Redox-responsive Gelatin/Silica-Nanogele funktionalisiert mit AS1411-Aptamer für gezielte siRNA-Delivery

Zusammenfassung

RNA-Interferenz (RNAi) bietet unübertroffene Spezifität für Gen-Silencing, doch siRNA-Stabilität und präzise Gewebelieferung bleiben limitierende Faktoren. Wir entwickelten ein dual-responsives System, indem wir gelatin-basierte Nanogele (GS) mit dem Nukleolin-zielenden AS1411-Aptamer und desoxynukleotid-substituiertem siRNA über einen Disulfid-Linker konjugierten. Dieses Design erlaubt transienten Andockens von siRNA und löst dessen Freisetzung in einer Glutathion-reichen Tumormikroumgebung aus. In Nukleolin-positiven A549-Zellen disassemblieren die Apt-GS/siRNA-Nanogele bei intrazellulärer GSH-Exposition und liefern siRNA effizient in das Zytosol, was potenten Luciferase-Knockdown erreicht. Zytotoxizitätsassays bestätigten Biokompatibilität bei therapeutisch relevanten Konzentrationen. Diese redox-responsiven, tumor-zielenden Nanogele repräsentieren eine vielversprechende Plattform für siRNA-basierte Krebstherapie.

Einleitung

RNAi nutzt sequenzspezifisches Gen-Silencing und positioniert es als führenden Kandidaten für Behandlung genetischer Störungen, Krebs und Infektionskrankheiten aufgrund seiner Präzision und niedrigen Toxizität. Im Vergleich zu Antisense-Oligonukleotiden zeigen kleine interferierende RNAs (siRNAs) erhöhte Nuklease-Resistenz. Chemische Modifikationen – wie Substitution von Ribonukleotiden durch Desoxynukleotide – haben gezeigt, siRNA-Stabilität zu steigern, während ~40 % der RNAi-Aktivität erhalten bleiben. Trotz dieser Fortschritte bleibt effiziente, gewebespezifische Lieferung eine gewaltige Herausforderung.

Nanopartikel-Träger können siRNA vor Abbau schützen und gezielte Lieferung erleichtern. Nukleolin, überexprimiert auf der Oberfläche vieler proliferierender Krebszellen, ist ein attraktives Ziel für tumor-spezifische Aufnahme. Der G-Quadruplex-DNA-Aptamer AS1411 (AGRO100) bindet Nukleolin mit hoher Affinität und ist in Phase-II-Klinische Studien als Antikrebsmittel eingetreten. Frühere Studien konjugierten AS1411 erfolgreich an verschiedene Nanomaterialien und erreichten selektive Tumorzell-Internalisierung. Gelatin, ein biologisch abbaubares Protein, wurde für siRNA-Einkapselung aufgrund seiner exzellenten Biokompatibilität und Gelier-Eigenschaften eingesetzt. Unsere Gruppe entwickelte zuvor siloxan-vernetzte Gelatin-Nanogele (GS NGs) mit kontrollierter Größe und Oberflächenladung, die effiziente Transfektion in vitro und in vivo demonstrierten.

Das Überwinden intrazellulärer Barrieren – insbesondere Endosomen-Flucht und siRNA-Freisetzung – ist kritisch. Stimuli-responsives Verknüpfungen, wie Disulfidbindungen, die in der hohen Glutathion (GSH)-Umgebung von Tumorzellen gespalten werden, haben signifikantes Interesse geweckt. Disulfid-vernetzte Träger können einen Burst-Release von therapeutischen Payloads spezifisch in malignen Zellen auslösen.

Hier präsentieren wir ein hybrides Nanogel-System, das GS NGs, AS1411-Aptamer-Targeting und einen Disulfid-Linker für redox-getriggerte siRNA-Freisetzung kombiniert. Wir evaluieren seine Fähigkeit, zelluläre Aufnahme zu verbessern, tumor-spezifisches Gen-Silencing zu erreichen und niedrige Zytotoxizität aufrechtzuerhalten.

