CKAP4-Antikörper-konjugierte Si-Quantenpunkt-Mizellen für die gezielte Bildgebung von Lungenkrebs

Einführung

Krebs ist weltweit eine der Hauptkrankheiten, die die menschliche Gesundheit bedroht [1]. Unter allen bösartigen Tumoren rangieren Inzidenz und Mortalität von Lungenkrebs am höchsten und zeigen jedes Jahr einen steigenden Trend [2]. Die chirurgische Resektion ist die primäre Behandlung solider Tumoren. Die Methoden zur Unterscheidung von malignem Gewebe von gesundem Gewebe beschränken sich jedoch hauptsächlich auf taktile und visuelle Hinweise und die Erfahrung des Chirurgen [3].

In den letzten Jahren hat sich die fluoreszenzgeführte Chirurgie im Forschungsbereich zur intraoperativen Echtzeitführung zur Tumorresektion durchgesetzt [4]. Mit Hilfe eines Fluoreszenz-Kontrastmittels und eines Fluoreszenz-Bildgebungssystems können Chirurgen mit Echtzeit-Bildführung die Primärtumore resezieren und Resttumore in der Operationshöhle identifizieren. Im Vergleich zu herkömmlichen biomedizinischen Bildgebungsverfahren bietet das Fluoreszenz-Bildgebungssystem mehrere Vorteile, wie das Fehlen ionisierender Strahlung und eine hohe räumliche Auflösung [3, 5, 6].

Derzeit berichten Forscher über verschiedene fluoreszierende Nanomaterialien für die biologische Bildgebung [7, 8]. Unter ihnen sind Siliziumquantenpunkte (Si QDs) im Bereich der biologischen Bildgebung populär geworden [9,10,11]. Es gibt jedoch keine Berichte über die Herstellung von fluoreszierenden Kontrastmitteln für die Navigation in der Lungenkrebschirurgie unter Verwendung von Si-QDs.

2014 haben Pi et al. berichteten über eine Synthesemethode für neue wasserdispergierbare Si-QD-Micellen [12]. Die Studiendaten zeigten, dass Si-QD-Micellen Vorteile wie kontrollierbare Größe, hohe Fluoreszenzquanteneffizienz und ausgezeichnete Lichtstabilität aufwiesen [12]. Diese Studie zielt darauf ab, die von Pi et al. beschriebenen wasserlöslichen Si-QD-Micellen zu verbessern und zu modifizieren. ein neuartiges fluoreszierendes Kontrastmittel herzustellen, das in Zukunft als fluoreszierendes Kontrastmittel für die Navigation in der Lungenkrebschirurgie verwendet werden soll.

Im Jahr 2018 haben Yanagita et al. berichteten, dass CKAP4 im Serum und im Krebsgewebe von Lungenkrebspatienten stark exprimiert wird und als neuer Biomarker für die Früherkennung von Lungenkrebs verwendet werden könnte [13]. Daher könnten CKAP4-Antikörper-konjugierte Si-QD-Mizellen ein neues fluoreszierendes Kontrastmittel sein, das als fluoreszierendes Kontrastmittel für die Navigation in der Lungenkrebschirurgie verwendet werden könnte.

In dieser Studie wurde DSPE-PEG-COOH verwendet, um Si-QD-Micellen mit Carboxylgruppen auf ihren Oberflächen herzustellen. Anschließend konjugierten wir den CKAP4-Antikörper mit Si-QD-Mizellen unter Verwendung von EDC. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Si-QD-Micellen-CKAP4 gut in einer wässrigen Lösung dispergierten. Die Si-QD-Micellen-CKAP4 zeigten unter Bestrahlung mit ultraviolettem Licht bei 365 nm eine starke rote Fluoreszenz. Aufgrund der Konjugation von Antikörpern zeigten Si-QD-Micellen-CKAP4 sowohl in vitro als auch in vivo eine gute Targeting-Fähigkeit auf Lungenkrebszellen und -gewebe. Darüber hinaus zeigten die Si-QD-Micellen-CKAP4 sowohl in vitro als auch in vivo eine hohe biologische Sicherheit. In dieser Studie haben wir ein potenzielles fluoreszierendes Kontrastmittel für die Navigation in der Lungenkrebschirurgie hergestellt.

Methoden

Reagenzien

Rinderserumalbumin (BSA) wurde von Sigma bezogen (Test  ≥  98%; Missouri, USA); Tetrahydrofuran (THF) von Adamas-beta (Reinheit:99,9%; Basel, Schweiz); DSPE-PEG-COOH von Aladdin (Shanghai, China); CKAP4-Antikörper von Abcam (0,55 mg/ml; Cambridge, UK); Dulbecco modifiziertes Adlermedium (DMEM) und Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) von Hyclone (Utah, USA); fötales Rinderserum (FBS) und Tyrisin von Gibco (New York, USA); Paraformaldehyd (4%), immunfärbender Permeabilisierungspuffer mit Triton X-100 und Blockierungspuffer für die Immunfärbung von Beyotime (Shanghai, China); Glycerin von Solarbio (Reinheit  ≥ 99%; Peking, China); und Trypsin von Kingmorn (0,25%; Shanghai, China).

