Magnetischer Graphen-Feldeffekttransistor-Biosensor für ultrasensitive Einzelstrang-DNA-Detektion

Zusammenfassung

In dieser Arbeit präsentieren wir einen magnetischen Graphen-Feldeffekttransistor (MGFET) Biosensor, hergestellt durch Transfer eines chemisch gasphasenabgeschiedenen (CVD) Graphenfilms auf ein Glassubstrat zur Bildung des leitenden Kanals und der Sensorschicht. Die Graphenoberfläche wird mit 1-Pyrenbutansäure-succinimidylester (PBASE) funktionalisiert, der als molekularer Anker für die Immobilisierung eines Sondenaptamers dient. Magnetisch markierte komplementäre Einzelstrang-DNA (cDNA) wird über Hybridisierung mit dem Aptamer eingefangen, und die Wechselwirkung wird in eine messbare Impedanzänderung transduziert. Unter einem periodisch modulierten Magnetfeld zeigt die MGFET-Impedanz Oszillationen, deren Amplitude direkt proportional zur cDNA-Konzentration ist. Mit diesem Prinzip detektiert der Sensor Einzelstrang-DNA mit einer Nachweisgrenze von 1 pM. Das beobachtete Verhalten wird durch ein Modell rationalisiert, in dem die magnetische Kraft den DNA-Perlen-Komplex biegt, wodurch die Doppelschichtkapazität des Graphenkanals moduliert wird. Durch Anlegen eines periodischen Magnetfelds kann die Impedanz wiederholt abgetastet werden, was eine Signal-Rausch-Verhältnis (SNR)-Verbesserung durch Integration über mehrere Perioden ermöglicht. Diese Studie demonstriert einen hochsensitiven DNA-Biosensor und deutet dessen potenzielle Anwendbarkeit auf andere Biomoleküle und zelluläre Assays hin.

Einleitung

Die Detektion von DNA ist entscheidend für molekularbiologische Forschung und Diagnose genetischer Störungen [1-3]. Im vergangenen Jahrzehnt wurden Biosensoren basierend auf Fluoreszenz [4,5], Elektrochemie [6-9] und Feldeffekttransistoren (FET) [10-13] hierfür entwickelt, wobei FET-Typ-Sensoren aufgrund ihrer inhärenten Sensitivität und Spezifität besondere Aufmerksamkeit erhielten. Kaisti et al. führten einen Peptid-Nukleinsäure-funktionalisierten FET für unmarkierte Einzelstrang-DNA-Detektion ein [12], während Kim et al. einen CMOS-basierten DNA-Ladungssensor fertigten [13]. Graphen, mit seiner außergewöhnlichen Oberfläche, elektrischen Leitfähigkeit und Trägerbeweglichkeit, hat sich als ideale Plattform für den Bau von FET-Biosensoren etabliert [14-16]. Cai et al. berichteten über einen Graphen-FET (GFET) für ultrasensitive DNA-Detektion via Peptid-Nukleinsäure-Hybridisierung [15], und unsere Gruppe demonstrierte zuvor einen Multi-Kanal-GFET für DNA-Bindungskinetik und Basenpaar-Mismatches [16]. In konventionellen GFETs erzeugt eine externe Gate-Elektrode ein elektrisches Feld, das eine Doppelschicht an der Graphen-Elektrolyt-Grenzfläche etabliert [17-19] und damit die Geräteleitfähigkeit moduliert. Neuere Studien erreichten femtomolare Nachweisgrenzen mit GFETs [20,21]; diese hohen Sensitivitäten beruhen jedoch auf teuren Halbleiteranalysatoren und Ag/AgCl-Referenzelektroden, was die praktische Anwendung limitiert. Um diese Herausforderungen zu überwinden, entwickelten wir einen magnetischen Graphen-FET (MGFET), der ein Magnetfeld statt eines elektrischen Gates zur Modulation des Graphenkanals nutzt. Der MGFET beinhaltet einen CVD-Graphenfilm, transferiert auf ein Glassubstrat, flankiert von Indium-Zinn-Oxid (ITO) Elektroden. Der Graphen wird mit PBASE funktionalisiert, was kovalente Bindung eines Sondenaptamers ermöglicht, der magnetisch markierte cDNA einfängt. Unter einem periodischen Magnetfeld oszilliert die MGFET-Impedanz korreliert mit cDNA-Konzentration. Dieser magnetische Ansatz eliminiert direkten Elektrodenkontakt, vereinfacht Integration und erweitert Anwendbarkeit. Die folgenden Abschnitte detaillieren Fertigung, Detektionssystem und zugrundeliegenden Detektionsmechanismus dieses neuartigen MGFET-Biosensors.