Methoden

Materialien

Gelatin (Bloom 240–270, pH 4,5–5,5) wurde von BBI Company Inc. (USA) bezogen. SPDP, GPSM und APTMS wurden von Sigma-Aldrich (USA) gekauft. MTT, DMEM, FBS, Penicillin und Streptomycin wurden von Hyclone (USA) erhalten. AS1411, 5'-FAM-AS1411 und der negative Kontroll-TDO wurden von Sangon Biotech (China) synthetisiert. Desoxynukleotid-substituiertes Luc-siRNA (Sense-Strang: 5'-SH-(CH2)6-CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'; Antisense-Strang: 3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5'; FAM-markiertes Antisense) wurde HPLC-gereinigt von Gene Pharma (China). Lipofectamine 2000, das Luciferase-Plasmid pGL3 und das Luciferase-Assay-System stammten von Promega (USA). A549 Lungenadenokarzinom-Zellen und NIH 3T3 Fibroblasten wurden vom Biomedizinischen Ingenieurzentrum der Xiamen Universität (China) bereitgestellt. Alle Reagenzien waren analytischer Grad; Glaswaren wurden gründlich gereinigt und mit deionisiertem Wasser gespült.

Verwendete DNA-Sequenzen:

• AS1411 Aptamer: 5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3'
• Kontroll TDO: 5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3'

Herstellung und Charakterisierung von Apt-GS/siRNA-Komplexen

GS-Nanogele wurden via Sol-Gel-Prozess synthetisiert: GPSM (0,2 g) wurde zu 20 ml 0,75 % Gelatin in HCl (pH 3) bei 60 °C für 30 min zugegeben, gefolgt von APTMS (0,08 g) und 24-h Inkubation. Die resultierenden GS NGs wurden durch Zentrifugation (14.000 rpm, 25 °C, 12 min) dreimal gereinigt. Anschließend wurden GS NGs (0,5 ml, 5 g L⁻¹ PBS) mit SPDP (25 µl, 20 mM DMSO) für 60 min bei Raumtemperatur reagiert, dann 12 h mit thioliertem AS1411 (1 mg ml⁻¹) inkubiert. Die Apt-GS-Nanogele wurden durch Zentrifugation zurückgewonnen und dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen. Die SPDP-aktivierte Apt-GS NG Suspension (80 ml, 5 mg ml⁻¹) wurde über Nacht bei 4 °C mit dem siRNA Sense-Strang gemischt. Nach Reinigung wurde der Antisense-Strang durch Erhitzen auf 94 °C für 5 min und Abkühlen auf 47 °C für 20 min geannealt, wodurch Apt-GS/siRNA-Komplexe gebildet wurden.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Hitachi S-4300) zeigte sphärische Partikel. Dynamische Lichtstreuung (Malvern Zetasizer) maß hydrodynamische Durchmesser und Zeta-Potenziale. Konjugationseffizienz wurde durch Fluoreszenz von FAM-markierter DNA und Ninhydrin-Assay für Oberflächen-Aminogruppen (≈0,642 mmol g⁻¹) quantifiziert.

Gel-Elektrophorese-Analyse

Elektrophorese wurde bei 100 V für 20–30 min auf 2 % Agarose in TBE-Puffer durchgeführt. Bilder wurden mit einem Gel-Dokumentationssystem aufgenommen. Für Freisetzungsstudien wurden GS/siRNA und Apt-GS/siRNA Komplexe mit 10 mM GSH (PBS) für 2 h vor dem Laden inkubiert.

In Vitro Zytotoxizität

MTT-Assays wurden an A549-Zellen (1 × 10⁴ Zellen / Well) in 96-Well-Platten durchgeführt. Nach 24 h, um 70 % Konfluenz zu erreichen, wurden Zellen mit Nanogelen (100–600 µg ml⁻¹) in serum-freiem DMEM für 24 h behandelt, gefolgt von 4 h Inkubation mit MTT (5 mg ml⁻¹). DMSO wurde zugegeben, und Absorption wurde bei 490 nm gelesen. Experimente wurden tripliziert; Vitalität (%) wurde relativ zu unbehandelten Kontrollen berechnet.

Zelluläre Internalisierung

A549 und 3T3 Zellen wurden mit 25 µl FAM-markierten Apt-GS oder TDO-GS (2 mg ml⁻¹) für 10 h in serum-freiem Medium bei 37 °C inkubiert. Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und per konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) abgebildet. Für Durchflusszytometrie wurden Zellen mit FAM-markierten Nanogelen (2 mg ml⁻¹) für 0,5–16 h behandelt, dann gewaschen, in Eis-kaltem PBS resuspendiert und auf einem EPICS XL Durchflusszytometer analysiert. Aufnahmeminderung wurde bewertet, indem Zellen mit freiem AS1411 (0,5, 5, 50 µM) für 8 h vor Inkubation mit Nanogelen vorinkubiert wurden.

Gen-Silencing

A549 (2 × 10⁵ Zellen / Well) und NIH 3T3 (4 × 10⁵ Zellen / Well) Zellen wurden mit Apt-GS/siRNA Komplexen (80 µg ml⁻¹) für 8 h transfiziert. Drei Behandlungsregime wurden evaluiert: (a) Apt-GS/siRNA allein; (b) Apt-GS/siRNA gefolgt von Liposom (A-GS/si→Lip); (c) gleichzeitiges Apt-GS/siRNA und Liposom (A-GS/si+Lip). Nach zusätzlichen 40 h wurde Luciferase-Aktivität mit einem Luciferase-Assay-System gemessen. Daten wurden als Mittelwert ± SEM (Triplikat) dargestellt.

Ergebnisse und Diskussionen

Synthese und Charakterisierung von GS-AS1411/siRNA-Komplexen

TEM-Bilder (Abb. 1) bestätigten, dass sowohl leere GS als auch Apt-GS-Nanogele uniforme sphärische Partikel mit Durchmessern von 170–200 nm formten. Fluoreszenzbildgebung demonstrierte erfolgreiche Konjugation von AS1411 und siRNA. Quantifizierung ergab ~0,65 µmol g⁻¹ Aptamer auf GS. Hydrodynamische Größen stiegen von 162,3 nm (GS) auf 216,5 nm (Apt-GS) und 234,9 nm (Apt-GS/siRNA), was Oberflächenfunktionalisierung widerspiegelt. Zeta-Potenziale verschoben sich von +40,1 mV (GS) auf +33,9 mV (Apt-GS) und –24,9 mV (Apt-GS/siRNA), was eine Reduktion der Oberflächenladung anzeigt, die nicht-spezifische Proteinbindung und Zytotoxizität verringern soll.

siRNA-Beladung und Freisetzung

Gel-Elektrophorese zeigte effiziente siRNA-Beladung auf Apt-GS/siRNA-Komplexe, belegt durch reduzierte Mobilität (Lanes 10–11). Bei Inkubation mit 10 mM GSH wurde siRNA innerhalb 2 h freigesetzt (Lanes 6–7), was redox-getriggertes Disassembly bestätigt. Beladungskapazität wurde auf 3:1 bis 2:1 pmol siRNA pro µg Nanogel geschätzt. Physikalische Einkapselung (Mischen von freiem siRNA mit GS) zeigte schwächere Retention, was den Vorteil kovalenter Bindung unterstreicht.

Zytotoxizität und Nukleolin-Targeting

MTT-Assays (Abb. 4) zeigten >80 % Vitalität für GS, Apt-GS und Apt-GS/siRNA über 100–600 µg ml⁻¹, was exzellente Biokompatibilität demonstriert. Leicht reduzierte Vitalität mit Apt-GS wurde auf AS1411-induzierte NF-κB-Inhibition und Organellen-Störung zurückgeführt. Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (Abb. 5 & 6) bestätigten selektive Aufnahme: Apt-GS zeigte 96 % Internalisierung in A549-Zellen versus 52 % in 3T3-Fibroblasten. Konkurrenz mit freiem AS1411 reduzierte Aufnahme um 50 % (Fluoreszenz) und 30 % (Prozentsatz positiver Zellen), was nukleolin-vermittelte Endozytose bestätigt.

RNA-Interferenz

Luciferase-Knockdown-Assays (Abb. 7a) demonstrierten eine 4,6-fache Reduktion in A549-Zellen mit Apt-GS/siRNA, verglichen mit nur 6 % in NIH 3T3-Zellen, was Tumor-Spezifität hervorhebt. Zugabe von Liposomen (A-GS/si→Lip) steigerte Silencing nicht signifikant (30,4 %) relativ zu Apt-GS/siRNA allein, während gleichzeitige Liposom-Behandlung (A-GS/si+Lip) Knockdown auf 41,6 % erhöhte. Die höchste Silencing (≈ 2,7-fach über 3T3) wurde bei 80 µg ml⁻¹ erreicht, mit abnehmender Effizienz bei 120 µg ml⁻¹ wahrscheinlich aufgrund erhöhter Zytotoxizität.

Schlussfolgerungen

Wir haben eine redox-responsive, nukleolin-zielende Nanogel-Plattform entwickelt, die desoxynukleotid-modifiziertes siRNA schützt und es spezifisch im GSH-reichen Tumorzytosol freisetzt. Die ~200 nm, positiv geladenen Apt-GS/siRNA-Nanogele erreichen potentes, tumor-selektives Gen-Silencing (~5-fache Verbesserung in A549-Zellen) bei Aufrechterhaltung niedriger Zytotoxizität. Diese Ergebnisse validieren die Strategie, Disulfid-Linker-Chemie mit Aptamer-Targeting für effiziente siRNA-Lieferung zu kombinieren und repräsentieren einen vielversprechenden Schritt Richtung klinischer RNAi-Therapeutika.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Artikel enthalten.

Abkürzungen

APTMS

3-Aminopropyl-trimethoxysilane

DMEM

Dulbecco's modified Eagle's medium

DMSO

Dimethyl sulfoxide

FAM

Fluorescein amidite

GE

Gel electrophoresis (Gel-Elektrophorese)

GPSM

3-Glycidoxypropyl-trimethoxysilane

GS NGs

Siloxane-crosslinked gelatin nanogels (Siloxan-vernetzte Gelatin-Nanogele)

MTT

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

RNAi

RNA interference (RNA-Interferenz)

siRNAs

Small interfering RNAs (Kleine interferierende RNAs)

SPDP

N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate

TDO

Negative DNA oligonucleotide (Negative DNA-Oligonukleotid)

Ein redox-responsives und tumor-zielendes Apt-GS-Nanogel wurde für siRNA-Delivery mit Disulfid-Konjugation und Aptamer AS1411 entwickelt.

Bilder von Apt-GS (a, c) und Apt-GS/siRNA Nanogelen (b, d). a, b TEM-Bilder. Skalenbalken: 0,5 µm. c, d Fluoreszenzbilder. Skalenbalken: 5 µm.

Hydrodynamische Größe und Zeta-Potenziale von GS, Apt-GS und Apt-GS/siRNA Nanogelen.

AGE-Analyse der siRNA reversiblen Bindung an Apt-GS Nanogele. Lanes 1–5: freies siRNA (50–10 pmol). Lanes 6–7: GS/siRNA und Apt-GS/siRNA mit 10 mM GSH (2 h). Lane 8: freies siRNA gemischt mit Apt-GS NGs. Lanes 10–11: GS/siRNA und Apt-GS/siRNA ohne GSH.

Zellvitalität von A549-Zellen mit GS, Apt-GS und Apt-GS/siRNA Nanogelen bei verschiedenen Konzentrationen (MTT-Assay).

a–c Zellaufnahme von FAM-siRNA geliefert durch Apt-GS und TDO-GS Nanogele. Bilder von CLSM. Grünes Signal: FAM. Skalenbalken: 10 µm.

Durchflusszytometrie-Analyse der Zellaufnahme von FAM-markierten Apt-GS und TDO-GS Nanogelen. Inset: FACS-Profile. a, b Kurven: Inkubationszeit (0,5–16 h). c Kurve: AS1411-Konzentration (0–16 µM).

In vitro Silencing-Effekt von Anti-Luciferase-siRNA formuliert in Apt-GS Nanogelen mit verschiedenen Behandlungen (a) und Konzentration von Apt-GS/siRNA Komplexen (b) auf Gen-Silencing.