Innovative Methotrexat-Folat-Nanopartikel-Therapie verbessert Brustkrebsbehandlung mit laserassistiertem photothermischem Ansatz

Zusammenfassung

Low-Level-Lasertherapie (LLLT) ist als sichere Art der Phototherapie bekannt, um Tumorengewebe/-zellen zu targetieren. Darüber hinaus erhöht die Verwendung gezielter Nanopartikel die Erfolgsaussichten der Krebstherapie. Diese Studie wurde konzipiert, um den kombinierten Effekt von Folat (FA)/Methotrexat (MTX) beladenen, silica-beschichteten Gold (Au@SiO₂) Nanopartikeln (NPs) und LLLT im Kampf gegen Brustkrebs zu untersuchen.

NPs wurden synthetisiert und mittels FTIR, TEM und DLS-Zeta charakterisiert. Die NPs wiesen eine sphärische Morphologie mit einem mittleren Durchmesser von ca. 25 nm und positiver Ladung (+13,3 mV) auf, während nach Konjugation mit FA und MTX ihre Nettoladung auf ca. -19,7 mV sank.

Unsere Ergebnisse in Zellaufnahme-Studien zeigten eindeutig eine verstärkte zelluläre Aufnahme von NPs nach FA- und MTX-beladenen NPs in beiden Brustkrebszelllinien, insbesondere auf MDA-MB-231 aufgrund hoher Expression von Folsäurerezeptoren. Die Ergebnisse zeigten, dass LLLT einen proliferativen Effekt auf beide Brustkrebszelllinien hatte, aber in Gegenwart des gezielten Brustkrebs-Nanopartikels die Wirksamkeit der kombinierten Chemo-Photothermischen Therapie signifikant erhöht wurde, nachgewiesen durch MTT-Assay (p<0,05), DAPI-Färbung und Zellzyklus-Befunde. Der höchste apoptotische Effekt auf Brustkrebszelllinien wurde in Zellen beobachtet, die einer Kombination aus MTX-FA-beladenen Au@SiO₂-NP und LLLT ausgesetzt waren, bewiesen durch DAPI-Färbung und Zellzyklus (durch Erhöhung der Zellarrest in subG0/G1). Zusammenfassend verbessert eine Kombination aus Chemotherapie und LLLT das Potenzial der Brustkrebsbehandlung mit minimalen Nebenwirkungen.

Einleitung

Brustkrebs (BC), als der häufigste Frauen betreffende Krebs, wurde kürzlich mit 1,7 Millionen neuen Fällen weltweit berichtet. Aufgrund seiner komplexen Ätiologie und schlechten Ansprechens auf die Behandlung ist er oft die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle von Frauen weltweit. Etwa 40.000 Frauen in den USA starben 2014 voraussichtlich an BC. Mit 522.000 Todesfällen insgesamt ist es die fünfthäufigste Krebstodesursache mit etwa 800.000 Fällen in weniger entwickelten und etwa gleicher Häufigkeit in entwickelten Regionen. In asiatischen Ländern liegt das größte Erkrankungsalter bei Erwachsenen von 40 oder 50 Jahren im Vergleich zu westlichen Ländern, wo er häufig bei 60–70 Jahren auftritt. Die Hauptrisikofaktoren für BC sind weibliches Geschlecht, familiäre Vorgeschichte, Alter und variierende generative Neigungen, wie erste Geburt nach 30 Jahren, frühe Menarche und späte Menopause sowie Nulliparität.

Das Hauptziel im Kampf gegen Krebs ist die Entwicklung effektiver Therapiepläne mit niedriger Toxizität und hoher Spezifität, um Tumoren, hauptsächlich ihre Metastasen, zu eliminieren und deren Rezidiv zu verhindern. Derzeit verwendete Krebstherapieansätze wie Chirurgie, Chemotherapie und Bestrahlung zeigen jedoch verschiedene Nebenwirkungen und erreichen dieses Ziel alle nicht.

Die letzten Jahrzehnte haben große Anstrengungen in der Krebsbehandlung gesehen. Unter den aktuellen populären therapeutischen Ansätzen hat sich die Thermotherapie als vielversprechende Behandlungsmethode herauskristallisiert. Kürzlich hat die photothermische Therapie (PTT) als potenziell effektive und nicht-invasive Krebstherapie erhebliche Aufmerksamkeit erregt. PTT basierend auf photoabsorbierenden Nanostrukturen ist zu einem anderen Weg als den allgemeinen Methoden geworden. Bei einer typischen PTT, die PTT-Agenten verwendet, um Tumoren durch Erreichen ausreichender Hyperthermie (42 °C) unter Laserbestrahlung (Nahinfrarot (NIR) Licht im Bereich 700–1100 nm) zu zerstören, wurde als hochpräzise und minimalinvasive Methode der Krebsbehandlung untersucht.

