Gezielte Kohlenstoffnanoröhren-Photothermische Therapie Plus Checkpoint-Inhibition: Eine Neue Strategie für Metastasierten Brustkrebs

Zusammenfassung

Die größten Beiträge zur Krebssterblichkeit sind Metastasen und die Folgen ihrer Behandlung. Hier präsentieren wir eine neuartige Behandlung von metastasiertem Brustkrebs, die photothermische Therapie mit gezielten einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs) und Immunstimulation mit einem Checkpoint-Inhibitor kombiniert. Wir finden, dass die selektive Nahinfrarot-photothermische Ablation primärer orthotoper EMT6-Brusttumoren in syngenen BALB/cJ-Mäusen mittels eines Annexin A5 (ANXA5) funktionalisierten SWCNT-Biokonjugats synergistisch eine anti-zytotoxische T-Lymphozyten-assoziierte Protein 4 (anti-CTLA-4)-abhängige abskopale Antwort verstärkt, was zu einer erhöhten Überlebensrate (55 %) nach 100 Tagen nach Tumorinokulation führt. Im Vergleich dazu gab es kein Überleben nach 100 Tagen weder für die photothermische Therapie allein noch für die Immunstimulation allein. Vor der photothermischen Therapie wurde das SWCNT-ANXA5-Biokonjugat systemisch bei einer relativ niedrigen Dosis von 1,2 mg/kg verabreicht, wo es sich dann über ANXA5-abhängige Bindung in der Tumorvaskulatur anreicherte. Während der photothermischen Therapie erreichte die durchschnittliche Maximaltemperatur im Tumor 54 °C (Dauer 175 s). Der Mechanismus der verlängerten Überlebenszeit durch kombinatorische photothermische Ablation und Immunstimulation wurde durch flusszytometrische Quantifizierung splenischer antitumoraler Immuneffektorzellen und Serumzytokinquantifizierung evaluiert.

Einleitung

Metastasen und die Folgen ihrer Behandlung sind die einzige größte Todesursache bei Krebs [1]. Beispielsweise fallen die 5-Jahres-Überlebensraten von Patientinnen, wenn Brustkrebs metastasiert, unter 25 %. Obwohl in den letzten 60 Jahren über 200 neue antineoplastische Medikamente die Patientenergebnisse verbessert haben, bleibt das Gesamtüberleben bei metastasierter Erkrankung schlecht [2]. Hier wird eine neuartige Kombination aus photothermischer Therapie, ermöglicht durch ein tumorzielgerichtetes einwandiges Kohlenstoffnanoröhren (SWCNT) Biokonjugat, und anti-zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4 (anti-CTLA-4) Checkpoint-Inhibition für die Behandlung von metastasiertem Brustkrebs in einem orthotopen murinen Modell untersucht.

Die einzigartigen Eigenschaften von SWCNTs als Nanomaterial haben erhebliches Interesse an ihrer Verwendung als potenzielles Werkzeug im Kampf gegen Krebs geweckt. Während SWCNTs eine Vielzahl biologischer Effekte ausüben, hat sich die Verwendung von SWCNTs in der Krebstherapie primär auf ihre Wechselwirkung mit Nahinfrarot (NIR) Licht und den resultierenden photothermischen Effekt konzentriert, bei dem SWCNTs den Tumor im Prozess der photothermischen Therapie (PTT) rasch erhitzen. Zahlreiche Gruppen haben das Potenzial von SWCNTs für PTT-basierte Behandlungsstrategien in verschiedenen Brustkrebsmodellen untersucht [3,4,5,6,7,8,9,10]. Diese Arbeiten konzentrierten sich weitgehend auf die Fähigkeit von PTT, Primärtumoren in Tiefen von nicht mehr als wenigen mm zu behandeln, wo die Dämpfung von NIR-Licht fast vollständig ist.

