Gezielte einwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen für die photothermische Therapie kombiniert mit Immun-Checkpoint-Hemmung zur Behandlung von metastasierendem Brustkrebs

Einführung

Metastasen und die Folgen ihrer Behandlung sind die häufigste Todesursache bei Krebs [1]. Wenn beispielsweise Brustkrebs metastasiert, sinken die 5-Jahres-Überlebensraten der Patienten unter 25 %. Obwohl in den letzten 60 Jahren über 200 neue antineoplastische Medikamente die Patientenergebnisse verbessert haben, bleibt das Gesamtüberleben bei metastasierten Erkrankungen gering [2]. Hier wird eine neuartige Kombination aus photothermischer Therapie, die durch ein tumorgerichtetes Single-Walled Carbon Nanotube (SWCNT)-Biokonjugat und antizytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4 (anti-CTLA-4)-Checkpoint-Hemmung ermöglicht wird, zur Behandlung von metastasierendem Brustkrebs untersucht ein orthotopes Mausmodell.

Die einzigartigen Eigenschaften von SWCNTs als Nanomaterial haben großes Interesse an ihrer Verwendung als potenzielles Werkzeug im Kampf gegen Krebs geweckt. Während SWCNTs eine Vielzahl biologischer Wirkungen ausüben, konzentrierte sich die Verwendung von SWCNTs bei der Behandlung von Krebs hauptsächlich auf ihre Wechselwirkung mit Nahinfrarot (NIR)-Licht und den daraus resultierenden photothermischen Effekt, bei dem SWCNTs den Tumor in dem als photothermische Therapie bezeichneten Prozess schnell erwärmen (PTT). Zahlreiche Gruppen haben das Potenzial von SWCNTs für den Einsatz in PTT-basierten Behandlungsstrategien in mehreren Brustkrebsmodellen untersucht [3,4,5,6,7,8,9,10]. Diese Arbeiten konzentrierten sich hauptsächlich auf die Fähigkeit der PTT, Primärtumore in Tiefen von nicht mehr als mehreren mm zu behandeln, wo die Abschwächung des NIR-Lichts fast vollständig ist.

Zuvor haben wir gezeigt, dass primäre orthotope Brusttumore bei syngenetischen Mäusen mit mildem NIR-Laserlicht in Verbindung mit einem photothermisch verstärkenden SWCNT-Biokonjugat fast vollständig eliminiert werden können [11]. In diesem Biokonjugat wurden die SWCNTs mit dem Protein Annexin A5 (ANXA5) funktionalisiert, das mit hoher Affinität an das anionische Phospholipid Phosphatidylserin bindet, das extern auf Tumorzellen und auf Endothelzellen des Tumorgefäßsystems exprimiert wird, nicht jedoch auf normalen Zellen im Gefäßsystem [ 12,13,14]. Dieses Konjugat wurde mit Rasterkraftmikroskopie (AFM) visualisiert, um zu zeigen, dass die Höhe des Konjugats zwischen 2,5 und 5,0 nm lag, was ähnlich der für andere SWCNT-Protein-Konjugate ist [11]. Während die photothermische Therapie allein in der Lage war, Primärtumoren in diesem früheren metastasierten Modell zu eliminieren, verlängerte sie das Überleben nur geringfügig. Wir fanden jedoch vorläufige Hinweise darauf, dass die gleichzeitige Behandlung mit Immunmodulatoren wie Cyclophosphamid das Überleben erhöhen konnte.

In letzter Zeit ist das Potenzial von Immunmodulatoren wie Cyclophosphamid, SWCNT-gerichtete PTT synergistisch zu verstärken, Gegenstand von großem Interesse. Eine Kategorie vielversprechender immunmodulierender Wirkstoffe sind Checkpoint-Inhibitoren. Checkpoint-Inhibitoren sind Antikörper wie Anti-CTLA-4, Anti-PD-1 und Anti-PDL-1, die kritische Zellproteine ​​binden, die für die Modulation der Reaktion des Körpers auf Krebs verantwortlich sind. Diese Antikörper blockieren wichtige biologische „Checkpoints“, an denen der Körper die Reaktion des Immunsystems auf Krebs herunterregulieren kann. Diese Proteine ​​spielen normalerweise eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Immunantwort des Körpers. Indem sie die Wirkung dieser Proteine ​​blockieren, beseitigen Checkpoint-Inhibitoren einen Mechanismus, durch den das Immunsystem normalerweise seine natürliche antitumorale Reaktion unterdrückt. Kürzlich haben mehrere Gruppen beobachtet, dass die Kombination von Anti-CTLA-4-Checkpoint-Hemmung mit SWCNT-verstärkter PTT das Potenzial hat, eine robuste Immunantwort bei Brustkrebs zu fördern [15, 16].