Eine Reihe von Nanopartikeln wurde umfassend als Bildgebungskontrastmittel, Drug-Delivery-Carrier und Transformator von Energiemodalitäten wie Laser, Radiowellen und Ultraschall in thermische Phänomene untersucht, die für therapeutische Effekte verantwortlich sind.

Gold-Nanopartikel haben in den letzten zehn Jahren große Aufmerksamkeit auf sich gezogen aufgrund ihrer hohen lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) und leichten Oberflächenkonjugation mit Biomolekülen. Sie haben eine hohe photothermische Umwandlungskapazität im NIR-Bereich ohne schädliche Nebenwirkungen in biologischen Systemen gezeigt.

Obwohl Gold-Nanopartikel als vielversprechende Photosensitisatoren erkannt wurden, verlieren sie aufgrund ihrer schlechten photothermischen Stabilität bei repetitiver NIR-Bestrahlung allmählich ihre photothermische Umwandlungsfähigkeit, was ihren Einsatz in der klinischen Praxis limitiert. Zusätzlich sind Gold-Nanopartikel keine guten Drug-Carrier aufgrund ihrer schlechten Drug-Loading-Kapazität und kontrollierten Drug-Release-Profile. Alternativ war mesoporöses Silica-Nanopartikel (MSN) als geeigneter Drug-, DNA- und Protein-Carrier bekannt aufgrund seiner höheren Drug-Loading-Fähigkeit und fehlender toxischer Inhalte aus seiner Degradation. Sie haben auch eine große Oberfläche, kontrollierbare Größe, hochverfügbares Porenvolumen und gewünschte Oberflächenmerkmale für Modifikationen.

Nanopartikel nach Konjugation mit einem Chemotherapeutikum und einem Krebs-Targeting-Liganden können Nachteile der routinemäßigen Chemotherapie hemmen, wie unspezifische Abgabe, schlechte Wasserlöslichkeit und niedrige therapeutische Indizes.

Chemotherapeutische Wirkstoffe wie Doxorubicin, Cyclophosphamid, Methotrexat, Fluorouracil und Docetaxel werden einzeln oder in Kombination als Hauptkernbehandlungen oder unterstützt durch andere Behandlungen wie PTT verwendet. Die meisten Krebspatienten erleben Nebenwirkungen von Chemotherapeutika aufgrund ihrer unspezifischen Verteilung im Körper, die alle Organe betrifft. Diese Medikamente schädigen einige schnell wachsende normale Zellen, beispielsweise Blutzellen, Schleimhautzellen, die innere Organe auskleiden, und Haarfollikel.

Methotrexat (MTX) ist eines der am häufigsten verwendeten Medikamente bei rheumatoider Arthritis und verschiedenen Tumorarten wie Haut, Lunge, Kopf und Hals sowie Brust. Es inhibiert Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), das Enzym, das zur Produktion von Tetrahydrofolat und seinen Nebenprodukten beiträgt, die für Thymidylat- und Purinsynthese notwendig sind, und beide sind lebenswichtig für Zellwachstum und Zellproliferation. Daher verhindert die Blockade von DHFR durch Methotrexat die Synthese von 4 grundlegenden Makromolekülen: DNA, RNA, Thymidylaten und Proteinen.

Leider besteht, ähnlich wie bei den meisten konventionellen PTT-Agenten, die Hauptforderung darin, eine selektive Anreicherung von GNPs im Zielgewebe nach systemischer Injektion zu erreichen. Zielgerichtete Krebstherapie ermöglicht die Abgabe von Chemotherapeutika an spezifische Krebszellen, während die Exposition normaler gesunder Zellen verringert wird. Dies ermöglicht die Verabreichung höherer Medikamentendosen an Krebszellen mit geringerer systemischer Toxizität. Ligand-zielgerichtete Nanopartikel identifizieren präzise Krebszellmarker, die auf der Krebszelloberfläche hoch exprimiert sind.

Folsäure (Folat oder Vitamin B9) ist ein Schlüsselmaterial für Zellwachstum und Stoffwechsel. Aufgrund der hohen Affinität von Folat für Folsäurerezeptor-Proteine wird es als Element für Krebs-Targeting genutzt. Der Folsäurerezeptor als Tumormarker ist in bestimmten malignen Zellen wie Brust-, Eierstock-, Lungen-, Nieren-, Gehirn- und Darmkrebs überexprimiert. Folat-konjugierte Drug-Delivery-Systeme verbessern die zelluläre Aufnahme von Medikamenten über Endozytose.

Materialien und Methoden

Reagenzien und Materialien

Wir verwendeten doppelt destilliertes Wasser (Ghazi Company, Tabriz, Iran) und analytische Reagenzien für unsere Experimente. Mehrere Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich Company bezogen, darunter: Tetraethylorthosilikat (TEOS, 98 %), (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan (MPTES, 95 % Reinheit), Folsäure und Rhodamin B. Eine Gruppe von Materialien wurde von Merck Co bezogen: Salzsäure (HCl, 37 %), Ammoniaklösung (25 %), Toluol, Natriumhydroxid (NaOH, 98 %) und weitere Lösungsmittel. MTX wurde von Zahravi Farma Company, Tabriz, Iran gekauft.

