchschnittliche Partikelgröße etwa 25 nm betrug (Abb. 3).

TEM-Bild von Au@SiO₂ Nanopartikel

Aufladen von Medikamenten

Hier vermittelt Folat die erhöhte Aufnahme von GNPs in bestimmte Arten von Krebszellen, die den Folatrezeptor durch rezeptorvermittelte Endozytose überexprimierten, um die geringe Wirksamkeit der Internalisierung von GNPs zu überwinden Ausrichtung [67, 73].

Nach Konjugation von MTX- und FA-Molekülen in Au@SiO₂ NPs änderte sich das Zetapotential von +13,3 auf -19,7 mV. Die geschätzten pKa-Werte der beiden Carbonsäureeinheiten von MTX betragen 3,8, 4,8 und FA beträgt 3,5 und 4,3 [72], https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Daher wurde die Nettoladung aufgrund der Deprotonierung von zwei Carbonsäuregruppen von MTX und FA bei einem pH-Wert von 7,4, der über ihrem pka liegt, negativ, was die erfolgreiche Konjugation von MTX und FA an Au@SiO₂ NPs. De Ying Tian et al. zeigen, dass die MTX-Beladung auf Au-Nanopartikeln mit 18 und 30 mm Durchmesser 15 ± 0,4 % bzw. 10 ± 1,0 % beträgt [74]. In dieser Studie wurden FA und MTX in Au@SiO2-NPs mit einer Einkapselungseffizienz von 22.6 bzw. 77.5 % geladen. Chromatogramm des gleichzeitigen MTX- und FA-Beurteilungspeaks ist in Abb. 2d gezeigt.

Zellaufnahme

Da die intrazellulären photothermischen Mittel die Effizienz der photothermischen Krebstherapie verbessern können [75], wurde angenommen, dass die Zellinternalisierung photothermischer Materialien erforderlich ist. In vitro ein zellulärer Aufnahmetest wurde mit menschlichen MDA-MB-231-Zellen von Brustkrebs durchgeführt, von denen bekannt ist, dass sie den Folatrezeptor stark überexprimieren [40]. Untersuchung der Rolle von FA als Targeting-Agens und der Effizienz der Oberflächenbeschichtung bei der Aufnahme von Au@SiO₂ NPs von Zielzellen, MCF-7- und MDA-MB-231-Zellen wurden mit Au@SiO2-NPs und MTX-FA-beladenen Au@SiO2-NPs behandelt. Die Ergebnisse der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der Zellaufnahme sind in Abb. 4 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aufnahme von Au@SiO2-NPs sowohl in MCF-7 als auch in MDA-MB-231 über die Zellkulturzeit für alle Proben erhöht war (Abb. 4 und 5 .). ). Auch nach Oberflächendekoration von Au@SiO2-NPs mit MTX und FA war die Zellaufnahme sowohl auf MCF-7 als auch auf MDA-MB-231 als Folatrezeptor-exprimierende Zellen signifikant erhöht. Die Aufnahme von MTX-FA-beladenen Au@SiO2-NPs in MDA-MB-231-Zellen war höher als die von MCF-7. Da MDA-MB-231-Zellen höhere Spiegel von Oberflächenfolatrezeptoren exprimieren, wurde ein hoher Anteil der auf Folatrezeptoren gerichteten NPs über den rezeptorvermittelten Endocytose-Mechanismus eingetragen, was zu einer höheren zellulären Aufnahme führte. In einer anderen Studie findet die erhöhte Zellinternalisierung der Folat-konjugierten NPs nur in den Krebszellen statt, die den aHFR überexprimieren, und nicht in den gesunden Zellen, die weniger aHFRs auf der Zelloberfläche exprimieren [40]. Die Konjugation von Au@SiO2-NPs mit FA kann die Zellaufnahme von NPs und Methotrexat erleichtern, was zu einer erhöhten Toxizität gegenüber MDA-MB-231-Zellen führt [76].