Instrumentierung

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Bilder wurden unter Verwendung von JEM-2100F-Elektronenmikroskopie (JEOL, Tokio, Japan) aufgenommen. Der Hydrodurchmesser wurde unter Verwendung von JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK) bestimmt. UV-Vis-Absorptionsspektren wurden mit dem Spektrophotometer Cary 50 (Varian, Palo Alto, CA, USA) erhalten. Das Fluoreszenzemissionsspektrum wurde unter Verwendung des Spektrophotometers F-182 4500 (Hitachi Ltd., Tokio, Japan) erhalten. Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) wurde unter Verwendung des RBD-aufgerüsteten PHI-5000C ESCA-Systems (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Photolumineszenz(PL)-Quantenausbeuten (QYs) wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers (FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, England) abgeschätzt. Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) wurde unter Verwendung von Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) durchgeführt. Röntgenbeugung (XRD) wurde von SmartLab (Rigaku Corporation, Tokio, Japan) getestet.

Zellen

Die T-Zelllinien A549 und 293 wurden vom Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, China) erworben.

Vorbereitung von Si-QD-Mizellen

Zuerst wurden Dodely-Si-QDs durch eine Hydrosilylierungsreaktion hergestellt und in THF gelöst, um eine Dodely-Si-QDs-Lösung (15 mg/ml) gemäß einer zuvor beschriebenen Methode herzustellen [12]. Dann wurden 20 mg DSPE-PEG-COOH gelöst und in 10 ml entionisiertem Wasser vermischt, um eine DSPE-PEG-COOH-Lösung (2 mg/ml, 10 ml) herzustellen. Anschließend wurde eine Dodecly-Si-QDs-Lösung (15 mg/ml, 66 µL) langsam tropfenweise zu einer 10 ml DSPE-PEG-COOH-Lösung gegeben. Nach 3-minütigem Ultraschallrühren wurde eine klare und transparente Lösung erhalten. Die Lösung wurde dann in einen Abzug gestellt und 12 h im Dunkeln gerührt. Anschließend wurde die Lösung 24 h dialysiert und dann 3 Tage gefriergetrocknet, um die Si-QD-Micellen zu erhalten.

Vorbereitung von Si QD Micellen-CKAP4

In dieser Studie wurde der CKAP4-Antikörper mit Si-QD-Micellen durch Aktivierung der Carboxylgruppe durch EDC konjugiert [14]. Das Verfahren war wie folgt:4 mg Si-QD-Micellen wurden in 900 µL PBS dispergiert, um die Si-QD-Micellenlösung herzustellen. EDC (10 mg) wurde zu 100 µl PBS hinzugefügt, um die EDC-Lösung herzustellen. Dann wurden 100 µl EDC-Lösung langsam zu 900 µl Si-QD-Micellen unter Ultraschallbewegung für 5 Minuten zugegeben. Darüber hinaus wurden 20 µL CKAP4-Antikörper langsam zugegeben und die Lösungsmischung 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln gerührt. Das Produkt wurde dann bei 4000 U/min für 15 Minuten ultrafiltriert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde das Produkt als Si QD-Micellen-CKAP4 bezeichnet.

Zytotoxizitätstest

In dieser Studie wurde Trypanblau verwendet, um die Biosicherheit der Nanomaterialien zu testen [15]. Die A549- und 293 T-Zellen wurden in einer 24-Well-Platte (1 × 10 ⁶ .) inkubiert /well) bei 37 °C für 12 h. Nach dem Verwerfen des Mediums wurde eine Reihe von Konzentrationen von Si-QD-Micellen oder Si-QD-Micellen-CKAP4 (Si-Konzentration:0–152 µg/ml) in eine 24-Well-Platte gegeben und 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach dem Verwerfen des Mediums wurden die Zellen gesammelt und zweimal mit PBS gewaschen. Trypanblau wurde mit der Zellsuspension im Verhältnis 1:1 gemischt. Die Anzahl der lebenden und toten Zellen wurde mit Countstar nachgewiesen und aufgezeichnet. Zelllebensfähigkeit (%)  =Anzahl lebender Zellen/(Anzahl lebender Zellen  +  Anzahl toter Zellen)  × 100. Es wurden drei biologische Replikate verwendet. Zur statistischen Auswertung wurde die Software Prism (Version 7.01; GraphPad Software, San Diego, CA, USA) verwendet. Die Daten wurden mittels Zweiwege-ANOVA mit Dunnetts Post-Test analysiert. Die statistische Signifikanz wurde auf P festgelegt < 0,05. *P <0,05; **P <0,01; und ***P <0,001.

Nanomaterialien zielen auf Lungenkrebszellen in vitro ab

Die Fähigkeit von Si-QD-Mizellen und Si-QD-Mizellen-CKAP4 auf Lungenkrebszellen in vitro zu zielen, wurde wie folgt nachgewiesen:Zuerst wurden A549-Zellen in konfokalen Laserschalen (3 × 10 ⁵ Zellen/Schale) bei 37 °C für 12 h. Nach dem Verwerfen des Mediums wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde 1 ml Paraformaldehyd (4 %) zu den Zellen gegeben und 10 min bei 25 °C inkubiert. Nach dem Verwerfen des Paraformaldehyds wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Als nächstes wurde 1 ml Immunfärbungs-Permeabilisierungspuffer mit Triton X-100 zu den Zellen gegeben und bei 25 °C für 10 Minuten inkubiert. Nach dem Verwerfen des immunfärbenden Permeabilisierungspuffers mit Triton X-100 wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde 1 ml Blockierungspuffer für die Immunfärbung zu den Zellen gegeben und 10 min bei 25 °C inkubiert. Nach dem Verwerfen des Blockierungspuffers für die Immunfärbung wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden den Zellen 200 µL Si QD-Micellen oder Si QD-Micellen-CKAP4 (Si-Konzentration 150 µg/ml) zugesetzt und 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach dem Verwerfen der Nanomaterialien wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Die Fotografien wurden unter Verwendung eines konfokalen Lasermikroskops (Leica, Wetzlar, Deutschland) aufgenommen. Das Anregungslicht wurde auf 405 nm eingestellt und die Emissionswellenlänge wurde auf 630 nm eingestellt.

