Grüne Synthese von Metall- und Metalloxid-Nanopartikeln und ihre Wirkung auf die einzellige Alge Chlamydomonas reinhardtii

Hintergrund

Metall- und Metalloxid-Nanopartikel (NPs) haben aufgrund ihrer außergewöhnlichen elektrischen, optischen, magnetischen und katalytischen Eigenschaften große Aufmerksamkeit in der Forschung erhalten. Diese haben ihren breiten Einsatz in verschiedenen industriellen, medizinischen, landwirtschaftlichen und Umweltanwendungen ermöglicht, wobei weitere Anwendungen ständig entwickelt werden [1,2,3,4]. Herkömmliche Synthesemethoden für reine Metall- und Metalloxid-NPs umfassen die Reduzierung und Stabilisierung chemischer Wirkstoffe, die für Menschen und andere Spezies in unterschiedlichen trophischen Ebenen toxisch sind [5,6,7,8,9,10,11]. Als Reaktion darauf suchen Forscher nun nach alternativen Ansätzen der „grünen Synthese“, um schädliche Chemikalien bei der Herstellung von Nanopartikeln zu reduzieren oder zu eliminieren [12,13,14,15,16,17,18].

Viele Studien haben aufgrund ihrer einzigartigen und weitreichenden physikalisch-chemischen Eigenschaften über die breite Palette von Metall- und Metalloxid-NP-Anwendungen berichtet [19]. Silber (Ag)-NPs werden beispielsweise häufig für medizinische, Textil-, Lebensmittelverpackungs- und Wasseraufbereitungsanwendungen verwendet [20,21,22,23]. Gold(Au)-NPs wurden in der biomedizinischen Forschung eingesetzt, während Platin(Pt)-NPs aufgrund ihrer katalytischen Eigenschaften für industrielle Anwendungen weit verbreitet sind [24, 25]. Schließlich wurden Palladium (Pd)-NPs als Katalysatoren bei der Herstellung von Arzneimitteln [26, 27] und Kupferoxid (CuO)-NPs als Antifouling-Mittel in Farben und Stoffen aufgrund ihrer nachgewiesenen antibakteriellen Eigenschaften [28] verwendet. Metall-NPs können als Katalysatoren für den Abbau einer Vielzahl üblicher Umweltschadstoffe dienen, darunter polychlorierte Biphenyle (PCBs), halogenierte Aliphate, chlororganische Pestizide, toxische Metalle und halogenierte organische Lösungsmittel [29]. CuO-, Ag- und Au-NPs werden auch zum Erfassen giftiger Gase wie Kohlenmonoxid (CO), Blausäure (HCN) und Schwefeldioxid (SO₂ .) verwendet ) [30, 31]. Kürzlich wurde eine Reihe von Metall-NPs (Au, Ag und Cu) mit lokalisierter Oberflächenplasmonenresonanz bei der Entwicklung von Bio-Nanosensoren verwendet [24].

Leider haben Metall- und Metalloxid-NPs das Potenzial, sowohl die menschliche Gesundheit als auch die Umwelt im Allgemeinen negativ zu beeinflussen, z. durch die Erzeugung neuer Klassen von Toxinen, die sich nachteilig auf mikrobielle Gemeinschaften auswirken können, mit Folgewirkungen auf das gesamte Ökosystem [32,33,34,35]. Als Ergebnis wurden die Auswirkungen von Nanopartikeln auf Mikroorganismen umfassend untersucht. Ag-NPs zum Beispiel hemmen das Algenwachstum und die Photosynthese und verändern das Chlorophyll (Chl ) Fluoreszenzgehalt von Chlamydomonas reinhardtii [36], das das Zellwachstum von Thalassiosira pseudonana . verändert und Synechococcus sp. [37] und beeinflusst das Wachstum und die zelluläre Lebensfähigkeit der Wasserpflanze geschwollene Wasserlinse Lemna gibba [38]. Książyk et al. [39] und Sørensen et al. [40] haben berichtet, dass Pt-NP das Wachstum in den Süßwassermikroalgen Pseudokirchneriella subcapitata . hemmen [39, 40]. Es überrascht nicht, dass sowohl Ag- als auch Pd-NPs als nützliche antibakterielle Mittel gegen eine Vielzahl von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien eingesetzt wurden [41,42,43]. Im Gegensatz dazu wird angenommen, dass Au-NPs keine negativen Auswirkungen auf Bakterien oder Algen haben [44, 45], obwohl eine Studie gezeigt hat, dass sie abhängig von ihrer Ladung und Oberflächenchemie toxisch sein können [46]. Negative Auswirkungen wurden für CuO-NPs auf C gemeldet. reinhardtii [36, 47], S. subcapitata [48], Westliche Wasserpflanze Elodea nuttallii [49] Wasserlinsen Lemna sp. , Daphnia magna [48] ​​und die frühen Lebensstadien von Zebrafischen Danio rerio [50, 51].

