Entschlüsselung von E. coli Genotyp-spezifischen Makromolekülen mittels AFM-Nanomechanischem Mapping

Zusammenfassung

Die Kategorisierung mikrobieller Stämme basiert konventionell auf molekularen Methoden, und selten werden die morphologischen Merkmale in bakteriellen Stämmen untersucht. In dieser Forschung enthüllten wir die makromolekularen Strukturen der bakteriellen Oberfläche mittels AFM-mechanischem Mapping, dessen Auflösung nicht nur durch die nanoskalige Spitzgröße, sondern auch durch die mechanischen Eigenschaften des Probenmaterials bestimmt wurde. Diese Technik ermöglichte die nanoskalige Untersuchung membranöser Strukturen mikrobieller Stämme mit einfacher Probenvorbereitung und flexiblen Arbeitsumgebungen, was die vielfältigen Einschränkungen in der Elektronenmikroskopie und markierungsbasierten biochemischen Analysemethoden überwand. Die charakteristischen Makromoleküle, die sich auf der Zelloberfläche befinden, wurden als Oberflächenschichtproteine (S-Layer-Proteine) betrachtet und als spezifisch für Escherichia coli Genotypen identifiziert, wobei die durchschnittlichen molekularen Größen mit Durchmessern von 38 bis 66 nm und die molekularen Formen nierenförmig oder rund waren. Zusammenfassend haben die oberflächennahen makromolekularen Strukturen einzigartige Merkmale, die mit dem E. coli Genotyp verknüpft sind, was darauf hindeutet, dass genomische Effekte auf zelluläre Morphologien mittels AFM-mechanischem Mapping schnell identifiziert werden können.

Hintergrund

Aufgrund der geringeren Auflösung der optischen Mikroskopie und der eingeschränkten Arbeitsumgebung der Elektronenmikroskopie ziehen Forscher im mikrobiellen Bereich selten das Erscheinungsbild bakterieller Zellen in Betracht, sondern wenden stattdessen molekulare oder chemische Analysemethoden zur Identifizierung genomischer Fragmente, Proteinexpression etc. an. Nicht überraschend haben diese Methoden eine Reihe von Nachteilen, darunter arbeitsintensiv und zeitaufwendig zu sein, weshalb geradlinigere, effizientere und flexiblere Ansätze benötigt werden. 1982 von Binnig et al. erfunden, ist das Rasterkraftmikroskop (AFM) darauf ausgelegt, einen nanoskaligen Sensor zu verwenden, der von einem Laserstrahl überwacht wird, um die Oberfläche eines Probenmaterials mit nanoskopischer oder sogar atomarer Auflösung zu beobachten [1]. Die Abbildung der Morphologie über eine physikalische Sensorspitze überwindet die Auflösungsgrenze und Umgebungsbeschränkungen sowohl der optischen als auch der Elektronenmikroskopie und bietet eine Reihe von Vorteilen, wie einfache Probenvorbereitung und flexible Arbeitsumgebungen in Umgebungsluft oder Flüssigkeitsbedingungen [2, 3]. Dennoch konzentrieren sich die aktuellen Anwendungen von AFM in mikrobiellen Studien hauptsächlich auf die qualitative Abbildung statischer oder dynamischer Morphologien bakterieller Zellen oder den Ausdruck von Flagellen und Pili [4,5,6], während sich wenige Studien auf die Oberflächen-Ultrastruktur mikrobieller Zellen und die quantitative Analyse zellulärer Eigenschaften konzentriert haben.

In dieser Forschung wurde AFM für die Oberflächenuntersuchung von Escherichia coli (E. coli) Zellen ausgewählt, und die Formen und Dimensionen der einzelnen Bakterien wurden durch AFM-Topographie- und Phasenbilder beobachtet. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass simultanes mechanisches Mapping zusätzliche biomechanische Informationen über die Oberflächenkomponenten enthüllt, wobei kleine Unterschiede in den adhäsiven Eigenschaften zwischen den Makromolekülen und der umgebenden Matrix während jedes physikalischen Kontakts zwischen Spitze und Probe detektiert werden konnten. Durch Anwendung solcher fortschrittlicher Techniken auf den mikrobiellen Bereich untersuchten wir drei E. coli Genotypen, die einen Laborstamm und zwei humanpathogene Stämme enthielten, zur Identifizierung von Oberflächenmakromolekülen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Technik eine Bildauflösung bieten konnte, die die Skala der AFM-Spitze übersteigt, indem sie die mechanische Verteilung des Probenmaterials erfasst. Zusammenfassend schlagen wir vor, dass eine solche Entwicklung in der Oberflächenwissenschaft Forschern im mikrobiellen Bereich nicht nur Details zum zellulären Erscheinungsbild liefern, sondern auch zu unserem Wissen über die Oberflächenmerkmale anderer bio- oder nanomaterialer Systeme beitragen würde.

