Entschlüsselung der SARS-CoV-2-Genome – diagnostische Tests

„Testen, testen, testen!“ ist ein weit verbreiteter Slogan zur Bekämpfung der COVID-19-Pandemie. Die Weltgesundheitsorganisation und andere Bundes- und Landesbehörden auf der ganzen Welt haben dieses bekannte Schlagwort veröffentlicht. Tatsächlich ist das schnelle Testen der menschlichen Bevölkerung der Grundstein für die Kontrolle einer Pandemie wie COVID-19.

Umfangreiche Tests bieten eine rationale Grundlage für die Umsetzung von Strategien der öffentlichen Gesundheit, die eine weitere Ausbreitung der Krankheit verhindern können. Sie ermöglicht es den Behörden, fundierte Entscheidungen über mildernde Maßnahmen wie soziale Distanzierung, Aufenthalt zu Hause und im Extremfall Ausgangssperre zu treffen. Nach einer durch die Luft übertragenen Krankheit wie COVID-19 sind diese wichtigen Initiativen im Bereich der öffentlichen Gesundheit von entscheidender Bedeutung, um den Druck auf die Gesundheitssysteme zu verringern und Menschenleben zu retten.

Genombasierte Analyse ist der Schlüssel zur Entwicklung eines für SARS-CoV-2 spezifischen Testkits. Dies ist der Fall, egal ob wir DNA-basierte Kits (PCR, isothermale Amplifikation, CRISPR) entwickeln oder Antigene für den serologischen Nachweis generieren . Eine globale Non-Profit-Organisation hat eine Liste aller im Handel erhältlichen SARS-CoV-2-Tests zusammengestellt. Hier werden wir die beiden derzeit verwendeten Haupttechniken besprechen:DNA-basierte Tests und Antikörper-basierte Tests.

DNA-basierte Tests

Derzeitige Tests auf COVID-19, die an viralem genetischem Material aus Nasen- und Rachenabstrichen durchgeführt werden, verwenden eine gängige molekularbiologische Technik namens Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Ein anderer Test verwendet die neuere isotherme Nukleinsäure-Amplifikationstechnologie, die von Abbot Labs entwickelt wurde ¹ . Beide Tests sind hochsensibel. Sie funktionieren, indem sie eine Region des Genoms amplifizieren, die für das SARS-CoV-2-Virus spezifisch ist. Diese Amplifikation wird durch ein Paar Oligonukleotide (auch Primer genannt) geprimt, die zu den viralen Sequenzen komplementär sind.

Die aktuelle RT-PCR-Methode umfasst die Extraktion viraler RNA aus Nasen- und Rachenabstrichen und die reverse Transkription der RNA in DNA, gefolgt von einer PCR-Reaktion. Das PCR-Verfahren verwendet eine Temperatur-Zyklus-Strategie, die das Denaturieren der Matrize und das Anlagern kurzer Primer an komplementäre Sequenzen auf der Matrize beinhaltet. Die durch das Polymerase-Enzym erleichterte Verlängerung des Primer-Template-Komplexes führt zu einer exponentiellen Amplifikation der Ziel-Amplikons. Die Ergebnisse liegen innerhalb weniger Stunden vor. Detaillierte Protokolle zur PCR-Methode werden von der WHO und CDC geteilt. Im Gegenteil, die isotherme Methode von Abbott Labs ist nicht durch thermische Zyklen eingeschränkt und die positiven Ergebnisse für COVID-19 werden in 5 Minuten erhalten, während negative Ergebnisse in 13 Minuten erhalten werden ¹ .

Die einzigartigen Regionen in SARS-CoV-2, die durch vergleichende Genomanalysen identifiziert wurden, dienen als charakteristische Marker für das Design von Primern oder Sonden, die in DNA-basierten Kits verwendet werden. SARS-CoV-2 ist ein einzelsträngiges RNA-Virus mit einem Genom von fast 30.000 Basen. Das virale Genom kodiert für vier Strukturproteine, nämlich das Hüllprotein (E), die Membran (M), das Nukleokapsid (N) und das Spike (S) Protein.

Vergleichende Genomanalysen haben verschiedene Regionen identifiziert, die für SARS-CoV-2 einzigartig sind. Die Einzigartigkeit der Sequenz wird durch die Suche nach ähnlichen Sequenzen unter Verwendung des BLAST-Algorithmus (Basic Local Alignment Search Tool) in der GenBank-Datenbank, einem globalen Repository aller sequenzierten Genome, validiert. Die einzigartigen Regionen in Genen wie ORF1ab, N, RdRp und S werden derzeit als Primer in der SARS-CoV-2-RT-PCR-Diagnose verwendet ² , während der ID NOW™ COVID-19-Schnelltest von Abbott auf das RdRp-Gen abzielt.

Neue Methoden am Horizont

CRISPR, eine beliebte Gen-Editing-Technologie, gilt als skalierbare Option für Bevölkerungstests. Diese Methode nutzt die Fähigkeit der CRISPR-Maschinerie, bestimmte genetische Sequenzen zu erkennen und zu schneiden. CRISPR schneidet auch ein der Reaktion hinzugefügtes Reportermolekül, das schnell das Vorhandensein von viralem genetischem Material aufdecken kann. Das auf CRISPR basierende SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) wird als Papiermessstreifenmethode beschrieben, die in einer Stunde Ergebnisse liefern kann. SHERLOCK wurde von Feng Zhang vom Broad Institute of MIT und Harvard gemeinsam entwickelt ³ . Eine andere von Jennifer Doudna an der University of California, Berkeley entwickelte Methode, usurpiert die isotherme Voramplifikation mit DNA Endonuklease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) für Coronavirus. DETECTR kann in 30 Minuten Ergebnisse liefern ⁴ .

Sequenzbasierte Methoden liefern kritische Informationen über das Vorhandensein oder Fehlen des Virus bei einem Patienten, Informationen, die bei der Entwicklung von Richtlinien für die öffentliche Gesundheit und Sicherheit besonders wertvoll sind. In den USA testen wir derzeit nur Personen, die Symptome auf COVID-19 aufweisen. Bei einer Krankheit wie COVID-19 besteht jedoch die ernsthafte Gefahr, dass asymptomatische Menschen das Virus in der Gemeinde verbreiten.

Woher wissen wir, ob eine Person bereits eine SARS-CoV-2-Infektion hatte und eine Immunität entwickelt hat?

Antikörperbasierte Tests

Antikörpertests identifizieren asymptomatische Personen, die bereits eine Infektion hatten und wahrscheinlich immun sind. Antikörpertests sind auch die beste Strategie, um die gesamte Bevölkerung zu screenen und die Angst vor einer Ausbreitung in der Gemeinschaft zu lindern. Personen mit positiven Antikörperergebnissen könnten auch eine potenzielle Plasmaquelle sein, die COVID-19-Patienten injiziert werden kann, ein Ansatz, der derzeit in den USA getestet wird.

Antikörpertests erfordern eine gewisse Kenntnis der für das Virus entscheidenden Proteine, z. B. des viralen Hüllproteins. Idealerweise sind diejenigen viralen Proteine, die das Immunsystem auslösen, die besten Kandidaten, da sie die Produktion von Antikörpern initiieren, die das Virus markieren oder neutralisieren. Es ist dann notwendig, diese Teile oder Abschnitte des viralen Proteins im Labor herzustellen und sie in Zelllinien zu transfizieren, um sie in einen Immunoassay wie ELISA aufzunehmen, der das Vorhandensein von Antikörpern nachweist.

Solche Immunoassays können möglicherweise die Grundlage für Heimtest-Kits bilden, um die Immunität gegen Krankheiten wie COVID-19 nachzuweisen. Die Entwicklung dieser Kits braucht jedoch Zeit. Der schwierigste Flaschenhals in diesem Prozess ist die Expression des Proteins oder Proteinsegments in der richtigen Konformation.

Das SARS-CoV-2-Spike-Protein stellt einen potenziellen Weg für die Entwicklung von Diagnostika dar, da es nur wenige einzigartige Regionen hat. Mehrere Teams testen die Rezeptorbindungsdomäne des S-Proteins, während einige das gesamte Spike-Protein untersuchen ² . Andere potentielle Kandidaten umfassen das Nukleokapsidprotein und das S-Protein. Die FDA bewertet verschiedene Antikörpertestmethoden und hat vor kurzem den ersten Test genehmigt, mit dem festgestellt werden kann, wie viele Menschen in der Bevölkerung immun sind ⁵ .

Inmitten der heutigen COVID-19-Pandemie machen DNA- und Antikörper-basierte Diagnosetests einen entscheidenden Unterschied in den Initiativen zur öffentlichen Gesundheit, die wir zur Eindämmung und Eindämmung des SARS-CoV-2-Virus ergreifen. Da wir uns bemühen, die Kurve abzuflachen, sind schnelle Tests wichtig.

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Modellierung und Simulation bieten neue Erkenntnisse für SARS-CoV-2 Entschlüsselung der SARS-CoV-2-Genome – Herkunft