Fortschrittlicher Zeolith-Eisenoxid-Nanokomposit-Kapazitiver Biosensor für schnelle IL-3-Sepsis-Detektion

Zusammenfassung

Sepsis ist ein lebensbedrohlicher Zustand, der durch eine extreme körperliche Reaktion auf schwere mikrobielle Infektionen verursacht wird. Bei Sepsis werden Chemikalien durch das Immunsystem in den Blutkreislauf freigesetzt, um gegen eine Infektion zu kämpfen, was Entzündungen und einen medizinischen Notfall auslöst. Ein komplexer longitudinaler Zeolith-Eisenoxid-Nanokomposit wurde aus Flugasche von Kohlekraftwerken extrahiert und genutzt, um die Oberflächeneigenschaften des kapazitiven Biosensors zur Identifikation von Sepsis-Anfällen zu verbessern. Anti-Interleukin-3 (anti-IL-3) Antikörper wurden über einen Amin-Linker an die zeolith- und eisenoxid-komplexierte kapazitive Elektrodenoberfläche gebunden, um mit dem Sepsis-Biomarker IL-3 zu interagieren. Die morphologischen und chemischen Komponenten des Nanokomplexes wurden durch FESEM, FETEM und EDX-Analysen untersucht. Bei etwa 30 nm half der longitudinale Zeolith-Eisenoxid-Nanokomposit, eine Detektionsgrenze für IL-3 von 3 pg/mL auf der linearen Kurve zu erreichen, mit einem Regressionskoeffizienten (R²) von 0,9673 [y = 1,638x − 1,1847]. Eine niedrigere Detektionsgrenze wurde im dosisabhängigen Bereich (3–100 pg/mL) aufgrund der höheren Antikörperimmobilisierung auf der Sensoroberfläche durch die Nanomaterialien und der verbesserten Oberflächenstrom erreicht. Kontrollexperimente mit relevanten Biomolekülen zeigten keine Kapazitätsänderungen, und gespiktes IL-3 in menschlichem Serum erhöhte die Kapazität, was die spezifische und selektive Detektion von IL-3 anzeigt. Diese Studie identifiziert und quantifiziert IL-3 über potenziell nützliche Methoden und hilft bei der Diagnose von Sepsis-Anfällen.

Einleitung

Sepsis ist ein tödlicher Zustand, der auftritt, wenn der Körper schwer auf eine Infektion reagiert. Durch den Sepsis-Angriff produziert der Körper einen höheren Level an Signalbiomolekülen, sogenannten „Zytokinen“, die Immunzellen anziehen. Zunehmende Zahlen dieser Zellen sezernieren mehr Zytokine, und der Zytokinsturm rekrutiert mehr Immunzellen. Anstatt die initiale Infektion zu kontrollieren, greifen Immunfaktoren Körperorgane und -gewebe an. Darüber hinaus löst diese Infektion eine Kettenreaktion im gesamten Körper aus und verursacht Organversagen und Gewebeschäden. Insbesondere beginnt Sepsis in Lunge, Haut, Harntrakt und Magen-Darm-Trakt und breitet sich auf andere Organe aus, was zu Organverletzungen führt. Daher ist es notwendig, den Prozess früher zu stoppen, um Angriffe auf andere Organe zu verhindern. Die Identifikation von Sepsis in frühen Stadien mit einem geeigneten Biomarker hilft, Patienten rechtzeitig zu behandeln und Leben zu retten. Forscher fanden, dass der Interleukin-3 (IL-3) Entzündungsfaktor ein unabhängiger Prädiktor für Sepsis-Angriff und Tod ist, der von angeborenen Reaktionsaktivator (IRA) B-Zellen nach Toll-ähnlicher Rezeptor-Aktivierung produziert wird. Zudem wurde festgestellt, dass ein höherer IL-3-Level mit einer höheren Sterblichkeitsrate bei Sepsis-Patienten assoziiert ist und bestätigt, dass IL-3 eine Hauptrolle in der Immunregulation und höheren Reaktionen auf Kortikosteroide während Sepsis spielt. Diese Forschung zielte darauf ab, den IL-3-Level mit einem zeolith-eisenoxid (zeolith-iron) Nanokomposit-modifizierten kapazitiven elektrochemischen Sensor zu quantifizieren.