Die Fähigkeit von Si-QD-Mizellen und Si-QD-Micellen-CKAP4, in vitro auf normale Zellen zu zielen, wurde wie folgt nachgewiesen:Zuerst wurden 293 T-Zellen in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit einer Dichte von 1 × 10 ⁶ . gesammelt Zellen/Röhre. Nach Zentrifugation bei 1000 U/min für 5 Minuten wurde der Überstand verworfen. Als nächstes wurde 1 ml Paraformaldehyd (4 %) zu den Zellen gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation bei 1000 U/min für 5 Minuten wurde der Überstand verworfen. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen. Dann wurde 1 ml Immunfärbungs-Permeabilisierungspuffer mit Triton X-100 zu den Zellen gegeben und bei 25 °C für 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstands wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Dann wurde 1 ml Blockierungspuffer für die Immunfärbung zu den Zellen gegeben und 10 min bei 25 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstands wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 200 µL Si QD-Micellen oder Si QD-Micellen-CKAP4 (Si-Konzentration 150 µg/mL) zu den Zellen gegeben und 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 1000 U/min wurde der Überstand verworfen und das Sediment dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden geerntet und Mikroskop-Objektträger hergestellt. Die Mikroskopie wurde unter Verwendung eines konfokalen Lasermikroskops durchgeführt. Das Anregungslicht wurde auf 405 nm eingestellt und die Emissionswellenlänge wurde auf 630 nm eingestellt.

Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt. Die quantitative Analyse der mittleren Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung der ImageJ-Software (Bethesda, MD, USA) durchgeführt. Für die statistische Analyse wurde die Prism-Software (Version 7.01) verwendet. Die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA mit Dunnetts Post-Test analysiert. Die statistische Signifikanz wurde auf P festgelegt < 0,05. ***P <0,001.

Tumor tragendes Mäusemodell

Zehn männliche Nacktmäuse (5–6 Wochen alt) wurden von Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Alle Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen im Experimental Animal Center der Tongji University (Shanghai, China) gehalten. Um das tumortragende Mausmodell zu etablieren, wurde Mäusen subkutan 1 × 10 ⁶ . injiziert A549-Zellen. Im Experiment wurden tumortragende Mäuse verwendet, als der Tumordurchmesser 6 mm erreichte. Alle Mausexperimente wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Use and Care Committee der Tongji University genehmigt.

Si QD Micellen-CKAP4 zielt in vitro auf Lungenkrebsgewebe ab

Tumortragende Mäuse wurden unter Narkose getötet. Der Tumor und normales Lungengewebe wurden gesammelt, um Paraffinschnitte herzustellen. Nach Dehydration, Antigengewinnung und Serumblockierung wurden den Geweben Si-QD-Mizellen oder Si-QD-Mizellen-CKAP4 (Si-Konzentration 150 µg/ml) zugesetzt und 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach dem Verwerfen der Nanomaterialien wurden die Gewebe dreimal mit PBS gewaschen. Die Gewebe wurden mit 4′, 6-Diamidino-2-phenylin-dol (DAPI) für 10 Minuten gefärbt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde den Geweben ein Antifade-Medium zugesetzt und 5 Minuten bei 25 °C inkubiert. Nach dem Verwerfen des Antifade-Mediums wurden die Gewebe dreimal mit PBS gewaschen. Die Fotos wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Tokio, Japan) mit einer Anregungswellenlänge von 405 nm und einer Emissionswellenlänge von 630 nm aufgenommen. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt. Eine quantitative Analyse der mittleren roten Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung der ImageJ-Software durchgeführt. Für die statistische Analyse wurde die Prism-Software (Version 7.01) verwendet. Die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA mit Dunnetts Post-Test analysiert. Die statistische Signifikanz wurde auf P festgelegt < 0,05. ***P <0,001.

Fluoreszenz-Bildgebung in Vivo

In dem Experiment wurden neun tumortragende Mäuse in drei Gruppen eingeteilt (Si-QD-Micellen-CKAP4-Injektionsgruppe, Si-QD-Micellen-Injektionsgruppe und Kochsalzlösungs-Injektionsgruppe). Mäusen in der Gruppe mit Si-QD-Micellen-CKAP4-Injektion wurden 200 µl Si-QD-Micellen-CKAP4 (Si:4 mg/kg) intravenös injiziert. Mäusen in der Gruppe mit Si-QD-Mizellen-Injektion wurden 200 µl Si-QD-Mizellen (Si:4 mg/kg) intravenös injiziert. Mäusen in der Kochsalzlösungs-Injektionsgruppe wurden 200 µl Kochsalzlösung intravenös injiziert. Fluoreszenzbilder wurden zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 und 4 h). Die Mäuse in der Si-QD-Micellen-CKAP4-Injektionsgruppe wurden nach 4 Stunden anästhesiert und eingeschläfert, um das Fluoreszenzsignal in Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere und Tumor zu erkennen. In dieser Studie wurde die Fluoreszenzbildgebung mit einem VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Gyeonggi-do, Korea) mit einem PE-Filtersatz (λ _Aufregung 450–500 nm, λ _Emission 600–650 nm). Für die statistische Analyse wurde die Prism-Software (Version 7.01) verwendet. Die Daten wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA mit Dunnetts Post-Test analysiert. Die statistische Signifikanz wurde auf P festgelegt < 0,05. *P <0,05; **P < 0.01.

Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E)

In dieser Studie wurde 12 tumortragenden Mäusen Kochsalzlösung (200 µl), Si-QD-Mizellen (Si:4 mg/kg, 200 µl) oder Si-QD-Mizellen-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µl) injiziert. durch die Schwanzvene. Nach 24 h wurden die Mäuse eingeschläfert. An Herz, Leber, Milz, Lunge und Nieren wurde eine H&E-Färbung durchgeführt. Pathologische Veränderungen wurden durch optische Mikroskopie beobachtet [14, 16].

Ergebnisse

Herstellung und Charakterisierung von Si-QD-Mizellen

Zunächst wurden Dodecyl-Si-QDs durch Hydrosilylierung gemäß einem bereits veröffentlichten Bericht hergestellt (Schema 1, Schritt 1) ​​[12]. Ähnlich den berichteten Daten dispergierten Dodecyl-Si-QDs, die von unserer Gruppe synthetisiert wurden, gut in Methylbenzol [12]. TEM zeigte, dass die Dodecyl-Si-QDs kugelförmig mit relativ einheitlicher Größe waren. Die Größen der Dodecyl-Si-QDs in den TEM-Bildern wurden mit der ImageJ-Software gemessen. Die Daten zeigten, dass der Durchmesser von Dodecyl-Si-QDs im Bereich von 4,1 bis 5,3 nm lag, mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 4,7 nm (Abb. 1a). In den vergrößerten Bildern der Dodecyl-Si-QDs sind deutliche Gittersäume zu erkennen (Abb. 1a). In dieser Studie wurde der Ebenenabstand des Gitters mit der ImageJ-Software gemessen. Die Daten zeigten, dass der durchschnittliche Abstand zwischen den Gitterstreifen etwa 0,35 nm beträgt, was fast dem der zuvor berichteten Dodecyl-Si-QDs (0,34 nm) entspricht. Daher zeigten die in dieser Studie synthetisierten Dodecyl-Si-QDs eine gute Kristallinität [12]. Dynamische Lichtstreuung (DLS) zeigte die hydrodynamischen Durchmesser von Dodecyl-Si-QDs im Bereich von 4,8 bis 13,5 nm mit einem Durchschnitt von 6,5 nm (Abb. 1b).

Schema der Si-QD-Micellen-CKAP4-Präparation und der gezielten biologischen Bildgebung in Lungenkrebsgewebe

a TEM-Bilder von Dodecyl-Si-QDs; b Hydrodurchmesserverteilung von Dodecyl-Si-QDs; c TEM-Bilder von Si-QD-Mizellen; d Hydrodurchmesserverteilung von Si-QD-Mizellen; e TEM-Bilder von Si-QD-Mizellen-CKAP4; f Hydrodurchmesserverteilung von Si-QD-Mizellen-CKAP4; g C1s-Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS)-Spektren von Si-QD-Micellen; h C1s XPS-Spektren von Si-QD-Mizellen-CKAP4

