Sicherheitsbewertung von Liposom-Nanoträgern bei intratympanischer Applikation im Ratten-Innenohr

Zusammenfassung

Liposom-Nanoträger (LPNs) bieten hohe Arzneimittelladung und effiziente Aufnahme im Innenohr nach minimal-invasiver intratympanischer Verabreichung. Doch ihre Biokompatibilität in diesem empfindlichen Organ war nicht systematisch bewertet worden. In dieser Studie wurden LPNs – mit oder ohne Gadolinium-Tetra-Azacyclo-Dodecan-Tetraessigsäure (Gd-DOTA) – transtympanisch in Sprague-Dawley-Ratten injiziert. Gadolinium-verstärkte Magnetresonanztomographie (Gd-MRT) verfolgte die LPN-Verteilung und bewertete die Barriereintegrität, während auditive Hirnstammpotenziale (ABR) die Hörfunktion maßen. Entzündungsmarker (Glykosaminoglykane, Hyaluronsäure, CD44, TLR2) und Apoptose (TUNEL) wurden in Cochleageweben quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten effizienten Innenohr-Eintritt der LPNs ohne Beeinträchtigung der Mittel- oder Innenohrbarrieren, keinen Hörverlust und keine Erhöhung entzündlicher oder apoptotischer Marker. Somit ist die transtympanische LPN-Verabreichung sicher für die Ratten-Cochlea und vielversprechend für die Behandlung sensorineuraler Schwerhörigkeit.

Hintergrund

LPNs sind die älteste nanotherapeutische Plattform in der Klinik, erfolgreich eingesetzt bei Krebs, Infektionskrankheiten, Entzündungen und Schmerzen. Ihre hohe Nutzlastkapazität und bewährte Aufnahme im Innenohr machen sie attraktiv für die otologische Therapie. Die intratympanische Verabreichung ist ein rationaler, gezielter Ansatz, der die systemische Exposition begrenzt und bereits klinisch bei Morbus Menière und plötzlichem sensorineuralem Hörverlust eingesetzt wird. Während frühere Arbeiten peptid-funktionalisierte LPNs zeigten, die die Cochlea erreichen, bleibt das Sicherheitsprofil von LPNs im Innenohr – insbesondere bezüglich Barrierefunktion, Entzündung und Zelllebensfähigkeit – unbekannt. Diese Studie schließt diese Lücke, indem sie die Biokompatibilität von LPNs im Ratten-Innenohr mittels Gd-MRT, ABR und umfassenden histologischen Analysen bewertet.

Hyaluronsäure (HA) ist ein Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix, der CD44 und TLR2/4 bindet und entzündliche Signalwege einleitet. HA-Akkumulation wurde mit erhöhter Permeabilität und Entzündung in verschiedenen Geweben, einschließlich der Cochlea, in Verbindung gebracht, wo Silbernanopartikel (AgNPs) zuvor HA-Aufbau induziert hatten. Daher wurden HA, CD44 und TLR2 als kritische Entzündungsmarker in dieser Studie untersucht.

Das Ziel war zu bestimmen, ob transtympanische LPNs die Innenohr-Barriereintegrität beeinträchtigen, Entzündungen auslösen oder Hörverlust verursachen. Gd-MRT bewertete die Barrierefunktion, ABR maß Hörschwellen, und Immunhistochemie quantifizierte HA, CD44, TLR2 und apoptotische DNA-Fragmentierung.

Ergebnisse

LPNs verursachten keine funktionellen Veränderungen in der Ratten-Cochlea

Gd-MRT zeigte, dass LPNs effizient in die Cochlea eindrangen, mit starkem Signal in der Scala vestibuli und Scala tympani innerhalb von 3 h post-Injektion (Abb. 2c–f). Nach 6 h wurde die Signalverteilung homogen über die Cochlea, was vollständige Gleichgewichtsverteilung anzeigte (Abb. 2e–f). Die Integrität der Blut-Perilymph- und Blut-Endolymph-Barriere blieb intakt, wie durch vergleichbare Signalintensitäten zwischen behandelten und unbehandelten Ohren reflektiert (Tabelle 1). ABR-Schwellen für Klick- und Tonbursts (2–32 kHz) zeigten keine signifikante Verschiebung nach 2, 4 oder 7 Tagen post-Injektion, was erhaltene Hörfunktion bestätigt (Abb. 3).

