Biokompatibilität von Liposomen-Nanocarriern im Innenohr der Ratte nach intratympanatischer Verabreichung

Hintergrund

Liposom-Nanocarrier (LPNs) sind aufgrund ihrer hohen Wirkstoffaufnahmekapazität und effizienten Aufnahme im Innenohr nach einer minimal-invasiven intratympanischen Verabreichung potenziell die Zukunft der Innenohrtherapie [1,2,3,4]. Der intratympanische Ansatz wird von Otologen als rationaler Ansatz zur gezielten Medikamentenverabreichung gut akzeptiert, da er die unnötige Akkumulation von Therapeutika in nicht gezielten Regionen vermeidet, was in der Klinik eine frühere Strategie zur Behandlung von Morbus Menière und plötzlichem sensorineuralem Hörverlust war mit Gentamicin und Kortikosteroiden. Das molekulare Targeting von Modelltherapeutika in der Cochlea wurde durch die intratympane Gabe spezifischer peptidfunktionalisierter LPNs angezeigt [5]. Darüber hinaus wurde die automatische anhaltende Abgabe von LPNs an das Innenohr durch das Mittelohr mit einem neuartigen Gerät erreicht, das aus einer osmotischen Pumpe und einem Hochleistungs-Polyimidschlauch besteht [6]. Als älteste nanotherapeutische Plattform in der Klinik waren LPNs sicher bei der Behandlung von Krebs, Infektionskrankheiten, Entzündungen, Schmerzen usw. [7,8,9]. Die Biokompatibilität von LPNs im Mittel- und Innenohr bleibt jedoch unbekannt und muss geklärt werden, bevor sie klinisch in der Otologie angewendet werden können.

Das Ohr besteht aus Außen-, Mittel- und Innenohr (Abb. 1), die nach der intratympanischen Entbindung den LPNs ausgesetzt sein können. Das Mittelohr ist die primäre Stelle, die den LPNs in ihrer höchsten Konzentration ausgesetzt ist, das Innenohr ist die therapeutische Stelle und das empfindlichste Organ gegenüber gefährlichen Stoffen, und der äußere Gehörgang kann durch ausströmende Stoffe aus dem Ohr gereizt werden Mittelohrhöhle. Biologische Barrieren sind das erste Abwehrsystem, das die Bioverfügbarkeit der Wirkstoffe begrenzt, und existieren in der Haut, Schleimhaut und den perineuralen Strukturen. Das Barrieresystem im Innenohr spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der ionischen Homöostase, die für die physiologische Aktivität des Innenohrs unerlässlich ist. Die funktionelle Veränderung dieser Barrieren kann mit Gadolinium-unterstützter Magnetresonanztomographie (Gd-MRT) genau beurteilt werden. Eine Beeinträchtigung der Hörfunktion kann durch die auditive Hirnstammreaktion (ABR) genau gemessen werden. Daher dient das Ohr (einschließlich Außen-, Mittel- und Innenohr) selbst als hervorragendes Modell für die Nanotoxikologie [10, 11].

Abbildung des Säugetierohrs. Das Ohr von Säugetieren (einschließlich Menschen und Ratten) besteht aus Außen-, Mittel- und Innenohren. Das äußere Ohr (OE ) besteht aus Ohrmuschel und äußerem Gehörgang (EAC ). Das Mittelohr (ICH ) besteht aus dem Trommelfell (TM ) und der Hohlraum, der die Gehörknöchelchenkette einschließlich des Hammers (Ma ), Inkus (Inc ) und Steigbügel. Die Mittelohrhöhle ist eine Verlängerung des Nasopharynx über die Eustachische Röhre (ET ) und kommuniziert mit dem Innenohr durch das ovale Fenster (OW ) und Rundfensterfolie (RWM ). Das Innenohr besteht aus der Hörschnecke und dem Vestibularsystem. Die Cochlea ist das Sinnesorgan des Hörens und hat drei Kammern, d. h. die perilymphatischen Kompartimente der Scala tympani (ST ) und Scala vestibuli (SV ) und das endolymphatische Kompartiment der Scala media (SM ). An der Seitenwand des SM befinden sich die Stria vascularis (StrV ) und Spiralband (SLig ). Auf der Unterseite von SM befindet sich ein Cortis-Organ, das innere Haarzellen enthält (IHCs ) und äußere Haarzellen (OHCs ), Tektorialmembran (TM ) und spiralförmiger Limbus (Slim ). Die Spiralganglienzellen (SGCs ) zünden ein Aktionspotential, das der mechanoelektrischen Transduktion der Haarzellen entspricht und liefern den gesamten auditiven Input des Gehirns. Das Vestibularsystem ist für das Gleichgewicht verantwortlich und besteht aus drei Bogengängen (SCC ) und Vorraum. Die ampulläre Cupula im SCC erkennt Rotationsbeschleunigungen und die Makula im Sacculus und Utriculus des Vestibulums erkennt Linearbeschleunigungen. CN Cochleanerv, SP spiralförmige Prominenz, VN Vestibularisnerv, VS vas spiralis. (adaptiert von Zou J. Focal Drug Delivery in Inner Ear Therapy:in Focal Controlled Drug Delivery. Herausgeber:Domb AJ und Khan W. Springer, London, UK. ISBN:978-1-4614-9433-1, 2014; p215- 224)