In der aktuellen Studie evaluieren wir die Kombination unserer neuartigen PTT-Modalität in Verbindung mit dem immunstimulierenden Wirkstoff Anti-zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4 (Anti-CTLA-4). Ursprünglich für die Behandlung des metastasierten Melanoms zugelassen [17], wird Anti-CTLA-4 nun in klinischen Studien in Kombination mit anderen immunstimulierenden Wirkstoffen zur Behandlung von Brustkrebs getestet [18]. Wir untersuchen den Mechanismus der verstärkten antineoplastischen Immunität bei PTT in Kombination mit der Anti-CTLA-4-Checkpoint-Hemmung sowie das längerfristige Schicksal von SWCNTs in Zielorganen.

Materialien und Methoden

Materialien

Das für ANXA5 kodierende Plasmid pET-30 Ek/LIC/ANX wurde zuvor in diesem Labor konstruiert [11]. Rinderserumalbumin (BSA), Triton X-100, EDTA, β-Mercaptoethanol, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tris-Acetat-EDTA-Puffer stammten von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Natriumphosphat und Natriumdodecylsulfat (SDS) stammten von Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). Ethanol von HPLC-Qualität war von Acros Organics (Waltham, MA). His-Trap-Säulen stammten von GE Healthcare (Chicago, IL). Durchflusszytometrie-Färbepuffer, Fixier-/Permeabilisierungspuffer, Permeabilisierungspuffer, chromogenes Endotoxin-Quantifizierungskit und Slide-A-Lyzer-Dialysekassetten (3,5 kDa) stammten von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Die Dialysemembranen mit 2 und 100 kDa stammten von Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Roswell Park Memorial Institute Zellmedium (RPMI-1640) und Hanks ausgewogene Salzlösung stammten von ATCC (Manassas, VA). Fötales Rinderserum (FBS) stammte von Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Trypton, Hefeextrakt und Kanamycinmonosulfat wurden von Alfa Aesar (Ward Hill, MA) bezogen. Natriumhydroxid, Kaliumchlorid und Natriumchlorid stammten von VWR Inc (Radnor, PA). HRV-C3-Protease stammte von Sino Biologics (Portland, OR). Anti-CTLA-4 monoklonaler Maus-Antikörper (Klon:9H10) und Mauszytokin-ELISA-Kits (TNF-&agr;, IFN-&ggr;, IL-6) wurden von BioLegend (San Diego, CA) erhalten. CoMoCAT SWCNTs (durchschnittlicher Durchmesser 0,8 ± ± nm, durchschnittliche Länge 1,5 ± ± 0,5 µm) wurden von CHASM (Boston, MA) bezogen. Es ist bekannt, dass die CoMoCAT-Methode SWCNT einer kleinen Anzahl von (n ,m ) Chiralitäten mit hoher Selektivität [19]. Die in dieser Studie verwendete Probe ist stark an [5, 6] SWCNTs angereichert, die eine starke NIR-Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 980 nm aufweisen. Diese Absorption entspricht dem S₁₁ Übergang für diesen Nanoröhrentyp zwischen einer besetzten van Hove-Singularität zu der entsprechenden unbesetzten. Um die Strahlungsabsorption durch die auf den Tumoren abgelagerten SWCNT zu maximieren, betrug die Wellenlänge des in dieser Studie verwendeten Lasers daher 980 nm, um genau der des S₁₁ . zu entsprechen optischer Übergang [20]. Abbildung S1 in der zusätzlichen Datei 1 zeigt die Fluoreszenzspektren, die deutlich die S₁₁ . zeigen NIR-Emission nach Anregung des S22-Übergangs mit sichtbarem Licht.

Zellkultur

EMT6-Brustkrebszellen von ATCC (Manassas, VA) wurden in Waymouths MB 752/1-Medium mit 2 mM L-Glutamin, ergänzt mit 15% FBS, kultiviert. Alle Zellen wurden bei 37 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit unter 5 % CO₂ . gezüchtet . Alle Zellen wurden unter Verwendung von 0,25% (w/v) Trypsin in 0,53 mM EDTA passagiert. Zelllinie und Mykoplasmenfreier Status wurden durch STR-Tests (Charles River) bestätigt und durch Limulus-Assay als endotoxinfrei getestet.