Früher zeigten wir, dass primäre orthotope Brusttumore in syngenen Mäusen nahezu vollständig eliminiert werden konnten, indem milde NIR-Laserlicht in Verbindung mit einem photothermisch verstärkenden SWCNT-Biokonjugat verwendet wurde [11]. In diesem Biokonjugat waren die SWCNTs mit dem Protein Annexin A5 (ANXA5) funktionalisiert, das mit hoher Affinität an das anionische Phospholipid Phosphatidylserin bindet, das extern auf Tumorzellen und Endothelzellen der Tumorvaskulatur exprimiert wird, aber nicht auf normale Zellen in der Vaskulatur [12,13,14]. Dieses Konjugat wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) visualisiert, um zu zeigen, dass die Höhe des Konjugats zwischen 2,5 und 5,0 nm lag, was ähnlich wie bei anderen SWCNT-Protein-Konjugaten ist [11]. Obwohl es in der Lage war, Primärtumore in diesem metastatischen Modell zu eradikieren, verlängerte die photothermische Therapie allein das Überleben nur mäßig. Wir fanden jedoch vorläufige Hinweise darauf, dass eine begleitende Behandlung mit Immunmodulatoren wie Cyclophosphamid das Überleben erhöhen könnte.

Kürzlich war das Potenzial von Immunmodulatoren wie Cyclophosphamid, synergistisch SWCNT-gesteuerte PTT zu verstärken, Gegenstand großen Interesses. Eine Kategorie vielversprechender immunmodulierender Wirkstoffe sind Checkpoint-Inhibitoren. Checkpoint-Inhibitoren sind Antikörper wie anti-CTLA-4, anti-PD-1 und anti-PDL-1, die kritische Zellproteine binden, die für die Modulation der körpereigenen Reaktion auf Krebs verantwortlich sind. Diese Antikörper blockieren wichtige biologische "Checkpoints", an denen der Körper die Immunantwort auf Krebs herunterregulieren kann. Diese Proteine dienen normalerweise einer wichtigen Rolle bei der Kontrolle der immunologischen Reaktion des Körpers. Durch Blockieren der Wirkung dieser Proteine entfernen Checkpoint-Inhibitoren einen Mechanismus, durch den das Immunsystem seine natürliche antitumorale Reaktion normalerweise unterdrückt. Kürzlich haben mehrere Gruppen beobachtet, dass die Kombination von anti-CTLA-4 Checkpoint-Inhibition mit SWCNT-verstärkter PTT das Potenzial hat, eine robuste Immunantwort bei Brustkrebs zu fördern [15, 16].

In der aktuellen Studie evaluieren wir die Kombination unserer neuartigen PTT-Modality in Verbindung mit dem immunstimulierenden Agenten anti-zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4 (anti-CTLA-4). Ursprünglich für die Behandlung von metastasiertem Melanom zugelassen [17], wird anti-CTLA-4 nun in klinischen Studien für die Behandlung von Brustkrebs in Kombination mit anderen immunstimulierenden Agenten getestet [18]. Wir evaluieren den Mechanismus der verstärkten antineoplastischen Immunität in PTT in Kombination mit anti-CTLA-4 Checkpoint-Inhibition sowie das langfristige Schicksal von SWCNTs in Zielorganen.

Materialien und Methoden

Materialien

Das Plasmid, das ANXA5 kodiert, pET-30 Ek/LIC/ANX, wurde zuvor in diesem Labor konstruiert [11]. Bovines Serumalbumin (BSA), Triton X-100, EDTA, β-Mercaptoethanol, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tris-Acetat-EDTA-Puffer waren von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Natriumphosphat und Natriumdodecylsulfat (SDS) waren von Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). HPLC-Grad Ethanol war von Acros Organics (Waltham, MA). His-Trap-Säulen waren von GE Healthcare (Chicago, IL). Flusszytometrie-Färbepuffer, Fixierungs/Permeabilisierungspuffer, Permeabilisierungspuffer, chromogenes Endotoxin-Quantifizierungskit und Slide-A-Lyzer Dialysekassetten (3,5 kDa) waren von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Die 2 und 100 kDa Dialysemembranen waren von Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Roswell Park Memorial Institute Zellmedium (RPMI-1640) und Hank's balancierte Salzlösung waren von ATCC (Manassas, VA). Fetales Kälberserum (FBS) war von Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Trypton, Hefeextrakt und Kanamycinsulfat wurden von Alfa Aesar (Ward Hill, MA) bezogen. Natriumhydroxid, Kaliumchlorid und Natriumchlorid waren von VWR Inc (Radnor, PA). HRV-C3 Protease war von Sino Biologics (Portland, OR). Anti-CTLA-4 Maus monoklonaler Antikörper (Klon: 9H10) und Maus Zytokin ELISA-Kits (TNF-α, IFN-γ, IL-6) wurden von BioLegend (San Diego, CA) bezogen. CoMoCAT SWCNTs (durchschnittlicher Durchmesser 0,8 ± nm, durchschnittliche Länge 1,5 ± 0,5 µm) wurden von CHASM (Boston, MA) bezogen. Die CoMoCAT-Methode ist bekannt dafür, SWCNTs einer kleinen Anzahl von (n,m) Chiralitäten mit hoher Selektivität zu liefern [19]. Die in dieser Studie verwendete Probe ist stark in [5, 6] SWCNTs angereichert, was eine starke NIR-Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 980 nm aufweist. Diese Absorption entspricht dem S₁₁ Übergang für diesen Nanoröhrentyp zwischen einer besetzten van Hove-Singularität zur entsprechenden unbesetzten. Daher wurde, um die Strahlungsabsorption der auf den Tumoren abgelagerten SWCNTs zu maximieren, die Wellenlänge des in dieser Studie verwendeten Lasers auf 980 nm festgelegt, um genau dem S₁₁ optischen Übergang zu entsprechen [20]. Abbildung S1 in der Zusatzdatei 1 zeigt die Fluoreszenzspektren, die die S₁₁ NIR-Emission nach Anregung des S22-Übergangs mit sichtbarem Licht deutlich zeigen.

Zellkultur

EMT6 Brustkrebszellen von ATCC (Manassas, VA) wurden in Waymouth's MB 752/1 Medium mit 2 mM L-Glutamin, supplementiert mit 15% FBS, kultiviert. Alle Zellen wurden bei 37 °C und 100% Luftfeuchtigkeit unter 5% CO₂ gezüchtet. Alle Zellen wurden mit 0,25% (Gew./Vol.) Trypsin in 0,53 mM EDTA passagiert. Zelllinienidentität und Mykoplasma-freier Status wurden via STR-Test (Charles River) bestätigt und als endotoxin-frei durch Limulus-Assay assayiert.

ANXA5 und SWCNT-ANXA5 Herstellung

Das SWCNT-ANXA5 Konjugat wurde mit einem Verfahren hergestellt, das wir zuvor entwickelt haben und das 2,5 mg ANXA5/mg SWCNT ergibt [11]. Kurz gesagt, E. coli, transfiziert mit einem Plasmid, das ANXA5 kodiert, pET-30 Ek/LIC/ANX, wurden gezüchtet und mittels immobilisierter Metallaffinitätschromatographie mit immobilisiertem Ni²⁺ gereinigt, um ANXA5 zu isolieren, was enzymatische Spaltung zur Entfernung eines (His)₆-Tags involvierte. Gefriergetrocknete CoMoCAT SWCNTs wurden in 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) unter Verwendung von zwei Zyklen der Sondensoniation bei 20 W und Zentrifugation bei 29.600 g für jeweils 30 min dispergiert. Die suspendierten SWCNTs wurden durch NIR-Fluoreszenz (Zusatzdatei 1: Abbildung S1) charakterisiert und dann für 30 min bei Raumtemperatur mit einem 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-polyethylenglycol-maleimid (DSPE-PEG-maleimid) Linker konjugiert, um hydrophobe Wechselwirkung zwischen SWCNTs und der DSPE-Funktionsgruppe zu ermöglichen. Dies wurde gefolgt von einer 8-stündigen Dialyse in destilliertem Wasser, um überschüssigen Linker und SDS zu entfernen. Das dialysierte Konjugat wurde dann 2 h mit ANXA5 reagiert, das eine Cystein-Gruppe enthält, und mit 1,5 mg ml⁻¹ L-Cystein blockiert. Das Endprodukt, SWCNT-ANXA5, wurde 8 h gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer dialysiert, um überschüssiges ANXA5 und L-Cystein zu entfernen. Proteingewicht und Reinheit wurden via SDS-PAGE charakterisiert. Der SWCNT- und ANXA5-Gehalt des Biokonjugats wurde durch UV-Vis-NIR Fluoreszenzspektroskopie, Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) Raman-Analyse und Bradford-Assay charakterisiert (Zusatzdatei 1: Abbildung S2).