Hyaluronsäure (Hyaluron) ist ein natürlich vorkommendes polyanionisches Biopolymer und ist ein Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix in der Basalmembran. Hyaluronsäure besteht aus D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-Glucosamin, die über alternierende β-1,4- und β-1,3-glykosidische Bindungen verknüpft sind. Die Ansammlung von Hyaluronsäure könnte zu einer erhöhten Permeabilität und Mikrozirkulationsentzündung bei renalen ischämischen Reperfusionsschäden beitragen [12]. In unserem vorherigen Bericht wurde gezeigt, dass die ototoxische Wirkung von Silbernanopartikeln mit der Anreicherung von Hyaluronsäure in der Cochlea von Ratten korreliert [11]. Hyaluronsäure bindet im Gewebe an CD44 und den Toll-like-Rezeptor 2/4 (TLR2/4) und löst biologische Reaktionen aus [13, 14]. Die von CD44 vermittelten biologischen Aktivitäten bei der Bindung an Hyaluronsäure beruhen hauptsächlich auf der Interaktion mit regulatorischen und Adaptermolekülen, wie SRC-Kinasen, Rho-GTPasen, VAV2, Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenes Protein 2-assoziiertes Bindungsprotein 1 (GAB1), Ankyrin, und Ezrin [15,16,17]. CD44 vermittelt auch den Metabolismus von Hyaluronsäure durch die Ansätze der zellulären Aufnahme und des Abbaus, zusätzlich zur Rekrutierung von T-Zellen an Entzündungsstellen und zur Regulierung der T-Zell-vermittelten Endothelschädigung [18]. Es wurde berichtet, dass die Zytotoxizität gegenüber Endothelzellen des Innenohrs durch Anti-Endothelzell-Antikörper eine Rolle bei der Schädigung der Stria vascularis bei immunvermittelter plötzlicher Innenohrschwerhörigkeit spielen könnte [19]. Die TLR2-abhängige nukleare Faktor-κB-Aktivierung war Berichten zufolge an der nicht-typisierbaren Haemophilus influenzae-induzierten Monozyten-Chemotaktik-Protein-1-Hochregulation in den Spiralligament-Fibrozyten des Innenohrs beteiligt, die der Schlüsselschritt bei einer Innenohr-Dysfunktion als Folge einer chronischen Mittelohrentzündung sein könnte [ 20]. Wenn LPNs nach Mittelohrgabe eine Innenohrschädigung auslösen, sollte der TLR2-vermittelte Signalweg der wichtige Mechanismus sein.

Unser Ziel war es, die Biokompatibilität von LPNs im Innenohr nach transtympanischer Injektion zu untersuchen. Die Funktionen der biologischen Barrieren in Haut (äußerer Gehörgang), Schleimhaut (Mittelohrhöhle) und Innenohrkompartimenten wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Gd-MRT gemessen. Die Hörfunktion wurde mittels ABR-Messung bewertet. Schließlich wurden die möglichen histopathologischen Veränderungen analysiert, indem die Ansammlungen von Glykosaminoglykanen und Hyaluronsäure, die Expression von CD44 und TLR2 sowie die DNA-Fragmentierung in der Cochlea gemessen wurden.

Ergebnisse

LPNs verursachten keine funktionellen Veränderungen in der Cochlea von Ratten

In der Positivkontrollgruppe ein helles Signal in der Perilymphe der Cochlea (Coch) und des Vestibularis (Vest) auf beiden Seiten (L, R) (Abb. 2a, b), was die Aufnahme von Gd-DOTA anzeigt. Nach transtympanalen Injektionen von Silbernanopartikeln (AgNPs) stiegen die Signalintensitäten in den perilymphatischen Kompartimenten signifikant an, während auch in der äußeren Gehörgangshaut und der Mittelohrschleimhaut ein extrem intensives Signal nachgewiesen wurde, was auf eine verstärkte Aufnahme von Gd-DOTA im Zusammenhang mit der AgNP-Verabreichung hinweist ( L in Abb. 2a, b) (Tabelle 1). Das Bewertungssystem wurde daher validiert. Bei dem Tier, das eine transtympanische Injektion von LPN + Gd-DOTA erhielt, wurde 3 h nach der Injektion ein helles Signal auf der Oberfläche der Gehörknöchelchenkette, der Scala vestibuli, der Scala tympani und des Vestibulums festgestellt, was auf eine offensichtliche Verteilung von LPN in diesen Regionen hinweist (Abb. 2c .). , D). Die Signalintensität in der Scala vestibuli in der basalen Windung war sichtbar stärker als in der Scala tympani, was auf einen effizienten Eintritt von LPN durch das ovale Fenster beim aktuellen Tier schließen lässt [21]. 6 h nach der Injektion wurden die Signalintensitäten zwischen der Scala vestibuli und der Scala tympani in der basalen Windung ähnlich und die gesamte Cochlea zeigte ein fast homogenes Signal, aber es gab unbedeutende Veränderungen im Vestibül (Abb. 2e, f). Bei Tieren, denen Gd-DOTA nach transtympanischer Injektion von leeren LPNs intravenös verabreicht wurde, zeigten beide Seiten ähnliche Signalintensitäten, außer dass starke Signale im Mittelohr auftraten, die eine transtympanische Injektion von leeren LPNs erhielten, die eine Ansammlung von LPNs auf der Oberfläche der Gehörknöchelchenkette vermuteten (Abb . 2g, h). Das Schwarze Loch in der Gehörknöchelchenkette zeigt die hohle Fläche des Steigbügels (Abb. 2h). Gleiche Signalintensitäten auf beiden Seiten deuteten darauf hin, dass sich die Transporteigenschaft für Gd-DOTA der Blut-Perilymph-Schranken auf beiden Ohren nach transtympanischer Injektion von LPNs nicht änderte (Abb. 2g, h) (Tabelle 1).