Methoden

Mikrobielle Proben

Die drei in dieser Forschung getesteten E. coli Stämme wurden klinisch isoliert und von Prof. Ching-Hao Tengs Labor am Institut für Molekulare Medizin, National Cheng Kung University, bereitgestellt. MG1655 ist der intestinale und der Wildtyp-Laborstamm von E. coli K-12, und die beiden anderen Stämme sind humanpathogene Stämme – CFT073, die Hauptursache für Harnwegsinfektionen, und RS218, assoziiert mit neonataler Meningitis bei Säuglingen [7].

Funktionalisiertes Substrat

Zwei Schritte der Oberflächenmodifikation wurden für die kovalente Bindung zwischen der festen Oberfläche und den mikrobiellen Zellen angewendet. Zunächst wurde eine 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES, Sigma-Aldrich Co. LLC, USA) Lösung verwendet, um eine initiale NH₂-funktionalisierte Schicht auf der Oberfläche zu bilden, wobei die stabile APTES-Beschichtung durch stabile Si-O-Bindungen beigetragen wurde – Si bereitgestellt durch APTES und O von der oxidierten Oberfläche. Da es zwei COOH-Funktionen besitzt, verbindet sich Glutaraldehyd mit der NH₂-Funktion von APTES mit einem COOH und arbeitet mit dem NH₂ auf der bakteriellen Oberfläche mit dem anderen COOH.

Die sauberen Substrate wurden für eine Stunde in APTES-Lösung, mit einer Mischung von 5 % APTES in Ethanol, eingetaucht und mit Ethanol und ddH₂O gespült. Die Objektträger wurden mit Stickstoffstrom getrocknet und dann über Nacht in Glutaraldehydlösung, 2 % in PBS, gelegt und mit PBS gewaschen.

Probenvorbereitung

Einzelkolonien der E. coli Stämme wurden von Lysogenie-Brühe (LB) Agarplatten ausgewählt und in LB-Brühe inkubiert. Nach Kultivierungszeiten von 12 h wurde die bakterielle Lösung dann 1:100 in frische, vor-gleichgewichtete LB-Brühe verdünnt. Nach weiteren 12 h für die mikrobielle Kultivierung wurde die bakterielle Lösung einer Zentrifugation bei 1500×g (4000 rpm) für 3 min unterzogen und in LB-Brühe resuspendiert, wobei dieser Prozess zweimal wiederholt wurde. Zweihundert Mikroliter der bakteriellen Lösung wurden auf das funktionalisierte Substrat getropft und 30 min ruhen gelassen. Das Präparat wurde dann zweimal in destilliertem Wasser getaucht, um nicht angehaftete Zellen zu entfernen, und sofort unter AFM in Umgebungsluft abgebildet.

AFM-Charakterisierung

Ein AFM-Instrument (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) und eine Siliziumnitrid-Sonde mit einer kalibrierten Federkonstanten von 0,7 N/m und einem Spitzenradius von 10 nm wurden für die Oberflächenuntersuchung mikrobieller Präparate ausgewählt. Die AFM-Scangeschwindigkeit und Zeilenpixel betrugen 0,5 Hz und 256 Zeilen für die Scan-Größe von 10 µm für die erste Topographie-Detektion, und die Parameter wurden dann auf 0,3 Hz und 512 Zeilen für die Scan-Größe von 2 µm für die detaillierte Beobachtung eingestellt. Der PeakForce Quantitative Nanomechanical (QNM) Modus wurde für das nanomechanische Mapping verwendet, wobei die adhäsiven Eigenschaften der Oberfläche aus der maximalen Anziehungskraft unter den Rückzugskraft-Abstandskurven berechnet wurden.