Metall-NPs besitzen physikalische und chemische Eigenschaften, die Zellschäden verursachen können, z. durch übermäßige Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit nachfolgender Schädigung von DNA, Proteinen und Lipiden. Die Bildung von ROS durch Ag-NPs wurde in Chlorella vulgaris . nachgewiesen und Dunaliella tertiolecta Kulturen und in L. Gibba [52] sowie bei Bakterien [53]. CuO- und Fe-NPs sind beide in der Lage, Wasserstoffradikale zu erzeugen, eine Familie von ROS, die durch die Fenton-Reaktion gebildet wird und eine Vielzahl von Wasser- und Landorganismen schädigen kann [54, 55].

Grüne Chemie ist eine Reihe von Prinzipien oder Praktiken, die die Entwicklung von Produkten und Prozessen fördern, die die Verwendung und Erzeugung gefährlicher Stoffe reduzieren oder eliminieren [56,57,58]. Aktuelle Praktiken der grünen Nanotechnologie beinhalten häufig die Verwendung natürlicher Quellen, ungefährlicher Lösungsmittel, biologisch abbaubarer und biokompatibler Materialien und energieeffizienter Verfahren bei der Herstellung von Nanopartikeln [59]. Beispielsweise werden Biopolymere wie Cellulose, Chitosan, Dextran oder Baumgummi häufig als Reduktions- und Stabilisierungsmittel für die Metall-NP-Synthese verwendet [12, 60, 61, 62]. Gum Karaya (GK), das in dieser Studie verwendet wurde, ist ein natürlicher Baumgummi von Sterculia bestehend aus ca. 13–26 % Galactose und 15–30 % Rhamnose, 30–43 % Galacturonsäure, 37 % Uronsäureresten und ca. 8 % Acetylgruppen [63]. Toxikologische Studien haben gezeigt, dass GK nicht toxisch ist, sodass es sogar als Lebensmittelzusatzstoff verwendet werden kann [62,63,64,65].

In dieser Studie zielten wir darauf ab, einen Ansatz der grünen Chemie zu verwenden, um eine Reihe von Metall- (Ag, Au, Pt, Pd) und Metalloxid-NPs (CuO) unter Verwendung wässriger Lösungen des natürlichen Polymers GK herzustellen. Die biologische Wirkung dieser neu hergestellten NPs wurde an C untersucht. reinhardtii Verwendung einer Reihe von zellulären Reaktionen, einschließlich Algenwachstum, oxidativer Stress, Membranschäden, Chl Fluoreszenz und Photosynthese. NP-Stabilität, Größe und Zeta-Potenzial wurden in Algen-Wachstumsmedium bestimmt, zusammen mit Löslichkeits- und abiotischen Tests der ROS-Erzeugung.

Methoden

Materialien

Handelsübliches GK, Silbernitrat (AgNO₃ .) ), Hydrogentetrachloroaurat (HAuCl₄ ·3H₂ O), Kupferchlorid (CuCl₂ .) ·2H₂ O), Chlorplatinsäure (H₂ .) PtCl₆ ), Kaliumtetrachloropalladat(II) (K₂ PdCl₄ ), Chlorwasserstoff (HCl), Natriumhydroxid (NaOH) und Ammoniumhydroxid (NH₄ .) OH) wurden alle von Sigma-Aldrich, USA, bezogen. Für alle Experimente wurde entionisiertes (DI) Wasser verwendet. Alle in dieser Studie verwendeten Chemikalien und Reagenzien waren von analytischer Qualität.

Das C. reinhardtii Algenkultur (Stamm CPCC11) wurde vom Canadian Phycological Culture Center (CPCC, Department of Biology, University of Waterloo, Kanada) bezogen.

GK-Verarbeitung

GK-Pulver (1 g) wurde in ein Becherglas mit 1 L entionisiertem Wasser gegeben und über Nacht auf einem Magnetrührer vorsichtig gerührt. Die Gummilösung wurde anschließend 18 h bei Raumtemperatur (20 °C) belassen, um alle ungelösten Stoffe abzutrennen. Die Gummilösung wurde dann durch einen Sinterglastrichter (10–16 μm Porengröße) filtriert und die klare Lösung lyophilisiert und bis zum Gebrauch gelagert.

Synthese von Metall- und Metalloxid-NPs mit GK

Kurz gesagt, 100 μl-Aliquots von 10 mM AgNO₃ , HAuCl₄ , H₂ PtCl₆ und K₂ PdCl₄ Lösungen wurden zu 10 ml wässriger GK-Lösung in separaten 50 ml-Erlenmeyerkolben gegeben. Der pH-Wert der kolloidalen Dispersion wurde durch Zugabe von 0,1 N HCl oder 0,1 N NaOH eingestellt, um eine maximale Ausbeute an NP-Bildung zu erreichen. Um die Ag-, Au-, Pt- und Pd-NPs zu synthetisieren, wurde das AgNO₃ , HAuCl₄ , H₂ PtCl₆ , und K₂ PdCl₄ und GK-Mischungen wurden in einem Innova 43 Orbitalschüttler (New Brunswick Scientific, USA) bei 250 U/min bei Temperaturen im Bereich von 45 bis 95 °C für 1 h gerührt. Die Lösungen wurden hellgelb, weinrot, intensiv schwarz bzw. gedämpft schwarz, was auf die Bildung von Ag-, Au-, Pt- und Pd-NPs hinweist. Im Fall von Pt traten Reduktion und NP-Bildung bei einem pH-Wert von 8,0 und einer Temperatur von 90 °C auf, während Pd-NPs bei pH 8,5 und 95 °C gebildet wurden. Siehe mehr bei Padil et al. [66, 67].