Instrumentierung

In dieser Studie wurde für die Analyse der Partikelgröße und -morphologie Transmissionelektronenmikroskopie (TEM) (LEO 906, Deutschland) eingesetzt. Wir bereiteten ca. 100 µL unserer in wässriger Lösung suspendierten Nanopartikel bei Raumtemperatur vor. Die Lösung wurde auf einen mit Kohlenstofffilm beschichteten Kupfergitter für TEM übertragen mit nachfolgender Gefriertrocknung und bei 80 kV beobachtet. Die Partikelgrößenbestimmung erfolgte durch DLS (dynamische Lichtstreuung) Messung bei 25 °C mit einem Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, UK. Die Zeta-Potenzial-Messungen für die hergestellten NPs wurden durch Photonenkorrelationsspektroskopie (Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, UK) durchgeführt. Ein Doppelstrahl-UV-Vis-Spektrophotometer (UV-1601 PC Modell SHIMADZU, Kyoto, Japan) wurde für Absorptionsmessungen mit 700 µL Quarzküvette mit 10 mm Weglänge eingesetzt. Fourier-Transform-Infrarot (FTIR) Spektroskopie vom Bruker Tensor 27 Spektrometer, Deutschland wurde für die KBr-Pellet-Methode genutzt. Die pH-Messungen erfolgten mit einem Metrohm 713 pH-Meter (Herisau, Schweiz). Der mechanische Rührer Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Deutschland) wurde für Rührvorgänge verwendet. Die Einkapselungseffizienz von FA und MTX wurde mit dem HPLC-System berechnet, bestehend aus Waters 2690 Trennmodul ausgestattet mit UV-Vis-Detektor Waters 2500 Pumpe 1000 Detektoren (Waters, Milford, MA). Die chromatographische Trennung wurde bei Umgebungstemperatur mit einer C18 m Bondapak (250 mm 4,6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Irland) Chromatographiesäule implementiert.

Herstellung von Au@SiO₂-Nanopartikeln

Die SiO₂-NPs wurden basierend auf der zuvor berichteten Sol-Gel-Methode synthetisiert. Im nächsten Schritt wurden thiolfunktionalisierte silica-beschichtete Nanopartikel (TFSNPs) gemäß der in unserer vorherigen Studie erwähnten Methode hergestellt. Die Au-Nanopartikel wurden durch eine Citratreduktionsmethode (Turkevich-Methode) produziert. Schließlich wurde die Oberfläche der TFSNPs mit AuNPs bedeckt. Zunächst wurden TFSNPs mit Hilfe des Badsonikators für mindestens eine Stunde in Wasser dispersiert und zur AuNP-Lösung gegeben und weitere 30 min soniziert. Die Reaktion erfolgte unter dunklen Bedingungen für zwei Tage unter dynamischem Rühren bei 25 °C. Die Au@SiO₂-Nanopartikel mit lila gefärbtem Erscheinungsbild wurden durch Zentrifugation (10.000 U/min, 10 min) gesammelt und in einem Vakuumofen getrocknet.

MTX- und FA-Beladung

MTX sowie FA wurden in den Au@SiO₂-Nanocarrier wie folgt beladen: MTX (10 mg) wurde zu einer 10 mL gut dispersen Suspension des Nanocarriers in PBS (5 mg/mL, pH 7,4) gegeben und bei Raumtemperatur für einen Tag unter dunklen Bedingungen mäßig agitiert. Der MTX-beladene Au@SiO₂-Nanocarrier wurde durch Zentrifugation gesammelt. Der Überstand wurde für die Messung des ungebundenen MTX gesammelt. Dann wurde der MTX-beladene Au@SiO₂-Nanocarrier in PBS (5 mg/mL, pH 7,4) dispersiert und FA (10 mg) wurde zur Lösung gegeben und für einen weiteren Tag bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen mäßig gerührt. Der FA-MTX-beladene Au@SiO₂-Nanocarrier wurde durch Zentrifugation gesammelt und der Überstand im letzten Schritt für die Berechnung des ungebundenen FA separiert. Der FA-MTX-beladene Au@SiO₂-Nanocarrier wurde gefriergetrocknet und für nächste Experimente gelagert. Die Mengen an ungebundenem MTX und FA wurden mit der HPLC-Methode gemäß dem zuvor berichteten Protokoll berechnet. Folsäure wurde in Ammoniumhydroxid (10 Gew.%) gelöst und mit der mobilen Phase verdünnt. Die Retentionszeiten für MTX und Folsäure betrugen 10,5 bzw. 5,95 min. Triplicate Proben wurden angewendet. Die Drug-Loading-Effizienz (DLE) wurde durch folgende Formeln berechnet: ee(%) = (initial totale Medikamente - unabsorbierte Medikamente) / Initial totale Medikamente × 100.