LPNs induzierten keine Glykosaminoglykan-Akkumulation in der Ratten-Cochlea

Periodic Acid-Schiff-Färbung zeigte keine Zunahme von Glykosaminoglykanen in Cochlea-Strukturen (Spiralwulst, Knochenwand, Stria vascularis) nach LPN- oder LPN-Gd-Behandlung im Vergleich zu deionisiertem Wasser als Kontrolle (Abb. 5, 6). Die Quantifizierung bestätigte keine statistisch signifikanten Unterschiede (p > 0,05).

Geringe Auswirkung auf Hyaluronsäure-Sekretion durch LPNs

Immunfluoreszenz detektierte HA hauptsächlich in Spiralganglienzellen, Stria-Basalzellen, äußeren Sulcuszellen und Kapillarendothelzellen (Abb. 7). Während die HA-Intensität in Spiralband-Fibrozyten nach LPN- oder LPN-Gd-Verabreichung leicht abnahm, führte diese Veränderung nicht zu veränderter Barrierepermeabilität oder Hörverlust (Abb. 8).

CD44-Expression blieb nach LPN-Exposition unverändert

CD44-positive Zellen waren reichlich in der Stria-Basalzellschicht, im Spiralband, in Deiters-Zellen und im Kapillarendothel aller Gruppen vorhanden, ohne signifikante Unterschiede in Färbungsintensität oder Zellzahlen zwischen behandelten und Kontrollohren (Abb. 9, 10).

TLR2-Expression wurde durch LPNs nicht beeinflusst

TLR2-Immunreaktivität war hoch in Stria-Basalzellen, Spiralband-Fibrozyten und Endothel, unterschied sich jedoch nicht zwischen LPN-, LPN-Gd- und wasserbehandelten Ohren (Abb. 11, 12).

Keine Zunahme der Cochlea-Apoptose nach LPN-Verabreichung

TUNEL-Färbung zeigte seltene apoptotische Kerne, die sich über die Cochlea in allen Gruppen verteilten, ohne Erhöhung in den LPN- oder LPN-Gd-Kohorten im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 13). Die gelegentliche Apoptose im Steigbügel-Fußplatten- und Ovalfenster-Bereich wird als Teil der normalen zellulären Turnover betrachtet.

Diskussion

Unsere Daten zeigen, dass intratympanische LPNs das Innenohr effizient erreichen, sowohl über das Oval- als auch das Rundfenster, und dies ohne Beeinträchtigung der Blut-Perilymph- oder Blut-Endolymph-Barrieren tun. Das Fehlen von Hörschwellenverschiebungen und das Fehlen entzündlicher oder apoptotischer Marker bestätigen, dass LPNs in der Ratten-Cochlea gut verträglich sind. Die geringfügige Reduktion der HA-Sekretion aus Spiralband-Fibrozyten scheint klinisch irrelevant, wahrscheinlich reflektierend einen Verschiebung zu hochmolekularer, anti-inflammatorischer HA ohne Induktion von Permeabilitätsveränderungen. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, dass 95-nm-LPNs am effizientesten für die Innenohr-Verabreichung sind und dass größere (110–115 nm) LPNs weiterhin Sicherheit bewahren.

Wichtig ist, dass die Studie bestätigt, dass LPNs die TLR2/CD44-entzündliche Achse nicht aktivieren, einen Schlüsselweg, der in Cochlea-Verletzungen durch reaktive Sauerstoffspezies und mitochondriale Toxine involviert ist. Daher stellen LPNs ein sicheres Vehikel für gezielte Arzneimittelverabreichung ins Innenohr dar, was ihre potenzielle klinische Anwendung bei sensorineuralem Hörverlust und anderen otologischen Erkrankungen unterstützt.