Unsere frühere Studie zu Streptococcus mutans zeigte die mechanische Evolution auf der bakteriellen Oberfläche für 2 h, überwacht durch kontinuierliches AFM-mechanisches Mapping, und die mikrobiellen Proben wurden als lebendig innerhalb solcher Dauer verifiziert [8,9,10]. Um die Vitalität der in dieser Arbeit verwendeten E. coli Proben zu gewährleisten, wurden Vorstudien an den bakteriellen Proben durchgeführt, und die kontinuierliche Änderung der Oberflächenadhäsion für 4 h implizierte, dass die Zellen mindestens 4 h nach Probenvorbereitung lebendig bleiben (gezeigt in Zusatzdatei 1). Folglich wurden die in dieser Arbeit getesteten mikrobiellen Proben innerhalb von 2 h nach Präparation mit AFM gemessen. Alle E. coli Genotypen wurden einzeln und zu unterschiedlichen Zeiten kultiviert, und die AFM-Messungen wurden unmittelbar nach der Präparation durchgeführt. Mit anderen Worten, die bakteriellen Proben standen nicht in einer Warteschlange für die Untersuchung, sodass die Effekte der Haltezeit auf die Unterschiede zwischen E. coli Stämmen minimiert wurden. Die quantitativen Daten für jeden E. coli Stamm wurden aus den Messungen gesammelt, die innerhalb von 2 h in dieser Studie durchgeführt wurden.

Statistische Analyse

Prism (GraphPad Software, USA) wurde für die statistische Analyse in dieser Arbeit verwendet. Zelluläre Längen und makromolekulare Größen wurden als Mittelwerte zusammen mit dem Standardfehler des Mittels (SEM) dargestellt. Die multiplen Vergleiche zwischen E. coli Genotypen wurden mit gewöhnlicher einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) verarbeitet. Das Konfidenzniveau von 95 % (p < 0,05) wurde gewählt, und die Asteriske zeigen den Grad des signifikanten Unterschieds an, der gefunden wurde. Die Probenzahl n jedes Stammes war > 40.

Ergebnisse und Diskussion

Oberflächen-Ultrastruktur durch multiples Mapping

Beim Scannen mit AFM auf einer Beobachtungsskala von 10 µm auf einer bakteriellen Probe konnten mehrere einzelne E. coli MG1655 Zellen gesehen werden, und die zelluläre Form in drei Dimensionen konnte aus dem topographischen Bild beobachtet werden (Abb. 1a); die klaren Umrisse der Zellen in zwei Dimensionen wurden durch das Deflektionsfehlerbild erhalten (Abb. 1b), und mehrere Tubuli neben den bakteriellen Zellen konnten gefunden werden. Die wellenförmigen Filamente (Abb. 1c) waren konsistent mit dem Erscheinungsbild mikrobieller Flagellen, das in einer anderen Arbeit berichtet wurde, was solche Funde als Flagellen bestätigte, und die kürzeren, haarähnlichen Pili konnten ebenfalls gesehen werden [11]. Beim Verringern des Beobachtungsbereichs der Sonde für die detaillierte Untersuchung einzelner mikrobieller Zellen zeigte die Topographie einen leichten Unterschied in vertikaler Richtung unter den Zelloberflächen, wie in Abb. 1d gezeigt, und das Deflektionsfehlerbild schien mehr morphologische Informationen zu liefern, während das gesammelte Umgebungsrauschen zu groß war, um die Ultrastruktur der Zelloberfläche zu untersuchen (Abb. 1e). Als die simultanen biomechanischen Eigenschaften des Probenmaterials während des Kontakts zwischen Spitze und Testobjekt gemessen wurden, stellte sich heraus, dass die bakterielle Oberfläche tatsächlich aus einer riesigen Anzahl von Makromolekülen mit spezifischer Form und Größe bestand, wie durch das adhäsive Kraft-Mapping enthüllt (Abb. 1f); somit wurden die morphologische Auflösung in topographischen und Deflektionsfehlerbildern durch biomechanische Informationen weiter verbessert.