ANXA5- und SWCNT-ANXA5-Produktion

Das SWCNT-ANXA5-Konjugat wurde nach einem von uns zuvor entwickelten Verfahren hergestellt, das 2,5 mg ANXA5/mg SWCNT ergibt [11]. Kurz gesagt, E. coli transfiziert mit einem für ANXA5 kodierenden Plasmid, pET-30 Ek/LIC/ANX, wurden gezüchtet und mittels immobilisierter Metallaffinitätschromatographie mit immobilisiertem Ni ²⁺ . gereinigt um die ANXA5 zu isolieren, die eine enzymatische Spaltung beinhaltet, um ein (His)₆ . zu entfernen Schild. Gefriergetrocknete CoMoCAT SWCNTs wurden in 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) dispergiert, wobei zwei Zyklen Sondenbeschallung bei 20 W und Zentrifugation bei 29.600 g für jeweils 30 Minuten verwendet wurden. Die suspendierten SWCNTs wurden durch NIR-Fluoreszenz charakterisiert (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1) und dann für 30 min an einen 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-Polyethylenglycol-Maleimid (DSPE-PEG-Maleimid)-Linker konjugiert bei Raumtemperatur, um eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen SWCNTs und der funktionellen DSPE-Gruppe zu ermöglichen. Darauf folgte eine 8-stündige Dialyse in destilliertem Wasser, um überschüssigen Linker und SDS zu entfernen. Das dialysierte Konjugat wurde dann mit ANXA5, das eine Cysteingruppe enthält, 2 h lang umgesetzt und mit 1,5 mg ml ⁻¹ . blockiert L-Cystein. Das Endprodukt, SWCNT-ANXA5, wurde 8 h gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer dialysiert, um überschüssiges ANXA5 und L-Cystein zu entfernen. Proteingewicht und Reinheit wurden über SDS-PAGE charakterisiert. Der SWCNT- und ANXA5-Gehalt des Biokonjugats wurde durch UV-Vis-NIR-Fluoreszenzspektroskopie, Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) Raman-Analyse und Bradford-Assay charakterisiert (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2).

In-vivo-Studien

Alle Verfahren entsprachen einem vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Oklahoma genehmigten Protokoll. Es wurden weibliche BALB/cJ-Mäuse im Alter von 6 Wochen verwendet (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Mäuse wurden mit einer Standard-Chow-Diät gefüttert. Während der photothermischen Bestrahlung von Tumoren mit einem NIR-Laserlicht wurden Mäuse mit einem Nasenkonus mit 2 % Isofluran und 98 % Sauerstoff anästhesiert.

Tumore wurden durch orthotope Injektion von 10 ⁶ . induziert EMT6-Maus-Brustkrebszellen in 100 µl PBS in das IV. Brustfettpolster. Die Tumore durften 12 Tage lang wachsen und erreichten ein Volumen von 60 mm ³ (~ 5 mm Durchmesser) erhielten Mäuse eine systemische i.v. Injektion von 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT pro kg Körpergewicht) Biokonjugat über die seitliche Schwanzvene. Nach 3 h wurde ein Bereich von 5 mm über der Tumorgrenze mit NIR-Licht (980 nm) mit einem Energie- und Leistungsniveau von 175 J/cm ² . bestrahlt und 1 W/cm ² (Zeit von 175 s; Diodevet-50 NIR-Laser, B&W Tek Inc., Newark, DE). Checkpoint-Hemmung wurde durch serielle i.p. Verabreichung von 200 µg Anti-CTLA-4-Antikörper in 100 µl PBS an den Tagen 8, 11 und 16 nach der Tumorinokulation. Das Tumorvolumen wurde mit der modifizierten Ellipsoidformel \(V =\frac{1}{2} \times {\text{length}} \times {\text{width}}^{2}\) unter Verwendung von Dickenmessungen der längste Abmessung und senkrechte Breite. Die Tumortemperatur wurde mit einer tragbaren Wärmebildkamera FLIR TG165 Spot (Raymarine ITC, Fareham, UK) überwacht, die auf Autoscan für die maximal erkannte Temperatur eingestellt war. Zielorgane wurden für die Toxizitätsbewertung entnommen und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert, und gefärbte Objektträger mit Formalin-fixiertem Paraffin (FFPE) wurden hergestellt und mit Hämatoxylin und Eosin für die Toxizitätsanalyse gefärbt.

Ex Vivo SWCNT-Erkennung

Mäuse erhielten eine systemische Injektion von 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT/kg Körpergewicht) über die seitliche Schwanzvene. Zu ausgewählten Zeitpunkten haben Mäuse (n = 3) wurden euthanasiert, obduziert und Zielorgane zur Analyse entnommen. Gewebeproben wurden wie zuvor beschrieben vorbereitet [21]. Das Vorhandensein von SWCNTs in ex vivo-Gewebeproben wurde dann durch relative NIR-Fluoreszenzspektroskopie mit einem NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX) bestimmt.