CuO-NPs wurden mithilfe eines kolloidalen thermischen Syntheseverfahrens synthetisiert [13]. Kurz gesagt, 100 μl-Aliquote einer 10 mM-Lösung von Kupferchlorid-Dihydrat (CuCl₂ ·2H₂ O) wurde mit 10 ml der GK-Lösung (100 mg dispergiert in 10 ml entionisiertem Wasser) und NaOH in separaten 50 ml-Erlenmeyerkolben mit CuCl₂ . gemischt ·2H₂ O und NaOH in einem Molverhältnis von 2:5 gehalten. Die Mischung mit CuCl₂ ·2H₂ O und GK wurden bei 250 U/min bei einer Temperatur von 75 °C für 1 h in einem Orbitalschüttler geschüttelt. Die Farbe der Mischung änderte sich allmählich von bläulich nach schwarz, was auf die Bildung von CuO-NPs hindeutet. Der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugation gewonnen und zuerst mit Ethanol und dann mit DI-Wasser gewaschen.

Charakterisierung von grünsynthetisierten NPs

Die Metallkonzentration in den frisch synthetisierten NPs wurde mit induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS, OPTIMA 2100 DV, Perkin Elmer) gemessen.

Die Bildung und Stabilität der Metall-NPs wurde mit einem Cintra 202 UV-Vis-Spektrophotometer (GBC, Australien) bewertet, wobei die NP-Stabilität nach 6 Monaten bestimmt wurde.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Bilder der Ag-, Au-, Pt-, Pd- und CuO-NPs wurden mit einem Tecnai F 12-Mikroskop (FEI, Thermo Fisher Scientific, Oregon, USA) aufgenommen, das bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV betrieben wurde. Die Proben wurden für die TEM-Analyse vorbereitet, indem 10–20 μL der GK-anorganischen NP-Dispersion auf ein Kupfergitter getropft und bei Raumtemperatur getrocknet wurden, nachdem überschüssige Lösung entfernt wurde.

Algenkulturbedingungen

Chlamydomonas reinhardtii wurde in TAPx4-Medium (zusätzliche Datei 1:Tabelle S1, unterstützende Informationen) bei 20 °C in einem Inkubator (Infors, Schweiz) kultiviert, der mit einem Schüttler ausgestattet war, der sich kontinuierlich mit 100 U/min drehte, und einem Beleuchtungsregime von 114,2 μmol phot m ^{− 2} s ⁻¹ . Die Algenzellen wurden mit einer exponentiellen Rate gezüchtet, um ungefähr 10 ⁶ . zu erhalten Zellen/ml.

Charakterisierung von NPs in Algen-Expositionsmedium

NP-Größenverteilung im C. reinhardtii Das TAPx4-Medium wurde unter Verwendung der Differentialzentrifugal-Sedimentationstechnik (DCS) auf einer DC24000UHR-Scheibenzentrifuge (CPS Instruments Inc., USA) gemessen. Die Messungen wurden bei einer Rotationsgeschwindigkeit der Scheibe von 24.000 U/min durchgeführt und die Partikelsedimentation wurde mit 8–24 % (w /w ) Saccharosedichtegradient. Vor jeder Probenmessung wurde das Instrument mit PVC-Nanosphärenstandards (470 nm) kalibriert. Die NPs wurden auch durch elektrophoretische Mobilität charakterisiert, und die Smoluchowski-Approximation wurde verwendet, um das Zeta-Potential (ZP) auf einem Zetasizer ZS (Malvern Instruments Ltd., UK) zu bestimmen. Jede Messung wurde über 10 Läufe mit Autokorrelationsfunktionen von 10 s durchgeführt, wobei jedes Ergebnis aus Dreifachmessungen derselben Probe gewonnen wurde.

Die Ultrafiltrationsmethode wurde verwendet, um die Menge an Ionenmetall in den Algenmedien zu bestimmen (Cheloni et al. [47]; Ma et al. [68]). Aliquots, die in verschiedenen Zeitintervallen (2 und 24 h) gezogen wurden, wurden 30 Minuten bei 7500 U/min zentrifugiert, um die Partikel und Aggregate zu trennen. Der Überstand wurde dann durch Amicon Ultracel 3K Ultrafiltrationsfilter mit einem 3 kDa Molekulargewichtsgrenzwert (Millipore, USA) filtriert, um Ionen von den Partikeln zu trennen. NPs und Aggregate mit einem Durchmesser von mehr als 1,3 nm wurden auf dem Filter zurückgehalten und das Filtrat wurde durch ICP-MS auf gelöste Ionen analysiert [68].

Die abiotische ROS-Erzeugung mit steigender Konzentration von NPs in Algenmedium wurde unter Verwendung von fluoreszierendem Dichlordihydroflouresceindiacetat (H₂ DCF-DA, Sigma-Aldrich, Schweiz), wie in früheren Studien beschrieben [47, 69].

