Antioxidatives Potenzial von Artemisia capillaris-, Portulaca oleracea- und Prunella vulgaris-Extrakten für die Biofabrikation von Goldnanopartikeln und die Zytotoxizitätsbewertung

Einführung

Das Interesse an metallischen Nanopartikeln hat aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums stark zugenommen [1]. Insbesondere Goldnanopartikel (AuNPs) haben eine Vielzahl wertvoller Anwendungen als Vehikel zur Wirkstoff-/Genabgabe, als Katalysatoren, Bildgebungsmittel und chemisch/biologische Sensoren [2]. Zur Herstellung von AuNPs stehen eine Vielzahl chemischer und physikalischer Methoden wie Ionensputtern, reverse Micellen und chemische Reduktion zur Verfügung. Diese Verfahren sind jedoch durch Bedenken hinsichtlich ihrer Kosten und potentiellen Toxizität eingeschränkt. Die Verwendung von Pflanzenextrakten bei der Biofabrikation (oder grünen Synthese) von AuNPs hat Vorteile gegenüber den anderen Methoden, was sie zu einer äußerst vielversprechenden Alternative macht [2]. Der Biofabrikationsprozess ist kostengünstig und einfach skalierbar. Es verwendet umweltfreundliche Materialien und weist synergistische Aktivitäten auf, indem es die Aktivitäten zweier Materialien (AuNPs und Pflanzenextrakte) kombiniert. Biofabrikation führt während der Synthese keine schädlichen chemischen Reduktionsmittel ein, was den Prozess vollständig grün macht. Darüber hinaus erhöht diese Eigenschaft die Biokompatibilität der resultierenden AuNPs und erhöht deren Stabilität. Verschiedene sekundäre Pflanzenstoffe aus Pflanzenextrakten werden nicht nur als Reduktionsmittel, sondern auch als Verkappungs- und Stabilisierungsmittel eingesetzt [3].

Artemisia capillaris gehört zur Gattung Artemisia , die eine der größten Gattungen der Familie der Asteraceae ist [4]. Seit der Antike hat A. capillaris wurde aufgrund seiner verschiedenen pharmakologischen Wirkungen, zu denen antibakterielle, entzündungshemmende, antioxidative und hepatoprotektive Wirkungen gehören, häufig als pflanzliches Arzneimittel verwendet. Frühere Studien führten diese Wirkungen den aktiven Bestandteilen von A zu. capillaris , einschließlich Capillin, Capillene, Scoparon und β-Sitosterol [4,5,6]. Portulaca oleracea , eine einjährige Sukkulente aus der Familie der Portulacaceae, zeigt verschiedene pharmakologische Wirkungen, wie antibakterielle, antimykotische, entzündungshemmende, antioxidative und antiulzerogene Wirkungen. Es wurde gezeigt, dass diese Wirkungen auf verschiedene Wirkstoffe zurückzuführen sind, darunter Alkaloide, Fettsäuren, Flavonoide, Polysaccharide und Terpenoide [7, 8]. Prunella vulgaris ist eine mehrjährige krautige Pflanze aus der Familie der Lippenblütler. Eine Reihe von Studien haben die antivirale [9], krebsbekämpfende [10], immunmodulatorische [11], antioxidative [11, 12] und hypoglykämische Wirkung [13] von P. vulgaris . Die wichtigsten aktiven Komponenten, die zu diesen Effekten beitragen, sind organische Säuren, Phenolsäuren und Triterpenoide, einschließlich Linolensäure, Palmitinsäure, cis- und trans- Kaffeesäuren, Rosmarinsäure, Oleanolsäure und Ursolsäure [14].

Aufgrund der „Proteinkorona“ besteht in der Nanopartikelforschung oft eine große Lücke zwischen in vitro- und in vivo-Ergebnissen. Beim Eintritt in eine biologische Umgebung wird die Oberfläche von Nanopartikeln mit einer Beschichtung aus verschiedenen Proteinen bedeckt, die als Proteinkorona bezeichnet wird [15]. Die mit Proteinkorona beschichteten Nanopartikel dringen in die Zelle ein und beeinflussen die zelluläre Aufnahme, Zytotoxizität, Bioverteilung, Ausscheidung, Zellantwort, Wirkstofffreisetzung und therapeutische Effizienz [16]. Interessanterweise beeinflussen die physikalisch-chemischen Eigenschaften metallischer Nanopartikel, wie ihre Form, Größe, Oberflächenladung und Oberflächenrauheit, die Serumproteinadsorption bei der Bildung der Proteinkorona stark [17]. Shannahan und Mitarbeiter berichteten, dass die Bildung einer Proteinkorona auf Silbernanopartikeln (AgNPs) die zelluläre Toxizität gegen Lungenepithelzellen der Ratte und Endothelzellen der Rattenaorta über . vermittelt Scavenger-Rezeptoren [18]. Serumalbumin beeinflusst in Hydrogel eingebettete kolloidale AgNPs, indem es ihre antibakterielle und zytotoxische Wirkung verringert [19].