Gadolinium-verstärkte MRT des Ratteninnenohrs nach Verabreichung von Liposomen-Nanocarriern (LPN). Bei allen Tieren wurden Nanomaterialien auf die mediale Wand der linken Mittelohrhöhle injiziert. Die Positivkontrolle wurde bei Ratten 2 h nach der intravenösen Injektion von Gd-DOTA sekundär zur transtympanischen Injektion von Silbernanopartikeln (AgNPs) 5 h im Voraus abgebildet (a , b ). Die dynamische Verteilung von LPNs im Mittel- und Innenohr wurde in c . gezeigt , d , e , f durch transtympanale Injektion von Gd-DOTA-haltigem LPN ohne intravenöse Verabreichung von Gd-DOTA. Der Einfluss leerer LPNs auf die biologische Barriere wurde durch MRT 2 h nach der intravenösen Injektion von Gd-DOTA (i.v. Gd-DOTA) bei Ratten gezeigt, die 5 h vorher transtympanische Injektion von LPN erhielten (g , h ). Bin Ampullar des hinteren Bogengangs, Coch Cochlea, EES äußere Ohrhaut, L linkes Ohr, LPN-Mu LPN in der Mittelohrschleimhaut, LPN-OC LPN an der Gehörknöchelchenkette (OC ), ME-Mu , Mittelohrschleimhaut, R rechtes Ohr, SM scala media , ST scala tympani, SV scala vestibuli, Weste Vestibulum, 1H basale höhere Windung der Cochlea, 1L basale untere Windung der Cochlea, 2H zweite höhere Windung der Cochlea, 2L zweite untere Windung der Cochlea. Skalierungsleiste = 5 mm

Weder LPN + Gd-DOTA noch LPNs verursachten einen signifikanten Hörverlust, der als ABR-Schwellenwertverschiebung dargestellt wurde, die unter Verwendung von Klick- und Tonimpulsstimuli bei den Frequenzen 2, 4, 8, 16 und 32 kHz bei 2, 4 und gemessen wurde 7 Tage nach der Verabreichung, im Vergleich zu den Ohren, die entionisiertes Wasser (dH₂ .) in die transtympanische Injektion erhielten O) (Abb. 3).

Einfluss der transtympanischen Injektion von Liposom-Nanocarriern auf die Hörfunktion bei Ratten, gemessen anhand der auditiven Hirnstammreaktion. Hörverlust wurde als Schwellenverschiebung ausgedrückt. Es gab einen unbedeutenden Unterschied zwischen den Gruppen (p> 0,05, Einweg-ANOVA). n = 6 in jeder Gruppe. H2O transtympanische Injektion von entionisiertem Wasser in der Negativkontrollgruppe, LPN leerer Liposom-Nanocarrier, LPN + Gd-DOTA Gd-DOTA-haltiges LPN, 2d , 4d , und 7d 2, 4 und 7 Tage nach der Injektion

LPNs induzierten keine Glykosaminoglykan-Akkumulation in der Cochlea von Ratten

Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung zeigte keine entzündliche Infiltration von Leukozyten und Fibrin in die Cochlea aller analysierten Tiere, einschließlich des Steigbügels und des ovalen Fensters, durch das die LPNs passieren (Abb. 4). Die Periodsäure-Schiff-Färbung zeigte die Existenz von Glykosaminoglykanen in der Knochenwand, dem spiralförmigen Limbus, dem spiralförmigen Ligament, der Tektorialmembran, der Reissner-Membran, der knöchernen spiralförmigen Lamina und der Stria vascularis in der Cochlea von Tieren, die transtympanale Injektionen von dH erhielten₂ O. Es gab einen Gradientenanstieg der Signalintensität von der basalen Windung zum Apex, und der Unterschied war in der Stria vascularis signifikant (Abb. 5 und 6). Der Signalgradient in der Cochlea war bei den Tieren, die transtympanische Injektionen von LPNs und LPN + Gd-DOTA erhielten, nicht verändert (Abb. 5 und 6).

Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Cochleae von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren. Es gab keine entzündliche Infiltration in der Cochlea nach Verabreichung von LPN (a ), LPN+Gd (b ) und H2O (c ). Eingekreister Bereich angezeigte Auswahl der Interessenregion für Intensitätsmessungen (a ). LPN leerer Liposom-Nanocarrier, LPN + Gd Gd-DOTA-haltiges LPN. Sa saccule, SFP Steigbügelfußplatte, SVJ Stapediovestibulargelenk, SM scala media, ST scala tympani, SV scala vestibuli, Ut utrikula. Skalierungsleiste = 1 mm

Die Glykosaminoglykan-Sekretion in der Cochlea von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren, wurde mit Periodsäure-Schiff-Färbungslichtmikroskopie nachgewiesen. Der spiralförmige Limbus (SLim ) und Knochenwand (BW ) der Cochlea zeigte die intensivste Färbung in Gruppen der Negativkontrolle (H2O ) (a –c ), leerer Liposom-Nanocarrier (LPN) (d –f ) und Gd-DOTA-haltiges LPN (LPN + Gd ) (g –ich ). Der Färbebereich mit sichtbar höherer Intensität wurde mit * in c . gekennzeichnet , f , und h im Vergleich zur linken Spalte. RM Reissner-Membran, SGC Spiralganglienzelle, SLig Spiralband, StrV stria vascularis, 1. Basaldrehung, 2. zweite Runde. Skalierungsleiste = 50 μm

Quantifizierung der Glykosaminoglykan-Sekretion in der Cochlea von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren, die mit Periodsäure-Schiff-Färbung nachgewiesen wurden. n = 3 in jeder Gruppe. AU beliebige Einheit, H2O Negativkontrolle, LPN leerer Liposom-Nanocarrier, LPN + Gd Gd-DOTA-haltiges LPN, SLig Spiralband, schlank Spirallimbus, StrV stria vascularis, 1. Basaldrehung, 2. zweite Runde. *p < 0,05, **p < 0.01 (Einweg-ANOVA mit LSD-Test als Post-hoc-Analyse)

Es gab geringe Auswirkungen auf die Hyaluronsäuresekretion in der Cochlea von Ratten durch LPNs

In der Cochlea von Ratten, die transtympanale Injektionen von dH2O erhielten, wurde eine positive Färbung für Hyaluronsäure unter anderem in den Spiralganglienzellen, Strialer-Basalzellen, äußeren Sulkuszellen und kapillaren Endothelzellen nachgewiesen (Abb. 7). Die Signalintensitäten in den Spiralligament-Fibrozyten der basalen und zweiten Windungen waren signifikant höher als die des Apex. Diese Unterschiede wurden in der Cochlea von Ratten durch die Gabe von LPNs und LPN + Gd-DOTA unbedeutend, was darauf hindeutet, dass die Sekretion von Hyaluronsäure durch die Spiralligament-Fibrozyten durch die LPN-Verabreichung beeinflusst wurde (Abb. 8). LPN + Gd-DOTA reduzierte auch die Färbung in den Spiralligament-Fibrozyten der basalen Windung. Die transtympanale Injektion von LPNs und LPN + Gd-DOTA hatte jedoch keinen Einfluss auf die Sekretion von Hyaluronsäure in den meisten Cochlea-Zellen (Abb. 7 und 8).

Die Hyaluronsäuresekretion in der Cochlea von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren, wurde mit konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Eine positive Färbung wurde in der Stria-Basalzelle (SBC ), äußere Sulkuszelle (OSC ), Spiralganglienzelle (SGC ) und kapillare Endothelzellen (CEC ) des Modiolus von Gruppen der negativen Kontrolle (H2O ) (a –c , j ), leere Liposom-Nanocarrier (LPN ) (d –f , k ) und Gd-DOTA-haltiges LPN (LPN + Gd ) (g –ich , l ). Es gab keine Färbung in der Antikörper Negativkontrolle weggelassen (AbNC ) (m ). CEC kapillare Endothelzelle, ISC innere Sulkuszelle, SBC Stria-Basalzelle, SL-I Spiralbandfibrozyt Typ I, SLSF spiralförmiger Limbus-Satellitenfibrozyt, SMC stria vascularis Marginalzelle. Skalierungsleiste = 16 μm

Quantifizierung der Hyaluronsäuresekretion in der Cochlea von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren, die mittels konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie nachgewiesen wurden. n = 3 in jeder Gruppe. AU beliebige Einheit, H2O Negativkontrolle, LPN leerer Liposom-Nanocarrier, LPN + Gd Gd-DOTA-haltige LPN, SBCs Stria-Basalzellen, SGCs Spiralganglienzellen, SLig , Spiralband, Slim spiralförmiger Limbus, 1. Basaldrehung, 2. zweite Runde. **p < 0.01 (im Vergleich zum Apex), ##p < 0.01 (im Vergleich zu LPN- und H2O-Gruppen der Basalkurve) (Einweg-ANOVA mit LSD-Test als Post-hoc-Analyse)

LPNs veränderten die CD44-Zellpopulation in der Cochlea von Ratten nicht

In den dH₂ . ausgesetzten Cochleae O, die Strialer Intermediate Zellen, Strialer Basalzellen, Spiralligament-Fibrozyten, Spiralganglionzellen, Deiters-Zellen im Corti-Organ und Kapillarendothelzellen im Modiolus und Spiralligament zeigten eine intensive Färbung für CD44. Es gab einen unbedeutenden Unterschied in den Signalintensitäten zwischen den Cochlea-Kurven. Die CD44-positive Population und die Expressionsintensität wurden durch die transtympanale Injektion von entweder LPN + Gd-DOTA oder LPNs nicht beeinflusst (Abb. 9 und 10).