Die Detektion von Biomolekülen mit Biosensoren hängt stark von der Immobilisierung des Ziel- oder Detektionsmoleküls auf der Transduktorelektrodenoberfläche ab. Eine höhere Anzahl immobilisierter Capture-Proben mit richtiger Orientierung führt zu niedrigeren Zieldetektionsgrenzen. In den meisten Fällen wurde die Capture-Proben-Immobilisierung durch physikalische Adsorption, elektrostatische Wechselwirkung, kovalente Verknüpfung und Biomolekül-Einkapselung mit Polymeren durchgeführt. Es kann schwierig sein, Reproduzierbarkeit und Biokompatibilität immobilisierter Biomoleküle mit den oben genannten Methoden zu erreichen. Insbesondere die Anbindung kleinerer Capture-Moleküle wie RNA, DNA, Aptamere und Peptide an Sensoroberflächen ist kompliziert. Verschiedene Forscher haben unterschiedliche Techniken für effiziente Immobilisierung verwendet. Kürzlich waren Nanomaterialien für den Prozess der Biomolekül-Immobilisierung auf Sensoroberflächen sehr attraktiv. Goldnanopartikel wurden effizient auf verschiedenen Sensoroberflächen immobilisiert, wie Polystyrol-ELISA-Substraten und Aluminiumelektroden, und haben potenzielle Moleküle einschließlich Antikörpern, Proteinen, DNA und Aptameren eingefangen. Neben Siliziumdioxid, Aluminium und Graphen sind häufig verwendete Materialien für die Biomolekül-Immobilisierung. Diese Nanomaterialien verbessern die Anzahl der Capture-Moleküle und gewährleisten Biokompatibilität und Stabilität der Biomoleküle auf Sensoroberflächen, was die Detektionsstrategie verbessert. Kürzlich haben anorganische Materialien wie Zeolith, Ton und Sol-Gel die Aufmerksamkeit von Forschern für die Lösung dieser Probleme auf sich gezogen. Zudem wurde die Synthese von Nanomaterialien durch grünere Ansätze aufgrund großer Vorteile, wie dem Verzicht auf gefährliche Materialien und geringeren Kosten, stark gefördert. Darüber hinaus können maßgeschneiderte Ansätze verwendet werden, um gewünschte Größen und Formen von Nanomaterialien zu erreichen. Die aktuelle Studie stand in Einklang mit diesem Ansatz und produzierte ein Zeolith-Nanomaterial in Kombination mit isoliertem Eisen zu einem Nanokomposit.

Zeolith ist ein kristallines mikroporöses Aluminosilikat, bestehend aus TO₄-Tetraedern und O-Atomen. Es ist ein vielversprechendes Material für Biomolekül-Immobilisierung aufgrund seiner größeren Oberfläche, Ionenaustauschfähigkeit, kontrollierbarer Hydrophobizität/Hydrophilie und hoher mechanischer und thermischer Leitfähigkeit. Daher wurden verschiedene Studien im Biosensor-Bereich mit Zeolith-Material für den Biomolekül-Immobilisierungsprozess etabliert und niedrigere Detektionsgrenzen erreicht, um Biosensoren wie Glucose- und Harnstoffsensoren zu entwickeln. Ähnlich verbessern Eisen-Nanomaterialien den Kationenaustauscheffekt und geben schnelle Reaktionen auf Stromänderungen bei Interaktionen mit Biomolekülen. Der in dieser Studie verwendete Zeolith-Eisenoxid-Nanokomposit mit einzigartiger Zusammensetzung verbessert die hohe Leistung des Sensors und bietet durch die Verbesserung der Leitfähigkeit verbesserte Empfindlichkeit. Diese Studie konzentrierte sich auf Zeolith-Eisen-Nanomaterialien, extrahiert aus Flugasche von Kohleminen, und nutzte sie als Substrate für kapazitive Elektroden zur Immobilisierung der Capture-Probe, des Anti-IL-3-Antikörpers. Im Vergleich zu früheren nanomaterialvermittelten Detektionen verschiedener Interleukine bietet das aktuelle Sensorsystem Verbesserungen in mehreren Aspekten. Beispielsweise seine höhere Eignung für elektrochemische Sensoren erfordert weniger experimentelle Schritte und zeigt Eignung für chemische Oberflächenfunktionalisierung und hohe Nicht-Fouling-Fähigkeit.