Im vorliegenden Bericht haben wir die antioxidativen Aktivitäten, einschließlich der Abfangaktivität freier Radikale, des Gesamtphenolgehalts und der Reduktionskraft der wässrigen Extrakte von A bewertet. capillaris , P. oleracea , und P. vulgaris . Anschließend wurde die Biofabrikation von AuNPs unter Verwendung dieser drei Extrakte durchgeführt, um zu untersuchen, wie sich die antioxidativen Aktivitäten der Extrakte auf die Farbe der kolloidalen Lösung und die Form der Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Bande der AuNPs auswirken. Im Folgenden werden die biofabrizierten AuNPs nach dem wissenschaftlichen Namen jeder Pflanze benannt:die AuNPs, die mit dem Extrakt von A. capillaris werden als AC-AuNPs bezeichnet, die AuNPs, die mit dem Extrakt von P. oleracea werden als PO-AuNPs bezeichnet, und die AuNPs, die mit dem Extrakt von P erhalten wurden. vulgaris werden als PV-AuNPs bezeichnet. Die antioxidative Aktivität des P. vulgaris Extrakt war der höchste; Daher haben wir die PV-AuNPs durch verschiedene spektroskopische und mikroskopische Methoden charakterisiert, darunter UV-Vis-Spektrophotometrie, hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HR-TEM), hochauflösende Röntgenbeugung (HR-XRD) und induktiv gekoppeltes Plasma optische Emissionsspektroskopie (ICP-OES). Die hydrodynamische Größe der PV-AuNPs wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) zusammen mit dem Zetapotential gemessen. Darüber hinaus untersuchten wir die antioxidative Aktivität der PV-AuNPs, indem wir die 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Radikalfängeraktivität überwachten. Die Zytotoxizität gegen drei Krebszellen wurde mit einem wasserlöslichen Tetrazolium (WST)-Assay entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von fötalem Rinderserum (FBS) in Zellkultur untersucht. Die folgenden Krebszellen wurden verwendet:humanes kolorektales Adenokarzinom (HT-29), humane Brust-Adenokarzinom-Zelle (MDA-MB-231) und humane duktale Pankreas-Adenokarzinom-Zelle (PANC-1).

Methoden

Materialien

Kaliumgold(III)-chlorid (KAuCl₄ ), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), einbasiges Natriumphosphat, zweibasiges Natriumphosphat, Trichloressigsäure, Folin-Ciocalteus Phenolreagenz, Natriumcarbonat, Gallussäure, Kaliumnatriumtartrat, Natriumbicarbonat, Schwefelsäure, 2,2′-Azino-bis- 3-Ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS), Kaliumpersulfat und d-(+)-Glucose wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. DPPH wurde von Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA) bezogen. Kaliumhexacyanoferrat(III) wurde von Wako (Osaka, Japan) bezogen. Natriumsulfat, Hexa-Ammoniumheptamolybdat-Tetrahydrat und Dinatriumhydrogenarsenat-Heptahydrat wurden von Junsei (Tokyo, Japan) bezogen. Eisen(III)-chlorid wurde von Duksan (Gyeonggi, Republik Korea) bezogen und Kupfersulfat-Pentahydrat wurde von Deajeng (Gyeonggi, Republik Korea) bezogen. Die anderen Reagenzien waren von analytischer Qualität und wurden wie erhalten verwendet. Hochglucose-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco, Penicillin-Streptomycin (10.000 E/ml), Trypsin-EDTA (0,5%, ohne Phenolrot) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurden von Gibco (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). FBS wurde von GE Healthcare HyClone™ (Victoria, Australien) bezogen.

Instrumente

Ein Shimadzu UV-2600-Spektrophotometer wurde verwendet, um UV-sichtbare-Spektren aufzunehmen und SPR zu beobachten (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Informationen zur Partikelgröße und -form wurden aus HR-TEM-Bildern gewonnen. Um HR-TEM-Bilder aufzunehmen, wurde ein JEM-2100F-Instrument verwendet, das bei 200 kV betrieben wurde (JEOL, Tokio, Japan). Eine kolloidale Lösung von PV-AuNPs wurde auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter (Kohlenstofftyp-B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, USA) geladen. Das probenbeladene Gitter wurde bei Umgebungstemperatur luftgetrocknet. Ein Rigaku Miniflex Diffraktometer (40 kV, 30 mA) wurde verwendet, um das HR-XRD-Muster mit einer CuKα-Strahlungsquelle (λ = 1.54056 Å) im Bereich von 10º bis 80° (2θ Skala) (Rigaku, Japan). Ein Gefriertrockner FD5505 wurde verwendet, um pulverförmige Proben für die HR-XRD-Analyse herzustellen (Il Shin Bio, Seoul, Republik Korea). Um die Reaktionsausbeute abzuschätzen, wurde ICP-OES auf einem Perkin Elmer Optima 8300 Instrument (Waltham, MA, USA) durchgeführt. Zentrifugation wurde durchgeführt (18.500g Kraft, 7 h, 18 °C) und der Überstand wurde gesammelt. Zwei Proben, d. h. die kolloidale PV-AuNP-Lösung und der Überstand, wurden einer ICP-OES-Analyse unterzogen. Zur Zentrifugation wurde eine Eppendorf 5424R Zentrifuge verwendet (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland). Hydrodynamische Größe und Zetapotentiale wurden mit dem NanoBrook 90 Plus Zeta-Analysator (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA) gemessen.

Herstellung der wässrigen Extrakte von A. capillaris , P. oleracea , und P. vulgaris

Die getrockneten Luftteile von P. vulgaris und A. capillaris , einschließlich der Blüten und Blätter, wurden von Omniherb (Daegu, Republik Korea) bezogen und P. oleracea wurde von Handsherb (Youngchun, Republik Korea) bezogen. Wässrige Extrakte der oberirdischen Teile jeder Pflanze wurden durch Beschallung hergestellt (WUC-A22H, Daihan Scientific Co. Ltd., Republik Korea). Für jede Pflanze wurden 100 g der gehackten Pflanze dreimal mit entionisiertem Wasser (1000 ml) extrahiert. Das Extraktionsverfahren umfasste eine Beschallung der Pflanzen bei 25 °C für 3 h. Der wässrige Extrakt wurde filtriert und das Filtrat in einem Vakuumgefriertrockner (FD8518, IlShinBioBase Co. Ltd., Republik Korea) lyophilisiert. Schließlich wurde das Extraktpulver jeder Pflanze gewonnen und vor der Verwendung bei - 20 °C gelagert.