Durchflusszytometrie

Mäuse wurden 14 Tage nach der Behandlung euthanasiert, und antitumorale Immuneffektorzellen der Milz wurden wie zuvor beschrieben quantifiziert [21].

Zytokinerkennung

Nach der oben beschriebenen Behandlung werden Mäuse (n = 4–5) wurden 7 Tage nach der photothermischen Therapie zur Blutentnahme eingeschläfert. Die Konzentration von Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), Interferon-gamma (IFN-γ) und Interleukin 6 (IL-6) in verdünnten Serumproben wurde gemäß dem Protokoll des Lieferanten mittels ELISA quantifiziert.

Statistische Analyse

Die Daten wurden mit der Graphpad Prism-Software analysiert. Die statistische Signifikanz wurde mit einer Einweg-ANOVA und einem Tukey-Kramer-Mehrfachvergleichstest bewertet. Die statistische Signifikanz der Überlebenskurven wurde durch den Mantel-Haenszel-Log-Rank-Test bestimmt. Die statistische Signifikanz der Zytokin-Serumkonzentration wurde durch Einweg-ANOVA und Dunnetts Mehrfachvergleichstest analysiert. Mehrfachvergleiche wurden durch den Bonferroni-Schwellenwert korrigiert. Der Fehler wird grafisch als Standardfehler des Mittelwerts dargestellt, es sei denn, der Fehler überschreitet nicht die Größe des gezeichneten Mittelwertpunktsymbols. In diesem Fall wurden die Balken aus Gründen der Übersichtlichkeit ausgeschlossen.

Ergebnisse

Thermische Kinetik

Unter Verwendung einer Dosis von 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 wurde die maximale Temperatur von Tumoren im Verlauf der Behandlung mit NIR-Licht aufgezeichnet, wie in Abb. 1 dargestellt. Mäuse, die vor der Bestrahlung SWCNT-ANXA5 erhielten, hatten höhere Tumortemperaturen für die gesamte NIR-Lichtbehandlung im Vergleich zu Mäusen, die physiologische Kochsalzlösung erhielten. Die durchschnittliche Tumortemperatur bei Mäusen, die SWCNT-ANXA5 erhielten, war signifikant anders als bei Mäusen, die physiologische Kochsalzlösung erhielten (54 °C vs. 37 °C, p < 0,05). Als Ergebnis dieser verstärkten photothermischen Therapie trat nur in der SWCNT-ANXA5-Gruppe eine sichtbare Tumorablation auf. Die Tumorablation war durch eine schnelle Verfärbung gekennzeichnet, gefolgt von Hautkontrakturen und dem Auftreten von Falten. Innerhalb von 48 h bildete sich an der Stelle der photothermischen Ablation ein erheblicher Schorf. Das vollständige Nachwachsen der Haut dauerte mehrere Wochen.

Thermische Kinetik durch Bestrahlung von Tumoren mit NIR-Licht bei 980 nm. BALB/cJ-Mäuse, die EMT6-Tumoren trugen, wurden durch i.v. in der Schwanzvene mit 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. Nach einer Wartezeit von 3 Stunden, um die Entfernung der SWCNTs aus dem Kreislauf zu ermöglichen, wurden die Tumoren mit einem NIR-Laser mit einer Energie- und Leistungsdichte von 175 J/cm ² . bestrahlt und 1 W/cm ² , bzw. (t = 175 s). Die maximale Temperatur des Tumors wurde als Funktion der Zeit aufgezeichnet. Die Tumortemperatur von Mäusen, die SWCNT erhielten, war bei t . signifikant höher als bei Mäusen, die physiologische Kochsalzlösung erhielten = 175 s (p < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± SE (n = 3)