Methoden

Materialien und Instrumente

Ein Glassubstrat mit ITO-Elektroden wurde von Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (China) bezogen. Der Sondenaptamer, cDNA und Mismatch-DNA wurden von Sangon Biotech Inc. (Shanghai, China) gekauft. Die Aptamer-Sequenz ist (5'-NH₂-TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3'); die komplementäre DNA (cDNA) Sequenz ist (5'-NH₂-GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA-3'); die vollständig mismatched DNA ist (5'-NH₂-TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3'); und die einzelbasige mismatched DNA ist (5'-NH₂-GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3'). PBASE und Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) bezogen. Magnetische Nanoperlen (MBs) mit Carboxyl-Funktionalisierung (10 mg ml⁻¹) wurden von Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Nanjing, China) erworben. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid, N-Hydroxysuccinimid, Natriumdodecylbenzolsulfonat (SDS) und phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, pH 7,4) wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) gekauft.

Ein Raman-Spektrometer (SPEX-1403, SPEX) charakterisierte Graphenqualität und bestätigte PBASE-Funktionalisierung. Fluoreszenz-Photometrie (LS55, PerkinElmer) quantifizierte die Kopplung magnetischer Nanopartikel an cDNA. Ein benutzerdefiniertes Datenerfassungssystem zeichnete Echtzeit-MGFET-Impedanz auf.

Kopplung von cDNA an MBs

Nach 20 min Sonikation wurden 20 µl von 4 mg ml⁻¹ MB-Suspension mit 200 µl von 2 mg ml⁻¹ EDC und 200 µl von 2 mg ml⁻¹ NHS für 15 min gemischt, um die MBs zu aktivieren [22,23]. Anschließend wurden 20 µl cDNA hinzugefügt und 2 h bei Raumtemperatur mit sanfter Agitation inkubiert. Ein Magnetfeld reicherte die MB/cDNA-Konjugate an, die dreimal mit PBS gewaschen und für den weiteren Gebrauch resuspendiert wurden.

Fertigung der MGFETs

Die MGFETs wurden in einem dreistufigen Prozess gefertigt: (1) Ein CVD-Graphenfilm wurde auf eine Glasplatte als leitenden Kanal zwischen den zwei ITO-Elektroden transferiert (Abb. 1a). (2) Eine 10 mM PBASE-Lösung in DMSO wurde 12 h bei Raumtemperatur auf dem Graphen inkubiert, was π-π-Stapelung mit dem Graphengitter ermöglichte (Abb. 1b). Überschüssiges PBASE wurde durch Spülen mit DMSO und PBS entfernt. (3) Eine 2 µM Sondenaptamer-Lösung wurde eingeführt und 4 h bei Raumtemperatur inkubiert, was kovalente Kopplung über den NHS-Ester von PBASE ermöglichte (Abb. 1c). Schließlich wurde ungebundener Aptamer durch dreimaliges Waschen mit 0,2 % SDS entfernt.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung der MGFETs

Der CVD-Graphenfilm wurde erfolgreich auf das Glassubstrat transferiert, wie durch das Raman-Spektrum bestätigt (Abb. 2). Das Vorhandensein der G-, D- und 2D-Peaks deutet auf hochwertiges Graphen hin; das I₂D/I_G-Verhältnis bestätigt einen Mehrlagenfilm, während das niedrige I_D/I_G-Verhältnis minimale Defekte belegt [24-26].

Direkte Anbindung von Aptameren an reines Graphen ist aufgrund fehlender Funktionsgruppen herausfordernd; daher dient PBASE als π-π-verankerter Linker. Die Succinimid-Gruppe von PBASE reagiert mit dem 5'-NH₂ des Aptamers via NHS-Chemie (Abb. 1c). Erfolgreiche Aptamer-Immobilisierung wurde durch Fluoreszenzintensität des 3'-End-FAM-Labels bestätigt (Abb. 3). Die Fluoreszenz stieg mit Aptamer-Konzentration bis zur Sättigung bei ~2 µM an, was Oberflächensättigung anzeigte. Folglich wurde in nachfolgenden Experimenten eine 2 µM Aptamer-Konzentration verwendet.

Charakterisierung von MB/cDNA

Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass die MBs ~7 nm im Durchmesser betragen (Abb. 4a,b). Um die Einfang-Effizienz zu maximieren, wurde eine 4 mg ml⁻¹ MB-Konzentration für die Aktivierung verwendet. Die Kopplungseffizienz wurde durch Messung der Abnahme der FAM-Fluoreszenz im Überstand überwacht (Abb. 4d). Vollständige Anreicherung von 10 nM cDNA wurde erreicht, wie durch das Fluoreszenzniveau des Überstands, das auf PBS-Niveau zurückkehrte, belegt.

Analyse der Magnetfeldintensität

Nach 10-min Inkubation von MB/cDNA mit den MGFETs wurden ungebundene MBs durch PBS-Wäschen entfernt, sodass nur MB/cDNA auf dem Sensor verblieben (Abb. 1d). Ein Permanentmagnet auf einem Rotationsmotor applizierte ein periodisches Magnetfeld (Abb. 1e). Die Impedanz des MGFETs wurde mit einem benutzerdefinierten Detektionsgerät aufgezeichnet.

Der Zusammenhang zwischen Magnetfeldstärke und MGFET-Impedanz wurde untersucht, um optimale Feldparameter zu identifizieren (Abb. 5). In MGFETs biegt die magnetische Kraft den MB/cDNA-Komplex, was den Abstand zwischen Komplex und Graphenoberfläche ändert und damit die Doppelschichtkapazität moduliert. Drei Regime wurden beobachtet: (1) <100 mT, wo die magnetische Kraft unzureichend zur DNA-Biegung ist, was vernachlässigbare Impedanzänderung ergibt; (2) 100–200 mT, wo Biegung rasch eintritt und eine ausgeprägte Impedanzantwort erzeugt; (3) >220 mT, wo der DNA-Stab seine Biegegrenze erreicht und die Impedanz stabilisiert (Abb. 5b). Dieses elastische-Stab-Modell stimmt mit früheren Berichten zur DNA-Mechanik überein [29,30].

Detektion von cDNA

Mit einem festen Magnetfeld von 240 mT wurden Impedanzänderungen über einen Bereich von MB/cDNA-Konzentrationen aufgezeichnet (Abb. 6a). Die Applikation des periodischen Magnetfelds induzierte klare Impedanzoszillationen. Zur Rauschunterdrückung wurde ein Sample-Integration-Algorithmus (SIA) eingesetzt: (1) Datenpunkte während der nicht-magnetischen Periode (T₀) wurden auf null normiert; (2) Punkte während jeder magnetischen Periode (T_M) wurden abgetastet und gemittelt; nach vier Zyklen wurde die periodische Impedanzänderung extrahiert (Abb. 6b). Dieser Ansatz verbessert den SNR effektiv durch wiederholtes Sampling.

Die Impedanzänderung zeigte eine lineare Beziehung zur cDNA-Konzentration (Abb. 7). Die hohe Sensitivität resultiert aus (1) der mechanischen Biegung des MB/cDNA-Komplexes, die die Modulation der Graphen-Doppelschicht verstärkt, und (2) dem periodischen Magnetfeld, das SIA-basierte Rauschunterdrückung erlaubt. Durch Erhöhung der Anzahl der Magnetfeldperioden kann der SNR des Systems weiter verbessert werden.

Selektivität der MGFETs

Selektivität wurde mit vollständig mismatched DNA und einzelbasiger mismatched DNA evaluiert, jeweils an MBs gekoppelt. Nach 10-min Inkubation mit den MGFETs und PBS-Wäsche wurde der vollständig mismatched MB/DNA-Komplex weitgehend entfernt, was vernachlässigbare Impedanzänderung ergab (Abb. 8a) und hohe Selektivität bestätigt. Die einzelbasige mismatched DNA erzeugte eine Impedanzänderung leicht niedriger als der voll komplementäre Strang, aber höher als der nicht-komplementäre Kontrolle, was demonstriert, dass der Sensor Einzelbasen-Mismatches diskriminieren kann (Abb. 8b). Während die intrinsische Spezifität des Aptamers die Selektivität bestimmt, trägt die MGFET-Architektur zur Gesamtsensitivität bei.

Schlussfolgerungen

Wir haben einen magnetischen Graphen-FET-Biosensor entwickelt, der magnetisch markierte DNA und ein periodisches Magnetfeld nutzt, um Bindungsereignisse in Impedanzoszillationen zu transduzieren. Die magnetische Kraft biegt den MB/cDNA-Komplex mechanisch, moduliert die Graphen-Doppelschicht und liefert eine 1 pM Nachweisgrenze für Einzelstrang-DNA. Das periodische Magnetfeld ermöglicht signalintegrationsbasierte Rauschunterdrückung, was die Sensitivität weiter erhöht. Über DNA-Detektion hinaus bietet diese Plattform einen vielseitigen Rahmen für die Messung mechanischer Eigenschaften von Nukleinsäuren und die Detektion anderer Biomoleküle oder Zellen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind im Artikel enthalten.

Abkürzungen

cDNA:

Komplementäre magnetisch markierte Einzelstrang-DNA

CVD:

Chemische Gasphasenabscheidung

DMSO:

Dimethylsulfoxid

FET:

Feldeffekttransistor

GFET:

Graphen-Feldeffekttransistor

MBs:

Magnetische Nanoperlen

MGFET:

Magnetischer Graphen-Feldeffekttransistor

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

PBASE:

1-Pyrenbutansäure-succinimidylester

PBS:

Natriumdodecylsulfat-phosphatgepufferte Salzlösung

SDS:

Natriumdodecylbenzolsulfonat

SIA:

Sample-Integration-Algorithmus

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

ITO:

Indium-Zinn-Oxid