In Vivo Studien

Alle Verfahren entsprachen einem vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Oklahoma genehmigten Protokoll. Weibliche BALB/cJ Mäuse, 6 Wochen alt, wurden verwendet (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Die Mäuse erhielten Standard-Futter. Während der photothermischen Bestrahlung von Tumoren mit NIR-Laserlicht wurden Mäuse mit 2% Isofluran und 98% Sauerstoff über eine Nasenmaske betäubt.

Tumore wurden durch orthotope Injektion von 10⁶ EMT6 Maus-Brustkrebszellen in 100 µL PBS in das IV. Mammafettpad induziert. Die Tumore durften 12 Tage wachsen, und wenn sie ein Volumen von 60 mm³ (~ 5 mm Durchmesser) erreichten, erhielten die Mäuse eine systemische i.v. Injektion von 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT pro kg Körpergewicht) Biokonjugat über die laterale Schwanzvene. Nach 3 h wurde ein Bereich, der 5 mm über die Tumorgrenze hinausging, mit NIR-Licht (980 nm) bei einer Energie und Leistungsdichte von 175 J/cm² und 1 W/cm² bestrahlt (Zeit 175 s; Diodevet-50 NIR Laser, B&W Tek Inc., Newark, DE). Checkpoint-Inhibition wurde durch serielle i.p. Verabreichung von 200 µg anti-CTLA-4 Antikörper in 100 µl PBS an den Tagen 8, 11 und 16 nach Tumorinokulation erreicht. Tumorvolumen wurde mit der modifizierten Ellipsoid-Formel \(V = \frac{1}{2} \times {\text{Länge}} \times {\text{Breite}}^{2}\) unter Verwendung von Schieblehrenmessungen der längsten Dimension und senkrechten Breite berechnet. Tumortemperatur wurde mit einer handgehaltenen FLIR TG165 Spot Wärmebildkamera (Raymarine ITC, Fareham, UK) überwacht, die auf Automatische Erfassung der maximalen detektierten Temperatur eingestellt war. Zielorgane wurden für Toxizitätsbewertung entnommen und in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, und formalin-fixiert-paraffin-eingebettete (FFPE) Schnitte wurden hergestellt und mit Hämatoxylin und Eosin für Toxizitätsanalyse gefärbt.

Ex Vivo SWCNT Detektion

Mäuse erhielten eine systemische Injektion von 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT/kg Körpergewicht) über die laterale Schwanzvene. Zu ausgewählten Zeitpunkten wurden Mäuse (n = 3) euthanasiert, necropsiert und Zielorgane für Analysen entnommen. Gewebeproben wurden wie zuvor beschrieben [21] präpariert. Das Vorhandensein von SWCNTs in ex vivo Gewebeproben wurde dann durch relative NIR-Fluoreszenzspektroskopie mit einem NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX) bestimmt.

Flusszytometrie

Mäuse wurden 14 Tage post-Behandlung euthanasiert, und splenische antitumorale Immuneffektorzellen wurden wie zuvor beschrieben [21] quantifiziert.

Zytokin Detektion

Nach Behandlung wie oben beschrieben wurden Mäuse (n = 4–5) 7 Tage nach photothermischer Therapie zur Blutentnahme euthanasiert. Die Konzentration von Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α), Interferon Gamma (IFN-γ) und Interleukin 6 (IL-6) in verdünnten Serumproben wurde gemäß dem Protokoll des Lieferanten durch ELISA quantifiziert.

Statistische Analyse

Daten wurden mit Graphpad Prism Software analysiert. Statistische Signifikanz wurde mit einem einweg ANOVA und Tukey-Kramer Mehrfachvergleichstest bewertet. Statistische Signifikanz der Überlebenskurven wurde durch den Mantel-Haenszel Log-Rank-Test bestimmt. Statistische Signifikanz der Zytokin-Serumkonzentration wurde durch einweg ANOVA und Dunnett's Mehrfachvergleichstest analysiert. Mehrfachvergleiche wurden durch den Bonferroni-Schwellenwert korrigiert. Fehler werden grafisch als Standardfehler des Mittelwerts dargestellt, es sei denn, der Fehler überschritt nicht die Größe des gezeichneten Mittelpunktsymbols, in welchem Fall die Balken zur Klarheit weggelassen wurden.