CD44-positive Zellverteilung in der Cochlea von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren, demonstriert durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie. CD44-positive Zellen wurden hauptsächlich in der Stria-Basalzelle (SBC ), Spiralband (SL ), Dieter-Zellen (DC ), Spiralganglienzelle (SGC ) und kapillare Endothelzellen (CEC ) in den Gruppen der Negativkontrolle (H2O ) (a –e ), leere Liposom-Nanocarrier (LPN ) (f –j ) und Gd-DOTA-haltiges LPN (LPN + Gd ) (k –n ). Es gab keine Färbung in der Antikörper Negativkontrolle weggelassen (AbNC ) (o ). IHC innere Haarzellen, M-CEC kapillare Endothelzelle in Modiolus, SL-CEC Kapillarendothelzelle im Spiralband:Spiralganglienzellen, SL-III Spiralbandfibrozyt Typ III, SL-IV Spiralbandfibrozyt Typ IV, TM Tektorialmembran, OHC äußeren Haarzellen. Skalierungsleiste = 16 μm

Quantifizierung des CD44-Proteinspiegels in der Cochlea von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren, die mittels konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie nachgewiesen wurden. Es gab einen unbedeutenden Unterschied zwischen den Gruppen (p> 0,05, Einweg-ANOVA). n = 3 in jeder Gruppe. n = 3 in jeder Gruppe. AU beliebige Einheit, H2O Negativkontrolle, LPN leerer Liposom-Nanocarrier, LPN + Gd Gd-DOTA-haltige LPN, SBCs Stria-Basalzellen, SGCs Spiralganglienzellen, SLig Spiralband, 1. Basaldrehung, 2. zweite Runde

LPNs veränderten die TLR2-Expression in der Cochlea der Ratte nicht

In der dH2O-exponierten Cochlea zeigten die Strialer Basalzellen, Spiralligament-Fibrozyten, Wurzelzellen, Spiralganglienzellen, Säulenzellen des Corti-Organs und Kapillarendothelzellen im Modiolus eine intensive Anfärbung für TLR2. Es gab einen unbedeutenden Unterschied in den Signalintensitäten zwischen den Cochlea-Kurven. Die TLR2-positive Population und die Expressionsintensität wurden durch die transtympanale Injektion von weder LPN + Gd-DOTA noch LPNs beeinflusst (Abb. 11 und 12).

TLR2-positive Zellverteilung in der Cochlea von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren, demonstriert durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie. TLR2-positive Zellen wurden hauptsächlich in der Stria-Basalzelle (SBC ), Spiralband (SL ), Wurzelzelle (RC ), Säulenzelle (PC ), Spiralganglienzelle (SGC ) und kapillare Endothelzellen (CEC ) in den Gruppen der Negativkontrolle (H2O ) (a –e ), leere Liposom-Nanocarrier (LPN ) (k –n ) und Gd-DOTA-haltiges LPN (LPN + Gd ) (f –j ). Es gab keine Färbung in der negativen Kontrolle ohne Antikörper (AbNC ) (o ). IHC innere Haarzellen, SL-III Spiralbandfibrozyt Typ III, OHC äußeren Haarzellen. Skalierungsleiste = 16 μm

Quantifizierung des TLR2-Proteinspiegels in der Cochlea von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren, die mit konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie nachgewiesen wurden. Es gab einen unbedeutenden Unterschied zwischen den Gruppen (p> 0,05, Einweg-ANOVA). n = 3 in jeder Gruppe. AU beliebige Einheit, H2O Negativkontrolle, LPN leerer Liposom-Nanocarrier, LPN + Gd Gd-DOTA-haltige LPN, SBCs Stria-Basalzellen, SGCs Spiralganglienzellen, SLig Spiralband, 1. Basaldrehung, 2. zweite Runde

LPNs verursachten keinen Zelltod in der Cochlea von Ratten

Es gab spärliche apoptotische Zellen, die zufällig in der Cochlea von nicht behandelten Ratten verteilt waren. Überraschenderweise waren in der Fußplatte des Steigbügels und der ovalen Fensternische reichlich apoptotische Zellen vorhanden. Es gab keinen Einfluss auf die Menge und das Verteilungsmuster apoptotischer Zellen durch die Verabreichung von LPNs und LPN + Gd-DOTA (Abb. 13).

Apoptose in der Cochlea von Ratten, die Liposomen-Nanocarriern ausgesetzt waren, wurde durch konfokale Mikroskopie mit TUNEL-Färbung nachgewiesen. Apoptotische Zellen wurden in den Cochlea-Zellen von Ratten in Gruppen mit negativer Kontrolle (H2O ) (a –c ), leere Liposom-Nanocarrier (LPN ) (f –ich ) und Gd-DOTA-haltiges LPN (LPN + Gd ) (j –l ). Es gab reichlich apoptotische Zellen in der Fußplatte des Steigbügels (FP ) und ovale Fensternische (EIGEN ) beider Gruppen (d , e ). In einer Positivkontrolle (PC) wurde eine reichliche TUNEL-Färbung in den Spiralligament-Fibrozyten (SL ), Stria-Basalzellen (SBC ) und Stria-Margina-Zellen (SMC ). PP peripherer Prozess der Spiralganglienzelle (SGC ), OK Osteozyten, OSC äußere Sulkuszelle, SL-IV Typ IV der Spiralligament-Fibrozyten, SLim Spirallimbus, StrV stria vascularis. Skalierungsleiste a –l = 32 μm, m = 16 μm

Diskussion

LPN traten nach transtympanischer Injektion effizient in das Innenohr ein, demonstriert durch MRT unter Verwendung von Gd-DOTA als Medikamentenmimetika, die in die LPNs eingekapselt waren (Abb. 2c–f). Obwohl eine frühere Studie gezeigt hat, dass das runde Fenster der Hauptweg von LPNs in das Innere war [6], zeigte die vorliegende Beobachtung, dass der ovale Fensterweg effizienter war als das runde Fenster, um die LPNs vom Mittelohr in das Innenohr zu transportieren Ohr. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass beide Pfade bei der Innenohrbelastung von LPNs nach gezielter Verabreichung der Mittelohrinnenwand wichtig sind. Mit der effizientesten In-vivo-Methode der Gadolinium-unterstützten Innenohr-MRT zur Bewertung der biologischen Barriere und der frequenzspezifischen ABR zur Beurteilung der Hörfunktion zeigte die vorliegende Studie, dass die transtympanische Injektion von LPNs und LPN + Gd-DOTA die Funktion von die Innenohrbarrieren und verursachten bei Ratten keine Hörbeeinträchtigung. Durch die Analyse der zuvor nachgewiesenen kritischen biologischen Entzündungsmarker [11, 22] induzierten LPNs und LPN + Gd-DOTA keine Entzündungsreaktion in der Cochlea. Obwohl die runde Fenstermembran nicht bewertet wurde, schloss das Fehlen einer Entzündung im Steigbügel und im ovalen Fenster eine offensichtliche Entzündungsreaktion in der runden Fenstermembran aus, da die vorliegende Studie zeigte, dass der ovale Fensterweg dem runden Fensteransatz für LPNs überlegen war.

Die Innenohr-MRT nach intravenöser Injektion von Gadoliniumchelat ist in der Lage, die durch mitochondriale Toxine induzierte durch oxidativen Stress vermittelte Störung der Blutperilymphe und Blutendolymphbarriere nachzuweisen [23]. Es wurde berichtet, dass AgNPs zelluläre Beeinträchtigungen durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und die Aktivierung von Jun-Amino-terminalen Kinasen (JNK) verursachen, was zur Freisetzung von Cytochrom C in das Cytosol und zur Translokation von Bax in die Mitochondrien führt [24 ]. Bei transtympanischer Injektion gelangten AgNPs in das Innenohr und induzierten Permeabilitätsänderungen in den biologischen Barrieren des Ratteninnenohrs [11, 25]. LPNs traten auch nach der transtympanischen Injektion in einem größenabhängigen Muster in das Innenohr der Ratte ein, und die LPNs mit einem Durchmesser von 95 nm zeigten die höchste Wirksamkeit beim Durchdringen der Mittel-Innenohr-Barrieren [3]. In der vorliegenden Studie betrug die mittlere Größe der LPNs 100 bis 115 nm, was etwas größer war als die effizienteste Größe. LPN + Gd-DOTA zeigte, dass LPNs dieser Größe in das Innenohr gelangten, was mit dem vorherigen Bericht übereinstimmt [3]. Der Eintritt von LPNs in das Innenohr verursachte jedoch keine Permeabilitätsänderungen der Blut-Perilymph- und Blut-Endolymph-Schranke. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass LPNs für das Innenohr sicher sind. ABR-Ergebnisse, die auf eine normale Hörfunktion hinweisen, unterstützten das MRT-Ergebnis.

There was an association between hyaluronic acid secretion and permeability change and microcirculation inflammation in renal ischemic reperfusion injury [12]. The previous study also showed that AgNPs caused the accumulation of hyaluronic acid in the rat cochlea [11]. CD44 and toll-like receptor 2/4 (TLR2/4) work as receptors of hyaluronic acid and trigger biological reactions [13, 14]. CD44 also mediates the metabolism of hyaluronic acid through cellular uptake and degradation in addition to recruiting T cells to inflammatory sites and regulating T cell-mediated endothelial injury [18]. In the present study, hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were detected in the rat cochlea. LPN + Gd-DOTA reduced the secretion of hyaluronic acid in the spiral ligament fibrocytes. The expressions of CD44 and TLR2 were not changed after the transtympanic injection of either LPNs or LPN + Gd-DOTA. The total glycosaminoglycan, which contains hyaluronic acid in the cochlea was not affected by the administrations of LPNs and LPN + Gd-DOTA. The impact of LPNs on the hyaluronic acid distribution in rat cochlea did not cause either permeability change or hearing loss, indicating that the modification is unharmful. It was reported that macrophages undergo phenotypic changes dependent on molecular weight of hyaluronan that correspond to either pro-inflammatory response for low molecular weight hyaluronic acid or anti-inflammatory response for high molecular weight hyaluronic acid [26]. The observed minor changes of hyaluronic acid distribution in the cochlea might have high molecular weight and anti-inflammatory function. Therefore, there was no hint of an inflammatory reaction in the rat cochlea.

The observed apoptosis in the stapes footplate cells might be normal biological activity. A balance between survival and apoptosis in the stapes footplate cells was reportedly as necessary to inactivate the otosclerosis [27]. Administration of LPN + Gd-DOTA did not affect apoptosis in the rat stapes.

Conclusions

The present study demonstrated that the transtympanic injection of liposome nanocarriers neither impaired the biological barriers of the inner ear nor caused hearing loss in the rats. The critical inflammatory mechanism was not activated by the administration of liposome nanocarriers, either. The results suggested that transtympanic injection of liposome nanocarrier is safe for the cochlea of rat.

Methods

Materials

Sphingosine (Sph), 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SOPC), and 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000] (ammonium salt) [DSPE-PEG-2000] were purchased from Avanti polar lipids (Alabaster, USA). DiI (Vybrant DiI cell-labeling solution, 1 mM in solvent) and N-(6-tetramethylrhodaminethiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-hosphoethanolamine, triethylammonium salt (TRITC-DHPE) were purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA). Gd-DOTA (DOTAREM) was from Guerbet, Cedex, France. Hepes and EDTA were from Sigma. The purity of the lipids was evaluated using thin-layer chromatography on silicic acid-coated plates (Merck, Darmstadt, Germany) developed with a chloroform/methanol/water mixture (65:25:4, v/v/v). An examination of the plates after iodine staining and, when appropriate, upon UV illumination revealed no impurities. The lipid concentrations were determined gravimetrically with SuperG (Kibron, Espoo, Finland); a high-precision microbalance. The polyvinylpyrrolidone-stabilized AgNPs were supplied by Colorobbia (Firenze, Italy). The AgNPs were dispersed in deionized water (370.7 mM), and scanning electron microscopy showed that the AgNPs are spheroids with a particle size of around 100 nm. Dynamic light scattering (DLS) showed a mean hydrodynamic size of 117 ± 24 nm and a mean zeta potential of −20 ± 9 mV.

In the visualization of nanocarrier uptake in the inner ear and the evaluation of biological barrier function, 5 male Sprague Dawley rats, weighing between 334 and 348 g, were provided by the Biomedicum Helsinki, Laboratory Animal Centre, University of Helsinki, Finland (this is the defined animal center that provides animals for MRI experiments in Biomedicum); in the ABR and histological studies, 18 Sprague Dawley rats, weighing between 300 and 400 g, were provided by the Experimental Animal Unit of the University of Tampere School of Medicine in Finland. Animal assignments in each study were shown in Table 2. All animal experiments were approved by the Ethical Committee of University of Tampere (permission number:ESAVI/3033/04.10.03/2011). Animal care and experimental procedures were conducted in accordance with European legislation. Animals in the Gd-MRI study were anesthetized with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min) for induction and 3% for maintenance via a facemask. Animals for the ABR and histological studies were anesthetized with a mixture of 0.5 mg/kg medetomidine hydrochloride (Domitor ^® , Orion, Espoo, Finland) and 75 mg/kg ketamine hydrochloride (Ketalar ^® , Pfizer, Helsinki, Finland) via intraperitoneal injection followed by an intramuscular injection of enrofloxacin (Baytril ^® vet, Orion, Turku, Finland) at a dose of 10 mg/kg to prevent potential infection. The animal’s eyes were protected by Viscotears® (Novartis Healthcare A/S, Copenhagen, Denmark).

Preparation and Characterization of LPNs with and without Gd

Preparation of Gd-containing LPNs

LPNs of unilamellar vesicles with an apparent hydrodynamic particle diameter (Z _av ) of 110 ± 15 nm that contain Gd-DOTA were prepared according to the previously published method [6]. A concentration of 1 mM Gd-DOTA-containing LPN (LPN + Gd-DOTA) refers to 1 mM liposomes encapsulating 500 mmol/L of Gd-DOTA.

Preparation of Blank LPNs

Blank LPNs of unilamellar vesicles with Z _av of 115 ± 10 nm were prepared according to a previous publication [6].

Administration of LPNs

Under general anesthesia with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min), 50 μl of either LPNs or LPN + Gd-DOTA were injected into the left middle ear cavity through the tympanic membrane penetration under an operating microscope (OPMI1-F, Carl Zeiss, Jena, Germany). The same amount of deionized water (H₂ O) was injected transtympanically in rats that were assigned to the negative group. After the injection, the animals were kept in the lateral position with the injected ear oriented upward for 15 min before further measurements.

Evaluation on Biological Barrier Function Using Gd-MRI

One animal receiving transtympanic injection of LPN + Gd-DOTA was selected to demonstrate distributions of LPN in the inner ear using MRI without contrast agent. Two animals receiving transtympanic injection of blank LPNs were engaged in MRI study for evaluation of the biological barrier function. Two animals receiving transtympanic injection of AgNPs (370.7 mM, 40 μl) were used as positive control. The contralateral ear without any injection was used as negative control in all studies. A 4.7T MR scanner with a bore diameter of 155 mm (PharmaScan, Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany) was utilized. The maximum gradient strength was 300 mT/m with an 80-μs rise time. A gadolinium-tetraazacyclododecane-tetraacetic acid (Gd-DOTA, 500 mM, DOTAREM, Guerbet, Cedex, France) solution was injected into the tail vein (0.725 mM/kg) 2 h before the MRI measurements. The imaging protocol and rapid acquisition with relaxation enhancement (RARE) sequences were applied according to a previous publication [10]. MRI scanning commenced at several time points after the transtympanic injection. The first MRI time of around 5 h was determined by taking the penetration time of liposome nanoparticles from the middle ear to the inner ear as a reference [1, 3, 6]. The final imaging time of 8 d was selected according to the course of potential acute inflammation and the availability of the scanner. ParaVision PV 4.0 (Bruker, MA, USA) software was used for the post-processing and quantification of MR images.