Um wasserdispergierbare Si-QD-Micellen herzustellen, wurden Dodecyl-Si-QDs durch Selbstorganisation aus DSPE-PEG-COOH modifiziert (Schema 1, Schritt 2) [12]. Hier wurde DSPE-PEG-COOH anstelle von F127 verwendet, um Si-QD-Micellen mit Carboxylgruppen auf der Oberfläche herzustellen. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Si-QD-Micellen gut in Wasser dispergierten. TEM-Bilder zeigten, dass die Si-QD-Micellen kugelförmige Partikel mit eingefügten Si-QDs waren. Der Durchmesser der Si-QD-Mizellen reichte von 22,7 bis 54,6 nm, mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 34,3 nm (Abb. 1c). DLS zeigte, dass die hydrodynamischen Durchmesser von Si-QD-Micellen zwischen 43,8 und 615,9 nm lagen, mit einem Durchschnitt von 58,7 nm (Abb. 1d). Das durchschnittliche Zetapotential der Si-QD-Micellen betrug ungefähr − 20,7 mV. In dieser Studie wurde FTIR durchgeführt, um die Zusammensetzung der Si-QD-Micellen zu untersuchen (Zusatzdatei 1:Abbildung S1A). Die Daten zeigten, dass die Streckschwingungsabsorptionspeaks von N–H, C–H, O–H und C=O bei 3430, 2920, 2850 und 1640 cm ⁻¹ . lagen , bzw; die Spitzen der Biegeschwingungsabsorption von C–H und O–H lagen bei 1460 und 1400 cm ⁻¹ , bzw; die Streckschwingungsabsorptionspeaks von Si–C, C–O und P–O–C lagen bei 1250, 1100 und 951 cm ⁻¹ , bzw; die Spitzen der Biegeschwingungsabsorption von Si–H und O=C–N lagen bei 850 und 526 cm ⁻¹ , bzw. Diese Daten zeigen, dass die charakteristischen Gruppen von DSPE-PEG-COOH (wie N–H, O–H, C=O, C–O, P–O–C und O=C–N) und die charakteristischen Gruppen von Dodecyl-Si-QDs (wie Si-C und Si-H) konnten im FTIR-Spektrum von Si-QD-Micellen gefunden werden, was darauf hindeutet, dass Dodecyl-Si-QDs erfolgreich in durch DSPE-PEG-COOH selbstorganisierte Micellen eingekapselt wurden. Darüber hinaus wurden die Si-QD-Mizellen durch XRD charakterisiert (Zusatzdatei 1:Abbildung S1B). Der Beugungspeak der Si-QD-Micellen war scharf, was anzeigt, dass die Kristallinität der Si-QD-Micellen gut war. Im XRD-Muster Peaks bei 2θ von 27.073, 28.451, 56.598 und 73.145 entsprechen den (100), (002), (112) und (203) Kristallebenen von Silizium (PDF # 80-0005), was darauf hinweist, dass die Si-QDs erfolgreich in die Si QD-Mizellen. Die Spitzen bei 2θ von 31,692, 45,431, 66,200, 75,260 und 83,955 entsprechen den (200), (220), (400), (420) und (422) Kristallebenen von NaCl (PDF # 77-2064). Eine rationale Erklärung für das Vorhandensein von NaCl in den Si-QD-Mizellen könnte wie folgt sein:Nach der Herstellung der Si-QD-Micellen lösten wir die Si-QD-Mizellen in PBS, was zum Vorkommen von NaCl in den Si-QD-Mizellen führte.

Das UV-sichtbare Absorptionsspektrum zeigte, dass die Absorption von Si-QD-Micellen im Bereich von 200 bis 500 nm lag (Abb. 2a). Bei einer Anregungswellenlänge von 330 nm wurde in den Fluoreszenzemissionsspektren der Si-QD-Micellen eine starke Fluoreszenz bei 650 nm beobachtet (Abb. 2b). Die wässrige Si-QD-Micellenlösung (Si-Konzentration:80 µg/ml) war bei natürlichem Licht transparent und klar; es emittiert jedoch unter 365 nm UV-Licht eine starke rote Fluoreszenz (Abb. 2c). In dieser Studie wurden die absoluten PL QYs mit einem Fluoreszenzspektrometer (FLS1000) getestet. Die Anregungswellenlänge betrug 365 nm. Die Daten zeigten, dass der absolute PL QY der Si-QD-Micellen ungefähr 14,49 % betrug.

a UV-sichtbares Absorptionsspektrum von Si-QD-Micellen und Si-QD-Micellen-CKAP4; b Fluoreszenzemissionsspektrum von Si-QD-Mizellen und Si-QD-Mizellen-CKAP4; c Bilder von Si-QD-Mizellen und Si-QD-Mizellen-CKAP4, die in natürlichem Licht (links) und 365 nm UV-Licht (rechts) belichtet wurden

Herstellung und Charakterisierung von Si-QD-Mizellen-CKAP4

Wir konjugierten den CKAP4-Antikörper mit Si-QD-Micellen unter Verwendung von EDC (Schema 1, Schritt 3) [14]. TEM-Bilder zeigten, dass die Si-QD-Micellen-CKAP4 kugelförmige Partikel mit eingefügten Si-QDs waren. Der Durchmesser der Si-QD-Micellen-CKAP4 reichte von 24,4 bis 67,7 nm, mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 35,5 nm (Abb. 1e). DLS zeigte, dass die hydrodynamischen Durchmesser der Si-QD-Micellen-CKAP4 von 58,7 bis 824,9 nm reichten, wobei der Durchschnitt von 78,8 nm etwas größer war als der von Si-QD-Mizellen (Abb. 1f). Dieser Anstieg kann auf die Konjugation des CKAP4-Antikörpers zurückzuführen sein. Die C1s-XPS-Spektren zeigten sechs Arten von Kohlenstoffatomen in der C1s-Region:C(O)O (288,81 eV), C=O (286,5 eV), C–O (285,76 eV), C–N (285,25 eV), C –C (284,88 eV) und C–H (284,34 eV) (Abb. 1g). Der C(O)O-Peak verschwand jedoch in den XPS-Spektren der Si-QD-Micellen-CKAP4 fast, was darauf hindeutet, dass die Konjugation zwischen den Carboxylgruppen und den primären Aminen erfolgreich war; daher wurde der CKAP4-Antikörper erfolgreich mit den Si-QD-Mizellen konjugiert (Abb. 1h). Das durchschnittliche Zeta-Potential der Si-QD-Micellen-CKAP4 war ungefähr – 10,7 mV, höher als das der Si-QD-Micellen. Die Erklärung für das obige Phänomen könnte wie folgt sein:Es gibt viele Carboxylgruppen auf der Oberfläche von Si-QD-Micellen; daher zeigten Si-QD-Mizellen eine starke negative Elektrizität. In den Si-QD-Mizellen-CKAP4 führte die Kopplung des CKAP4-Antikörpers jedoch zu einer Abnahme der Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Si-QD-Mizellen-CKAP4; daher erhöhte sich das durchschnittliche Zeta-Potential der Si-QD-Micellen-CKAP4.