In Abb. 2a konnte der Ausdruck von Flagellen durch E. coli MG1655 deutlich gesehen werden, wobei die Größe der Filamente ähnlich war wie in Abb. 1b, mit relativ geringeren Adhäsionseigenschaften als das Substrat. Zusätzlich stellte sich heraus, dass die bakterielle Oberfläche aus kreisförmigen Komponenten bestand, die als weniger adhäsiv charakterisiert wurden im Vergleich zur umgebenden Matrix. Diese Beobachtung ähnelt unseren früheren Ergebnissen an den Gewebeschichten von Mäusehaut, und die wiederkehrenden und vergleichbaren Körnchen wurden als Makromoleküle betrachtet, deren Struktur dichter und konsistenter ist als die im intermolekularen Bereich gesehenen, sodass die Unterschiede in der Adhäsionsleistung leicht erfasst werden konnten [12]. Die äußerste Schicht der zellulären Hülle bei Gram-negativen Bakterien ist eine Schicht aus Selbstassembly-Proteinen, wie in Abb. 2b illustriert, die als Oberflächenschicht (S-Layer) Protein bekannt ist [13]. S-Layer-Strukturen wurden traditionell durch Elektronenmikroskopie gemessen, während die Anforderungen an Vakuumumgebungen und leitfähige Beschichtung die nativen und Echtzeit-Informationen über die Proteine verloren. Obwohl einige Forschungen die S-Layer-Proteine extrahierten und sie auf Mica-Substrat für das AFM-Scannen wieder zusammenbauten, fehlten die Ergebnisse die in situ und Echtzeit-Leistung der S-Layer-Struktur [14, 15]. Basierend auf der zellulären Architektur und einigen früheren Bildern mikrobieller Oberflächen durch Elektronenmikroskopie betrachteten wir die beobachteten Makromoleküle als S-Layer-Proteine [16].

Vergleicht man die AFM- und Transmissionelektronenmikroskopie (TEM)-Messungen, so hat die erstere mehrere Vorteile gegenüber der letzteren, wie einfachere Probenvorbereitung, weniger eingeschränkte experimentelle Anforderungen und biologisch-freundlichere Bildgebungsanwendungen. Die Auswahl von TEM im biologischen Bereich erfolgt allgemein aufgrund seiner Fähigkeit, interzelluläre Organellen zu sehen und die ultra-hohe Auflösung (typischerweise Nanometer oder Sub-Nanometer) zu erreichen. Das AFM-Adhäsionsmapping in der aktuellen Arbeit verbesserte die Merkmalsauflösung und präsentierte die Anordnungen der Oberflächenmakromoleküle auf eine Weise, die nicht von der Spitzengröße abhing, sondern von der intrinsischen Struktur des Probenmaterials selbst. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz nanoskalige Auflösung der mikrobiellen Oberfläche über einen Bereich von zehn Quadratmikrometern.

Genomisch bedingte Unterschiede in morphologischen Merkmalen

Nach der Beobachtung der Oberflächen-Ultrastruktur von E. coli MG1655 Zellen ist eine interessante Frage, wie die Makromoleküle in anderen Stämmen angeordnet sind. Die humanpathogenen E. coli CFT073 und RS218 wurden daher mit den gleichen experimentellen Parametern mittels AFM untersucht, und es gab keine signifikanten Unterschiede in zellulären Formen und Dimensionen zwischen diesen drei Genotypen bei der Merkmalsgröße von 10 µm, gesehen in Abb. 3a–c. Adhäsives Kraft-Mapping wurde verwendet, um die S-Layer-Proteine zu identifizieren, und unähnliche Strukturen mit verschiedenen Formen und Größen wurden unter den verschiedenen E. coli Stämmen detektiert, wie in Abb. 3d–f gezeigt. Zum leichteren Vergleich wurden die detaillierten Adhäsionsmapping-Bilder der E. coli Stämme in Abb. 3g–i dargestellt. Die Oberflächenmakromoleküle wurden als rund in MG1655 und RS218 Zellen charakterisiert, obwohl unterschiedliche molekulare Durchmesser vorlagen, die 38 ± 1,1 nm (n = 80) für MG1655 und 58 ± 2,7 nm (n = 46) für RS218 betrugen. Andererseits besaßen die CFT073 Zellen eine einzigartige Form von S-Layer-Proteinen, die nierenförmig waren mit einem Längenunterschied zwischen den beiden Endpunkten von 66 ± 3,2 nm (n = 44). Nach der Analyse der Größen der S-Layer-Proteine dieser drei Genotypen für multiple Vergleiche demonstrierten die Ergebnisse signifikante Unterschiede zwischen diesen Stämmen (Abb. 4).