Auswirkung von NPs auf Algenwachstum, Membranintegrität und Erzeugung von oxidativem Stress

Die Wirkung der Metall- und Metalloxid-NPs auf das Algenwachstum, die Membranintegrität und die Erzeugung von oxidativem Stress wurde mittels Durchflusszytometrie (FCM; BD Accuri C6 Flow Cytometer, BD Biosciences, USA) getestet. Das Experiment wurde in transparenten Fläschchen (PS, 50 ml, Semadeni, Schweiz) mit 5 ml Algensuspension und NPs in Konzentrationen von 1, 5, 10 und 20 mg/l durchgeführt. Kontrollproben ohne NPs wurden parallel laufen gelassen. Algenzellen wurden in kochendem Wasser (100 °C) 15 min lang erhitzt, um eine positive Kontrolle für beschädigte Zellmembranen bereitzustellen. Algenzellen wurden auch mit Kreuzkümmel (Sigma-Aldrich, USA), einem Wirkstoff einer oxidativen Spezies, 30 Minuten lang im Dunkeln als positive Kontrolle von oxidativem Stress (ROS) behandelt. Alle unbehandelten Proben und mit NPs behandelten Proben wurden unter ähnlichen Bedingungen inkubiert, wie sie für die Kulturerhaltung verwendet wurden. Nach 1, 3, 5 und 24 h wurden Teilproben entnommen, um die Wirkung von NPs auf die Integrität der Zellmembran und den oxidativen Stress mithilfe von FCM zu bewerten. Ein 250-μl-Aliquot jeder Probe wurde auf eine Microtiter® 96-Well-Flachbodenplatte übertragen. Um die Integrität der Zellmembran zu beurteilen, wurden der Probe Propidiumiodid (PI)-Fluoreszenzsonden (P4170, Sigma-Aldrich, USA) in einer Endkonzentration von 7 μM zugesetzt. Zum Nachweis von oxidativem Stress wurde den Proben CellROX® Green Reagent (ROS) (C10444, Life Technologies, USA) gemäß der Produktanleitung zugesetzt. Kurz gesagt, PI bindet an DNA und bindet an RNA nach intrazellulärer Penetration durch beeinträchtigte Zellmembranen, wird jedoch von gesunden Zellen ausgeschlossen. CellROX® Green Reagent ist eine Sonde zur Messung von oxidativem Stress in lebenden Zellen. Der zelldurchlässige Farbstoff ist in reduziertem Zustand schwach fluoreszierend, zeigt jedoch nach Oxidation durch ROS und anschließender Bindung an DNA eine hellgrüne photostabile Fluoreszenz. Daher ist sein Signal hauptsächlich auf dem Zellkern und den Mitochondrien lokalisiert. Die Platten wurden vor der FCM-Messung 20 min (PI) und 30 min (ROS) im Dunkeln inkubiert. Die Algensuspensionen wurden dann mit einem blauen 488-nm-Anregungslaser durch das FCM geleitet. CellROX Green wurde im FL1-Kanal 533/30 nm gemessen, die PI-Rot-Fluoreszenz im FL2-Kanal 585/40 nm und die rote Autofluoreszenz von Chlorophyll a (Chla ) im FL3-Kanal> 670 nm. Das Experiment wurde doppelt durchgeführt und wiederholt.

FCM-Daten wurden unter Verwendung der CFlow Plus-Software (BD Biosciences, USA) analysiert. Die Proben wurden auf der Grundlage der Vorwärtsstreuungseigenschaften und der roten Autofluoreszenz von Chla . getriggert , um Signale von NPs, Trümmern und anderen Verunreinigungen zu eliminieren. Die Anzahl der Zellen, der Prozentsatz beschädigter Zellmembranen oder oxidativ gestresster Zellen und Autofluoreszenzdaten wurden basierend auf der Autofluoreszenz von Chla . ermittelt (670 nm), PI-markierte Zellen (585 nm) und ROS Green (533 nm) (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1).

Effizienz des Algen-Photosystems II

Metall- und Metalloxid-NP-Suspensionen wurden derselben Algenkultur (ca. 10 ⁶ Zellen/ml) in 15-ml-Glaskolben, um Endkonzentrationen von 1, 5, 10 und 20 mg/l zu erreichen. Als Negativkontrollen wurden Algenkulturen ohne NPs hergestellt. Alle Proben wurden dann unter den gleichen Bedingungen wie für die ursprünglichen Algenkulturen in einen Inkubator überführt. Aliquots (2,2 ml) jeder Probe wurden sofort und nach 1, 3, 5 und 24 h Inkubation entnommen, um die Quantenausbeute (QY) des Photosystems II mit einem AquaPen-C AP-C 100-Fluorometer (PSI Ltd., Tschechien) zu bestimmen Republik). Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt. QY steht für das Verhältnis der variablen Fluoreszenz (F _v = F _m − F ₀ ) bis zur maximalen Fluoreszenz (F _m ), mit QY = F _v :F _m als Proxy für die photochemische Löscheffizienz verwendet [70]. F _m wurde durch Anwenden einer Beleuchtung bei 680 nm für einige Sekunden vor und am Ende der Beleuchtung mit minimaler Fluoreszenz (F ₀ ) ist die anfängliche Messung bei minimaler Fluoreszenz in Abwesenheit von photosynthetischem Licht.