Fazit

Die transtympanische Verabreichung von Liposom-Nanoträgern ist sicher für das Ratten-Innenohr, bewahrt Barriereintegrität, Hörfunktion und zelluläre Homöostase. LPNs sind vielversprechend als Arzneimittelverabreichungsplattform für zukünftige Innenohr-Therapien.

Methoden

Materialien

Lipide (Sphingosin, SOPC, DSPE-PEG-2000), Fluoreszenzfarbstoffe (DiI, TRITC-DHPE), Gd-DOTA (DOTAREM) und Silbernanopartikel (AgNPs) wurden von kommerziellen Lieferanten bezogen. Die Lipidreinheit wurde durch Dünnschichtchromatographie verifiziert; Konzentrationen wurden gravimetrisch bestimmt.

Herstellung und Charakterisierung von LPNs

Unilamellare LPNs (~110 nm) mit 500 mM Gd-DOTA (LPN-Gd) und leere LPNs (~115 nm) wurden durch eine zuvor beschriebene Dünnschicht-Hydratationsmethode (Refs 6, 3) hergestellt. Größenverteilung und Zeta-Potenzial wurden durch dynamische Lichtstreuung gemessen.

Verabreichung von LPNs

Unter Isofluran-Narkose wurden 50 µl LPN oder LPN-Gd transtympanisch in das linke Mittelohr über ein Operationsmikroskop injiziert. Das kontralaterale Ohr erhielt deionisiertes Wasser als Negativkontrolle. Die Tiere wurden 15 min post-Injektion mit dem injizierten Ohr nach oben positioniert.

Bewertung der biologischen Barrierefunktion mittels Gd-MRT

Gd-MRT wurde an einem 4,7 T Bruker-Scanner mit RARE-Protokoll durchgeführt. Kontrastmittel wurde intravenös 2 h vor der Bildgebung verabreicht. Bildgebungszeitpunkte reichten von 5 h bis 8 Tage post-Injektion, um akute und subakute Veränderungen zu erfassen.

Auditorische Hirnstammpotenziale (ABR)

ABR-Schwellen für Klick- und Tonbursts (2–32 kHz) wurden zu Baseline, 2, 4 und 7 Tagen post-Injektion mit standardmäßiger Elektrodenmontage und schallgedämmter Kammer aufgezeichnet.

Histologische und Immunfluoreszenz-Analysen

Nach dem finalen ABR wurden Cochleae entnommen, dekalzifiziert und geschnitten. Hämatoxylin-Eosin- und Periodic Acid-Schiff-Färbungen bewerteten Entzündung und Glykosaminoglykan-Gehalt. Immunfluoreszenz für HA, CD44 und TLR2 wurde an Kryoschnitten durchgeführt, und Konfokalmikroskopie quantifizierte Signalintensitäten. Apoptose wurde durch TUNEL-Markierung detektiert.

Statistische Analyse

Daten wurden mit SPSS 20 analysiert. Einfaktorielle ANOVA und Kruskal-Wallis-Tests verglichen ABR-Verschiebungen und Färbungsintensitäten; post-hoc LSD-Tests folgten signifikanten Befunden. p < 0,05 wurde als signifikant betrachtet.

Abkürzungen

ABR

Auditory brainstem response (Auditorische Hirnstammpotenziale)

AgNPs

Silver nanoparticles (Silbernanopartikel)

dH2O

Deionized water (Deionisiertes Wasser)

Gd-DOTA

Gadolinium-tetra-azacyclo-dodecane-tetra-acetic acid (DOTAREM)

Gd-MRI

Gadolinium-enhanced magnetic resonance imaging (Gadolinium-verstärkte MRT)

LPN

Liposome nanocarrier (Liposom-Nanoträger)

LPN-Gd

Gd-DOTA-containing LPN (Gd-DOTA-haltiger LPN)

ROI

Region of interest (Interessensgebiet)

TLR

Toll-like receptor (Toll-ähnlicher Rezeptor)