Quantitativer Zellaufnahmetest von Rhodamin B-markiertem Au@SiO₂ Nanopartikel (NP) oder Rhodamin B-markiertes MTX-FA beladenes Au@SiO₂ Nanopartikel (NPD) in MCF-7 (a ) und MDA-MB-231(b ) Zelllinien für Expositionsdauern von 0,5 h, 1,5 h und 3 h, erhalten durch Durchflusszytometrie. Als Negativkontrolle wurden unbehandelte Zellen beider Zelllinien verwendet. c Vergleich der mittleren Fluoreszenzintensität von Rhodamin B-markiertem Au@SiO₂ Nanopartikel (NP) oder Rhodamin B-markiertes MTX-FA beladenes Au@SiO₂ Nanopartikel (NPD) für Expositionsdauern von 0,5 h, 1,5 h und 3 h durch Durchflusszytometrie erhalten

A Qualitativer Zellaufnahmetest mit Rhodamin B-markiertem Au@SiO₂ Nanopartikel (NP) in MCF7 mit Expositionsdauern von 30 (a ), 90 (b ) und 180 (c ) min oder Rhodamin B-markiertes MTX-FA beladenes Au@SiO₂ Nanopartikel (NPD) mit Expositionsdauern von 30 (d ), 90 (e ) und 180 (f ) min und (B ) Qualitativer Zellaufnahmetest mit Rhodamin B-markiertem Au@SiO₂ Nanopartikel (NP) in MDA-MB-231 mit Expositionsdauern von 30 (a ), 90 (b ) und 180 (c ) min oder Rhodamin B-markiertes MTX-FA beladenes Au@SiO₂ Nanopartikel (NPD) mit Expositionsdauern von 30 (d ), 90 (e ) und 180 (f ) min durch Fluoreszenzmikroskopie erfasst

Zytotoxizitätstest

In-vitro-Studien zur zellulären Zytotoxizität des freien MTX, blank Au@SiO₂ NPs und MTX-FA-konjugiertes Au@SiO₂ NPs wurden durch den MTT-Assay für 24, 48 und 72 Stunden bewertet (Fig. 6). Die Ergebnisse des MTT-Assays zeigten, dass Au@SiO₂ NPs hatten keine zytotoxische Wirkung auf die Zelllinien MCF-7 und MDA-MB-231. Darüber hinaus sollten die Zytotoxizitätswirkungen von sowohl freiem MTX als auch MTX-FA-konjugiertem Au@SiO₂ . verglichen werden NPs wurde für alle Behandlungszeiten die gleiche MTX-Konzentration (25, 50, 100 und 200 μg/ml) verwendet. Die Ergebnisse der Zellzytotoxizität zeigen, dass freies MTX oder MTX-FA-konjugiertes Au@SiO₂ NPs zeigten in beiden Zelllinien nach 24 Stunden Behandlung eine Mortalitätsrate von etwa 10-25%. Frühere Studien berichteten über die proliferative Wirkung von Gold-Nanopartikeln auf verschiedene Zelllinien wie murinen Osteoblasten MC3T3-E1-Zellen und humane Parodontalligament-Stammzellen unter In-vitro-Bedingungen. Unsere Ergebnisse stimmen mit diesen Studien überein und Abbildung 6a und b zeigen die proliferative Wirkung freier Au@SiO2-NPs. Daher kann die gleiche zytotoxische Wirkung von mit MTX und FA-MTX beladenen Au@SiO2-Nanopartikeln (NPD) auf dieses Phänomen zurückzuführen sein [77, 78].

a MCF-7 und (b ) Wachstumshemmungsraten von MDA-MB-231-Zellen nach Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von NP-, MTX- und FA-MTX-beladenem Au@SiO₂ Nanopartikel (NPD) nach 24, 48 und 72 Stunden Expositionszeit

Laserbestrahlung

In dieser Studie wurde die Zelllebensfähigkeit von MCF-7- und MDA-MB 231-Zellen, die mit Au@SiO₂ . behandelt wurden, untersucht NPs und MTX-FA geladenes Au@SiO₂ NPs nach Laserbestrahlung mit einer Dosis im Bereich von 30–105 J/cm ² wurde durch MTT-Assay untersucht. Die Sterblichkeitsrate von MCF-7- und MDA-MB-231-Zellen, die mit MTX-FA beladenem Au@SiO₂ . behandelt wurden NPs (die MTX-Konzentration betrug 100 μg/ml) nach LLLT in einer Dosis von 75 J/cm ² waren etwa 39 bzw. 45,5%. Unter gleichen Bedingungen wurden die Zellen mit Au@SiO₂ . behandelt NPs nach Laserbestrahlung oder Laser allein zeigten keinen offensichtlichen Zelltod. Auch durch Erhöhung der Laserdosis auf 105 J/cm ² die Sterblichkeitsrate beider Zelllinien stieg auf 60-75%, während beide Zelllinien mit Au@SiO₂ . behandelt wurden NPs + Laser oder Laser allein bei gleicher Bestrahlungsdosis zeigten keine zytotoxische Wirkung. Der IC50-Wert für MCF-7- und MDA-MB-231-Zellen nach einer Kombinationstherapie mit MTX-FA beladenem Au@SiO₂ NPs (MTX-Dosis von 100 µg/ml) und LLLT wurden bei einer Dosis von 90 und 75 J/cm ² . erhalten , bzw. Andererseits die Sterblichkeitsrate von MTX und MTX-FA beladenem Au@SiO₂ NPs ohne Laserbestrahlung bei einer MTX-Dosis von 100 µg/ml (ausgewählte Dosis für die Lasertherapiestudie) lagen in beiden Zelllinien zwischen 15-25%. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Kombination von mit MTX-FA beladenem Au@SiO₂ NPs and laser therapy showed a synergistic effect in both cell lines and significantly decreased the cell viability (p <0.001) compared to cells received only laser irradiation. These results indicated that NPs treatment, especially with targeting strategy can improved the efficacy of laser therapy in breast cancer cell destruction (Fig. 7).

A comparison of cell growth inhibition rates exposed to different laser powers (30, 60, 75, 90 and 105 J/cm ² ) for treatment groups of laser alone, laser + Au@SiO2 nanoparticles and laser + MTX-FA loaded Au@SiO2 nanoparticles directed for two cell line MCF-7 (a ) and MDA-MB-231(b ) with subsequent checking after 24h

Apoptosis study by DAPI

The apoptosis were studied in MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treatment with Au@ SiO₂ NPs; MTX-FA loaded Au@ SiO₂ NPs with or without laser to know if laser treatment could enhance the efficacy of chemotherapy. Our results summarized in Fig. 8 indicated that normal MCF-7 and MDA-MB-231 cells without any treatment set as control as well as cells treated with laser alone or free Au@SiO₂ NPs without laser irradiation had typical nuclei, lacking any apoptosis. However, MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with free MTX, Au@ SiO₂ NPs with laser irradiation and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs without laser irradiation showed partial apoptotic nuclei (Fig. 8). The cells treated with MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs in combination with laser irradiation (810 nm, 75 J/cm ² , 139 sec) showed a major drop in MCF-7 and MDA-MB-231 cell population. Therefore, laser irradiation efficacy was enhanced after MTX/FA loaded Au@SiO₂ NPs uptake on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Hence, the novel developed MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs has the capability of augmenting the photothermal effects by highly fragmented cell nuclei, a radical rise in cell loss and complete damage of cells.