Zelllinien-Auswahl und Kultur

Zwei Brustkrebszelllinien von Interesse mit berichteten Oberflächenexpressionsniveaus des Folsäurerezeptors (FR) einschließlich MCF-7 und MDA-MB-231 wurden ausgewählt und von der Pasteur Cell Bank (Tehran, Iran) für Zytotoxizitätsuntersuchungen bezogen. Die ausgewählten Zelllinien wurden in vollem Medium mit RPMI1640 (Thermoscientific), 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penstrep (Thermoscientific) unter thermischen und atmosphärischen Bedingungen von 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit gezüchtet.

Zellzytotoxizitäts-Assay

Zellviabilitätsassays wurden zur Messung der Zellproliferation nach verschiedenen NP-Behandlungen ohne Laserbestrahlung durchgeführt. Kurz: MCF-7 oder MDA-MB-231 Zellen wurden in 96-Mikroplatten mit einer Zelldichte von 1,5×10⁴ für 24 h ausgesät, dann wurden Zellen mit MTX, Au@SiO₂ und FA-MTX beladenen Au@SiO₂ NPs behandelt. Zellen ohne Behandlung dienten als Kontrolle. Im nächsten Schritt wurde der Tetrazoliumfarbstoff MTT (Sigma) bei einer Endkonzentration von 5 µg/ml zu den Zellen gegeben und bei 37 °C für 4 h inkubiert. Dann wurde die MTT-Lösung entfernt und die sich absetzenden Formazan-Kristalle in Dimethylsulfoxid (DMSO) (BioIdea, Iran) unter sanftem Schütteln für 10 min gelöst. Schließlich wurde die Absorption bei 570 nm mit einem ELISA-Reader gemessen. Die Zellviabilität wurde auf Kontrollzellen normalisiert und der Hintergrund durch Subtraktion der Blanko-Messungen entfernt.

In-vitro-Lasertherapie

Für Low-Level-Lasertherapie (LLLT) wurde ein 810 nm Wellenlänge NIR-Laser (Diodenlaser Mustang 2000, Russland) mit 185 mW Ausgangsleistung für die Zerstörung von Krebszellen verwendet. Zunächst wurden MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen mit einer Zelldichte von 1,5×10⁴ mit Au@SiO₂ und FA-MTX beladenen Au@SiO₂ NPs behandelt und dann Laserbestrahlung mit verschiedenen Laserdosen (30, 60, 75, 90 und 105 J/cm²) und fester Expositionszeit (139 s) ausgesetzt. Zellen, die nur Laserbestrahlung (ohne NPs) ausgesetzt waren, und Zellen ohne jegliche NP- und Laserbehandlung dienten als positive und negative Kontrolle. Nach 24 h Laserbestrahlung wurde die Zellviabilität mittels MTT-Assay-Methode gemessen.

Nanopartikel-Zellaufnahme-Assay

Eine detaillierte Überprüfung der NP-Zellinternalisierung ist essenziell, um den spezifischen Effekt des oberflächenmodifizierten Nanocarriers für jede Zelllinie zu bestätigen. In der vorliegenden Arbeit setzten wir sowohl Durchflusszytometrie als quantitative als auch Fluoreszenzmikroskopie für qualitative Überprüfung der NP-Aufnahme durch MCF-7 und MDA-MB-231 Zelllinien ein.

Für die Suspension der NPs wurde Rhodamin B (RhoD) Lösung in PBS unter Rühren für 24 h bei Umgebungstemperatur und dunklem Raum (Verhinderung von Bleichen) hinzugefügt. Dann wurden RhoD-beladene NPs durch Amicon-Filter mit nominalem Molekulargewichtslimit (NMWL) von 30 kDa separiert und 15 min bei 5000 U/min zentrifugiert und mit PBS-Puffer gewaschen, um ungebundenes RhoD zu eliminieren. Die Zellen wurden in Platten mit einer Dichte von 5×10⁵ pro Well ausgesät und bis zur Konfluenz gelassen. Die Zellen wurden 30, 90 und 180 Minuten mit Rhodamin B-beladenen NPs behandelt, unbehandelte Zellen dienten als Kontrolle. Anschließend wurden die Zellen trypsinisiert und mit PBS gewaschen, und die Fluoreszenz wurde mit Durchflusszytometrie-Analyse (BD Biosciences FCASCalibur Durchflusszytometer; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) quantifiziert. Die intrazelluläre Aufnahme von Rhodamin B-markierten NP oder NPD wurde weiter durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen wurden auf Deckgläsern gezüchtet und nach 24 h mit freien Au@SiO₂ NPs und MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs behandelt. Nach Inkubation für 30, 90 und 180 Minuten wurden die Zellen mit PBS gewaschen und die Rhodamin B-markierten Nanocarrier-Aufnahmen mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus Mikroskop Bh2-FCA, Japan) beobachtet.

Apoptose-Studie durch Fluoreszenzmikroskopie

Eine Methode für die nukleare qualitative Studie der Apoptose ist ein fluoreszierender Farbstoff DAPI, der an DNA bindet und durch geeignetes Mikroskop detektierbar ist. Wir verwendeten ein Protokoll wie zuvor für DAPI-Färbung berichtet, kurz: MCF-7 oder MDA-MB-231 Zellen wurden in 6-Well-Format-Gefäßen mit einer Dichte von 5×10⁵ ausgesät und 24 Stunden anhaften und wachsen lassen. Nach Behandlung mit MTX, Au@SiO₂ NPs und MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs mit und ohne Laserbehandlung wurden die Zellen mit PBS (Sigma) gewaschen und dann durch 10 % Formaldehyd (Merck) fixiert, anschließend: Zellen wurden mit Triton X-100 (Sigma) für 15 Minuten permeabilisiert. Nach ordnungsgemäßen Waschungen wurden die Zellen 5 min mit DAPI (Sigma) gefärbt. Schließlich wurden die apoptotischen Kerne (fragmentiert oder gefaltet) durch ein Fluoreszenzmikroskop (Olympus) visualisiert. Zellen ohne jegliche Behandlung dienten als negative Kontrolle und Zellen, die nur Laserbestrahlung erhielten, als positive Kontrolle.

Untersuchungen von Zellzyklusstörungen

Die MCF-7 und MDA-MB-231 Zellzyklusverteilungen wurden durch Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt. Dabei wurden die Zellen mit Startpopulationen von 5×10⁵ ausgesät und bis zu 80 % Konfluenz gelassen. Anschließend wurde die Behandlung der Zellen mit MTX, Au@SiO₂ NPs und MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs mit und ohne Laserbestrahlung durchgeführt. Zellen ohne jegliche Behandlung dienten als negative Kontrolle und Zellen, die nur Laserbestrahlung erhielten, als positive Kontrolle. Dann wurden die Zellen durch Trypsinisierung mit nachfolgenden ordnungsgemäßen PBS-Waschungen geerntet. Anschließend wurden die Zellen 48 Stunden mit Ethanol (Merck) fixiert. Im nächsten Schritt wurden die fixierten Zellen gewaschen, dann mit Ribonuklease A (Cinaclone) behandelt, mit anschließender Zugabe von Propidiumiodid (PI) (Sigma) im Dunkeln. Die Fluoreszenzsignale wurden durch FACS-Set von Beckton Dickinson Company detektiert.

Statistik der Studie

Die Experimente für jeden Schritt wurden in drei Wiederholungen durchgeführt und die Ergebnisse als Mittelwert ± SD berichtet. ANOVA wurde für den Vergleich der Signifikanz zwischen Gruppen verwendet. Die Unterschiede wurden als signifikant reflektiert, wo der Wahrscheinlichkeitswert <0,05 berechnet wurde mit SPSS Software.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung der synthetisierten NPs

Die Au@SiO₂-NPs wurden in vier Schritten hergestellt: 1-Synthese von SiO₂-Nanopartikeln, 2-Zugabe von thiolhaltigem Linker zu SiO₂-NPs, 3-Synthese von Gold-Nanopartikeln und 4-Anheften der Gold-Nanopartikel an die Oberfläche der SiO₂-Linker-Komplexe (Abb. 1). Die erfolgreiche Synthese von Au@SiO₂ wurde durch FTIR bestätigt (Abb. 2a). Der Si-O-Si-Peak erschien bei ca. 1088 cm⁻¹. Ein breiter Peak bei 3000–3700 und 803 cm⁻¹ wird der Streckung und der out-of-plane-Biegung freier Silanol-O-H-Gruppen zugeschrieben. Die aliphatische C-H-Streckungsschwingung zeigte sich als starker Peak bei 2950 cm⁻¹. Das C-O von drei Methoxysilan-Gruppen wurde durch Peak bei 1191 cm⁻¹ gezeigt.

Dynamische Lichtstreuung (DLS) Messungen zeigten, dass FA-MTX konjugierte Au@SiO₂ NPs Größe im Nanometerbereich (105±2,3 nm) mit enger Größenverteilung aufwiesen (Abb. 2b).

Zeta-Potenzial ist ein wichtiger physikochemischer Parameter, der die Stabilität von Nanosuspensionen beeinflusst. Extrem positive oder negative Zeta-Potenzial-Werte verursachen größere abstoßende Kräfte. Andererseits verursacht die hohe Ladung der Partikel, ob positiv oder negativ, dass die NPs von den Phagozyten der Leber absorbiert und aus dem Körper ausgeschieden werden. Im Fall einer kombinierten elektrostatischen und sterischen Stabilisierung ist ein minimales Zeta-Potenzial von ±20 mV wünschenswert. Die Zeta-Potenzial-Daten der NPs wurden vor und nach Beladung mit MTX-FA bei pH=7,4 und T=25 °C verglichen (Abb. 2c). Die erhaltenen Zeta-Potenziale von Au@SiO₂ NPs betrugen +13,3 mV, was nach dualer Drug-Beladung auf -19,7 mV sank, was im wünschenswerten Bereich lag. MTX und FA hatten bei pH (7,4) über ihrem pKa (3,8 und 4,8, 3,5 und 4,3) eine negative Nettoladung aufgrund der Deprotonierung von zwei Carbonsäuregruppen in ihrer Struktur. Daher wurde die Nettoladung nach simultaner Beladung von MTX und FA auf Au@SiO₂ NPs negativ.

