Effiziente Chlorin-e6-Aufnahme und verbesserter Energietransfer in PS-PPO-PNIPAM Hybrid-Nanopartikeln

Abstract

Polystyrol (PS) Nanopartikel, dotiert mit Diphenyloxazol (PPO) und gekappt mit einer vernetzten Poly-N-isopropylacrylamid (PNIPAM) Schale, bilden PS-PPO-PNIPAM Hybrid-Nanosysteme (NS). Fluoreszenzstudien von Chlorin e₆, das diesen NS zugesetzt wurde, demonstrieren effizienten elektronischen Anregungsenergietransfer (EEET) sowohl vom PS-Kern als auch vom eingebetteten PPO zum Chlorin e₆ Akzeptor. Die EEET-Effizienz steigt innerhalb der ersten Stunde nach Chlorin-e₆-Zugabe stark an, was darauf hindeutet, dass PNIPAM den Sensibilisator während dieser Zeit weiterhin einbindet. Erhitzen der PS-PPO-PNIPAM-Chlorin-e₆ NS von 21 °C auf 39 °C steigert EEET weiter, konsistent mit dem thermisch induzierten Kollaps des PNIPAM-Netzwerks, der Donor-Akzeptor-Distanzen verkürzt. Dennoch assoziiert nur ein bescheidener Anteil freien Chlorin e₆ mit PNIPAM, was zusätzlichen Optimierungsbedarf nahelegt.

Hintergrund

Die primäre Limitation der photodynamischen Therapie (PDT) bei Krebs ist die geringe Penetration des Anregungslichts in Gewebe. Röntgen-getriebene photodynamische Therapie (X-PDT) bietet eine Lösung, da Röntgenstrahlen tief eindringen und Sensibilisatoren aktivieren können, die bei Röntgenanregung Singulett-Sauerstoff erzeugen. Schlüssel für X-PDT ist effizienter elektronischer Anregungsenergietransfer (EEET) zwischen einer Szintillations-Komponente und einem Sensibilisator. Strategien zur Aufrechterhaltung optimaler Donor-Akzeptor-Nähe umfassen chemische Konjugation, elektrostatische Anziehung, Tensidschichten oder Polymerschalen. In vorangegangener Arbeit untersuchten wir EEET in PS-PPO-Chlorin-e₆ Nanopartikeln, wo Chlorin e₆ über eine Natriumdodecylsulfat-Schale an PS-PPO gebunden war.

Poly-N-isopropylacrylamid (PNIPAM) ist ein stimuliresponsives Polymer, das oberhalb seiner unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) von 32 °C einen Konformationsübergang durchläuft, hydrophober wird und schrumpft. Für vernetztes PNIPAM ist die LCST höher, was temperaturgetriebene Größenänderungen bei physiologischen Temperaturen ermöglicht. Wir fertigten PS-PPO Nanopartikel an, umhüllt von einer vernetzten PNIPAM-Schale, was PS-PPO-PNIPAM Hybrid-NS ergab. Wir untersuchten, ob diese Schale Chlorin e₆ ankern kann und ob der temperaturabhängige Kollaps von PNIPAM Donor-Akzeptor-Distanzen verringern kann, wodurch EEET und Tumorzell-Abtötungseffizienz gesteigert werden.

Experimentell

Materialien

Styrol (ST, Ukraine) p.a. Qualität wurde vor der Polymerisation durch Standardmethoden gereinigt. N-Isopropylacrylamid (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N,N'-Methylenbisacrylamid (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), Kaliumpersulfat (K₂S₂O₈, KPS, Ukraine), Natriumphosphat-Monobasisch-Dihydrat (NaH₂PO₄ × 2H₂O, Ukraine) und anionisches Tensid Natriumdodecylsulfat (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) waren Reagenzqualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Chlorin e₆ (Frontier Scientific Inc.) wurde freundlicherweise von T.Y. Ohulchanskyy (Institute for Lasers, Photonics and Biophotonics, State University of New York at Buffalo) bereitgestellt. Ein 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7.2) diente als Lösungsmittel.