Ein kapazitiver Biosensor ist ein elektrochemischer Sensor, der durch Registrierung der Anziehung zwischen Sonde und Ziel bei deren Interaktion auf der Elektrodenoberfläche entsteht. Ein kapazitiver Biosensor hilft, Änderungen in der dielektrischen Schicht an der Elektrodengrenzfläche zu messen, wenn ein Zielbiomolekül mit der immobilisierten Sonde auf der Sensoroberfläche bindet. Die Kapazität zwischen Elektrode und Elektrolyt wird durch C = (2nε₀εA)/d beschrieben, wobei ε: dielektrische Konstante, A: Plattenoberfläche, ε₀: Permittivität des freien Raums, n: Anzahl repetitiver Finger, d: Isolierschichtdicke. Ein nicht-faradischer kapazitiver Biosensor hilft, Protein-Denaturierung durch Metallisierung zu vermeiden und die Interaktion von Ziel- und Sondenbindung zu verbessern. Verschiedene Studien haben kapazitive Biosensoren zur Identifikation verschiedener Zielmoleküle genutzt, einschließlich Nukleotide, Schwermetalle, Proteine und organische Moleküle. In dieser Forschung wurde ein nicht-faradischer Kapazitiv-Biosensor-Experiment auf einer zeolith-eisen-modifizierten Elektrodenoberfläche durchgeführt. Zeolith-Eisen wurde über (3-Aminopropyl)-trimethoxysilane als Amin-Linker an die Kapazitiv-Elektrode angebunden, und dann wurde Anti-IL-3 an die Oberfläche durch die Anziehung zwischen der Amin-Oberfläche und der Carbonsäuregruppe (COOH) des Antikörpers angebunden. Ein Anti-IL-3-Antikörper-modifizierter Elektrode wurde verwendet, um IL-3 zu quantifizieren und Sepsis-Angriffe zu diagnostizieren.

Materialien und Methoden

Apparatur und Reagenzien

Flugasche wurde von einem thermischen Kraftwerk in Indien bezogen. Natriumhydroxid und Schwefelsäure wurden von Sigma Aldrich (Missouri, USA) gekauft. (3-Aminopropyl)-trimethoxysilane (APTMS) wurde von Merck (NJ, USA) bezogen. Whatman-Filterpapier wurde von Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, USA) erhalten. IL-3 und Anti-IL-3-Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology (Texas, USA) bezogen. Rasterelektronenmikroskopie mit Feldemission (FESEM; Hitachi, S-4300 SE, Japan) und Transmissionelektronenmikroskopie mit Feldemission (FETEM; JEM-2100F, JEOL, Japan) wurden zur Analyse des Zeolith-Eisen-Nanomaterials nach zuvor beschriebenen Methoden verwendet.

Synthese des Zeolith-Eisen-Nanomaterials

Zeolith-Eisen-Nanomaterialien wurden unter Verwendung von Eisen, Siliziumdioxid und Aluminiumoxid, extrahiert aus Flugasche, synthetisiert. Das Verfahren umfasste drei Hauptschritte: (1) Trennung von Eisenpartikeln; (2) Extraktion von Natriumaluminosilikat; und (3) Herstellung von Zeolith-Eisen-Nanopartikeln durch die Sol-Gel-Synthesemethode.

Trennung von Eisen aus Flugasche

Eine 25 g Aliquot Flugasche wurde mit 500 µl destilliertem Wasser gemischt und 30 min mit einem Magnetrührer gerührt. Die am Magnetrührer haftenden Eisenpartikel wurden getrennt, und dann wurde 1 g der getrennten Partikel mit 25 % Schwefelsäure gemischt und 1 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden die eisenhaltige Lösung und die Eisenpartikel durch Whatman-Filterpapier getrennt und als Basis für Eisenoxid zur Synthese des Zeolith-Eisen-Nanomaterials verwendet.

Extraktion von Natriumaluminosilikat aus Flugasche

Die alkalische Extraktionsmethode wurde verwendet, um Natriumaluminosilikat aus Flugasche zu extrahieren. Zuerst wurden 25 g eisengetrennte Flugasche mit 500 µl 2 M Natriumhydroxid gemischt und 6 h bei 100 °C unter Rühren erhitzt. Nach Abkühlung der Lösung wurde Natriumaluminosilikat (die Lösung im Gemisch) durch Whatman-Filterpapier getrennt. Die gefilterte Lösung wurde als Basis zur Synthese eines Zeoliths verwendet.

Zeolith-Eisen-Nanomaterial synthetisiert durch Sol-Gel-Methode

Das extrahierte Eisen und Natriumaluminosilikat wurden als Basis zur Synthese von Zeolith-Eisen-Nanomaterialien durch die Sol-Gel-Methode verwendet. Im ersten Schritt wurde ein Becherglas mit 200 ml Natriumaluminosilikat bei pH 12 auf einer Heizplatte unter Rühren platziert. Dann wurde die Lösung mit Eisenlösung bei pH 1 durch tropfenweises Hinzufügen von Eisenlösung titriert, bis pH 7 erreicht war. Bei pH 7 bildete sich ein weißes Gel, das über Nacht kontinuierlich gerührt wurde, um gleichmäßig verteilte Zeolith-Eisen-Nanopartikel zu erhalten. Am nächsten Tag wurde das Gel durch Zentrifugation (10.000×g für 10 min) getrennt und dann mit 25 % Ethanol und destilliertem Wasser gewaschen. Das Endprodukt wurde 1 h bei 100 °C getrocknet, um ein Pulver bestehend aus Zeolith-Eisen-Nanomaterialien zu erhalten. Die Oberfläche des Zeolith-Eisen-Nanomaterials wurde durch FETEM und FESEM charakterisiert. Energie-dispersive Röntgen (EDX) Analyse wurde ebenfalls durchgeführt, um die Elemente im Zeolith-Eisen zu identifizieren.

Amin-Modifikation von Zeolith-Eisen und Funktionalisierung der Kapazitiv-Elektrodenoberfläche

Amin wurde über den Silankupplungsmittel APTMS auf die Oberfläche des Zeolith-Eisens aufgebracht. Dafür wurde 1 g Zeolith-Eisen mit 1 % KOH für 10 min gemischt, und der überschüssige KOH wurde durch destilliertes Wasser entfernt. Anschließend wurde der KOH-behandelte Zeolith-Eisen mit 1 % APTMS gemischt, und das Gemisch wurde über Nacht auf einem beheizten Rührer platziert. Am nächsten Tag wurde das Nanomaterial mit Ethanol gewaschen und durch Zentrifugation (10.000×g für 10 min) getrennt. Dieses APTMS-Zeolith-Eisen wurde auf die Kapazitiv-Elektrodenoberfläche aufgebracht, um IL-3 zu identifizieren. Für diese Immobilisierung wurde APTMS-Zeolith-Eisen auf die hydroxylierte Elektrode getropft und 3 h bei RT belassen. Die Bindung zwischen dem Zeolith-Eisenoxid-Nanokomposit, APTMS und der Sensoroberfläche erfolgte durch Silankupplung mit den gebildeten Oxidgruppen. Im Allgemeinen erfolgt Silankupplung mit mehreren Armen, die für die Oxidgruppen verfügbar sind, was Verknüpfungen zwischen dem Zeolith-Eisenoxid-Nanokomposit, APTMS und der Sensoroberfläche ergibt. Aufgrund dieser vielfachen Verknüpfungen wird eine räumliche Anordnung auf der Sensoroberfläche gebildet. Nach Waschen der Oberfläche mit Ethanol gefolgt von Wasser wurde ein Anti-IL-3-Antikörper-Immobilisierungsprozess durchgeführt, um mit IL-3 zu interagieren.

Bestimmung von IL-3 auf der Anti-IL-3-modifizierten Kapazitiv-Elektrodenoberfläche

Die oben beschriebene Oberfläche wurde durch Amin-Verankerung gebildet, die eine Reaktion mit verfügbaren COOH-Gruppen ermöglicht, wenn der Antikörper anbindet. IL-3 wurde auf einer Anti-IL-3 immobilisierten Kapazitiv-Elektrodenoberfläche identifiziert. Dafür wurde IL-3 bei 100 pg/mL in PBS-Puffer verdünnt und auf eine Antikörper-modifizierte Elektrodenoberfläche getropft. Nach Antikörper-Immobilisierung wurde die verbleibende ungebundene Oberfläche durch PEG-COOH (1 mg/ml) blockiert. Eine ähnliche Reaktion wie Antikörper-APTMS tritt auf, wenn PEG-COOH angebunden wird. Der Kapazitätswert wurde vor und nach der Interaktion mit IL-3 aufgezeichnet. Differenzen im Wert wurden für die Bindung von IL-3 mit seinem Antikörper berücksichtigt. Zur Berechnung der Detektionsgrenze wurde IL-3 von 3 bis 50 pg/mL titriert und unabhängig auf die Antikörper-modifizierten Oberflächen getropft. Das andere experimentelle Verfahren wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Der Unterschied im Kapazitätswert für jede IL-3-Konzentration wurde berechnet und geplottet, um die Detektion von IL-3 anhand des R²-Werts zu berechnen. Wenn IL-3 an die antikörperimmobilisierte Oberfläche bindet, wird es eine echte Interaktion geben.

Biofouling und selektive Bestimmung von IL-3 auf der Zeolith-Eisen-modifizierten Kapazitiv-Elektrodenoberfläche

Ein Biofouling-Experiment wurde unter drei verschiedenen Biomolekül-Bedingungen durchgeführt, einschließlich der Anwesenheit eines nicht-immunen Antikörpers oder eines Kontrollproteins und der Abwesenheit von IL-3-Antikörper. Im ersten Fall wurde statt IL-3-Antikörper ein nicht-immuner Antikörper verwendet; im zweiten Experiment wurde statt IL-3 ein Kontrollprotein verwendet; und das letzte Experiment wurde ohne IL-3-Antikörper durchgeführt. Die Kapazitätswerte wurden für die spezifische Interaktion von IL-3-Antikörper mit IL-3 verglichen. Ein selektives Experiment wurde durchgeführt, indem IL-3 in einer 1:100 Verdünnung von menschlichem Serum gespikt und tropfenweise auf eine Anti-IL-3-modifizierte Elektrodenoberfläche gegeben wurde. Die Kapazitätsänderungen wurden für jede IL-3-Konzentration aufgezeichnet, um die selektive Identifikation von IL-3 zu bestimmen. Reproduzierbarkeit wurde durch dreimalige Wiederholung der Experimente (in Triplikaten) mit ähnlichen Geräten aus der gleichen Batch-Fertigung bestätigt. Die Lagerlebensdauer und Stabilität der Sonde-immobilisierten Oberfläche wurden ebenfalls bestimmt.

Ergebnisse und Diskussion

Sepsis ist der Zustand mit vielen Chemikalien, die im Immunsystem freigesetzt werden, und löst eine weitverbreitete Entzündung mit letztendlicher Organschädigung aus. Abbildung 1a zeigt eine schematische Illustration der IL-3-Identifikation auf einer Anti-IL-3-modifizierten kapazitiven Elektrodenoberfläche zur Bestimmung des mit Sepsis assoziierten Zustands. APTMS-modifizierter Zeolith-Eisen wurde verwendet, um den Capture-Antikörper an die Sensor-Elektrodenoberfläche anzubinden. APTMS auf der Oberfläche des Zeolith-Eisens wurde auf der Elektrodenoberfläche durch die Interaktion zwischen Amin auf dem Nanomaterial und OH-Gruppen auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Abbildung 1b bestätigt die Unversehrtheit der Oberflächen-Elektrode am kapazitiven Sensor, wie unter einem Hochleistungsmikroskop aufgenommen. Der Antikörper wurde über COOH und das Amin des Zeolith-Eisens an die Oberfläche gebunden. Zeolith-Eisen hilft, eine höhere Anzahl von APTMS auf der Sensor-Elektrode anzubinden, was hilft, mehr Antikörper auf der kapazitiven Elektrodenoberfläche einzufangen. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Capture-Proben-Immobilisierung auf der Sensoroberfläche eine entscheidende Rolle bei der Senkung der Detektionsgrenze des Zielmoleküls spielt. In dieser Forschung wurde das Zeolith-Eisen-Nanomaterial verwendet, um Anti-IL-3-Antikörper an die Sensor-Elektrodenoberfläche anzubinden. Höhere Immobilisierung von Anti-IL-3-Antikörper mit richtiger Orientierung hilft, niedrigere Detektionsgrenzen von IL-3 zu erreichen.

Morphologische Analyse des Zeolith-Eisen-Nanomaterials durch FESEM und FETEM

Abbildung 1c, d (Inset) zeigt das morphologische Bild des Zeolith-Eisen-Nanomaterials, erhalten durch FESEM bei verschiedenen Vergrößerungen und die EDX-Elementaranalyse. Das erhaltene Zeolith-Eisen-Nanomaterial war glatt und gleichmäßig verteilt, mit einer dicht gestapelten longitudinalen Nanostruktur. Die Größe dieser Nanostruktur betrug ~30 nm, und das erhaltene Bild zeigt, dass der Nanokomposit mit gleichmäßigen Formen angeordnet und in angemessener Distanz gut verteilt war. Das FETEM-Bild bewies ebenfalls eine ähnliche Form wie die durch FESEM erhaltene für die gebildeten Zeolith-Eisen-Nanokomposite (Abb. 2a, b). Das EDX-Ergebnis bestätigte das Vorhandensein von Fe, Al, Si und O im synthetisierten Zeolith-Eisen-Nanokomposit (Abb. 2c, d). Die hauptsächlichen elementaren Atomprozente von Si, Al, Fe und O betrugen 3,46, 0,78, 2,13 und 24,39 %. Dieses FESEM- und EDX-Ergebnis bestätigt die Bildung von Zeolith-Eisen-Nanomaterialien.