ABR Measurement

The auditory function of animals receiving injections of both blank and Gd-containing LPNs were evaluated using ABR measurements using BioSig32 (Tucker Davis Technologies, FL, USA) in a custom made, soundproof chamber. The ABR thresholds upon click and tone burst stimuli were recorded before and at a certain time point post-administration of LPNs. The first ABR measurement was followed on 2 days post-administration of AgNPs, allowing the animals to recover from the general anesthesia during the injection and to ensure the injected solution to be entirely cleared from the middle ear cavity. The second follow-up time of 4 days post-injection was chosen because it is close to the peak time of potential mitochondrial impairment-induced cell death in the cochlea [22]. The third follow-up time of 7 days is the time point when temporary threshold shifts remained significantly approved in an animal model of mitochondrial toxin-induced hearing loss [28]. The ABR recording procedure followed the previous report [11].

Glycosaminoglycan Staining in Rat Cochlea After Administration of LPNs

Hematoxylin-eosin staining to assess potential inflammatory infiltration and periodic acid Schiff’s staining to evaluate potential glycosaminoglycan accumulation in the cochlea after administration of LPNs were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11] The slices were observed and digital images were acquired under a light microscope (Leica DM2000 microscope equipped with an Olympus DP25 camera) for further analysis.

Immunofluorescence Staining for Hyaluronic Acid and Receptors

Immunofluorescence staining for hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11, 21].

Cell Death Detection

Potential nuclear DNA fragmentation in the cochlea was investigated using terminal transferase (TdT) to label the free 3′OH breaks in the DNA strands of apoptotic cells with TMR-dUTP (TUNEL staining) following the reported procedure [11]. Slices exposed to recombinant DNase I (Fermentas, Vantaa, Finland, 100 U/ml in 50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mg/ml bovine serum albumin) at 37 °C for 10 min, which induced DNA strand breaks prior to the labeling procedures, were utilized as positive controls. The samples were observed under a confocal microscope.

Confocal Microscopy

The samples were observed under a Nikon inverted microscope (ECLIPSE Ti) combined with an Andor confocal system installed with Andor iQ 2.8 software (Andor Technology, Belfast, UK). The excitation lasers were 488 nm (green excitation) and 568 nm (red excitation) from an Andor laser combiner system, and the corresponding emission filters were 525/50 (Alexa Fluor-488) and 607/45 nm (Cy ^TM 3 and TMR Red). DAPI was excited with light at 405 nm generated from a light-emitting diode and was detected using a 450–465 nm filter.

Analysis and Statistics

ImageJ (1.45S, National Institutes of Health, Bethesda, USA) software was used for signal intensity measurements. For light microscopy of periodic acid Schiff’s staining, the region of interests (ROIs) including spiral ligament, spiral limbus, and stria vascularis were selected using freehand selections button. The “measure” function was used to obtain the mean gray scale value of the ROI, which was inversely correlated with the staining intensity. For confocal microscopy of immunofluorescence staining, the ROIs including stria basal cells, spiral ganglion cells, spiral ligament, and spiral limbus were extracted using photoshop CS6 (version 13.0, Adobe Systems Software Ireland Ltd, Dublin, Ireland) program and were imported into ImageJ program. The images were split into individual channel, and the green (corresponded to CD44 and TLR2) and red (corresponded to hyaluronic acid) channels were selected for further quantifications. The “Threshold” was adjusted using the “set” button in the “Image” menu, and “Limit to Threshold” option should be selected and “Direct to” should be defined to the corresponding channel in the “Analyze” menu. Then the gray scale value, which was inversely correlated with the staining intensity, was obtained using the “Measure” function in the same menu.

Statistical analyses were performed using the IBM ^® SPSS ^® Statistics Version 20 software package (SPSS Inc., Chicago, USA). A one-way ANOVA and Kruskal-Wallis test were used to compare ABR threshold shifts and signal intensities (grayscale) of staining for glycosaminoglycan and hyaluronic acid secretions, and TLR2 and CD44 staining between the LPN injected-ear and saline injected-ear groups in the different cochlear structures among various turns. Least significant difference (LSD) test was used as post hoc analysis. Higher numbers in the grayscale analysis correlate with lower signal intensities of the staining. p  < 0.05 was accepted as statistically significant.

Abkürzungen

ABR:

Auditory brainstem response

AgNPs:

Silver nanoparticles

dH₂ O:

Entionisiertes Wasser

GAB1:

Growth factor receptor-bound protein 2-associated-binding protein 1

Gd-DOTA:

Gadolinium-tetra-azacyclo-dodecane-tetra-acetic acid (DOTAREM)

Gd-MRI:

Gadolinium-enhanced magnetic resonance imaging

JNK:

Jun amino-terminal kinases

LPN + Gd-DOTA:

Gd-DOTA-containing LPNs

LPNs:

Liposome nanocarriers

ROI:

Region of interests

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

TLR:

Toll-like receptor