Statistische Analyse

Die Wirkung von Metall- und Metalloxid-NPs auf C. reinhardtii wurden unter Verwendung der Varianzanalyse ANOVA und des Dunnett-Tests (GraphPad PRISM, USA) getestet. Die Signifikanzstufen wurden auf *P . festgelegt < 0,05, **P < 0.01 und ***P <0,001.

Ergebnisse

Bildung und primäre Charakterisierung von NPs

TEM-Bilder von mit GK synthetisierten Ag-, Au-, Pt-, Pd- und CuO-NPs zeigen gut getrennte, kugelförmige NPs mit Durchmessern von 2 bis 100 nm (Abb. 1a–e). Wässrige kolloidale NP-Lösungen, die unter UV-Vis-Spektroskopie untersucht wurden (Abb. 1f), zeigten eine ausgeprägte Oberflächenplasmonenresonanz bei 412 und 525 nm, was mit der Bildung von Au- und Ag-NPs innerhalb des GK-Netzwerks übereinstimmt. Für Pt-, Pd- oder CuO-NPs wurden keine ausgeprägten Oberflächenplasmonenresonanzen beobachtet. UV-Vis-Messungen nach 6 Monaten bestätigten die Stabilität aller NPs. Die Spektren zeigten einen einzelnen Peak mit einer ähnlichen durchschnittlichen Größe wie die frisch synthetisierten NPs (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2).

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von a Au, b Pt, c Ag, d Pd und e CuO-Nanopartikel synthetisiert unter Verwendung von Gummi Karaya und ihren entsprechenden Metallsalzen. a , b , c , d und e Diagrammeinsätze zeigen die Spitzenpartikelgrößenverteilung nach Nanopartikelgewicht in Algenmedien, wie durch differentielle Zentrifugalsedimentation bestimmt. (F) UV-Vis-Spektren der Au-, Ag-, Pt-, Pd- und CuO-Nanopartikel

Charakterisierung von NPs in Algen-Expositionsmedium

Die Größe der NPs lag, basierend auf der Gewichtsverteilung, im Bereich von 180 bis 5 nm wie folgt:CuO> Au> Pt> Ag> Pd. Alle NPs waren bei pH 7 negativ geladen (Tabelle 1 und zusätzliche Datei 1:Abbildung S3). Pt-, Ag- und CuO-NPs hatten die höchsten ionischen Metallkonzentrationen (33–36 μg/l) und Au- und Pt-NPs die niedrigsten (6–7 μg/l) (Tabelle 1). Die ionischen Formen von Metallen wurden in Algenmedium nachgewiesen (Tabelle 1).

Auswirkung auf das Algenwachstum

Nicht betroffen C. reinhardtii Kultur hatte eine Wachstumsrate von 1 × 10 ⁶ Zellen/Std. In Gegenwart von 1 mg/l Ag-, Pd- und CuO-NPs sank die Wachstumsrate stark auf 2,2 × 10 ⁴ , 1,7 × 10 ⁴ und 0,2 × 10 ⁴ Zellen/h bzw. (P < 0,001). Als die NP-Konzentration weiter anstieg, wurde das Algenwachstum vollständig gehemmt (Abb. 2). Wenn Algen Au- und Pt-NPs ausgesetzt wurden, war die Wachstumsrate im Vergleich zur Kontrolle ebenfalls signifikant reduziert (P < 0,001), aber steigende Konzentrationen erhöhten die Wirkung nicht.

Wachstumsrate von Chlamydomonas reinhardtii ausgesetzt Au-, Pt-, Pd-, Ag- und CuO-Metall- und Metalloxid-Nanopartikeln (1, 5, 10 und 20 mg/l). Die Wachstumsrate für die nicht exponierte Kontrolle (Algenkultur) betrug 1 × 10 ⁶ Zellen/h nach 24 h. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von wiederholten Experimenten mit doppelten Proben dar

Erzeugung von oxidativem Stress in Zellen

Oxidativer Stress variierte je nach NP-Typ (Abb. 3). Die höchste Wirkung mit fast 100 % der betroffenen Zellen wurde durch 5–20 mg/l Ag- und CuO-NP verursacht (Abb. 3d, e und zusätzliche Datei 1:Tabelle S2). Wenn Algenzellen Au-NPs ausgesetzt waren, war der oxidative Stress viel geringer, wobei meist < 10% der Zellen betroffen waren . Die höchsten Konzentrationen von Au-NPs (20 mg/l) betrafen nur 15 % der Zellen (P < 0,001). Der Prozentsatz der gestressten Zellen nahm im Laufe der Zeit allmählich ab, wobei nach 24 h für alle getesteten Au-Konzentrationen kein oxidativer Stress nachgewiesen wurde (Abb. 3a). Pt-NP verursachten während der ersten 5 Stunden der Exposition bei weniger als 8 % der Algenzellen oxidativen Stress (Abb. 3b). Erst bei Konzentrationen von 10 bzw. 20 mg/l wurde Stress in 10 bzw. 19 % der Zellen nach 24 h erzeugt (P < 0,001; Zusätzliche Datei 1:Tabelle S2), bei niedrigeren Konzentrationen (P .) wurde kein Stress festgestellt> 0,1) nach 24 h Exposition (Abb. 3b). Die Exposition gegenüber 1 mg/l Ag-NP führte über einen Zeitraum von 24 Stunden nicht zu oxidativem Stress in Algenzellen (P> 0.9). Eine Exposition gegenüber 5 mg/l führte jedoch nach 5 h zu oxidativem Stress, und eine Exposition gegenüber 10 und 20 mg/l führte nach 3 h zu oxidativem Stress. Nach 24 Stunden Exposition gegenüber Ag-NPs waren 100 % der Zellen gestresst (P < 0,001; Abb. 3c und Zusatzdatei 1:Tabelle S2). CuO-NPs induzierten signifikante (P < 0,001) oxidativer Stress in Algenzellen schneller (3 h) als die anderen Metall-NPs, die bei 10 und 20 mg/l getestet wurden (zusätzliche Datei 1:Tabelle S2), außer bei Ag-NPs. Oxidativer Stress war bereits nach 5 h bei 5 mg/l signifikant. Alle Konzentrationen (> 5 mg/l) hatten einen signifikanten Einfluss auf den oxidativen Stress der Zellen (Abb. 3d, e). Als ergänzenden Parameter haben wir auch die von den NPs erzeugten abiotischen ROS bestimmt. Im Gegensatz zu C. reinhardtii Wachstumsrate und Prozentsatz von C. reinhardtii Zellen mit oxidativem Stress erzeugten Au-NPs nur einen leichten Anstieg der abiotischen ROS (P>   0,05; Zusätzliche Datei 1:Abbildung S4).

Prozentsatz von Chlamydomonas reinhardtii Zellen, die oxidativen Stress aufweisen, nachdem sie steigenden Konzentrationen (1, 5, 10 und 20 mg/l) von a . ausgesetzt waren Au, b Pt, c Pd, d Ag und e CuO-Nanopartikel nach 1, 3, 5 und 24 h. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von wiederholten Experimenten mit doppelten Proben dar. Beachte andere y -Achsenskalen für Au und Pt

Auswirkung auf die Integrität der Algenmembran

Au- und Pt-NPs verursachten signifikante (P < 0,001) Zellmembranschädigung bei allen Konzentrationen von 1 bis 5 h (Zusatzdatei 1:Tabelle S3); jedoch kein signifikanter Effekt (P> 0,05) wurde nach 24 h beobachtet (Abb. 4a, b). Bei Ag-NPs waren 100 % der Zellen geschädigt (P < 0,001) nach 1 h Exposition gegenüber 1–20 mg/L (Abb. 4c, Zusatzdatei 1:Tabelle S3, Ag). Der Prozentsatz der Zellmembranen, die nach Exposition mit 1 und 5 mg/l Pd-NPs geschädigt wurden (zusätzliche Datei 1:Tabelle S3, Pd) war vergleichbar mit dem für die Kontrolle über 24 h (P> 0,4). Andererseits ist ein erheblicher Schaden (P < 0,001) wurde nach 24 Stunden Exposition gegenüber 20 mg/l Pd-NP beobachtet (Abb. 4d). Die Wirkung von CuO nahm mit zunehmender Konzentration und Zeit zu und erreichte ihre größte Wirkung nach 24 h (Abb. 4e und zusätzliche Datei 1:Tabelle S3).

Prozentsatz von Chlamydomonas reinhardtii Zellen mit beschädigten Membranen nach Exposition gegenüber steigenden Konzentrationen (1, 5, 10 und 20 mg/l) von a Au, b Pt, c Pd, d Ag und e CuO-Nanopartikel nach 1, 3, 5 und 24 h. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von wiederholten Experimenten mit doppelten Proben dar. Beachte andere y -Achsenskalen für Au und Pt

Wirkung auf Chlorophyll (Chl ) Fluoreszenz

Chl Fluoreszenz wurde nicht signifikant beeinflusst (P> 0,1) von Au-NPs bei jeder Konzentration über den 24-Stunden-Zeitraum und von Pt über den 5-Stunden-Zeitraum (Abb. 5a, b und zusätzliche Datei 1:Tabelle S4). Andererseits werden Ag-, Pd- und CuO-NPs stark inhibiert (P <0,001) Chl Fluoreszenz mit zunehmender Konzentration und Einwirkzeit, z.B. Chl Fluoreszenz wurde von 98 % (1 h) auf 22 % (24 h) reduziert (P < 0,001), wenn Algenzellen in Gegenwart von 5 mg/l Ag gezüchtet wurden (zusätzliche Datei 1:Tabelle S4). Eine ähnliche Verringerung der Fluoreszenz wurde auch für 10 und 20 mg/l Ag beobachtet, wobei die Spiegel auf 20 % und 9 % (P < 0,001) bzw. (Abb. 5c). CuO- und Pd-NP (beide 20 mg/l) verursachten einen starken Rückgang von Chl Fluoreszenz nach 24 h (P < 0,001). Es gab keinen beobachtbaren Effekt (P> 0,1, jedoch für 1 oder 5 mg/L Pd und für 1 mg/L Ag- und CuO-NPs (Abb. 5c–e).

Prozentsatz von Chlamydomonas reinhardtii Zellen mit Chlorophyll (Chl ) Fluoreszenz nach Exposition gegenüber steigenden Konzentrationen (1, 5, 10 und 20 mg/l) von a Au, b Pt, c Pd, d Ag und e CuO-Nanopartikel nach 1, 3, 5 und 24 h. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von wiederholten Experimenten mit doppelten Proben dar

Auswirkung von NPs auf das Algen-Photosystem II

Au-, Pt- und CuO-NPs hatten einen leichten signifikanten Effekt (P <0,05) auf Photosystem II QY zu einigen Zeitpunkten über den 24-Stunden-Zeitraum bei Konzentrationen im Bereich von 1 bis 20 mg/l (Abb. 6 und Zusatzdatei 1:Tabelle S5). Andererseits wurde QY signifikant reduziert (P < 0,001) nach nur 1 h nach Kontakt mit Ag-NPs bei allen Konzentrationen (Abb. 6c und zusätzliche Datei 1:Tabelle S5). Pd- und CuO-NPs führten zu einer signifikanten Verringerung des QY bei der höchsten Konzentration von 20 mg/l (Abb. 6d, e und zusätzliche Datei 1:Tabelle S5).

Wirkung von a Au, b Pt, c Pd, d Ag und e CuO-Nanopartikel (1, 5, 10 und 20 mg/L) auf die Effizienz des Photosystems II (QY %) nach 1, 3, 5 und 24 h. Hundertprozentig auf dem y -Achse repräsentiert den QY der Kontrollalgenkultur ohne Nanopartikel. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von wiederholten Experimenten von duplizierten Proben dar

Diskussion

In der vorliegenden Arbeit zielten wir darauf ab, die Eliminierung der Produktion von giftigen Abfällen bei der Synthese von Metall- und Metalloxid-Nanomaterialien durch die Umsetzung des Ansatzes der grünen Chemie [16, 57, 58] zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf der Verwendung umweltfreundlicher Dispergiermittel und nachwachsende und biologisch abbaubare Materialien. Wir haben GK, ein natürliches, erneuerbares und biologisch abbaubares Material, erfolgreich zur Synthese und Stabilisierung einer Reihe von Nanopartikeln eingesetzt. Bei Verwendung von DI-Wasser als Lösungsmittel fungierten die in GK vorhandenen funktionellen Gruppen (dh –OH und –COO–) als Reduktionsmittel und das GK-Polymer selbst fungierte als Verkappungsmittel für die gebildeten NPs, wodurch eine grüne Synthese von NPs ermöglicht wurde [59, 68]. Die in unserer Studie synthetisierten NPs (Au, Pt, Pd, Ag und CuO) waren in Bezug auf Größe, Stabilität und Kosteneffizienz mit anderen grün synthetisierten NPs aus früheren Studien vergleichbar [13, 69].

Anschließend verwendeten wir eine Reihe von nanoskaligen Konzentrationen (1–20 mg/l) in Bezug auf erwartete oder aufgezeichnete Umweltkonzentrationen [39, 71, 72, 73], um die biologische Wirkung der NPs auf C zu bewerten. reinhardtii unter Verwendung von Endpunkten wie Algenwachstum, Membranintegrität, Chl Effizienz des Fluoreszenz-Photosystems II und oxidativer Stress. Unsere Ergebnisse zeigten zwei unterschiedliche Gruppierungen:Au- und Pt-NPs haben wenig oder keine Wirkung auf die Alge, und Ag-, Pd- und CuO-NPs zeigen eine starke Wirkung auf fast alle Endpunkte (zusätzliche Datei 1:Tabelle S6). Toxizitätsstudien von Metall- oder Metalloxid-NPs haben mehrere wichtige physikalisch-chemische Eigenschaften von NPs identifiziert, die mit ihrer Toxizität in Verbindung gebracht werden können, einschließlich Zusammensetzung, Beschichtung, Größe, Form und Homo- oder Heteroaggregation [69, 74, 75, 76, 77, 78]. Darüber hinaus wurde die Toxizität von gelösten Metallen (ionische Form) bereits an Algen anhand einer Reihe von Kriterien nachgewiesen, darunter intrazelluläre ROS-Erzeugung, Chl Depletion und Photosynthesehemmung [79,80,81]. Wir haben eindeutig die ROS-Erzeugung und eine Auswirkung auf das Wachstum festgestellt, Chl Produktion und Photosystem II nach Exposition mit Ag-, Pd- und CuO-NPs.

Obwohl Pd-NPs normalerweise als toxische Gruppe angesehen wurden, wurden sie nicht umfassend untersucht und erst vor kurzem als wichtige antibakterielle NPs erkannt [41]. Es wird allgemein angenommen, dass die geringe Größe (1,5–3 nm) von Pd-NPs zu ihren antibakteriellen Eigenschaften beiträgt und möglicherweise den Transport zu Zellen durch Bakterien- oder Algenzellwandporen mit Durchmessern von 5 bis 20 nm erleichtert [82, 83] . In our study, Pd NPs of 1.5 nm mean size could directly enter algal cell walls and cause damage when releasing ions in the cell membrane and chloroplasts (Chl fluorescence, PS II, ROS). There is clear evidence that soluble Pd salt was able to enter P. subcapitata cells, where Pd precipitates were mostly formed in chloroplasts [78] which could increase generation of ROS and thus oxidative stress. It was also reported that Pd NPs (127 nm z -average hydrodynamic size) were less toxic toward P. subcapitata than soluble Pd salt [69] maybe due to larger size of NPs that could not directly enter the cells, while Pd salt could. On the other hand, Pd NPs could form hetero-aggregates with algal cells leading to physical entrapment. Surprisingly, the entrapment is not inevitably lethal because the cells could recover their growth after transfer to clean medium [69].