Sensorelektrodenpräparation für IL-3-Bestimmung

Die Anti-IL-3-Antikörper-Immobilisierung auf dem kapazitiven Biosensor wurde durch Veränderung des Kapazitätsniveaus nach jeder biomolekularen Immobilisierung bestätigt. Abbildung 3a zeigt die Kapazitätsänderungen während des Prozesses der Antikörperanbindung an die zeolith-eisen-modifizierte Oberfläche. Wie in Abb. 3a gezeigt, weist die KOH-verankerte kapazitive Elektrodenoberfläche einen Kapazitätswert von 1,74 × 10⁹ nF auf, und nach tropfenweiser Zugabe des APTMS-Zeolith-Eisens stieg er auf 2,02 × 10⁹ nF. Dieser Kapazitätsanstieg bestätigte die Anbindung der Nanomaterialien an die Sensor-Elektrode. Darüber hinaus stieg der Kapazitätswert nach Zugabe von Anti-IL-3-Antikörper drastisch auf 3,42 × 10⁹ nF. Dieser höhere Anstieg wurde aufgrund der höheren Antikörperimmobilisierung auf dem APTMS-modifizierten Zeolith-Eisen festgestellt. Zudem zeigten die Nanomaterialien eine geeignete Anordnung mit einer höheren Anzahl von APTMS auf der Sensor-Elektrodenoberfläche, was letztendlich mehr Antikörper anzieht. Schließlich wurde PEG-COOH für Blockierzwecke hinzugefügt, und die Kapazität stieg auf 3,64 × 10⁹ nF. Der Sensor arbeitet basierend auf Änderungen der Oberflächenladung und letztendlich Kapazitätsänderungen. Die Oberflächenladungsänderungen variieren mit molekularen Anbindungen/Interaktionen. Jedes Molekül trägt unterschiedliche Ladungen und beeinflusst die Kapazität des Sensors. Daher wurde der Unterschied in der Kapazität für die Messungen berücksichtigt. Höhere Kapazitätsänderungen wurden aufgrund der höheren Belegung von IL-3-Antikörpern auf der Sensor-Elektrodenoberfläche festgestellt (Abb. 3b). PEG-COOH hilft, unspezifische Bindung von IL-3 auf der Sensor-Elektrodenoberfläche zu reduzieren und falsch-positive Ergebnisse zu eliminieren. Verschiedene Studien haben bewiesen, dass PEG-basierte Polymere auf Sensoroberflächen die Biokompatibilität verbessern, das Signal-Rausch-Verhältnis reduzieren und eine richtige Orientierung immobilisierter Biomoleküle auf Sensoroberflächen bieten, was zu einer niedrigeren Detektionsgrenze des Sensors führt. Da die APTMS-Oberfläche andere Biomoleküle elektrostatisch anzieht, wurde PEG-COOH verwendet, um die überschüssige APTMS-Oberfläche auf dem Zeolith-Eisen-Nanomaterial abzudecken, was hilft, Biofouling zu reduzieren. Diese Anti-IL-3-modifizierte Oberfläche wurde genutzt, um IL-3 zu identifizieren.

Bestimmung und Quantifizierung von IL-3 auf der Anti-IL-3-Antikörper-Oberfläche

IL-3 wurde auf einer Anti-IL-3-modifizierten kapazitiven Elektroden-Sensoroberfläche quantifiziert. Zunächst wurde eine höhere Konzentration von IL-3 (100 pg/mL) auf der Antikörper-modifizierten Oberfläche getestet, und der Kapazitätswert stieg von 3,74 × 10¹⁰ nF auf 13 × 10¹⁰ nF. Dieser Anstieg bestätigt die Interaktion von IL-3 mit Anti-IL-3-Antikörper (Abb. 4a). Ein ähnliches Experiment wurde mit IL-3-Konzentrationen von 3 bis 50 pg/mL durchgeführt. Wie in Abb. 4b gezeigt, stiegen die Kapazitätswerte auf 4,56 × 10¹⁰ nF, 5,84 × 10¹⁰ nF, 6,64 × 10¹⁰ nF, 8,39 × 10¹⁰ nF und 12 × 10¹⁰ nF. Es wurde festgestellt, dass mit steigenden IL-3-Konzentrationen die Kapazitätswerte allmählich zunahmen (Abb. 5a). Der Unterschied in den Kapazitätswerten wurde berechnet und in einem Excel-Blatt geplottet, und die Detektion von IL-3 wurde als 3 pg/mL mit einem R²-Wert von 0,9673 berechnet (Abb. 5b). Eine lineare dosisabhängige Antwort mit verschiedenen IL-3-Konzentrationen (3–100 pg/mL) wurde bei der Interaktion mit Anti-IL-3 gefunden. Bei weiteren Titrationen waren die Proben jedoch gesättigt.