TEM-Analyse liefert die definitive individuelle Partikelgröße. Au-Nanopartikel wurden als dunkle Kugeln gesehen, die auf den SiO₂-NPs als graue Basisschicht dispersiert waren. TEM-Bilder bestätigten, dass die Au@SiO₂-NPs mit homogener sphärischer Form synthetisiert wurden, in der die durchschnittliche Partikelgröße ca. 25 nm betrug (Abb. 3).

Drug-Loading

Hierin vermittelt Folat die erhöhte Aufnahme von GNPs in bestimmten Krebszelltypen, die Folsäurerezeptor überexprimieren, durch rezeptorvermittelte Endozytose, um die geringe Wirksamkeit der Internalisierung von GNPs zu überwinden, daher ist der Folsäurerezeptor als Tumormarker bekannt und Folat wird zunehmend für Tumor-Targeting verwendet.

Nach Konjugation von MTX- und FA-Molekülen in Au@SiO₂ NPs änderte sich das Zeta-Potenzial von +13,3 auf -19,7 mV. Die geschätzten pKa-Werte der beiden Carbonsäure-Moieties von MTX sind 3,8, 4,8 und FA 3,5 und 4,3. Daher wurde aufgrund der Deprotonierung von zwei Carbonsäuregruppen von MTX und FA bei pH 7,4, was über ihrem pKa liegt, die Nettoladung negativ, was die erfolgreiche Konjugation von MTX und FA auf Au@SiO₂ NPs anzeigt. De Ying Tian et al. zeigt, dass MTX-Beladung auf Au-Nanopartikeln mit 18 und 30 mm Durchmesser 15 ± 0,4 % und 10 ± 1,0 % betragen. In dieser Studie wurden FA und MTX in Au@SiO₂ NPs mit Einkapselungseffizienz von 22,6 % und 77,5 % beladen. Chromatogramm der simultanen MTX- und FA-Bewertung Peak ist in Abb. 2d gezeigt.

Zellaufnahme

Da intrazelluläre photothermische Agenten die Effizienz der photothermischen Krebstherapie verbessern können, wird angenommen, dass die Zellinternalisierung photothermischer Materialien notwendig ist. In-vitro-Zellaufnahmetest wurde mit menschlichen Brustkrebs-MDA-MB-231-Zellen durchgeführt, von denen bekannt ist, dass sie den Folsäurerezeptor hoch überexprimieren. Um die Rolle von FA als Targeting-Agent und die Effizienz der Oberflächenbeschichtung auf die Aufnahme der Au@SiO₂ NPs durch Zielzellen zu untersuchen, wurden MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen mit Au@SiO₂ NPs und MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs behandelt. Die mittleren Fluoreszenzintensitätsergebnisse der Zellaufnahme sind in Abb. 4 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Au@SiO₂ NPs-Aufnahme in sowohl MCF-7 als auch MDA-MB-231 über die Zellkulturzeit für alle Proben zunahm (Abb. 4 und 5). Auch nach Oberflächendekoration von Au@SiO₂ NPs mit MTX und FA wurde die Zellaufnahme signifikant auf beiden MCF-7 und MDA-MB-231 als Folsäurerezeptor-exprimierende Zellen erhöht. MTX-FA-beladene Au@SiO₂ NPs-Aufnahme in MDA-MB-231-Zellen war größer als in MCF-7. Da MDA-MB-231-Zellen höhere Oberflächen-Folsäurerezeptor-Level exprimieren, traten hohe Anteile folsäurerezeptor-zielgerichteter NPs über den rezeptorvermittelten Endozytose-Mechanismus ein, was zu höherer zellulärer Aufnahme führte. In einer anderen Studie erfolgte die erhöhte Zellinternalisierung der folat-konjugierten NPs nur in Krebszellen, die den aHFR überexprimieren, und nicht in gesunden Zellen, die weniger aHFRs an der Zelloberfläche exprimieren. Konjugation von Au@SiO₂ NPs mit FA kann die Zellaufnahme von NPs und Methotrexat erleichtern, was zu gesteigerter Toxizität gegenüber MDA-MB-231-Zellen führt.