DPPH-Radikalfängeraktivität

In jeder Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte wurden 20 μl jedes Extrakts mit einer DPPH-Radikallösung in Ethanol (0,1 mM, 180 μl) gemischt, um mehrere Endkonzentrationen des Extrakts (31,25 μg/ml, 62,5 μg/ml, 125 μg/ml und 250 μg/ml). Die Platte wurde im Dunkeln für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert, und dann wurde die Extinktion jedes Wells bei 517 nm unter Verwendung eines Multidetektionslesegeräts (Synergy HT, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) gemessen. Als Standard wurde BHT verwendet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Extinktion der AuNPs wurde von der Extinktion jeder Probe abgezogen, um die intrinsische Extinktion der AuNPs bei 517 nm zu eliminieren.

ABTS-Radikalfänger-Aktivität

Das ABTS-Radikalkation wurde durch die Reaktion eines 1:1 (v/v ) Mischung aus einer 7,4 mM ABTS-Lösung und einer 2,6 mM Kaliumpersulfatlösung für 24 h im Dunkeln bei Umgebungstemperatur. Die ABTS-Radikallösung wurde für Messungen mit Ethanol auf eine Extinktion von 0,74 bei 730 nm verdünnt. In jeder Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte wurde die ABTS-Radikallösung in Ethanol (180 μl) zu 20 μl jedes Extrakts gegeben (Endkonzentrationen des Extrakts 15,63 μg/ml, 31,25 μg/ml, 62,5 μg/ml, und 125 μg/ml). Nach 10 minütiger Inkubation im Dunkeln bei Umgebungstemperatur wurde die Extinktion jedes Wells bei 730 nm unter Verwendung eines Multidetektionslesegeräts gemessen. Als Standard wurde eine Lösung von Vitamin C hergestellt. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.

Leistungsreduzierung

Gleiche Volumina (500 μL) verschiedener Konzentrationen der Extrakte wurden mit 0,2 M Phosphatpuffer (pH 6,6, 500 μL) und 1% Kaliumhexacyanoferrat(III) (500 μL) gemischt. Die Endkonzentrationen der Extrakte betrugen 52,1 μg/ml, 104,2 μg/ml, 208,3 μg/ml und 416,7 μg/ml. Jede Mischung wurde bei 50 °C inkubiert. Nach 20 Minuten wurde Trichloressigsäure (10 %, 500 μl) zum Gemisch gegeben, gefolgt von einer Zentrifugation bei 3400g 10 Minuten lang erzwingen. Dann wurde eine Eisenchloridlösung (0,1 %, 100 μl) zu 500 μl des Überstands gegeben. Nach 10 Minuten wurde die Extinktion der Reaktionsmischung bei 700 nm unter Verwendung eines Multidetektionslesegeräts gemessen. Als Standard wurde BHT verwendet. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.

Phenolgehalt insgesamt

Die Beziehung zwischen der antioxidativen Aktivität und dem Gehalt an phenolischen Verbindungen wurde untersucht. Zwanzig Mikroliter des Extrakts wurden mit 100 μl Folin-Ciocalteu-Reagenz (10-fach mit entionisiertem Wasser verdünnt) und 80 μl Natriumcarbonat (7,5%, w/v) vermischt ). Die Reaktion wurde im Dunkeln bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Nach 30 min wurde die Extinktion bei 765 nm gemessen und der Gesamtphenolgehalt wurde unter Verwendung einer mit Gallussäure erstellten Eichkurve bestimmt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt.

Biofabrikation der PO-AuNPs, AC-AuNPs und PV-AuNPs

Vor den Biofabrikationsreaktionen wurden zwei Stammlösungen hergestellt:Kaliumgold(III)-chlorid (10 mM) und der Extrakt (2%, w/v ). Die Stammlösung jedes Extrakts (2%) wurde zentrifugiert (18.500g Kraft, 30 min, 18 °C). Der Überstand wurde gesammelt und für die Biofabrikationsreaktion verwendet. Die Endkonzentrationen wurden auf 0,5 mM Kaliumgold(III)-chlorid und 0,05 % (w/v ) Extrakt in einem 2 ml-Glasfläschchen für die Biofabrikation von AuNPs. Nach dem Mischen der Au-Salze mit dem Extrakt wurde die Inkubation bei 37 °C in einem Trockenofen für 5 h durchgeführt. Dann wurden UV-sichtbare Spektren im Bereich von 300–800 nm aufgenommen.

Zellkultur

Drei Krebszellen (HT-29, PANC-1 und MDA-MB-231) wurden von der Korean Cell Line Bank (Seoul, Republik Korea) gekauft. Die Zellen wurden in DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) gezüchtet. Die Zellen wurden bei 37 °C kultiviert (5 % CO₂ . zugeführt). ) in einem Inkubator und behielt vor der Trypsinisierung eine Konfluenz von etwa 80 % bei.

