Fluoreszente SnO₂/SiO₂ Nanoadsorbentien für hocheffizienten GST-getaggten Protein-Capture

Abstract

Wir berichten über eine facile, hydrothermal synthetisierte thiol-funktionalisierte Silica-Nanosphären-Plattform (SiO₂-SH), die anschließend mit SnO₂-Quantenpunkten (QDs) dekoriert wird. Die resultierenden SnO₂/SiO₂-Komposit-Nanosphären (NSs) zeigen starke, sichtbarlicht-responsive Fluoreszenz, was Echtzeit-Tracking des Protein-Captures ermöglicht. Funktionalisierung mit reduziertem Glutathion (GSH) konvertiert die NSs in SnO₂/SiO₂-GSH, die spezifisch Glutathion-S-Transferase (GST)-getaggte Proteine binden. Bei Anwendung auf E. coli-Lysate zeigen die Nanoadsorbentien vernachlässigbare unspezifische Adsorption, eine Proteinbindungskapazität von 7,4 mg g⁻¹ und bewahren den Redoxzustand und die Peroxidase-Aktivität von isolierter Glutathion-Peroxidase 3 (GPX3). Diese Eigenschaften positionieren SnO₂/SiO₂-GSH NSs als vielversprechendes Werkzeug für schnelle, hochausbeutende Reinigung von GST-getaggten Proteinen.

Hintergrund

Effiziente Proteinreinigung ist Grundlage für Fortschritte in Arzneimittelstoffwechsel, Strukturbiologie und Impfstoffentwicklung. Traditionelle chromatographische und Fällungsmethoden sind mühsam und beeinträchtigen oft die Proteinintegrität. Affinitätsreinigung, die die natürliche Interaktion zwischen GST und seinem Liganden nutzt, bleibt der Goldstandard für rekombinante Proteine mit GST-Tag. Konventionelle GST-Affinitätsharze (z. B. Glutathion Sepharose 4B) leiden jedoch unter begrenzter Bindungskapazität, hohen Kosten und fehlender intrinsischer visueller Berichterstattung.

Nanomaterialien können diese Limitationen überwinden, indem sie hohe Oberfläche, einstellbare Chemie und, wenn angemessen engineered, optische Signaturen bieten. SnO₂ QDs sind für Bioanwendungen attraktiv: sie sind chemisch stabil, biokompatibel und zeigen defektinduzierte Fluoreszenz, die für Imaging genutzt werden kann. Durch Ankern von SnO₂ QDs auf Silica-Nanosphären schufen wir eine Dual-Funktions-Plattform, die Affinitäts-Capture mit Fluoreszenz-Monitoring koppelt.

Experimentell

Materialien und Allgemeine Verfahren

Alle Reagenzien waren Analytikqualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Schlüsselsubstanzen umfassen CTAB, SnCl₄·5H₂O, TEOS, MPS und GSH. Die SnO₂ QDs wurden via hydrothermaler Methode hergestellt, gefolgt von Oberflächenanbindung an SiO₂-SH NSs und anschließender GSH-Konjugation.

Synthese von SnO₂ Quantenpunkten

SnCl₄·5H₂O (3,5 g) wurde in 50 ml H₂O gelöst; Ammoniak (5 ml) wurde zugegeben, um Sn(OH)₄ zu fällen, welches gewaschen und in 30 ml H₂O redispersiert wurde. Der pH wurde mit 2 M NH₄OH auf 12 eingestellt, dann in einen Teflon-ausgekleideten Autoklaven überführt und bei 150 °C für 24 h erhitzt. Das resultierende Produkt wurde gesammelt, mit Ethanol-Isopropanol (1:1) gewaschen und getrocknet, um SnO₂ QDs (~5 nm Durchmesser) zu erhalten.

Herstellung von SnO₂/SiO₂-SH Nanosphären

SnO₂ QDs (0,2 g) und CTAB (0,09 g) wurden in einem Wasser-Ethanol-Gemisch (42,5 ml + 7 ml) dispersiert. TEA (2,7 ml) wurde zugegeben, gefolgt von TEOS (3,5 ml) und MPS (0,35 ml) unter Rühren bei 60 °C für 5 h. Das Gemisch wurde zentrifugiert, mit HCl-Ethanol und Wasser gewaschen und redispersiert, um SnO₂/SiO₂-SH NSs (~460 nm Durchmesser) zu produzieren.

GSH-Funktionalisierung

SnO₂/SiO₂-SH NSs (4 ml, 0,12 g ml⁻¹) wurden mit GSH (16,7 mg ml⁻¹) in PBS (pH 7,4) bei 37 °C für 24 h inkubiert. Nach Zentrifugation und Waschung wurden die SnO₂/SiO₂-GSH NSs in 25 % Ethanol bei 4 °C gelagert.

Affinitäts-Capture von GST-getaggten Proteinen

GST-getaggte GPX3, OST1 und ABI2 wurden in E. coli BL21(DE3) aus pGEX-6p1 Konstrukten exprimiert. Zelllysate (pH 7,4, 0,01 M) wurden mit SnO₂/SiO₂-GSH NSs (1 ml) gemischt und bei 4 °C für 2 h rotiert. Nach Zentrifugation und Waschung wurden gebundene Proteine mit 0,5 M GSH eluiert, via BCA-Assay quantifiziert und per SDS-PAGE analysiert.

GPX3 Aktivitätsassay

Reinigte GPX3 wurde mit PreScission Protease de-tagged und auf Peroxidase-Aktivität getestet durch Monitoring von NADPH-Verbrauch bei 340 nm in Gegenwart von Thioredoxin, Thioredoxin-Reduktase und H₂O₂.

Redoxzustandsanalyse

GPX3-Proben wurden mit H₂O₂ und DTT behandelt, dann auf nicht-reduzierendem 15 % SDS-PAGE getrennt, um oxidierte und reduzierte Formen zu differenzieren.

Charakterisierung

Morphologie und Zusammensetzung wurden durch TEM (JEM-2010) und SEM (JSM 5600LV) untersucht. XRD-Muster wurden auf einem X'Pert Philips Diffraktometer aufgezeichnet. Fluoreszenzspektren wurden mit einem FluoroSENS Spektrometer (Anregung 260 nm) gemessen. Proteinreinheit wurde durch SDS-PAGE (Power PAC 300) beurteilt. BCA-Assays wurden mit dem Beijing CoWin Kit durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Morphologie, Kristallinität und Fluoreszenz der Nanoadsorbentien

Die SnO₂ QDs zeigten monodisperse, ~5 nm kugelförmige Morphologie mit Gitterabstand 0,29 nm (110)-Ebene, was ihre hohe Kristallinität bestätigt (Abb. 1). XRD stimmte mit der Cassiterit-Phase (JCPDS 41-1445) überein. Die kompositen SnO₂/SiO₂-GSH NSs behielten eine kugelförmige Form (~430 nm) mit mäßig rauer Oberfläche, wie in SEM- und TEM-Bildern zu sehen (Abb. 2). Die Präsenz von SnO₂ QDs auf SiO₂ wird durch TEM (Abb. 2c,d) bestätigt.

Fluoreszenzanalyse zeigte einen starken Emissionspeak bei 368 nm, zuzuschreiben Sauerstoff-Vakanz-Defekten in SnO₂ (Abb. 3b). Fluoreszenz-Imaging der NSs nach Protein-Capture (Abb. 3c) demonstrierte intakte Lumineszenz, was visuelles Tracking gebundener Komplexe ermöglicht.

Protein-Capture-Effizienz

SDS-PAGE von GST-GPX3, captured by SnO₂/SiO₂-GSH NSs, zeigte klare Anreicherung des Zielproteins (Abb. 4a). Erhöhung der Elutions-GSH-Konzentrationen (10–100 mM) setzte das gebundene Protein progressiv frei, was die Spezifität der GSH-GST-Interaktion bestätigt. Die Nanoadsorbentien zeigten vernachlässigbare unspezifische Bindung an das E. coli-Lysat-Gesamt.

Wiederverwendbarkeitstests ergaben, dass die NSs ihre Bindungskapazität über drei aufeinanderfolgende Capture-Zyklen beibehielten (Abb. 4b), was ihre Robustheit unterstreicht.

Erweiterung des Ansatzes auf andere GST-getaggte Proteine (OST1, ABI2) lieferte vergleichbare Ergebnisse (Abb. 5). Bindungskapazitäten betrugen 7,4 mg g⁻¹ (GPX3), 7,1 mg g⁻¹ (OST1) und 6,8 mg g⁻¹ (ABI2), was kommerziellem Glutathion Sepharose 4B (7,1, 6,9, 5,6 mg ml⁻¹) überlegen ist.

Erhaltung von GPX3 Redoxzustand und Aktivität

Nach GST-Entfernung behielt GPX3 sowohl oxidierte als auch reduzierte Formen bei, wie durch distincte Migration auf nicht-reduzierendem SDS-PAGE belegt (Abb. 6a). Der Peroxidase-Aktivitätsassay (Abb. 6b) demonstrierte, dass GPX3, isoliert via SnO₂/SiO₂-GSH NSs, Aktivität aufwies, vergleichbar mit der aus kommerziellem Harz, was bestätigt, dass der Nanoadsorbent enzymatische Funktion bewahrt.

Schlussfolgerungen

Wir haben einen fluoreszierenden, silika-geschützten SnO₂-Quantenpunkt-Nanoadsorbentien entwickelt, der GST-getaggte Proteine mit hoher Spezifität und Kapazität einfängt, während er ihren nativen Redoxzustand und enzymatische Aktivität bewahrt. Die Plattform's robuste Wiederverwendbarkeit, überlegene Bindungsleistung und intrinsische Fluoreszenz machen sie zu einer attraktiven Alternative zu konventionellen Affinitätsharzen für schnelle Proteinreinigung.

Abkürzungen

ABI2:

ABA insensitive 2

CTAB:

Hexadecyltrimethylammoniumbromid

DTT:

Dithiothreitol

GPX3:

Glutathion-Peroxidase 3

GSH:

Reduziertes Glutathion

GST-getaggt:

Glutathion-S-Transferase-getaggt

MPS:

3-Mercaptopropyl-trimethoxysilan

NADPH:

Dihydronicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat

OST1:

Open Stomata 1

QDs:

Quantenpunkte

SDS-PAGE:

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

SiO₂-SH NSs:

Thiol-funktionalisierte Silica-Nanosphären

SnCl₄:

Zinn(IV)-chlorid

TEA:

Triethylamin

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

TEOS:

Tetraethylorthosilikat

XRD:

Röntgenbeugung