Photothermische Therapie und Checkpoint-Hemmung

Die Ergebnisse der Kombination der photothermischen Therapie mit der Checkpoint-Hemmung unter Verwendung des monoklonalen Anti-CTLA-4-Antikörpers sind in Abb. 2 dargestellt. Während die photothermische Therapie allein die primäre Brustkrebs-Neoplasie leicht eliminieren konnte, begrenzte die Unfähigkeit des NIR-Laserlichts, über einige mm hinaus einzudringen, die Behandlung von Brustkrebsmetastasen. Um die Mängel der lokalisierten photothermischen antineoplastischen NIR-Behandlung zu überwinden, haben wir die Kombination dieser einzigartigen therapeutischen Behandlungsmethode mit systemischer Checkpoint-Hemmung untersucht (Abb. 2). Während die photothermische Therapie bei der Zerstörung primärer EMT6-Tumoren hervorragend war (Abb. 2a), konnte diese Behandlung Metastasen nicht beseitigen und das Überleben von Mäusen mit orthotopen EMT6-Tumoren nur geringfügig verlängert (Abb. 2b). Im Gegensatz dazu verbesserte eine Checkpoint-Hemmung mit Anti-CTLA-4 das Gesamtüberleben, verzögerte jedoch nur vorübergehend das Wachstum des Primärtumors. Während keine Therapie allein zu einer Verlängerung des Gesamtüberlebens führte, verbesserte die Kombination aus der verbesserten photothermischen Therapie mit SWCNT-ANXA5 und der Anti-CTLA-4-Checkpoint-Hemmung das Gesamtüberleben, was zu einer Überlebensrate von 55 % 100 Tage nach der Tumorimpfung führte.

Ergebnisse der kombinatorischen photothermischen Therapie (PTT) und der Checkpoint-Inhibition (anti-CTLA-4) bei EMT6-Tumoren. Mäuse mit gut entwickelten orthotopen syngenen Tumoren (d ≥ 5 mm) wurden i.v. systemische Dosis von 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. a Das Tumorvolumen wurde dann nach der Bestrahlung (Pfeil) mit NIR-Laserlicht für 175 s bei einer Leistungsdichte von 1 W/cm ² . überwacht am 12. Tag nach der Impfung. Zusätzlich zu PTT erhielten ausgewählte Gruppen an den Tagen 8, 11 und 16 Anti-CTLA-4 (100 µg). Den Mäusen der Kontrollgruppe wurde i.v. mit physiologischer Kochsalzlösung. Tumorvolumen angezeigt als Mittelwert ± SE (n = 7). Die Signifikanz im Vergleich zur Kontrolle wird durch * (p < 0,05). b Die Kombination aus photothermischer Therapie und Immun-Checkpoint-Hemmung erhöhte das Überleben im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant (p < 0.05, n = 7). c , d Nur wenn Mäuse eine photothermische Therapie in Verbindung mit einer Anti-CTLA-4-Checkpoint-Hemmung erhielten, war die relative Anzahl von CD4 ⁺ . signifikant erhöht und CD8 ⁺ Splenozyten, die 2 Wochen nach der PTT beobachtet wurden. Splenozyten als Mittelwert ± SE (n = 3). Die Bedeutung wird mit *** angegeben (p <0,005)

Die zytometrische Analyse von Milzeffektorzellen nach der Behandlung zeigte einen mutmaßlichen Mechanismus für ein verbessertes Überleben bei Mäusen, die eine kombinatorische photothermische Therapie und eine Checkpoint-Hemmung erhielten. Mäuse wurden mit EMT6 geimpft und wie zuvor beschrieben behandelt. Zwei Wochen nach der Behandlung wurden die Mäuse getötet und sowohl die Prozentsätze als auch die relative Anzahl von mehreren Immuneffektortypen wurden quantifiziert. Populationen von Helfer-T-Zellen, zytotoxischen T-Zellen, Neutrophilen, Myeloid-derived Suppressor Cell (MDSC) Monozyten, FoxP3-Regulatorischen T-Zellen und Makrophagen wurden ausgewertet (Zusatzdatei 1:Abbildung S3). Die Analyse dieser Populationen zeigte signifikante Unterschiede zwischen Behandlungspopulationen und Kontrollen nur bei Mäusen, die die Kombination von sowohl photothermischer Therapie als auch Anti-CTLA-4-Checkpoint-Hemmung zusammen erhielten. Bei den Tieren, die diese Kombination erhielten, beobachteten wir eine Zunahme der relativen Zahl der T-Helferzellen (CD4 ⁺ ) und zytotoxische T-Zellen (CD8 ⁺ ), (Abb. 2c, d). Anstieg von CD4 ⁺ und CD8 ⁺ Zellzahlen korrelierten mit starken Zunahmen der Milzgröße, die nach der Autopsie beobachtet wurden.