Mikrobielle S-Layer wird berichtet, wichtige Rollen in vielen Funktionen zu spielen, die den Schutz der Zellen vor rauen Umgebungen, Angriffen der Phagozytose und räuberischen Bakterien enthalten. Zusätzlich dienen S-Layer auch als Adhäsine, die eine effektive Kolonisation ermöglichen [17]. Die S-Layer-Strukturen wurden gut durch TEM untersucht und in verschiedene Gittertypen kategorisiert mit dem Abstand zwischen Zentrum-zu-Zentrum im Bereich von 4–35 nm [16]. Die Variation zwischen unseren AFM-Ergebnissen und TEM-Berichten aus der Literatur wurde als die unterschiedlichen Bildgebungsmethoden angesehen, wo TEM die 2D-Morphologie der S-Layer-Struktur gibt und AFM die 3D-Topographie erfasst, die die mehrfachen Einflüsse durch zelluläre Radien und Rauheit und die Geometrie der AFM-Sonde einschließt.

Verschiedene Arten von S-Layer-Strukturen wurden ursprünglich als möglich angesehen, ihre verschiedenen taxonomischen Merkmale zu nutzen, um zwischen bakteriellen Arten zu unterscheiden, obwohl dann festgestellt wurde, dass sogar für eine einzelne Art die mikrobiellen Stämme unterschiedliche Gitter von Proteinen besitzen können [13, 16, 18, 19]. Während einige Studien die Rolle des S-Layers in der Filamentbildung untersuchten, die Arten von Proteinen auf Zellmembranen und die genomischen Diversitäten in der Größe unter E. coli Genotypen, wurden die Unterschiede in S-Layer-Proteinen selten festgestellt [20,21,22]. Die Ergebnisse der aktuellen Studie enthüllten die Unterschiede in morphologischen Merkmalen unter E. coli MG1655, CFT073 und RS218 und legen nahe, dass die Erscheinungen der Oberflächenmakromoleküle wahrscheinlich spezifisch für individuelle E. coli Genotypen sind.

Schlussfolgerungen

In dieser Arbeit wurden genom-spezifische nanostrukturelle Informationen über die bakterielle Oberfläche durch AFM-mechanisches Mapping detektiert, das die adhäsiven Unterschiede zwischen den Makromolekülen und der umgebenden Matrix unterschied. Die Oberflächenmakromoleküle der mikrobiellen Zellen wurden als Oberflächenschichtproteine betrachtet, gemäß der molekularen Architektur von Gram-negativen Mikroben. Die Anordnungen und Größen dieser Makromoleküle wurden als spezifisch für die getesteten E. coli Genotypen mit unterschiedlichen Formen und Größen gefunden, wobei diese Unterschiede durch statistische Analyse als signifikant gezeigt wurden. Zusammenfassend betrachten wir die bakterielle S-Layer-Struktur als genomabhängig und als potenzielle Methode für die schnelle Diagnose mikrobenassoziierter Krankheiten oder mikrobieller Stämme. Zur Implementierung der praktischen Anwendung der S-Layer-Merkmale ist die Untersuchung weiterer bakterieller Genotypen für den ergänzenden Katalog erforderlich. Wir etablieren derzeit die Datenbank, die bakterielle morphologische Merkmale mit physiologischen/pathologischen Leistungen verbindet, und glauben, dass dies ein vielversprechender Fortschritt für die praktische Anwendung der AFM-Untersuchung sein wird.

Abkürzungen

AFM:

Atomic Force Microscope (Rasterkraftmikroskop)

ANOVA:

One-way Analysis of Variance (einseitige Varianzanalyse)

APTES:

3-Aminopropyltriethoxysilane

LB:

Lysogeny Broth (Lysogenie-Brühe)

QNM:

Quantitative Nanomechanical (quantitativ nanomechanisch)

S-layer:

Surface Layer (Oberflächenschicht)

TEM:

Transmission Electron Microscopy (Transmissionelektronenmikroskopie)