Zytotoxizität

Der EZ-CYTOX-Kit von DoGenBio (Gyonggi, Republik Korea) wurde für den WST-Assay verwendet, um die Zytotoxizität gegenüber Krebszellen zu beurteilen. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 5.0 × 10 ³ . ausgesät Zellen/Well. Die Inkubation wurde 24 h lang in einem Inkubator mit 37 °C unter CO₂ . durchgeführt (5%) Atmosphäre. Nach der Inkubation wurde das Medium verworfen. Dann wurden den Zellen mit dem Kulturmedium entweder in Gegenwart oder Fehlen von FBS. Nach weiteren 24 h Inkubation bei 37 °C im Brutschrank wurde das EZ-CYTOX-Reagenz (10 μL) zugegeben und die Zellen in einem CO₂ . inkubiert Inkubator für weitere 1 h. Die Extinktion wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Cytation-Hybrid-Multimode-Readers (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) gemessen. Die intrinsische Extinktion der PV-AuNPs störte die Messung der Zytotoxizität bei 450 nm. Daher wurde die Hintergrundabsorption der PV-AuNPs von der bei 450 nm gemessenen Absorption jedes Datenpunkts abgezogen. Die Hintergrundabsorption der PV-AuNPs wurde unter WST-freien Bedingungen gemessen. Außerdem wurde anstelle der PV-AuNPs das gleiche Volumen an entionisiertem Wasser als Kontrolle verwendet.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, und die Ergebnisse sind als mittlere ± ± Standardfehler (SE) dargestellt. Die Signifikanz der Unterschiede wurde mittels ANOVA (Einweg-Varianzanalyse) und anschließendem Tukey-Multiple-Vergleichstest oder Newman-Keuls-Multiple-Vergleichstest untersucht. Statistische Analysen wurden unter Verwendung der GraphPad Software (GraphPad Software Version 5.02, San Diego, CA, USA) berechnet. Die Ergebnisse wurden für Werte von p . als statistisch signifikant angesehen < 0.05.

Ergebnisse und Diskussion

Antioxidative Wirkung der Extrakte

Wässrige Extrakte der oberirdischen Teile jeder Pflanze wurden durch Beschallung erhalten. Die Extraktionsausbeuten von A. capillaris , P. oleracea , und P. vulgaris 14,1 %, 39,12 % bzw. 28,6 %. Die höchste Extraktionsausbeute wurde in P gezeigt. oleracea , gefolgt von P. vulgaris und zuletzt von A. capillaris . Um die antioxidativen Aktivitäten der Extrakte zu bewerten, haben wir die Aktivität zum Abfangen freier Radikale, die Reduktionskraft und den Gesamtphenolgehalt gemessen. Die Radikalfängeraktivitäten der Extrakte wurden durch DPPH- und ABTS-Assays bestimmt. DPPH wird häufig verwendet, um die antioxidative Aktivität von phenolischen Verbindungen zu beurteilen, da das DPPH-Radikal ein stabiles freies Radikal ist, das seine Absorptionsintensität verliert, wenn es durch Antioxidantien reduziert wird. Der ABTS-Assay misst die Fähigkeit eines Antioxidans, die Radikale abzufangen, die durch die Reaktion eines starken Oxidationsmittels mit ABTS erzeugt werden. Bewertet wird die Verringerung der Absorption des ABTS-Radikals durch Antioxidantien mit wasserstoffspendenden Eigenschaften. Die wässrigen Extrakte zeigten dosisabhängig Abfangaktivitäten. Bei den getesteten Konzentrationen (15,63 μg/ml, 31,25 μg/ml, 62,5 μg/ml, 125 μg/ml und 250 μg/ml) wurde der Extrakt von P. vulgaris (IC₅₀ 50,35 ± 1,22 μg/ml gegen DPPH-Radikale; IC₅₀ 38,6 ± 0,44 μg/ml gegen ABTS-Radikale) zeigte die stärksten Aktivitäten gegen die DPPH- und ABTS-Radikale, gefolgt vom Extrakt von A. capillaris (IC₅₀ 156,72 ± 0,97 μg/ml gegen DPPH-Radikale; IC₅₀ 147,28 ± 2,95 μg/ml gegen ABTS-Radikal) und dann der Extrakt von P. oleracea (IC₅₀ 247,33 ± 1,57 μg/ml gegen DPPH-Radikale; IC₅₀ 305,54 ± 4,86 μg/ml gegen ABTS-Radikale). Insbesondere P. vulgaris zeigte eine stärkere DPPH-Fängeraktivität für freie Radikale als BHT (IC₅₀ 71,37 ± 0,84 μg/ml), der als Standard verwendet wurde (Tabelle 1 und Abb. 1a, b). Der Auszug von P. vulgaris zeigten die höchsten DPPH- und ABTS-Radikalfängeraktivitäten unter den drei Extrakten. Dieses Ergebnis implizierte, dass möglicherweise mehr antioxidative Verbindungen in P vorhanden wären. vulgaris als in A. capillaris und P. oleracea.

DPPH- und ABTS-Radikalfängeraktivitäten und Reduktionskraft der wässrigen Extrakte von A. capillaris , P. oleracea , und P. vulgaris . a DPPH-Radikalfängeraktivitäten. b Radikalfängeraktivitäten von ABTS. c Reduzierende Kraft der Extrakte. Die Daten werden als Mittelwert  ± SEM dargestellt. Die Sternchen zeigen die Signifikanz des Unterschieds zum Standard (BHT oder Vitamin C):*p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente

Wir haben auch die antioxidativen Aktivitäten der Extrakte via . untersucht ein Reduktionskrafttest. In Gegenwart von Antioxidantien kann Kaliumferricyanid (Fe ³⁺ ) wird in Kaliumferrocyanid (Fe ²⁺ .) umgewandelt ), das mit Eisenchlorid reagiert, um einen Eisen-Eisen-Komplex zu bilden. Der Eisen-III-Komplex hat eine maximale Absorption bei 700 nm, die verwendet werden kann, um die Reduktionskraft eines Antioxidans zu bewerten. Im aktuellen Bericht wird die Reduktionskraft als Konzentration (μg/ml) jedes Extrakts ausgedrückt, der eine Extinktion von 0,7 bei 700 nm ergab. Wie in Abb. 1c gezeigt, P. vulgaris (162,98 μg/ml) übte eine bemerkenswert höhere Reduktionskraft aus als A. capillaris (235,38 μg/ml) und P. oleracea (396,16 μg/ml). Wie bereits erwähnt, zeigten die Ergebnisse der Reduktionskraft auch, dass möglicherweise mehr antioxidative Verbindungen in P vorhanden wären. vulgaris als in A. capillaris und P. oleracea.

Der Gesamtphenolgehalt jedes Extrakts wurde ebenfalls untersucht. Es ist bekannt, dass phenolische Verbindungen potentielle Antioxidantien sind und aufgrund ihrer Hydroxylgruppen die Fähigkeit besitzen, Radikale abzufangen. Somit kann die antioxidative Aktivität eines Pflanzenextrakts gut mit seinem Phenolgehalt korrelieren. Unter Verwendung von Gallussäure wurde eine Standardkalibrierungskurve erstellt, und diese Kurve zeigte eine lineare Beziehung (y = 6.0617x + 0,1293, r ² = 0,9983). Unter Verwendung der Standardkurve wurde der Gesamtphenolgehalt berechnet und wird als Milligramm Gallussäureäquivalent (GAE) pro Gramm Extrakt ausgedrückt. Der Gesamtphenolgehalt der Extrakte betrug 90,53 ± 6,81 mg GAE/g für P. vulgaris , 39,88 ± 4,55 mg GAE/g für A. capillaris , und 18,32 ± 2,76 mg GAE/g für P. oleracea . Der Gesamtphenolgehalt war in P am höchsten. vulgaris unter den drei Auszügen.

Es bestand eine positive Korrelation zwischen dem Gesamtphenolgehalt und der Fähigkeit der Extrakte, Radikale abzufangen bzw. deren Reduktionskraft. Zusammengenommen sind die wässrigen Extrakte von A. capillaris , P. oleracea , und P. vulgaris zeigten signifikante antioxidative Aktivitäten. Insbesondere der Extrakt von P. vulgaris zeigte die größte Radikalfängeraktivität sowohl gegen DPPH- als auch ABTS-Radikale, die stärkste Reduktionskraft und den höchsten Gesamtphenolgehalt, was darauf hindeutet, dass der Extrakt von P. vulgaris würde die stärkste Aktivität als Reduktionsmittel für die Biofabrikation von AuNPs ausüben. Diese interessanten Ergebnisse der Biofabrikation von AuNPs unter Verwendung der drei Extrakte werden im folgenden Abschnitt diskutiert.

Biofabrikation von AC-AuNPs, PO-AuNPs und PV-AuNPs

Wir haben vorgeschlagen, dass die antioxidative Aktivität des Extrakts den Biofabrikationsprozess von AuNPs stark beeinflusst. Da die antioxidative Aktivität eine wesentliche treibende Kraft bei der Reduktion von Au-Salzen zu AuNPs ist, P. vulgaris , das die höchste antioxidative Aktivität aufweist, ist in der Lage, das effizienteste Reduktionsmittel zu sein. Dem Biofabrikationsprozess folgte eine UV-Vis-Spektrophotometrie, da AuNPs eine ausgeprägte SPR im sichtbaren bis nahen Infrarot-Wellenlängenbereich besitzen. Die Biofabrikation von AuNPs wurde durch Mischen von Au-Salzen mit jeder Extraktlösung durchgeführt. Jeder Extrakt enthielt verschiedene sekundäre Pflanzenstoffe, die sehr effizient für die Reduktion von Au-Salzen zu AuNPs sind.

Die ausgeprägte SPR-Bande der AuNPs führte zu Farbänderungen der anfänglich blassgelben Lösung zu dunkelblau für die PO-AuNPs, fluoreszierend braun für die AC-AuNPs und weinrot für die PV-AuNPs (Abb. 2) . UV-sichtbare Spektren wurden nach Inkubation bei 37 °C in einem Trockenofen für 5 Stunden aufgezeichnet, um die unterschiedliche SPR-Bande jedes Satzes von AuNPs zu beobachten (Abb. 3). Die maximale Absorption wurde bei 530 nm für die PV-AuNPs und bei 555 nm für die AC-AuNPs beobachtet. Im Fall der PO-AuNPs wurde eine breite SPR-Bande von 500 bis 700 nm beobachtet. Die drei Extrakte erzeugten AuNPs mit einer charakteristischen SPR-Bande in UV-sichtbaren Spektren. Jeder Farbwechsel zusammen mit der deutlichen SPR-Bande unterstützte eindeutig die erfolgreiche Biofabrikation von AuNPs mit jedem Extrakt. Wir schlugen vor, dass die drei Faktoren im Zusammenhang mit der antioxidativen Aktivität (Fängeraktivität freier Radikale, Gesamtphenolgehalt und Reduktionskraft) die Biofabrikation von AuNP beeinflussen. Der Auszug von P. vulgaris erzielte bei allen drei Faktoren die höchste Punktzahl, gefolgt von A. capillaris und zuletzt von P. oleracea . Interessanterweise wurde gezeigt, dass die PO-AuNPs nach 30 minütiger Lagerung bei Umgebungstemperatur (25 °C) aggregieren. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass die PO-AuNPs am instabilsten waren, was die antioxidative Aktivität, die Gesamtmenge der phenolischen Verbindungen und die Reduktionskraft von P betrifft. oleracea waren die niedrigsten unter diesen drei Extrakten. Im Gegensatz dazu zeigten die PV-AuNPs die höchste Absorption und eine transparente weinrote Lösung. Die Absorption der AC-AuNPs lag zwischen der der PO-AuNPs und der PV-AuNPs. Daher wurde basierend auf diesen Beobachtungen festgestellt, dass eine höhere Fängeraktivität freier Radikale, ein höherer Gesamtphenolgehalt und eine höhere Reduktionskraft des P. vulgaris Extrakt führte zur Synthese stabilerer AuNPs im Vergleich zu den AuNPs, die durch die Extrakte von A hergestellt wurden. capillaris und P. oleracea . Insgesamt zeigten die maximalen SPR-Banden bathochrome und hypochrome Verschiebungen mit abnehmender antioxidativer Aktivität des Extrakts. Darüber hinaus neigte die Form der SPR-Bande dazu, sich mit der Abnahme der antioxidativen Aktivität zu verbreitern. Dementsprechend wurden die PV-AuNPs weiter durch HR-TEM-, HR-XRD-, hydrodynamische Größen- und Zetapotentialmessungen charakterisiert. Zur Bestimmung der Reaktionsausbeute wurde eine ICP-OES-Analyse durchgeführt. Die antioxidative Aktivität und Zytotoxizität in Gegenwart/Abwesenheit von FBS wurden weiter gegen Krebszellen untersucht.

Digitalfotos von PO-AuNPs, AC-AuNPs und PV-AuNPs

UV-sichtbare Spektren von PO-AuNPs (schwarze Linie), AC-AuNPs (rote Linie) und PV-AuNPs (blaue Linie)

HR-TEM-Bilder der PV-AuNPs

Mikroskopische Techniken sind die effektivsten Werkzeuge zur Visualisierung von Nanopartikeln. Zusammen mit HR-TEM werden Rasterelektronenmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie häufig verwendet, um Größe, Morphologie, Topographie und zweidimensionale/dreidimensionale Strukturen zu bestimmen. Größe und Morphologie der PV-AuNPs wurden mit HR-TEM untersucht. Wie in Abb. 4 gezeigt, wurden verschiedene Formen beobachtet, darunter Kugeln, Dreiecke, Stäbchen, Rhomben und Sechsecke (Abb. 4a~e). Die Beobachtung von Gitterstrukturen in einem Stab (Abb. 4f, g) und einem Dreieck (Abb. 4h) zeigte deutlich, dass die PV-AuNPs kristalliner Natur waren. Dieses Ergebnis wurde durch die nachfolgenden HR-XRD-Analyseergebnisse stark unterstützt. Die Größe jeder Partikelform wurde aus den HR-TEM-Bildern gemessen und die resultierenden Größenhistogramme sind in Abb. 5 dargestellt. Alle Histogramme zeigten eine Gaußsche Verteilung. Diskrete Nanopartikel in den Bildern wurden zufällig ausgewählt, um eine durchschnittliche Größe jeder Form zu erhalten. Der Durchmesser der Kugeln wurde mit 23,8 ± 1,3 nm aus 250 Nanopartikeln bestimmt (Abb. 5a). Interessanterweise wurden gleichseitige Dreiecke erzeugt; Daher haben wir die Höhe von 64 Nanopartikeln gemessen (25,7 ± 2,2 nm, Abb. 5b). 27 stäbchenförmige Nanopartikel wurden zufällig ausgewählt, um die durchschnittliche Länge zu bestimmen (28,4 ± 0,4 nm, Abb. 5c). Das durchschnittliche Aspektverhältnis, definiert als Länge geteilt durch die Breite, der Stäbe wurde zu 2,4 bestimmt. Für die Rautenform wurden 38 Rauten zufällig in den Bildern ausgewählt. Wie in Fig. 5d, e gezeigt, wurden die durchschnittlichen Längen der langen und kurzen diagonalen Linien mit 22,0 ± 0,6 nm bzw. 15,4 ± 0,3 nm gemessen. PV-AuNPs mit unterschiedlichen Formen wiesen eine Größe von weniger als 30 nm auf, und die Größen wurden im folgenden Abschnitt mit der hydrodynamischen Größe verglichen.

HR-TEM-Bilder von PV-AuNPs. Der Maßstabsbalken steht für a 50 nm, b 50 nm, c 50 nm, d 50 nm, e 10 nm, f 2 nm, g 2 nm und h 2 nm

Größenhistogramme von PV-AuNPs. a Der Durchmesser von Kugeln. b Die Höhe gleichseitiger Dreiecke. c Die Länge der Stangen. d Die Länge (lange diagonale Linie) von Rhomben. e Die Länge (kurze diagonale Linie) der Rauten

Hydrodynamische Größe und Zetapotential der PV-AuNPs

Die hydrodynamische Größe und das Zetapotential sind wichtige Eigenschaften in der Nanopartikelforschung für weitere Anwendungen. Im Allgemeinen ist die aus HR-TEM-Bildern gemessene Größe kleiner als die der hydrodynamischen Größe, da die hydrodynamische Größe die an der Oberfläche der Nanopartikel gebundenen Biomoleküle widerspiegelt. Wie in Abb. 6a gezeigt, wurde die hydrodynamische Größe zu 45 ± 2 nm mit einem Polydispersitätsindex von 0,258 bestimmt, was größer war als die Größe der Kugeln, die aus den HR-TEM-Bildern gemessen wurden (23,8 ± 1,3 nm aus 250 Nanopartikeln). . Dieses Ergebnis deutet eindeutig darauf hin, dass die sekundären Pflanzenstoffe im Extrakt an die Oberfläche der PV-AuNPs gebunden und diese stabilisiert haben. Außerdem besaßen die PV-AuNPs ein negatives Zetapotential von − 13,99 mV (Abb. 6b). Diese Ergebnisse zeigten, dass Phytochemikalien mit negativen Ladungen höchstwahrscheinlich zum negativen Zetapotential beigetragen haben. Dieses negative Zetapotential erzeugt abstoßende Kräfte in einer kolloidalen Lösung von PV-AuNPs, die deren Stabilität verleiht. Daher wird eine unserer zukünftigen Arbeiten das phytochemische Screening des Extrakts von P umfassen. vulgaris um die genauen Verbindungen aufzuklären, die zum negativen Zetapotential beitragen.

Hydrodynamic size and zeta potential of PV-AuNPs. a Hydrodynamic size. b Zeta potential

HR-XRD Analysis of the PV-AuNPs

X-ray diffraction analysis is generally employed to obtain crystallographic information about metallic nanoparticles. The characteristic diffraction patterns in terms of the Bragg reflections obtained from HR-XRD showed that the PV-AuNPs possessed a crystalline structure. The diffraction peaks (2θ values) observed at 38.1°, 44.5°, 64.8°, and 77.4° corresponded to the (111), (200), (220), and (311) planes, respectively, of a face-centered cubic structure in the PV-AuNPs (Fig. 7). The Scherrer equation (D  = 0.89·λ/W·cosθ ) was used to determine the approximate size of the PV-AuNPs. We selected the most intense (111) peak for application in the equation. The definition of each term in the equation is as follows:D is the size of the PV-AuNPs determined from the (111) peak, θ is the Bragg diffraction angle of the (111) peak, λ is the X-ray wavelength that was utilized, and W is the full width at half maximum (FWHM) of the (111) peak, in radians. From the Scherrer equation, the approximate size of the PV-AuNPs was determined to be 16.7 nm. The size determined from the Scherrer equation was smaller than the sizes measured from both HR-TEM images and the hydrodynamic size. The hydrodynamic size was the largest, possibly due to the fact that phytochemicals in the extract bound to the surface of the PV-AuNPs.

HR-XRD analysis of PV-AuNPs

Reaction Yield of the PV-AuNPs

ICP-OES was used to estimate the reaction yield. First, the total concentration of Au was obtained by analyzing the PV-AuNP solution. Second, the PV-AuNPs were centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was analyzed to ascertain the concentration of unreacted Au in the reduction reaction. Then, the reaction yield was estimated as follows:reaction yield (%) = 100 − [Au concentration in the supernatant/Au concentration in the colloidal solution] × 100.

Based on ICP-OES analysis, the concentrations of Au in the colloidal PV-AuNP solution and the supernatant were determined to be 96.337 ppm and 0.679 ppm, respectively. Therefore, the reaction yield of the PV-AuNPs was determined to be 99.3%. From the ICP-OES results, we concluded that the reaction condition was optimal which produced a high reaction yield of PV-AuNPs.

Antioxidant Activity of the PV-AuNPs

The DPPH radical scavenging activity was examined to evaluate the antioxidant activity of the PV-AuNPs. As shown in Fig. 8, the DPPH radical scavenging activity of the PV-AuNPs was nearly constant at a concentration of less than 20.9 μg/mL (based on the Au concentration). However, as the concentration increased (41.9~334.8 μg/mL based on the Au concentration), the DPPH radical scavenging activity also increased, suggesting that the activity was dose-dependent. The IC₅₀ of the PV-AuNPs was observed to be 165.0 μg/mL, which was equivalent to the IC₅₀ of vitamin C (49.4 μM).

DPPH radical scavenging activity of PV-AuNPs. The concentration was expressed as Au concentration

Green-synthesized AuNPs or AgNPs have been known to possess antioxidant activity in terms of DPPH radical scavenging activity [20, 21]. Ginseng-berry-mediated AuNPs demonstrated antioxidant activity [20]. The absorption of phytochemicals in the ginseng berry extract on the surface of nanoparticles having a large surface area can be credited to the antioxidant activity of AuNPs [20]. Green-synthesized AuNPs using Angelica pubescens roots showed antioxidant activity with a dose-dependent manner [21]. Secondary metabolites in A. pubescens such as flavonoids, sesquiterpenes, and phenolic compounds are potential contributors for the free radical scavenging activity [21]. However, AgNPs demonstrated higher antioxidant activity than AuNPs in the two articles mentioned above.

Cytotoxicity of the PV-AuNPs

The cytotoxicity of the PV-AuNPs against three cancer cells from different tissue types (colon, pancreas, and breast) was evaluated to examine the tissue-specific cytotoxicity of the nanoparticles in the presence/absence of FBS (Fig. 9). When serum was present during the cell culture, various kinds of protein coronas formed. The protein corona was dependent on the characteristics of the nanoparticles, such as the size, shape, surface charge, and surface roughness [22]. The protein corona can either increase or decrease the cellular uptake and cytotoxicity of the nanoparticles [23]. However, there are controversial reports regarding whether the protein corona causes the cytotoxicity to increase or decrease. Thus, the cytotoxicity of the PV-AuNPs was evaluated in the presence and absence of FBS. In the absence of FBS, HT-29 showed the greatest cytotoxicity at the tested concentrations (29.9~478.3 μg/mL) among three cells (Fig. 9a), followed by MDA-MB-231 (Fig. 9b) and lastly by PANC-1 (Fig. 9c). However, in the presence of FBS, these cells demonstrated a different phenomenon. PANC-1 showed the highest cytotoxicity, followed by HT-29 cells. In the absence of FBS and with 478.3 μg/mL Au, both the PANC-1 and MDA-MB-231 cells did not show any significant cytotoxicity, while strong cytotoxicity was observed for the HT-29 cells (65.6% cytotoxicity). However, in the presence of FBS, cytotoxicity was observed for PANC-1 (37.5% cytotoxicity) at 478.3 μg/mL Au. In general, the PV-AuNPs surrounded by a protein corona strongly influenced the cytotoxicity against cancer cells, although the results were tissue-specific. The protein corona produced by FBS increased the cytotoxicity against PANC-1 when compared with the cytotoxicity in the absence of FBS; however, the cytotoxicity decreased in the presence of the protein corona for HT-29 when compared with the cytotoxicity without the protein corona.

In vitro cytotoxicity on cancer cells. a HT-29. b MDA-MB-231. c PANC-1

It has been reported that a variety of proteins bind to both positively and negatively charged AuNPs, while few proteins bind to AuNPs with a neutral charge [17, 24]. The negatively charged AuNPs showed a higher affinity and a slower release of fibrinogen protein than the positively charged AuNPs, suggesting the existence of specific binding sites for fibrinogen on the negatively charged AuNPs [17]. The PV-AuNPs possessed a negative zeta potential; thus, the binding of fibrinogen may affect the cytotoxicity against cancer cells. The investigation of the protein corona of nanoparticles is beneficial in nanomedicine research for future biomedical and clinical applications.

Conclusions

The aqueous extracts of A. capillaris , P. oleracea , und P. vulgaris exhibited antioxidant activity which was evaluated by free radical scavenging activity, total phenolic content, and reducing power. P. vulgaris exerted the highest antioxidant activity, followed by A. capillaris and P. oleracea . The extract of P. vulgaris possessing the highest antioxidant activity was a very efficient green reducing agent for the biofabrication of AuNPs. The findings of our study demonstrate that the factors of the antioxidant activity, such as the free radical scavenging activity, reducing power, and total phenolic content, are closely correlated with the color of the colloidal solution and the shape of the SPR band of the resulting AuNPs. When the antioxidant activity was high, the resulting AuNPs showed a narrow SPR band with a strong absorbance. In contrast, a broad SPR band was observed for the PO-AuNPs, in which P. oleracea exhibited the lowest antioxidant activity among the three extracts. Furthermore, the PO-AuNPs aggregated easily after storage at ambient temperature. Consequently, the extract of P. vulgaris produced a wine-red colloidal solution of PV-AuNPs with various shapes with a maximum SPR of 530 nm. A face-centered cubic crystalline pattern of PV-AuNPs was confirmed by high-resolution X-ray diffraction analysis. The reaction yield was estimated by ICP-OES to be 99.3%. The hydrodynamic size (45 ± 2 nm) was larger than that measured from HR-TEM images suggesting that phytochemicals bound on the surface of the PV-AuNPs. Furthermore, phytochemicals with negative charges possibly attributed to a negative zeta potential of − 13.99 mV. The antioxidant activity of the PV-AuNPs was dependent on the Au concentration that was assessed based on the DPPH radical scavenging activity. Green-synthesized AuNPs using ginseng-berry and A. pubescens root extracts also showed DPPH radical scavenging activity [20, 21]. The PV-AuNPs showed cytotoxicity against HT-29, PANC-1, and MDA-MB-231 cells. Interestingly, the presence or absence of FBS dramatically affected the cytotoxicity against these cells. This phenomenon was possibly due to the protein corona that surrounded the surface of the nanoparticles.

Currently, AuNPs have diverse applications in nanomedicine as drug delivery vehicles or carriers of anticancer agents such as doxorubicin. P. vulgaris ethylacetate fraction showed cardioprotective effects with a concentration-dependent manner on isolated rat cardiomyocytes subjected to doxorubicin-induced oxidative stress [25]. PV-AuNPs can be applied as doxorubicin delivery vehicles with a cardioprotective ability. Therefore, our subsequent work will explore the anticancer activities of the PV-AuNPs loaded with doxorubicin for future biomedical and pharmaceutical applications. Diverse plant extracts have a potential to be effective reducing agents for biofabricating AuNPs. When the biofabrication reaction is conducted, it is essential to select a plant extract that possesses a high antioxidant activity in order to produce stable AuNPs. Additionally, P. vulgaris extract has a potential to be used as a reducing agent for the green synthesis of other novel metallic nanoparticles with valuable applications in the future.

Abkürzungen

ABTS:

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

AC-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of A. capillaris

AgNPs:

Silver nanoparticles

AuNPs:

Goldnanopartikel

BHT:

Butylated hydroxytoluene

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

DPPH:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

FBS:

Fetal bovine serum

GAE:

Gallic acid equivalent

HR-TEM:

Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie

HR-XRD:

High-resolution X-ray diffraction

HT-29:

Human colorectal adenocarcinoma cell

IC₅₀ :

Half maximal inhibitory concentration

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy

MDA-MB-231:

Human breast adenocarcinoma cell

PANC-1:

Human pancreas ductal adenocarcinoma cell

PO-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. oleracea

PV-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. vulgaris

SPR:

Surface plasmon resonance

WST assay:

Water-soluble tetrazolium assay