Apoptosis assay using DAPI staining for MCF-7 or MDA-MB-231 cells, images captured using an inverted microscope. The untreated cells as the negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP (c ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h )

Cell cycle

Cell cycle distributions after treatment with MTX, Au@SiO₂ NPs and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs either in combination with LLLT (75 J/cm ² ) or without laser irradiation was studied in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells using flowcytometry and PI staining of DNA. Our study indicated that in MDA-MB-231 or MCF-7 cells, the percentage of non-treated cells (control group) were actively in phase S (Fig. 9a, b). Using 75 J/cm ² laser treatments reduced the percentage of cells in S-phase in a non-significant manner. On the other hand the cells irradiated with LLLT without NP and drug treatment showed the significant increase in Go/G1 cell population indicated the safety of LLLT alone. Also NPs treatment did not disturb the cell cycle in both cell lines. Treatment of cells with free MTX in the absence or presence of laser irradiation showed some disturbances in cell cycles, including reduction of cells in S-phase. Using NPD alone reduced the cells in S-phase. And interestingly using MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) enhanced the cell percentage in sub Go/G1 as a sign of apoptosis [72]. Also the percentage of the MDA-MB-231 cells present in sub Go/G1 (around 18%) were significantly higher than MCF-7 cells (12%) in MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) treatment group due to the higher uptake of NPs in MDA-MB-231 cells.

Cell cycle distributions investigated for MCF-7 (A ) or MDA-MB-231 (B ) cells. The untreated cells as negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (c ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h ), C ) Quantitative results of cell cycle arrest and its distribution

Ramos et al , showed that in tumor cells, LLLT increases the percentage of cells in S and G2 /M phases, also they detected a reduction in proliferation and enhancing in senescence [79]. The cell cycle study after LLLT (15 J/cm2) showed a G1 arrest, which is in line with growth stopover in irradiated TK6 cells [80]. Another group reported that PTT is primarily disturbing cells in the S phase and increasing the cell population and arrest in the G2/M phase [81]. As a result, PTT can induce radio-sensitization of the cells via disturbing cell cycle [82]. Their results are in accordance with our study, which showed cell cycle disturbance and reduction of cells in S-phase. Our study also showed the increase in population of apoptotic cells (sub Go/G1) after combination chemo-photothermal therapy. Therefore, applying a combination of LLLT and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) as breast cancer targeted nanoparticles could enhance the breast cancer therapy efficacy.

Schlussfolgerungen

In this study MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs was designed for target breast cancer therapy in combination with LLLT as noninvasive, FDA approved laser therapy. MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs with spherical morphology and mean diameter of 25nm and surface charge of -19.7 was obtained. This size and surface charge is in a suitable range to increase the bio-distribution of NPs. The successful targeted strategy of this novel developed NPs was approved with a higher cellular uptake percentage of MDA-MB-231 compared to MCF-7 as two breast cancer cell lines with different folate receptor expression. The MTT assay, DAPI staining and cell cycle study's results indicated that the combination of chemo-photothermal therapy showed synergistic effect and the cytotoxicity and apoptosis effect on both breast cancer cell lines especially on MDA-MB-231 cells was increased significantly(p <0.001). Since the Au@SiO₂ nanoparticles or LLLT showed no cytotoxic effects, it can be concluded that our therapeutic design has synergistic effects on targeted site. The findings of this study could be useful for designing future cancer therapy programs using bio-chemotherapy combined with low level lasers.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend

Abkürzungen

Au@SiO₂ :

Silica coated gold

BC:

Breast cancer

DHFR:

Dihydrofolate reductase

DMSO:

Dimethyl Sulfoxide

FA:

Folate

LLLT:

Low level laser therapy

LSPR:

Lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz

MSN:

Mesoporöse Siliziumdioxid-Nanopartikel

MTX:

Methotrexate

NIR:

Nahinfrarot

NPs:

Nanopartikel

PTT:

Photothermische Therapie

RhoD:

rhodamine B

TFSNPs:

Thiol-functionalized silica-coated nanoparticles