Zytotoxizitäts-Assay

In-vitro zelluläre Zytotoxizitätsstudien von freiem MTX, blanken Au@SiO₂ NPs und MTX-FA konjugierten Au@SiO₂ NPs wurden durch MTT-Assay für 24, 48 und 72 h bewertet (Abb. 6). Die MTT-Assay-Ergebnisse zeigten, dass Au@SiO₂ NPs keine zytotoxische Wirkung auf MCF-7 und MDA-MB-231 Zelllinien hatten. Darüber hinaus, um die zytotoxischen Effekte von sowohl freiem MTX als auch MTX-FA konjugierten Au@SiO₂ NPs zu vergleichen, wurde die gleiche MTX-Konzentration (25, 50, 100 und 200 µg/mL) für alle Behandlungszeiten verwendet. Zellzytotoxizitätsergebnisse deuten darauf hin, dass freies MTX oder MTX-FA konjugierte Au@SiO₂ NPs nach 24 h Behandlung eine Mortalitätsrate von ca. 10-25 % in beiden Zelllinien zeigten. Frühere Studien berichteten über den proliferativen Effekt von Gold-Nanopartikeln auf verschiedene Zelllinien wie murine Osteoblasten MC3T3-E1-Zellen und menschliche parodontale Ligament-Stammzellen unter In-vitro-Bedingungen. Unsere Ergebnisse stimmen mit diesen Studien überein und Abb. 6a und b zeigen den proliferativen Effekt von freien Au@SiO₂ NPs. Daher kann der gleiche zytotoxische Effekt von MTX und FA-MTX beladenen Au@SiO₂ Nanopartikeln (NPD) auf dieses Phänomen zurückzuführen sein.

Laserbestrahlung

In dieser Studie wurde die Zellviabilität von MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen, behandelt mit Au@SiO₂ NPs und MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs nach Laserbestrahlung mit Dosen im Bereich 30-105 J/cm², mittels MTT-Assay untersucht. Die Mortalitätsrate von MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen, behandelt mit MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs (MTX-Konzentration 100 µg/mL) nach LLLT bei einer Dosis von 75 J/cm², betrug ca. 39 % bzw. 45,5 %. Unter gleichen Bedingungen zeigten Zellen, behandelt mit Au@SiO₂ NPs nach Laserbestrahlung oder Laser allein, keine offensichtliche Zelltötung. Durch Erhöhung der Laserdosis auf 105 J/cm² stieg die Mortalitätsrate beider Zelllinien auf 60-75 %, während beide Zelllinien, behandelt mit Au@SiO₂ NPs + Laser oder Laser allein bei gleicher Bestrahlungsdosis, keine zytotoxische Wirkung zeigten. Der IC50-Wert für MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen nach Kombinationstherapie mit MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs (MTX-Dosis 100 µg/mL) und LLLT wurde bei einer Dosis von 90 bzw. 75 J/cm² ermittelt. Andererseits lag die Mortalitätsrate von MTX und MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs ohne Laserbestrahlung bei MTX-Dosis 100 µg/mL (ausgewählte Dosis für Lasertherapiestudie) zwischen 15-25 % in beiden Zelllinien. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Kombination von MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs und Lasertherapie einen synergistischen Effekt in beiden Zelllinien zeigte und die Zellviabilität signifikant verringerte (p<0,001) im Vergleich zu Zellen, die nur Laserbestrahlung erhielten. Diese Ergebnisse zeigten, dass NP-Behandlung, insbesondere mit Targeting-Strategie, die Wirksamkeit der Lasertherapie bei der Zerstörung von Brustkrebszellen verbessern kann (Abb. 7).

Apoptose-Studie durch DAPI

Die Apoptose wurde in MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen nach Behandlung mit Au@SiO₂ NPs; MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs mit oder ohne Laser untersucht, um zu wissen, ob Laserbehandlung die Wirksamkeit der Chemotherapie verbessern könnte. Unsere Ergebnisse, zusammengefasst in Abb. 8, zeigten, dass normale MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen ohne jegliche Behandlung als Kontrolle dienten sowie Zellen, die nur mit Laser oder freien Au@SiO₂ NPs ohne Laserbestrahlung behandelt wurden, typische Kerne aufwiesen, ohne Apoptose. Allerdings zeigten MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen, behandelt mit freiem MTX, Au@SiO₂ NPs mit Laserbestrahlung und MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs ohne Laserbestrahlung, partielle apoptotische Kerne (Abb. 8). Die Zellen, behandelt mit MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs in Kombination mit Laserbestrahlung (810 nm, 75 J/cm², 139 s), zeigten einen starken Rückgang der MCF-7 und MDA-MB-231 Zellpopulation. Daher wurde die Laserbestrahlungswirksamkeit nach MTX/FA beladenen Au@SiO₂ NPs-Aufnahme auf MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen erhöht. Daher haben die neu entwickelten MTX- und FA-beladenen Au@SiO₂ NPs die Fähigkeit, die photothermischen Effekte durch hochfragmentierte Zellkerne, einen radikalen Anstieg des Zellverlusts und vollständige Zellschädigung zu verstärken.