Das UV-sichtbare Absorptionsspektrum zeigte, dass die Absorption der Si-QD-Micellen-CKAP4 im Bereich von 200 bis 500 nm lag, ähnlich dem Ergebnis der Si-QD-Micellen (Abb. 2a). Bei einer Anregungswellenlänge von 330 nm wurde eine starke Fluoreszenz bei 640 nm von Si-QD-Micellen-CKAP4 in den Fluoreszenzemissionsspektren beobachtet (Abb. 2b). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Antikörperkonjugation keinen signifikanten Einfluss auf die Fluoreszenzeigenschaften der Si-QD-Micellen-CKAP4 ausübte. Die wässrige Si-QD-Micellen-CKAP4-Lösung (Si-Konzentration:80 µg/ml) war bei natürlichem Licht transparent und klar. Unter 365 nm UV-Licht könnte es eine starke rote Fluoreszenz emittieren, die mit den Ergebnissen der Si-QD-Micellen übereinstimmt (Abb. 2c). PL QY-Tests zeigten, dass der absolute PL QY der Si-QD-Micellen-CKAP4 ungefähr 16,96 % betrug.

Zytotoxizitätstest von Si-QD-Mizellen-CKAP4 in vitro

Die humane Lungenkrebszelllinie A549 und die humane Nierenepithelzelllinie 293 T wurden als Zielzellen verwendet, um die biologische Sicherheit von Si-QD-Mizellen und Si-QD-Mizellen-CKAP4 zu untersuchen. In dieser Studie wurden verschiedene Konzentrationen von Si-QD-Mizellen und Si-QD-Mizellen-CKAP4 (Si-Konzentration 0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 und 152 µg/ml) zuerst mit A549- oder 293-T-Zellen bei 37 °C inkubiert °C für 2 h. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit Trypanblau nachgewiesen (Abb. 3) [15]. Die ID50 von Si-QD-Mizellen und Si-QD-Mizellen-CKAP4 wurde unter Verwendung der GraphPad-Software erhalten. Die Daten zeigten, dass die ID50 von Si-QD-Mizellen in A549- und 293 T-Zellen größer als 152 µg/ml war. Die ID50 von Si-QD-Micellen-CKAP4 betrug 25,94 µg/ml in A549-Zellen und 72,69 µg/ml in 293 T-Zellen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Zytotoxizität von Si-QD-Mizellen-CKAP4 signifikant höher war als die von Si-QD-Mizellen und die Zytotoxizität von Si-QD-Mizellen-CKAP4 in A549-Zellen signifikant höher war als die von 293 T-Zellen. Dieses Phänomen kann auf eine komplementabhängige Zytotoxizität zurückzuführen sein [17]. Darüber hinaus zeigten diese Ergebnisse auch, dass Si-QD-Micellen-CKAP4 in normalen Zellen eine höhere biologische Sicherheit als in Lungenkrebszellen zeigten, was einen Grundstein für seine Anwendung in vivo legte.

Zelllebensfähigkeit von A549 a und 293 T b inkubiert mit unterschiedlichen Konzentrationen von Si-QD-Mizellen und Si-QD-Mizellen-CKAP4 (Si-Konzentration:0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 und 152 µg/mL) für 2 h (n .) = 3; bedeuten  ± SD; Zweiwege-ANOVA mit Dunnett-Post-Test; *P <0,05; **P <0,01; und ***P <0,001)

Si QD Micellen-CKAP4 zielt in vitro auf Lungenkrebszellen ab

Um die Targeting-Funktion von Si-QD-Micellen-CKAP4 in Lungenkrebszellen in vitro weiter zu untersuchen, wurden A549- und 293 T-Zellen als Zielzellen verwendet. Si-QD-Micellen und Si-QD-Micellen-CKAP4 wurden zuerst mit A549- und 293 T-Zellen bei 37 °C für 2 h inkubiert. Der Targeting-Effekt wurde mittels konfokaler Lasermikroskopie nachgewiesen (Abb. 4). Die Ergebnisse zeigten, dass die rote Fluoreszenz in der mit Si QD-Micellen-CKAP4 inkubierten A549 signifikant höher war als die der Si QD-Micellen-CKAP4- und 293 T-Co-Inkubationsgruppe, der Si QD-Micellen und der A549-Co-Inkubationsgruppe und der Si QD-Micellen und 293 T koinkubierende Gruppe. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Si-QD-Micellen-CKAP4 in vitro spezifisch auf A549-Zellen abzielen könnten.