Biofouling/Nicht-Fouling auf der APTES-Zeolith-Eisen-modifizierten Kapazitiv-Elektrode

Biofouling ist das größte Problem bei jedem Biosensor, was zu falsch-positiver Identifikation des Ziels auf der Sensoroberfläche führt. Blockiermittel wie BSA, Ethanolamin und PEG-basierte Polymere sind gängige Moleküle, die Biofouling auf Sensoroberflächen reduzieren. Hier wurde PEG-COOH als Blockiermittel verwendet, und der Biofouling-Effekt wurde in drei verschiedenen Kontrollexperimenten bestätigt: ohne IL-3-Antikörper, mit einem nicht-immunen Antikörper und mit einem Kontrollprotein (IL-8). Wie in Abb. 6a gezeigt, zeigten alle drei Kontrollexperimente keinen Kapazitätsanstieg, was die spezifische Identifikation von IL-3 ohne Biofouling anzeigt.

Spiking von IL-3 in menschlichem Serum und Stabilität

Verschiedene Konzentrationen von IL-3 wurden in menschlichem Serum gespikt und dem gleichen experimentellen Verfahren unterzogen, um IL-3 in realen Situationen zu identifizieren. Wie in Abb. 6b dargestellt, erzeugte gespiktes IL-3 in menschlichem Serum eindeutig erhöhte Kapazitätswerte mit steigenden IL-3-Konzentrationen. Dieses Ergebnis bestätigt die selektive IL-3-Identifikation durch die Anti-IL-3-modifizierte kapazitive Elektrode.

In Bezug auf die Reproduzierbarkeit verhält sich die Sensoroberfläche gut, mit minimalen Fehlerwerten. Die Betriebslebensdauer der gefertigten Sensoroberfläche mit angebundenem Nanomaterial kann bei ordnungsgemäßer Lagerung in einem Desikkator auf drei Monate verlängert werden. Nach Anbindung der Sonde war die Oberfläche 2 Wochen stabil und neigte dazu, 19 % der Stabilität zu verlieren, wobei der Stabilitätsverlust ab der 3. Woche steil wurde. Um die hohe Leistung des aktuellen Sensors zu beweisen, wurde eine Vergleichsstudie mit derzeit verfügbaren Sensoren durchgeführt, und die Ergebnisse zeigen, dass er vergleichbar ist und in mehreren Fällen besser abschneidet (Tabelle 1).

Schlussfolgerung

Sepsis ist lebensbedrohlich, involviert eine überwältigende Immunreaktion, ist extrem gefährlich und betrifft den ganzen Körper. Diese Studie demonstrierte die Identifikation eines Sepsis-Biomarkers (IL-3) auf einer kapazitiven Elektrode. Zeolith-Eisen-Nanomaterial wurde aus kohleflugasche-modifizierter kapazitiver Elektrode extrahiert, um den Stromfluss bei Bindung von Biomolekülen an die Sensor-Elektrode zu erhöhen. Amin-Modifikation wurde durchgeführt, um Anti-IL-3-Antikörper an das Zeolith-Eisen anzubinden. IL-3-Detektion wurde auf einer Antikörper-modifizierten Elektrode durchgeführt und erreichte die Detektionsgrenze von IL-3 von 3 pg/mL. Weitere Kontrollexperimente zeigten keinen Kapazitätsanstieg, was die spezifische Detektion von IL-3 bestätigt, und selektive Experimente mit gespiktem IL-3 in menschlichem Serum zeigten einen klaren Kapazitätsanstieg. Diese experimentelle Methode quantifiziert IL-3-Level und hilft bei der Diagnose von Sepsis-Angriffen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind vollständig ohne Einschränkung verfügbar.

Abkürzungen

IL-3:

Interleukin-3

pg:

Pikogramm

mL:

Milliliter

µL:

Mikroliter

M:

Molar

FESEM:

Rasterelektronenmikroskopie mit Feldemission

FETEM:

Transmissionelektronenmikroskopie mit Feldemission

EDX:

Energiedispersive Röntgenspektroskopie

IRA:

Angeborener Reaktionsaktivator

COOH:

Carbonsäure

DNA:

Desoxyribonukleinsäure

RNA:

Ribonukleinsäure

ELISA:

Enzymgebundener Immunosorbenten-Assay

APTMS:

(3-Aminopropyl)-trimethoxysilane

KOH:

Kaliumhydroxid

PEG:

Polyethylenglykol