Zusätzlich zur zytometrischen Analyse von Milzeffektorzellen wurde die Serumzytokinkonzentration 7 Tage nach der PTT bestimmt, um die Mechanismen der antitumoralen Immunität aufzuklären. Die Spiegel der proinflammatorischen Zytokine IL-6, IFN-γ und TNF-α sind in Fig. 3 dargestellt. Weder die SWCNT- noch die Anti-CTLA-4-Behandlung allein erhöhten die Zytokinspiegel im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe signifikant. Jedoch konnte die PTT-Behandlung allein TNF-α signifikant erhöhen. Die weitere Zugabe von Anti-CTLA-4 zur PTT-Behandlung erhöhte die Spiegel von TNF-α, IL-6 und IFN-γ signifikant.

Zytokinkonzentration im Serum. Die Quantifizierung der Serumzytokinspiegel im Mausserum 7 Tage nach PTT zeigte einen signifikanten Anstieg der IL-6-, IFN-γ- und TNF-α-Spiegel bei Mäusen nach PTT in Verbindung mit Checkpoint-Hemmung (Anti-CTLA-4). Die Ergebnisse sind für die unbehandelte Kontrolle, nur SWCNT-Behandlung, nur Anti-CTLA-4-Behandlung, PTT-Behandlung und PTT + anti-CTLA-4-Behandlung gezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SE (n = 4–5). Die statistische Signifikanz wurde für die behandelten Gruppen verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe durch Einweg-ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest analysiert. Statistische Signifikanz wird durch * (p < 0,05) und **** (p < 0,0001)

Bioverteilung und Toxizität von SWCNT-ANXA5

Die Bioverteilung von SWCNT-ANXA5 nach Verabreichung zur photothermischen Therapieverstärkung in verschiedenen Organen wurde mit Fluoreszenzquantifizierung von SWCNT in ex-situ-Gewebelysaten im Vergleich zu Standards überwacht (Zusatzdatei 1:Abbildung S4). Die Bioverteilung in den Zielorganen wurde über einen Zeitraum von 4 Monaten nach i.v. Injektion von 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 in gesunde Mäuse (Abb. 4a, b). Im Gegensatz dazu wurde die Akkumulation von SWCNT-ANXA5 in EMT6-Tumor tragenden Mäusen nach der Verabreichung gemäß dem zuvor beschriebenen Injektionsprotokoll 3 h nach der Verabreichung bestimmt. (Der Zeitpunkt, zu dem die photothermische Therapie in der Behandlungsstudie durchgeführt wurde.) Während des Zeitraums von 4 Monaten vor der Organentnahme wurden die Mäuse auf physikalische Nebenwirkungen und abnormales Verhalten überwacht. Bei Mäusen, denen SWCNT-ANXA5 während dieses Zeitraums injiziert wurde, wurden keine Nebenwirkungen beobachtet. Bei der Untersuchung von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten FFPE-Schnitten aus Zielorganen am Ende der Studie wurde keine histopathologische Toxizität beobachtet (Zusatzdatei 1:Abbildung S5).

Bioverteilung von SWCNT-ANXA5 gemessen als % der injizierten Dosis (a ) und Gewebekonzentration in g/L (b ). Das SWCNT-ANXA5-Konjugat wurde i.v. Balb/cJ-Mäuse in einer Dosis von 1,2 mg/kg injiziert. Die SWCNT-Konzentration wurde in verschiedenen Organen von Mäusen ohne Tumoren nach 1, 2, 3 und 4 Monaten (von links nach rechts) gemessen. Bei Mäusen mit Tumoren wurde die SWCNT-Konzentration zu dem Zeitpunkt gemessen, wie er unmittelbar vor der Behandlung mit photothermischer Therapie wäre. Die Daten werden als Mittelwert ± SE (n = 3)

Diskussion

Die hier präsentierten Daten unterstützen die Wirksamkeit einer Kombination aus gezielter photothermischer Therapie und Immun-Checkpoint-Hemmung zur Behandlung von metastasierendem Brustkrebs. Dieses Phänomen ist als „abskopaler Effekt“ bekannt und beschreibt die Fähigkeit lokalisierter Strahlung, eine Antitumorreaktion auszulösen, die das Tumorwachstum entfernt vom primären Ziel unterdrückt. Bereits in den 1950er Jahren beobachteten Forscher, dass eine lokalisierte Tumorbestrahlung einen signifikanten Effekt auf entfernte Tumoren hatte [22]. Studien haben gezeigt, dass die systemische Natur der abskopalen Wirkung auf die Immunantwort des Wirts zurückzuführen ist [23,24,25]. Während die γ-Bestrahlung im Mittelpunkt der meisten abskopalen Forschung stand, zeigt eine wachsende Zahl von Arbeiten, dass die photothermische Therapie auch eine abskopale Wirkung hervorrufen kann. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die thermische Ablation in Kombination mit dem Checkpoint-Inhibitor Anti-CTLA-4 eine verstärkte Immunantwort hervorruft [16, 26, 27, 28, 29]. Wir beobachten eine ähnliche abskopale Reaktion nach gezielter photothermischer Ablation und Anti-CTLA-4-Blockade im EMT6-Modell von Brustkrebs.