Numerous studies have shown that Ag NPs toxicity to algae was mainly driven by Ag ions dissolved in the exposure medium rather than Ag NPs and also depended on Ag NPs coatings and sizes [80, 84,85,86,87,88,89]. Our study revealed high toxicity of Ag NPs thus suitable for algicidal applications. The ionic Ag and/or Ag NPs (5 nm) could directly enter algal cells [90], causing damage to the cell membranes and other cellular compartments by ROS formation. Moreover, Ag NPs could damage algal cells by direct interaction between NPs and algal cells [72] or the type of NPs coating could play a significant role. For example, dexpanthenol, polyethylene glycol and polyvinyl polypyrrolidone coatings caused a similar effect as AgNO₃ on C. reinhardtii , while carbonate, chitosan, and citrate decreased the Ag effect on photosynthesis [87]. Our Ag NPs showed strong effect toward C. reinhardtii regardless GK coating.

The ecotoxicity of CuO NPs has been extensively studied [36, 47,48,49, 69, 91]. We observed CuO NPs harming cell membranes right after 1 h, while the ROS elevated after 3 h at concentrations higher than 5 mg/L and also Chl fluorescence substantially decreased over 24 h. It is possible that the CuO NPs (or ionic Cu)-damaged membranes could increase further uptake of Cu and oxidative stress in the C. reinhardtii cells [91] where observed hetero-aggregation of NPs and the cells (data not shown) could even enhance this interaction. von Moos et al. [36] stated that free Cu ²⁺ or the NPs themselves were the main mediators of toxicity toward C. reinhardtii , while Cheloni et al. [47] believed ion Cu at lower CuO NPs concentrations was the driving force, being unable to clarify the contribution of dissolved Cu in CuO NPs . This was probably elucidated by other study revealed much stronger effect of soluble ionic Cu and soluble fraction of CuO NPs on P. subcapitata than bare CuO NPs [69].

Au NPs slightly increased membrane impairment and oxidative stress after 3 and 5 h, but these effects disappeared after 24 h. Interestingly, abiotic ROS were constantly generated during whole 24 h study contrary to all other NPs. We assume that stable conditions allowed the cells to cope with such small level of stress. Previous study has reported a range of EC50 values for dissolved Au on C. reinhardtii of between 5.9 and 1.7 mg/L, depending on exposure time [92]. In our opinion, almost any Au NP toxicity would not have been exacerbated or affected by the degree of ion Au and would have had nearly no bearing on any of the criteria adopted for our experiments. Moreover, Au NPs seemed to be well dispersed in exposure media and we did not observe any aggregates or direct interactions with the C. reinhardtii cells (data not shown).

We found that Pt NPs caused slight Chl and a growth rate decrease after 24 h for all concentrations. These not so pronounced effects could be caused by both ionic Pt and Pt NPs. Up to now, there has been only limited knowledge about the toxicity of Pt NPs on algae. For example, Pt NPs decreased growth rate, and Chl fluorescence and oxidative stress on P. subcapitata and C. reinhardtii [39, 40]. The latter authors also suggested that the toxicity of Pt NPs might be only partly attributed to dissolved form of Pt in the case of P. subcapitata and that also the shading effect might influence toxicity [40]. In our study, we did not find such evidence.

Conclusions

Green-synthesised metal and metal oxide NPs were produced at nanoscale sizes of 42 nm (Au), 12 nm (Pt), 1.5 nm (Pd), 5 nm (Ag) and 180 nm (CuO):all with a negative charge. GK, a natural hydrocolloid, was successfully applied as a safe, cost-effective stabiliser and showed no aggregation (all NPs) after 6 months at + 4 °C. The biological effect (algal growth, membrane integrity, oxidative stress, Chl fluorescence and photosystem II efficiency) of these NPs was investigated on green alga C. reinhardtii . All NPs had a significant effect on algal growth rate; however, Au and Pt NPs inhibited algal growth far less than the other NPs (Pd, Ag and CuO). In terms of other biological effects, Pd, Ag and CuO NPs caused significant cell membrane damage, highly affected Chl fluorescence and caused oxidative stress. Ag and Pd NPs mostly inhibited photosystem II, while it was not much affected by CuO (only the highest concentration of 20 mg/L significantly decreased QY) and Au or Pt. Generally, metal and metal oxide NPs were successfully synthesised following green chemistry rules, without harmful side-products and showing high stability. Some could find reasonable application in algicides (Ag and CuO) or antimicrobial surfaces (Pd, Ag and CuO), while Au and Pt proved to be almost non-toxic to green alga C. reinhardtii .