Zellzyklus

Zellzyklusverteilungen nach Behandlung mit MTX, Au@SiO₂ NPs und MTX-FA beladenen Au@SiO₂ NPs entweder in Kombination mit LLLT (75 J/cm²) oder ohne Laserbestrahlung wurden in sowohl MCF-7 als auch MDA-MB-231 Zellen mittels Durchflusszytometrie und PI-Färbung der DNA untersucht. Unsere Studie zeigte, dass in MDA-MB-231 oder MCF-7 Zellen der Prozentsatz unbehandelter Zellen (Kontrollgruppe) aktiv in der S-Phase war (Abb. 9a, b). Die Verwendung von 75 J/cm² Laserbehandlungen reduzierte den Prozentsatz der Zellen in der S-Phase in nicht-signifikanter Weise. Andererseits zeigten die mit LLLT ohne NP- und Medikamentenbehandlung bestrahlten Zellen einen signifikanten Anstieg der Go/G1-Zellpopulation, was die Sicherheit von LLLT allein anzeigte. Auch NP-Behandlung störte den Zellzyklus in beiden Zelllinien nicht. Behandlung der Zellen mit freiem MTX in Abwesenheit oder Gegenwart von Laserbestrahlung zeigte einige Störungen im Zellzyklus, einschließlich Reduktion der Zellen in der S-Phase. Die Verwendung von NPD allein reduzierte die Zellen in der S-Phase. Und interessanterweise erhöhte die Verwendung von MTX- und FA-beladenen Au@SiO₂ NPs (NPD) den Zellprozentsatz in sub Go/G1 als Anzeichen für Apoptose. Auch der Prozentsatz der MDA-MB-231-Zellen in sub Go/G1 (ca. 18 %) war signifikant höher als bei MCF-7-Zellen (12 %) in der MTX- und FA-beladenen Au@SiO₂ NPs (NPD) Behandlungsgruppe aufgrund der höheren NP-Aufnahme in MDA-MB-231-Zellen.

Ramos et al. zeigte, dass in Tumorzellen LLLT den Prozentsatz der Zellen in S- und G2/M-Phasen erhöht, auch eine Reduktion der Proliferation und Zunahme der Seneszenz detektierte. Die Zellzyklus-Studie nach LLLT (15 J/cm²) zeigte einen G1-Arrest, was mit Wachstumsstopp in bestrahlten TK6-Zellen übereinstimmt. Eine andere Gruppe berichtete, dass PTT primär Zellen in der S-Phase stört und die Zellpopulation und den Arrest in der G2/M-Phase erhöht. Als Ergebnis kann PTT Radio-Sensibilisierung der Zellen durch Störung des Zellzyklus induzieren. Ihre Ergebnisse stimmen mit unserer Studie überein, die Zellzyklusstörungen und Reduktion der Zellen in der S-Phase zeigte. Unsere Studie zeigte auch die Zunahme der Population apoptotischer Zellen (sub Go/G1) nach kombinierter Chemo-Photothermischer Therapie. Daher könnte die Anwendung einer Kombination aus LLLT und MTX- und FA-beladenen Au@SiO₂ NPs (NPD) als brustkrebszielgerichtete Nanopartikel die Wirksamkeit der Brustkrebsbehandlung erhöhen.

Schlussfolgerungen

In dieser Studie wurden MTX- und FA-beladene Au@SiO₂ NPs für zielgerichtete Brustkrebsbehandlung in Kombination mit LLLT als nicht-invasive, FDA-zugelassene Lasertherapie entwickelt. MTX- und FA-beladene Au@SiO₂ NPs mit sphärischer Morphologie und mittlerem Durchmesser von 25 nm und Oberflächenladung von -19,7 mV wurden erhalten. Diese Größe und Oberflächenladung liegen in einem geeigneten Bereich, um die Bioverteilung der NPs zu erhöhen. Die erfolgreiche zielgerichtete Strategie dieser neu entwickelten NPs wurde durch einen höheren zellulären Aufnahmeprozentsatz von MDA-MB-231 im Vergleich zu MCF-7 als zwei Brustkrebszelllinien mit unterschiedlicher Folsäurerezeptor-Expression bestätigt. Die MTT-Assay-, DAPI-Färbungs- und Zellzyklus-Studien-Ergebnisse zeigten, dass die Kombination der Chemo-Photothermischen Therapie einen synergistischen Effekt zeigte und der zytotoxische und apoptotische Effekt auf beide Brustkrebszelllinien, insbesondere auf MDA-MB-231-Zellen, signifikant erhöht wurde (p<0,001). Da Au@SiO₂-Nanopartikel oder LLLT keine zytotoxischen Effekte zeigten, kann geschlossen werden, dass unser therapeutisches Design synergistische Effekte an der Zielstelle hat. Die Ergebnisse dieser Studie könnten nützlich sein für die Gestaltung zukünftiger Krebstherapieprogramme unter Verwendung von Bio-Chemotherapie kombiniert mit Low-Level-Lasern.