Der abskopale Effekt wird durch die Daten in Abb. 2a, b veranschaulicht. Orthotope EMT6-Tumoren wachsen schnell und haben Metastasen gebildet, wenn sie mit der photothermischen Therapie behandelt werden. Dies ist der Grund, warum Mäuse mit Tumoren, die nur mit photothermischer Therapie behandelt wurden, im Vergleich zur unbehandelten Mäusekontrolle nur eine geringe Überlebensverlängerung aufwiesen, obwohl der Primärtumor vollständig abgetragen war. Die alleinige Gabe von Anti-CTLA-4 verzögerte das Tumorwachstum im Vergleich zur Kontrolle und verlängerte die Überlebenszeit auf 68 Tage, führte jedoch nicht zur Heilung. Ein ähnliches Ergebnis des verzögerten EMT6-Tumorwachstums wurde von Jure-Kunkel et al. wenn Anti-CTLA-4 verabreicht wurde [30]. Bei der Kombination aus photothermischer Therapie und Anti-CTLA-4 überlebten 55 % der behandelten Mäuse 100 Tage nach der Tumorimpfung und sind wahrscheinlich geheilt.

Einblicke in den Mechanismus der Antitumorimmunität wurden mittels Durchflusszytometrie ausgewertet, um die Populationen von Immuneffektorzellen in der Milz zu quantifizieren. Im Vergleich zur photothermischen Therapie oder allein mit Anti-CTLA-4 führte die Kombinationstherapie zu einem siebenfachen Anstieg der Helfer-CD4 ⁺ T-Zellen und ein dreifacher Anstieg des zytolytischen CD8 ⁺ T-Zellen, wobei beide Ergebnisse statistisch hoch signifikant sind (p < 0,005). Diese Ergebnisse liefern einen weiteren Beweis für eine potenzielle abskopale Reaktion durch die Kombination von Phototherapie und T-Zell-Kostimulationstherapie mit Immun-Checkpoint-Hemmung.

Anstieg von CD4 ⁺ und CD8 ⁺ Zellzahlen korrelierten mit einer Zunahme der Milzgröße, die während der Nekropsie beobachtet wurde. Eine erhöhte Milzgröße weist auf eine verstärkte Immunantwort hin. Die Milz besteht aus mehreren Zelltypen, von denen die häufigsten die der CD4 ⁺ . sind , CD8 ⁺ , und B-Zell-Linien [31, 32]. Obwohl dies in dieser Arbeit nicht untersucht wurde, würden wir erwarten, dass die B-Zellzahl zusammen mit CD4 ⁺ . ansteigt und CD8 ⁺ T-Zell-Zahlen [33]. Helfer-CD4 ⁺ T-Zellen unterstützen die humorale Immunität, indem sie andere Immunzellen durch Zytokinstimulation und direkte Zell-Zell-Interaktionen fördern. Zytolytisches CD8 ⁺ T-Zellen töten Tumorzellen direkt ab. Anstieg von CD4 ⁺ und CD8 ⁺ Zellzahlen weisen auf eine systemische abskopale Immunantwort hin.

Das Vorliegen einer systemischen abskopalen Immunantwort nach der Kombinationsbehandlung wird weiter durch einen Anstieg der proinflammatorischen Zytokinspiegel im Mausserum unterstützt (Abb. 3). TNF-α aktiviert tumorassoziierte Makrophagen, um antitumorale Wirkungen zu zeigen [34, 35]. IFN-γ spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorüberwachung [36, 37]. IL-6 fördert die Proliferation von Makrophagen und Lymphozyten [38]. Der signifikante Anstieg dieser Effektormoleküle im Mausserum 7 Tage nach der PTT-Behandlung in Kombination mit Anti-CTLA-4 unterstützt die Existenz einer antitumoralen Immunantwort weiter.

Am Ende der Bestrahlung von Mäusen, die SWCNT erhielten, betrug die durchschnittliche maximale Tumortemperatur 54 °C; diese Temperatur reichte aus, um den Tumor vollständig zu entfernen (Abb. 1). Dies liegt im Bereich von 45–60 °C, in dem eine Enzyminaktivierung und eine mitochondriale Schädigung auftritt [39]. Die Temperatur der Tumoren in der Kochsalzlösungs-Kontrollgruppe blieb unter 40 °C, eine Temperatur, die einen minimalen therapeutischen Nutzen bietet [39,40,41].

Wir beobachteten, dass die Mehrheit der SWCNT-ANXA5-Akkumulation basierend auf der Konzentration hauptsächlich in der Leber, im Herzen, in der Milz, in den Nieren, in der Lunge und im Tumor stattfand (Abb. 4a). Bei Mäusen mit EMT6-Tumoren beobachteten wir, dass die SWCNT-ANXA5-Konzentration ähnlich der in Leber und Niere war (Abb. 4a, b). Spuren von SWCNT-ANXA5 wurden im Gehirn, Dickdarm und Dünndarm nachgewiesen. Es ist wichtig anzumerken, dass die Bioverteilung von SWCNT auf Basis von % der injizierten Dosis (ID) nicht gut mit der absoluten SWCNT-Konzentration in einem Zielgewebe korreliert. Dies ist in erster Linie auf die Unterschiede zwischen den Organgewichten zurückzuführen. Zum Beispiel entspricht ein gegebener % ID in einem Organ einer höheren Konzentration in kleineren Organen und einer kleineren Konzentration in größeren Organen. Ein Vergleich der Proben auf der Grundlage der SWCNT-Konzentration zeigt, dass die höchste Konzentration in der Niere liegt, dicht gefolgt von Leber und Milz (Abb. 4a).

Es gibt einige Hinweise auf den Abbau von SWCNTs in den verschiedenen Organen über den Zeitraum der Bioverteilungsstudie (Abb. 4a, b). Der Abbau von SWCNTs in Organen wird aufgrund einer früheren Erkenntnis erwartet, dass mehrwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Makrophagen abgebaut werden [42]. Die in unserer Studie verwendeten SWCNTs haben einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,8 nm und eine durchschnittliche Länge von 1500 µm. Basierend auf einer Studie von Zhu et al. wird nicht vorhergesagt, dass diese Größe zytotoxisch ist. [43], die das Potenzial für eine Schädigung der Lipiddoppelschicht durch die Toxizität von Kohlenstoffnanoröhren basierend auf Länge und Durchmesser klassifizierten. Gemäß dieser Klassifizierung sind die von uns verwendeten SWCNTs in der Kategorie „biologisch weich“ und minimieren die Zytotoxizität, was mit unseren Beobachtungen in den Studien an Mäusen übereinstimmt, bei denen wir keine Nebenwirkungen oder histopathologische Toxizität als Folge der Verabreichung des SWCNT . beobachteten -ANXA5 konjugiert.

Schlussfolgerungen

Hier demonstrieren wir eine neuartige kombinatorische Behandlungsmethode, bei der wir eine relativ hohe Überlebensrate bei Mäusen mit aggressivem metastasiertem Brustkrebs durch photothermische Therapie mit dem SWCNT-ANXA5-Biokonjugat in Kombination mit Anti-CTLA-4-basierter Checkpoint-Inhibition erzielen. Die Verwendung des tumorvaskulären Targeting-Proteins ANXA5 minimierte die Menge an systemisch verabreichtem SWCNT, die erforderlich ist, um Primärtumore in einer niedrigen einmaligen Dosis zu beseitigen. Interessanterweise stellten wir eine Erhöhung des Überlebens von Mäusen mit metastasiertem Krebs fest, die mit kombinatorischer Therapie behandelt wurden, obwohl nur der Primärtumor bestrahlt wurde. Eine mechanistische Studie zur Quantifizierung der Zahl wichtiger Antitumor-Effektorzellen der Milz ergab, dass nur die Kombination beider Behandlungsmodalitäten die Zahl der CD4 ⁺ . erhöht Helfer und CD8 ⁺ zytotoxische T-Zellen. Wir nehmen an, dass dieser Anstieg der T-Zellen eine abskopale Reaktion widerspiegelt, bei der antitumorale Effektorzellen die Tumormetastasierung unterdrückten. Obwohl SWCNTs auch 4 Monate nach der Verabreichung in Organen nachgewiesen wurden, wurden im Verlauf der Experimente keine Nebenwirkungen oder offensichtliche Gewebetoxizität beobachtet.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind uneingeschränkt verfügbar.

Abkürzungen

SWCNT:

Einwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen

ANXA5:

Annexin A5

Anti-CTLA-4:

Anti-zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4

EDTA:

Ethylenediamine tetraacetic acid

SDS-SEITE:

Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis

DSPE:

1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine

PTT:

Photothermische Therapie