Synthese und Charakterisierung der Nanosysteme

PS-co-PNIPAM Kernnanopartikel, dotiert mit PPO, wurden zunächst durch Mikroemulsionspolymerisation hergestellt. Kurz: 0,2 g NIPAM, 0,2 g SDS und 0,01 g NaH₂PO₄ × H₂O wurden in 90 g H₂O gelöst. Anschließend wurde 0,09 g PPO in 1,8 g Styrol gelöst und über 30 min tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde bei 700 rpm gerührt, 30 min mit Ar gespült und dann auf 70 °C erhitzt. 0,01 g K₂S₂O₈ in 1 ml H₂O gelöst initierte die Polymerisation. Nach 4 h bei 70 °C wurde ein Vernetzungsschritt durch Zugabe von 0,69 g NIPAM und 0,06 g BIS in wässriger Lösung durchgeführt, gefolgt von 3 h bei 70 °C und 1 h bei 90 °C. Das Produkt wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 48 h gegen eine Zellulosemembran (MWCO 3500 Da) dialysiert.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder (Abb. 2) bestätigen, dass die Hybrid-NS aus mehreren PS-PPO-Kernen bestehen, die durch ein vernetztes PNIPAM-Netzwerk verbunden sind.

Spektralmessungen und Probenvorbereitung

Absorptionsspektren wurden mit einem Specord M40 Spektrophotometer (Carl Zeiss, Deutschland) aufgezeichnet. Fluoreszenzanregungs- und Emissionsspektren wurden mit einem Cary Eclipse Fluorimeter (Varian, Australien) erhalten. Alle Messungen wurden in 1 × 1 cm Quarzküvetten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die PS-PPO-PNIPAM-Lösung wurde 100-fach in Tris-HCl-Puffer verdünnt. Ein 10 mM Chlorin-e₆-Stock in DMF wurde auf 1 mM in Puffer verdünnt, und 2 µM finale Chlorin-e₆-Konzentration wurde der NS-Lösung zugesetzt (DMF ≤ 0,02 %). Fluoreszenzanregungs- und Emissionsspektren wurden nach 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 und 100 min nach Zugabe gesammelt, wobei Sättigung nach ≈ 80 min erreicht wurde.

Für temperaturabhängige Studien wurde die NS-Lösung mit Chlorin e₆ in einen thermostatisierten Halter (T = 23 °C) gegeben. Nach ≈ 88 min Sättigung wurde das Sample auf 39 °C erhitzt (über der LCST von vernetztem PNIPAM). Fluoreszenzanregungsspektren (Chlorin-e₆-Emission bei 680 nm) wurden in Intervallen nach Erhitzen aufgezeichnet. Der Konformationsübergang von PNIPAM begann ≈ 3 min nach Erhitzen, mit Koagulation nach ≈ 18 min – reversibel bei Abkühlung. Experimente wurden dreimal mit konsistenten Ergebnissen wiederholt.

Ergebnisse und Diskussion

Absorptions-, Fluoreszenzanregungs- und Emissionsspektren der PS-PPO-PNIPAM NS in 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7.2) sind in Abb. 3 gezeigt. Das Absorptionsprofil zeigt Styrol (≈ 260 nm) und PPO (≈ 307 nm) Bänder. Fluoreszenzanregung bei 250 nm (Styrol-Absorption) ergibt PPO-Emission bei 367 nm, was nahezu vollständigen EEET von Styrol zu PPO bestätigt. Das Anregungsspektrum von PPO (380 nm Emission) illustriert weiter den Beitrag des Styrol-Bands. Vibrationsstruktur in der PPO-Emission, abwesend in wässrigem PPO, bestätigt dessen Einbau in die PS-Matrix.

Bei Zugabe von Chlorin e₆ (2 µM) bleibt sein Absorptionsspektrum weitgehend unverändert (Abb. 4), außer einer leichten Reduktion der Peak-Optischen Dichte. Im Gegensatz dazu induziert Chlorin-e₆-Zugabe ein starkes Quenching der PPO-Fluoreszenz, das sich über etwa eine Stunde intensiviert (Abb. 5). Dieses Quenching resultiert sowohl aus EEET (Donor-zu-Akzeptor-Energietransfer) als auch Reabsorption (Donor-Emission überlappt Akzeptor-Absorption). Initial dominiert Reabsorption, aber mit fortschreitender Zeit wird EEET der primäre Beitrag.