Ergebnisse

Thermische Kinetik

Bei einer Dosis von 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 wurde die Maximaltemperatur der Tumore während der Behandlung mit NIR-Licht aufgezeichnet, wie in Abb. 1 angegeben. Mäuse, die SWCNT-ANXA5 vor der Bestrahlung erhielten, hatten höhere Tumortemperaturen für die gesamte NIR-Lichtbehandlung im Vergleich zu Mäusen, die physiologische Kochsalzlösung erhielten. Die durchschnittliche Tumortemperatur für Mäuse, die SWCNT-ANXA5 erhielten, war signifikant anders als für Mäuse, die physiologische Kochsalzlösung erhielten (54 °C vs. 37 °C, p < 0,05). Als Ergebnis dieser verstärkten photothermischen Therapie trat sichtbare Tumorablation nur in der SWCNT-ANXA5-Gruppe auf. Tumorablation wurde durch rasche Verfärbung, gefolgt von Hautkontraktion und dem Auftreten von Falzen charakterisiert. Innerhalb von 48 h bildete sich eine signifikante Eschar an der Stelle der photothermischen Ablation. Die vollständige Hautregeneration dauerte mehrere Wochen.

Photothermische Therapie und Checkpoint-Inhibition

Die Ergebnisse der Kombination von photothermischer Therapie mit Checkpoint-Inhibition unter Verwendung von anti-CTLA-4 monoklonalem Antikörper sind in Abb. 2 dargestellt. Während die photothermische Therapie allein primäre Brustkrebsneoplasien problemlos eradikierte, begrenzte die Unfähigkeit des NIR-Laserlichts, über wenige mm hinaus einzudringen, die Behandlung von Brustkrebsmetastasen. Um die Mängel der lokalisierten NIR-photothermischen antineoplastischen Behandlung zu überwinden, erforschten wir die Kombination dieser einzigartigen therapeutischen Behandlungsmodalität mit systemischer Checkpoint-Inhibition (Abb. 2). Während die photothermische Therapie bei der Zerstörung primärer EMT6-Tumore hervorragend abschnitt (Abb. 2a), versagte diese Behandlung bei der Eradikation von Metastasen und erhöhte das Überleben von Mäusen mit EMT6 orthotopen Tumoren nur mäßig (Abb. 2b). Im Gegensatz dazu verbesserte Checkpoint-Inhibition mit anti-CTLA-4 das Gesamtüberleben, verzögerte aber nur vorübergehend das Primärtumorwachstum. Während keine der Therapien allein eine Erhöhung des Gesamtüberlebens ergab, verbesserte die Kombination sowohl von SWCNT-ANXA5-verstärkter photothermischer Therapie als auch anti-CTLA-4 Checkpoint-Inhibition das Gesamtüberleben, was zu 55% Überleben nach 100 Tagen post Tumorinokulation führte.

Zytometrische Analyse splenischer Effektorzellen nach Behandlung offenbarte einen vermuteten Mechanismus des verbesserten Überlebens bei Mäusen, die kombinatorische photothermische Therapie und Checkpoint-Inhibition erhielten. Mäuse wurden mit EMT6 inokuliert und wie zuvor beschrieben behandelt. Zwei Wochen nach Behandlung wurden Mäuse geopfert und sowohl die Prozentsätze als auch die relativen Anzahlen mehrerer Immuneffektortypen quantifiziert. Populationen von Helfer-T-Zellen, zytotoxischen T-Zellen, Neutrophilen, myeloischen supprimierenden Zellen (MDSC) Monozyten, FoxP3 regulatorischen T-Zellen und Makrophagen wurden evaluiert (Zusatzdatei 1: Abbildung S3). Analyse dieser Populationen ergab signifikante Unterschiede zwischen Behandlungspopulationen und Kontrollen nur bei Mäusen, die die Kombination aus sowohl photothermischer Therapie als auch anti-CTLA-4 Checkpoint-Inhibition erhielten. In diesen Tieren, die diese Kombination erhielten, beobachteten wir einen Anstieg der relativen Anzahlen von Helfer-T-Zellen (CD4⁺) und zytotoxischen T-Zellen (CD8⁺), (Abb. 2c, d). Zunahmen der CD4⁺ und CD8⁺ Zellzahlen korrelierten mit groben Zunahmen der Milzgrößen, die nach Nekropsie beobachtet wurden.

Zusätzlich zur zytometrischen Analyse splenischer Effektorzellen wurde die Serumzytokin-Konzentration 7 Tage nach PTT bestimmt, um die Mechanismen der antitumoralen Immunität zu elucidieren. Die Spiegel der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6, IFN-γ und TNF-α sind in Abb. 3 dargestellt. Weder SWCNT noch anti-CTLA-4 Behandlung allein erhöhten die Zytokinwerte signifikant im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. PTT-Behandlung allein konnte jedoch TNF-α signifikant erhöhen. Die weitere Addition von anti-CTLA-4 zur PTT-Behandlung erhöhte die Spiegel von TNF-α, IL-6 und IFN-γ signifikant.

Biodistribution und Toxizität von SWCNT-ANXA5

Die Biodistribution von SWCNT-ANXA5 nach Verabreichung zur photothermischen Therapie-Verstärkung in verschiedenen Organen wurde mit fluoreszierender Quantifizierung von SWCNT in ex situ Gewebelysaten im Vergleich zu Standards überwacht (Zusatzdatei 1: Abbildung S4). Biodistribution in Zielorganen wurde über einen Zeitraum von 4 Monaten nach i.v. Injektion von 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 in gesunden Mäusen verfolgt (Abb. 4a, b). Im Gegensatz dazu wurde die Anreicherung von SWCNT-ANXA5 in EMT6 Tumor-tragenden Mäusen nach Verabreichung, gemäß dem zuvor beschriebenen Injektionsprotokoll, 3 h nach Verabreichung bestimmt. (Der Zeitpunkt, zu dem die photothermische Therapie in der Behandlungsstudie durchgeführt wurde.) Während des 4-monatigen Zeitraums vor Organentnahme wurden Mäuse auf physische Nebenwirkungen und abnormales Verhalten überwacht. In keinem der mit SWCNT-ANXA5 injizierten Mäuse wurden während dieses Zeitraums Nebenwirkungen beobachtet. Keine histopathologische Toxizität wurde bei der Untersuchung von Hämatoxylin und Eosin gefärbten FFPE-Schnitten aus Zielorganen am Studienende beobachtet (Zusatzdatei 1: Abbildung S5).

Diskussion

Die hier vorgestellten Daten unterstützen die Wirksamkeit der Kombination gezielter photothermischer Therapie und immuner Checkpoint-Inhibition für die Behandlung von metastasiertem Brustkrebs. Dieses Phänomen ist als "abskopaler Effekt" bekannt, der die Fähigkeit lokaler Bestrahlung beschreibt, eine antitumorale Antwort zu initiieren, die Tumorwachstum fern vom primären Ziel unterdrückt. Bereits in den 1950er Jahren beobachteten Forscher, dass lokale Tumorbestrahlung einen signifikanten Effekt auf ferne Tumore hatte [22]. Studien haben gezeigt, dass die systemische Natur des abskopalen Effekts auf die Immunantwort des Wirts zurückzuführen ist [23,24,25]. Während γ-Bestrahlung der Hauptfokus der meisten abskopalen Forschungen war, demonstriert ein wachsender Körper von Arbeiten, dass photothermische Therapie ebenfalls einen abskopalen Effekt induzieren kann. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass thermische Ablation in Kombination mit dem Checkpoint-Inhibitor anti-CTLA-4 eine verstärkte Immunantwort hervorruft [16, 26,27,28,29]. Wir beobachten eine ähnliche abskopale Antwort nach gezielter photothermischer Ablation und anti-CTLA-4 Blockade im EMT6-Modell von Brustkrebs.

Der abskopale Effekt wird durch die Daten in Abb. 2a, b illustriert. Orthotope EMT6-Tumore wachsen schnell und haben metastasiert, wenn sie durch photothermische Therapie behandelt werden. Dies ist der Grund, warum Mäuse mit Tumoren, die nur mit photothermischer Therapie behandelt wurden, nur eine leichte Überlebensverlängerung im Vergleich zu den unbehandelten Mäusen als Kontrolle aufwiesen, obwohl der Primärtumor vollständig ablatiert war. Die Verabreichung von anti-CTLA-4 allein verzögerte Tumorwachstum im Vergleich zur Kontrolle und erhöhte die Überlebenszeit auf 68 Tage, führte aber nicht zur Heilung. Ein ähnliches Ergebnis verzögerten EMT6-Tumorwachstums wurde von Jure-Kunkel et al. beobachtet, als anti-CTLA-4 verabreicht wurde [30]. Für die Kombination aus photothermischer Therapie und anti-CTLA-4 überlebten 55% der behandelten Mäuse 100 Tage nach Tumorinokulation und sind wahrscheinlich geheilt.

Einblick in den Mechanismus der antitumoralen Immunität wurde durch Flusszytometrie zur Quantifizierung der Populationen von Immuneffektorzellen in der Milz evaluiert. Im Vergleich zu entweder photothermischer Therapie oder anti-CTLA-4 allein führte die Kombinationstherapie zu einem siebenfachen Anstieg von Helfer-CD4⁺ T-Zellen und einem dreifachen Anstieg von zytolytischen CD8⁺ T-Zellen, beide Ergebnisse hoch statistisch signifikant (p < 0,005). Diese Ergebnisse liefern weitere Belege für eine potenzielle abskopale Antwort durch die Kombination von Phototherapie und T-Zell-Kostimulationstherapie mit immuner Checkpoint-Inhibition.

Zunahmen der CD4⁺ und CD8⁺ Zellzahlen korrelierten mit Zunahmen der Milzgrößen, die während der Nekropsie beobachtet wurden. Erhöhte Milzgröße deutet auf eine verstärkte Immunantwort hin. Die Milz besteht aus mehreren Zelltypen, die häufigsten sind CD4⁺, CD8⁺ und B-Zell-Linien [31, 32]. Obwohl in dieser Arbeit nicht untersucht, würden wir erwarten, dass B-Zellzahlen zusammen mit CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellzahlen zunehmen [33]. Helfer-CD4⁺ T-Zellen unterstützen die humorale Immunität, indem sie andere Immunzellen durch Zytokinstimulation und direkte Zell-Zell-Interaktionen facilitieren. Zytolytische CD8⁺ T-Zellen töten Tumorzellen direkt. Zunahmen der CD4⁺ und CD8⁺ Zellzahlen sind indikativ für eine systemische abskopale Immunantwort.

Das Vorhandensein einer systemischen abskopalen Immunantwort nach der Kombinationstherapie wird weiter durch Anstiege der pro-inflammatorischen Zytokinwerte im Mäusesserum unterstützt (Abb. 3). TNF-α aktiviert tumorassoziierte Makrophagen, um antitumorale Effekte zu präsentieren [34, 35]. IFN-γ spielt eine wichtige Rolle in der Tumorsurveillance [36, 37]. IL-6 fördert die Proliferation von Makrophagen und Lymphozyten [38]. Der signifikante Anstieg dieser Effektormoleküle im Mäusesserum 7 Tage nach PTT-Behandlung kombiniert mit anti-CTLA-4 unterstützt weiterhin die Existenz einer antitumoralen Immunantwort.

Am Ende der Bestrahlung von Mäusen, die SWCNT erhielten, betrug die durchschnittliche Maximaltumortemperatur 54 °C; diese Temperatur war ausreichend, um den Tumor vollständig abzulatieren (Abb. 1). Dies liegt im 45–60 °C Bereich, in dem Enzyminaktivierung und mitochondriale Verletzung auftreten [39]. Die Temperatur der Tumore in der Kochsalz-Kontrollgruppe blieb unter 40 °C, einer Temperatur, die minimalen therapeutischen Nutzen bietet [39,40,41].

Wir beobachteten, dass die Mehrheit der SWCNT-ANXA5-Anreicherung basierend auf Konzentration primär in Leber, Herz, Milz, Nieren, Lunge und Tumor lag (Abb. 4a). In Mäusen mit EMT6-Tumoren beobachteten wir, dass die SWCNT-ANXA5-Konzentration ähnlich wie in Leber und Nieren war (Abb. 4a, b). Spuren von SWCNT-ANXA5 wurden in Gehirn, Dickdarm und Dünndarm detektiert. Es ist wichtig zu beachten, dass die Biodistribution von SWCNT auf Basis von % der injizierten Dosis (ID) nicht gut mit der absoluten SWCNT-Konzentration in einem Zielgewebe korreliert. Dies ist primär auf die Unterschiede in den Organmassen zurückzuführen. Beispielsweise entspricht ein gegebener % ID in einem Organ einer höheren Konzentration in kleineren Organen und geringeren Konzentrationen in größeren Organen. Beim Vergleich der Proben auf Basis der SWCNT-Konzentration zeigt sich, dass die höchste Konzentration in der Niere liegt, gefolgt von Leber und Milz (Abb. 4a).

Es gibt Hinweise auf Degradation von SWCNTs in den verschiedenen Organen über den Zeitraum der Biodistributionsstudie (Abb. 4a, b). Degradation von SWCNTs in Organen wird aufgrund eines früheren Befunds erwartet, dass mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren in Makrophagen abgebaut werden [42]. Die in unserer Studie verwendeten SWCNTs haben einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,8 nm und eine durchschnittliche Länge von 1500 µm. Diese Größe wird nicht als zytotoxisch vorhergesagt, basierend auf einer Studie von Zhu et al. [43], die das Potenzial für Lipiddoppelschicht-Schädigung durch Kohlenstoffnanoröhren-Toxizität basierend auf Länge und Durchmesser klassifizierte. Gemäß dieser Klassifizierung fallen die von uns verwendeten SWCNTs in die Kategorie "biologisch weich", was Zytotoxizität minimiert, was mit unseren Beobachtungen in den Mäusestudien konsistent ist, wo wir keine Nebenwirkungen oder histopathologische Toxizität als Folge der Verabreichung des SWCNT-ANXA5-Konjugats beobachteten.

Schlussfolgerungen

Hier demonstrieren wir eine neuartige kombinatorische Behandlungsmodalität, bei der wir eine relativ hohe Überlebensrate bei Mäusen mit aggressivem metastasiertem Brustkrebs erzielen, indem wir photothermische Therapie mit dem SWCNT-ANXA5-Biokonjugat kombiniert mit anti-CTLA-4-basierter Checkpoint-Inhibition anwenden. Die Verwendung des tumorvaskulär zielgerichteten Proteins ANXA5 minimierte die Menge an systemisch verabreichten SWCNTs, die notwendig war, um Primärtumore in einer niedrigen Einzeldosis zu eradikieren. Interessanterweise stellten wir eine Zunahme des Überlebens von Mäusen mit metastasiertem Krebs fest, die mit kombinatorischer Therapie behandelt wurden, obwohl nur der Primärtumor bestrahlt wurde. Eine mechanistische Studie zur Quantifizierung der Anzahlen wichtiger splenischer antitumoraler Effektorzellen zeigte, dass nur die Kombination beider Behandlungsmodalitäten die Anzahl der CD4⁺ Helfer- und CD8⁺ zytotoxischen T-Zellen erhöhte. Wir hypothesieren, dass dieser Anstieg der T-Zellen einen abskopalen Effekt reflektiert, bei dem antitumorale Effektorzellen Tumor-Metastasen unterdrückten. Obwohl SWCNTs noch 4 Monate nach Verabreichung in Organen nachgewiesen wurden, wurden während der Experimente keine Nebenwirkungen oder offensichtliche Gewebetoxizität beobachtet.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind vollständig ohne Einschränkung verfügbar.

Abkürzungen

SWCNT:

Einwandige Kohlenstoffnanoröhre

ANXA5:

Annexin A5

anti-CTLA-4:

Anti-zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4

EDTA:

Ethylendiamintetraessigsäure

SDS-PAGE:

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

DSPE:

1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin

PTT:

Photothermische Therapie