Nachweis der Fähigkeit von Si-QD-Micellen-CKAP4, in vitro auf A549-Zellen zu zielen. a A549 und 293 T wurden mit Si-QD-Micellen-CKAP4 und Si-QD-Micellen (die Konzentration von Si 150 µg/ml) bei 37  für 2 h inkubiert. Nach dem Verwerfen des Überstands und zweimaligem Waschen wurden die Zellen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Balken, 25 µm) abgebildet. b Eine quantitative Analyse der mittleren Fluoreszenzintensität wurde mit ImageJ gemessen (n = 3; bedeuten  ± SD; Einweg-ANOVA mit Dunnett-Post-Test; ***P <0,001)

Si QD Micellen-CKAP4 zielt auf Lungenkrebsgewebe in vitro ab

Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass Si-QD-Mizellen-CKAP4 auf Lungenkrebsgewebe abzielt, haben wir ein In-vitro-Experiment entwickelt, um die Targeting-Eigenschaft von Si-QD-Micellen-CKAP4 auf A549-Gewebe zu überprüfen. In dieser Studie wurden den Mäusen A549-Zellen subkutan inokuliert. Nach der Tumorbildung wurden A549-Tumorgewebe und normales Lungengewebe gesammelt und mit Si-QD-Mizellen und Si-QD-Mizellen-CKAP4 bei 37 °C für 2 h inkubiert. Der Targeting-Effekt wurde mittels konfokaler Lasermikroskopie nachgewiesen (Abb. 5). Die Ergebnisse zeigten, dass mit Si-QD-Micellen-CKAP4-inkubiertes A549-Gewebe eine starke rote Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 405 nm emittieren konnte. Es wurde jedoch nur eine schwache rote Fluoreszenz in mit Si QD-Mizellen inkubierten A549-Geweben, in mit Si QD-Mizellen-CKAP4 inkubierten normalen Lungengeweben und in mit Si QD-Mizellen inkubierten normalen Lungengeweben beobachtet. Die rote Fluoreszenz in dem mit Si QD-Mizellen-CKAP4 inkubierten A549-Gewebe war signifikant höher als die von mit Si QD-Mizellen inkubierten A549-Geweben, mit Si QD-Mizellen-CKAP4-inkubierten normalen Lungengeweben und mit Si QD-Mizellen inkubierten normalen Lungengeweben. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Si-QD-Micellen-CKAP4 in vitro effektiv auf Lungenkrebsgewebe abzielen könnten, was ein potenzielles fluoreszierendes Kontrastmittel für Lungenkrebs sein soll.

Nachweis der Fähigkeit von Si-QD-Micellen-CKAP4, in vitro auf A549-Gewebe zu zielen. a A549-Gewebe und normales Lungengewebe wurden mit Si-QD-Micellen-CKAP4 und Si-QD-Micellen (die Konzentration von Si:150 µg/ml) bei 37 für 2 h kultiviert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Gewebe mit DAPI gefärbt, um den Kern sichtbar zu machen. Die Gewebe wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Bar, 200 µm) abgebildet. b Eine quantitative Analyse der mittleren roten Fluoreszenzintensität wurde mit ImageJ gemessen (n = 3; bedeuten  ± SD; Einweg-ANOVA mit Dunnett-Post-Test; ***P <0,001)

Fluoreszenz-Bildgebung in Vivo

Neun tumortragende Mäuse wurden in drei Gruppen eingeteilt (Si-QD-Micellen-CKAP4-Injektionsgruppe, Si-QD-Micellen-Injektionsgruppe und Kochsalzlösungs-Injektionsgruppe). Mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were intravenously injected with 200 µL Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg). Mice in the Si QD micelle injection group were intravenously injected with 200 µL of Si QD micelles (Si:4 mg/kg). Mice in the saline injection group were intravenously injected with 200 µL saline. Fluorescence images were acquired at different time points (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, and 4 h). The significant fluorescence signals were not observed in lung cancer tissues among all the mice in the three groups (data not shown). This might be because of the weak fluorescence penetration of the Si QD micelles-CKAP4 and Si QD micelles.

The mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were anesthetized and euthanized at 4 h to detect the fluorescence signal in their heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor. Data showed that a significant fluorescence signal could be observed in the liver, kidney, and tumor tissues. However, there was no significant fluorescence signal in the heart, spleen, or healthy lung tissues (Fig. 6). The significant fluorescence signal in the liver and kidney indicated that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. In addition, the fluorescence signal in A549 tumor tissues was significantly higher than that in healthy lung tissues. This phenomenon contributed to the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer tissues. These results indicate that Si QD micelles-CKAP4 specifically targets lung cancer tissue, which is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

a Bright photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. b Fluorescence photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. c Relative fluorescence intensities of heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor tissue (n = 3; mean ± SD; one-way ANOVA with Dunnett’s post test; *P <0,05; **P  < 0.01)

Biosafety Evaluation of Si QD Micelles-CKAP4 In Vivo

Finally, we investigated the acute toxicity of the Si QD micelles-CKAP4 in vivo. In this study, tumor-bearing mice (n  = 12) were intravenously injected with saline (200 µL), Si QD micelles (Si:4 mg/kg, 200 µL), or Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) and then euthanized 24 h later. H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys are shown in Fig. 7. Compared with saline-injected mice, there were no evident pathological changes in the major organs of Si QD micelles-injected mice and Si QD micelles-CKAP4-injected mice. The above data indicated that Si QD micelles (Si:4 mg/kg) and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) showed no significant toxicity in vivo.

H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys in tumor-bearing mice injected with saline, Si QD micelles (Si:4 mg/kg), and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) for 24 h (magnification:200×)

Diskussion

At present, various fluorescent nanomaterials have been designed and synthesized as optical contrast agents for surgical navigation [3, 4]. In 2020, On et al. prepared fluorophore [indocyanine green (ICG) or cyanine 5.5 (Cy5.5)]-conjugated glycol chitosan nanoparticles (CNPs) as a fluorescent contrast agent in lung cancer surgery navigation [18]. However, there are no reports on the preparation of fluorescent contrast agents for lung cancer surgery navigation using Si QDs.

This study successfully synthesized Si QD micelles-CKAP4, which could target the imaging of lung cancer tissues. Si QD micelles-CKAP4 is expected to be used as an optical contrast agent for navigation in lung cancer surgery in the future. The advantages of Si QD micelles-CKAP4 are as follows:(1) We synthesized a fluorescent contrast agent for lung cancer surgery navigation using Si QDs for the first time, which expands the toolbox of the lung cancer surgery navigation tool library. (2) This study optimized water-dispersible Si QD micelles reported by Pi et al. to add targeting ability to Si QD micelles [12]. Thus, it provides a new possibility for applying Si QDs in the biomedical field. (3) The principle of Si QD micelles-CKAP4 targeting lung cancer is based on the high expression of CKAP4 protein in lung cancer tissue. Owing to the conjugation of CKAP4 antibody, Si QD micelles-CKAP4 could actively target lung cancer tissue. Compared with the nanomaterials that passively target tumors via the EPR effect, Si QD micelles-CKAP4 showed stronger specificity to lung cancer tissue. (4) Si QD micelles-CKAP4 showed selective toxicity to tumor cells in a specific range of concentrations. Therefore, Si QD micelles-CKAP4 showed high biological safety in the range of rational drug concentrations, which exhibited its potential clinical application value.

In this study, PL QY tests showed that the absolute PL QY of Si QD micelles was approximately 14.49% and the absolute PL QY of the Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%. A study by Pi et al. showed that the PL QY of dodecyl-Si QDs was approximately 26%, which was very high for Si QDs that emit red light with a PL peak at less than 700 nm [12, 19, 20]. However, the PL QY of the Si QD micelles in this study was approximately 14.49%, which was lower than that of dodecyl-Si QDs. This might be because of the surface defects introduced during the emulsion process, which was nearly consistent with the decrease in PL QY in Si-QD micelles (dodecyl-passivated Si QDs were encapsulated in the micelles self-assembled from F127 in the emulsion) in the study reported by Pi et al. [12, 21]. In this study, the PL QY of Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%, which was slightly higher than that of Si QD micelles (14.49%). This could be because in the Si QD micelles-CKAP4, the coupling of the CKAP4 antibody repaired some surface defects of the Si QD micelles, leading to a slight enhancement of the PL QY.

As we all know, there is a challenge in Si QDs biological imaging applications:Although Si exhibits little cytotoxicity, Si particles may exhibit cytotoxicity as the size decrease to a certain extent. In this study, cytotoxicity tests showed that Si QD micelles-CKAP4 exhibited selective cytotoxicity to lung cancer cells at 9.5–19 µg/mL. Therefore, as a result of CKAP4 antibody conjugation, the cytotoxicity of Si QD micelles-CKAP4 to normal cells was significantly less than that of lung cancer cells, which provides a powerful condition for the biological application of Si QD micelles-CKAP4.

In this study, human lung cancer cell line A549 and human renal epithelial cell line 293 T were used as target cells to investigate the targeting ability of Si QD micelles and Si QD micelles-CKAP4. A549 and 293 T cells were adherent and semi-adherent, respectively. During the experiment, the number of 293 T cells decreased because of repeated centrifugation and washing. Therefore, as shown in Fig. 4, the number of 293 T cells was lower than that of A549 cells.

In addition, it should be noted that A549 cells belong to the p53 wild-type lung cancer cell line. Therefore, only A549 cells cannot fully reflect the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer. Further studies will be conducted to test the targeting ability and imaging effect of Si QD micelles-CKAP4 on p53-negative cell lines (such as H1299) to provide a solid experimental basis for the clinical application of Si QD micelles-CKAP4 [22].

Schlussfolgerungen

This study improved and modified the Si QD micelles reported by Pi et al. to prepare water-dispersible Si QD micelles-CKAP4. Si QD micelles-CKAP4 were spherical particles with a mean hydrodiameter of approximately 78.8 nm. UV–visible absorption of the Si QD micelles-CKAP4 ranged from 200 to 500 nm. With an excitation wavelength of 330 nm, strong fluorescence at 640 nm was observed in the fluorescence emission spectra. Si QD micelles-CKAP4 exhibited good targeting ability to lung cancer cells and lung cancer tissues both in vitro and in vivo. In addition, the in vivo fluorescence-imaging assay further showed that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. Cytotoxicity and H&E staining assays showed that the Si QD micelles-CKAP4 exhibited high biosafety both in vitro and in vivo. Si QD micelles-CKAP4 is a specifically targeted imaging agent for lung cancer and is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Daten und die Analysen in der aktuellen Arbeit sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Abkürzungen

Si QD:

Si quantum dot

Si QD micelles-CKAP4:

CKAP4 antibody-conjugated Si quantum dot micelles

Dodecyl-Si QDs:

Dodecyl-passivated Si QDs

BSA:

Rinderserumalbumin

THF:

Tetrahydrofuran

DMEM:

Dulbecco’s modified eagle’s medium

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

FBS:

Fötales Rinderserum

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

XRD:

Röntgenbeugung

SPF:

Specific pathogen free

DAPI:

4′, 6-Diamidino-2-phenylin-dole

H&E:

Hematoxylin and eosin