Chlorin-e₆-Emission erscheint bei PS-Anregung bei 250 nm, verschiebt sich über die Zeit zu längeren Wellenlängen und erreicht Sättigung nach ≈ 60 min (Abb. 6). Dieser Rotverschiebung zeigt den Einfluss der PNIPAM-Umgebung auf gebundene Chlorin-e₆-Moleküle an. Anregung an Chlorin-e₆-eigenem Soret-Band (400 nm) erzeugt nur geringfügige Änderungen in der Emission, was unterstreicht, dass ein kleiner Anteil Chlorin e₆ frei in Lösung verbleibt.

Das Anregungsspektrum von Chlorin e₆ (Emission bei 680 nm) zeigt initial ein schwaches PS-PPO-Band, das sich über die Zeit intensiviert (Abb. 7), was erhöhten EEET vom Donor zum Akzeptor widerspiegelt. Das PS-PPO-Band bleibt schwach im Anregungsspektrum, aufgezeichnet bei Chlorin-e₆-Emission (660 nm) sogar nach 100 min, was bestätigt, dass der meiste Energietransfer über den PS-PPO-Donor erfolgt.

Zusammenfassend demonstrieren diese Ergebnisse, dass Chlorin e₆ in das PNIPAM-Netzwerk eindringt und EEET von PS und PPO zum Sensibilisator ermöglicht. Die EEET-Effizienz steigt während der ersten Stunde der Inkubation und kann durch Erhitzen des Systems über die LCST von vernetztem PNIPAM weiter gesteigert werden, was das Polymernetzwerk kontrahiert und Donor-Akzeptor-Distanzen verkürzt.

Frühere Studien haben gezeigt, dass PS-PPO-Nanopartikel unter Röntgenanregung PPO-Fluoreszenz emittieren, was suggeriert, dass der hier unter UV-Beleuchtung beobachtete EEET auch unter Röntgenbestrahlung funktionieren würde. Allerdings erfordert die Detektion Röntgen-induzierter Emission typischerweise hohe NP-Konzentrationen; die Einbindung schweratomhaltiger Moieties könnte die Röntgenabsorption erhöhen und die Sensitivität verbessern.

Im temperaturabhängigen Experiment (Abb. 8-9) verursachte Erhitzen von 23 °C auf 39 °C (post-Sättigung) zunächst einen moderaten Abfall des I_ex320/I_ex404 Verhältnisses (von 0,90 auf 0,85), was möglicherweise eine reduzierte Chlorin-e₆-PNIPAM-Affinität reflektiert. Anschließend stieg das Verhältnis auf 1,02, einhergehend mit erhöhter Lichtstreuung – indikativ für PNIPAM-Kollaps und nähere Donor-Akzeptor-Nähe, wodurch EEET gesteigert wird.

Zusammenfassend erleichtern PS-PPO-PNIPAM Hybrid-NS die Chlorin-e₆-Aufnahme und EEET, wobei die Effizienz über ~1 h Inkubation steigt und bei Erhitzen über LCST weiter zunimmt. Dennoch bindet nur ein begrenzter Anteil Chlorin e₆ an PNIPAM, was die Notwendigkeit zukünftiger Optimierung unterstreicht.

Schlussfolgerungen

Fluoreszenzanalyse bestätigt, dass Chlorin e₆ in PS-PPO-PNIPAM Hybrid-NS eingebaut wird und EEET von der PS-Matrix und eingebettetem PPO zu Chlorin e₆ stattfindet. Die Aufnahme sättigt nach etwa einer Stunde. Erhitzen des Systems von 21 °C auf 39 °C steigert EEET weiter, konsistent mit dem thermisch getriebenen Kollaps der vernetzten PNIPAM-Schale, der Donor und Akzeptor näher zusammenbringt. Obwohl nur eine bescheidene Menge Chlorin e₆ an PNIPAM gebunden bleibt, unterstützen diese Ergebnisse das Potenzial solcher Hybrid-NS in Röntgen-getriebener photodynamischer Therapie und rechtfertigen weitere Studien zur Erhöhung der Sensibilisator-Beladung.

Abkürzungen

EEET:

Elektronischer Anregungsenergietransfer

LCST:

Untere kritische Lösungstemperatur

NS:

Nanosystem

PNIPAM:

Poly-N-isopropylacrylamid

PPO:

Diphenyloxazol

PS:

Polystyrol

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie