Gezielte Gliomtherapie: Gint4.T-modifizierte DNA-Tetraeder liefern Doxorubicin zur Hemmung der PDGFRβ-getriebenen Zellproliferation

Zusammenfassung

Gliom ist einer der tödlichsten intrinsischen Hirntumoren aufgrund seines invasiven Wachstums. Die Wirkung der Gliombehandlung ist schlecht aufgrund der Präsenz der Blut-Hirn-Schranke und Blut-Tumor-Schranke sowie unzureichender Medikamenten-Targeting. DNA-Tetraeder (TDN) zeigen großes Potenzial für Medikamentenlieferung und könnten eine neuartige therapeutische Strategie für Gliome sein. In dieser Studie verwendeten wir TDN, um Doxorubicin (DOX) für die Gliomtherapie zu liefern. Gint4.T, ein Aptamer, das den Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor β auf Tumorzellen erkennen kann, wurde verwendet, um TDN (Apt-TDN) für gezielte Medikamentenlieferung zu modifizieren. Die TDN wurden durch Ein-Schritt-Synthese selbst-assembliert, was kleine Größe (10 nm) und negative Ladung zeigte. Fetales Kälberserum-Test zeigte seine Stabilität als Medikamentenlieferungsvehikel. Apt-TDN konnte effektiv von U87MG-Zellen aufgenommen werden. Im Vergleich zu DOX und DOX@TDN (TDN beladen mit DOX) zeigte DOX@Apt-TDN (Gint4.T-modifizierte TDN beladen mit DOX) höhere frühe Apoptoserate, höheren Zellzyklusarrest und größere Zytotoxizität gegenüber U87MG-Zellen. Zusammenfassend wiesen unsere Ergebnisse darauf hin, dass DOX@Apt-TDN eine neuartige Therapie mit vielversprechender klinischer Anwendung für Gliompatienten bietet.

Einleitung

Gliom, ein Tumor, der aus dem Neuroepithel abgeleitet ist, ist die häufigste intrakranielle Malignität. Fast 1/3 aller Hirntumoren sind Gliome, und ungefähr 4/5 der primären malignen Hirntumoren sind Gliome. Derzeit ist die effektivste Behandlung für Gliom chirurgische Resektion und postoperative gleichzeitige Chemoradiotherapie, aber leider bleibt die Prognose für Patienten schlecht. Traditionelle Chemotherapie für Gliom zeigt kein gutes Ergebnis aufgrund schlechter Tumor-Targeting, Komplikationen durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) und Blut-Tumor-Schranke (BTB) sowie unzureichendes Medikamenten-Targeting. Die BBB ist der wichtigste Faktor, der die Lieferung fast aller Makromoleküle (einschließlich Medikamente und Gene) in das Hirnparenchym und ihre ordnungsgemäße Funktion verhindert. Medikamente, die die BBB nicht überwinden können, müssen in ausreichend hohen Dosen verabreicht werden, um eine effektive Behandlungskonzentration im Interessengebiet zu erreichen. Allerdings können übermäßige Medikamente schwere systemische Nebenwirkungen und unerwünschte Medikamentenakkumulation in unbeeinflussten Geweben verursachen. Darüber hinaus haben bestehende konventionelle Anti-Gliom-Medikamente unzureichende Targeting-Fähigkeiten. Nanopartikel haben sich als das vielversprechendste Medikamententransportwerkzeug herausgestellt. Aufgrund ihres Größen-Vorteils können Nanopartikel die BBB überwinden und eine antitumorale Wirkung ausüben. Kafa et al. entwarfen chemisch funktionalisierte mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren (f-MWNTs), die ANG targetieren, und bestätigten ihre Fähigkeit, die BBB durch in vivo und in vitro Experimente zu überwinden. Allerdings können diese Nanomaterialien auf verschiedene Organe im gesamten Körper verteilt werden oder sogar in das zentrale Nervensystem (ZNS) eintreten, wo sie Neurotoxizität verursachen können.

DNA ist ein ideales Material für Nanostrukturkonstruktion, da ihre Assemblierung durch Watson-Crick-Basenpaarung präzise kontrolliert werden kann. Bis heute wurden eine Reihe von zwei-dimensionalen (2D) und drei-dimensionalen (3D) DNA-Nanostrukturen entworfen und demonstriert. Tetraedrische DNA-Nanostrukturen (TDN) haben erhebliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen aufgrund ihrer Biokompatibilität, Stabilität, reichlicher funktionalisierbarer Modifikationsstellen und geringer Immunogenität. Turberfield et al. synthetisierten DNA-tetraedrische Nanostrukturen mit hoher Ausbeute unter Verwendung einer Ein-Schritt-Synthesemethode. Walsh et al. fanden, dass ein Nukleinsäure-Sonden-haltender DNA-Tetraeder in Säugetierzellen eintreten konnte, ohne Transfektionsreagenz zu benötigen. Lee et al. demonstrierten, dass selbst-assemblierte tetraedrische Nanopartikel für gezielte siRNA-Lieferung in vivo verwendet werden können. TDN haben hervorragende Anwendungsperspektiven in molekularer Diagnostik, molekularer Lieferung und gezielter Medikamententherapie gezeigt. Sie werden auch breit in der Forschung zu Tumoren in verschiedenen Organen verwendet, wie Brustkrebs. Ähnlich wurden TDN auch in der Untersuchung von Nervensystemerkrankungen eingesetzt. Tian et al. verwendeten DNA-Tetraeder als Grundlage und modifizierten sie mit Angiopep-2 (ANG), um erfolgreich den Nanoprobe ANG-TDN zu konstruieren, der das Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-verwandte Protein 1 (LRP-1) für gezielte Bildgebung targetieren konnte. Forschung zeigte, dass ANG-TDN die BBB überwinden kann. Ma et al. schlugen vor, dass tetraedrische DNA-Nanostrukturen in neurale Stammzellen (NSCs) ohne Transfektionsmittel eintreten können, wo sie neurale Stammzellmigration, -proliferation und -differenzierung fördern und großes Potenzial für neurale Gewebereparatur und -regeneration haben. Daher untersuchten wir die Möglichkeit der Verwendung von TDN in der Gliomtherapie und der Verbesserung ihrer Targeting-Fähigkeit.

Der Thrombozyten-abgeleitete Wachstumsfaktor-Rezeptor β (PDGFRβ) ist ein wichtiges Mitglied der Tyrosin-Proteinkinase-Familie, das an zellulärer Proliferation, Migration und Angiogenese beteiligt ist. Mehrere Studien haben gezeigt, dass PDGFβ ein vielversprechendes Ziel für Anti-Tumor-Therapien ist wegen seiner Rolle in der Angiogenese. Aptamere sind kurze, einzelnsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide, die durch die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) Methode produziert werden. Aptamere sind Antikörpern ähnlich, die hohe Affinität und Spezifität gegenüber ihren Zielen haben. Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften spielen Aptamere eine wichtige Rolle in der gezielten Lieferung von Chemotherapeutika, siRNAs und medikamentenbeladenen Nanopartikeln. Gint4.T, ein RNA-Aptamer, das spezifisch PDGFRβ binden kann, ist auch ein PDGFRβ-spezifischer Antagonist. Monaco et al. schlugen vor, dass Gint4.T-Aptamere die Blut-Hirn-Schranke (BBB) überwinden und spezifisch PDGFRβ erkennen können. Gint4.T-konjugierte polymere Nanopartikel (PNPs) können leicht von Glioblastom (GBM) Zellen aufgenommen werden. In dieser Studie berichten wir über ein neuartiges medikamentenbeladenes System, das den Gint4.T-Aptamer und TDN kombiniert. Das Gint4.T-modifizierte TDN (Apt-TDN) beladen mit DOX (DOX@Apt-TDN) zeigte verbesserte spezifische zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität gegen U87MG-Zellen.

Methoden

Materialien

Alle DNA-Oligonukleotide und 2'F-Py RNA-Oligonukleotide wurden von Sangon Biotech (Shanghai, China) gekauft, und alle Oligonukleotid-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. GelRed DNA-Gel-Färbelösung wurde von Sangon Biotech gekauft. Sowohl fetales Kälberserum (FBS) als auch Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) wurden von Thermo Fisher (New York, USA) gekauft. Doxorubicin (DOX) wurde von Mengbio Technology (Chongqing, China) gekauft. U87MG-Zellen wurden von Shanghai Life Academy of Sciences Cell Library (Shanghai, China) gekauft. DAPI wurde von Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, China) gekauft.

Herstellung von DNA-Nanostrukturen

Zur Assemblierung des DNA-Tetraeders (Tabelle 1) wurden 2 μL jedes Oligonukleotids (S1, S2, S3 und S4) zu 42 μL TM-Puffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, pH = 8) gegeben. Die DNA-Lösung wurde dann auf 95 °C für 5 min erhitzt und anschließend auf 4 °C für 2 min mit einem Bio-Rad PCR-Gerät (Kalifornien, USA) abgekühlt. Die finale Konzentration von TDN betrug 2 μM. TDN' wurde auf die gleiche Weise hergestellt, außer dass S1 durch S1' ersetzt wurde. Zur Synthese des Apt-TDN wurde der Gint4.T-Aptamer im gleichen molaren Verhältnis zu TDN zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37 °C für 60 min inkubiert. Vor der Synthese wurde der Aptamer einem kurzen Denaturierungs-Renaturierungsschritt unterzogen (85 °C für 5 min, schnelle Abkühlung über 2 min und anschließendes Erwärmen auf 37 °C über 10 min).

Agarose-Gelelektrophorese

Ein Agarose-Gel (3 %) wurde in 0,5× TEB-Puffer bei 100 V für 30 min durchgeführt. Die Temperatur des Elektrophoresegeräts wurde durch Platzieren des Geräts in einem Eisbad auf 0 °C gehalten. Vor der Elektrophorese wurde GelRed zum Agarose-Gel hinzugefügt, um die DNA-Stränge zu färben. Wenn der Prozess beendet war, wurde ein Bio-Rad-Fluoreszenz-Scanner (Kalifornien, USA) verwendet, um ein Bild des Gels aufzunehmen.

Dynamische Lichtstreuung

Ein Malvern Zetasizer ZS90 (Malvern, UK) wurde verwendet, um die hydrodynamische Größe und das Zeta-Potenzial der TDN zu messen. Insgesamt 1 mL der TDN (100 nM) wurde der dynamischen Lichtstreuung (DLS) Analyse unterzogen.

Rasterkraftmikroskopie-Bildgebung

Die TDN wurden mit TM-Puffer (Tris-HCl-Puffer mit MgCl₂) auf 100 nM verdünnt. Dann wurden 10 μL jeder TDN-Probe zu frisch gespaltenem Glimmer gegeben und für 10 min inkubiert. Die Proben wurden anschließend an einem Rasterkraftmikroskop (AFM) Instrument im AC-Modus (Agilent 5500, USA) abgebildet.

Messung der Medikamentenbeladungskapazität der hergestellten TDN

Doxorubicin wurde in deionisiertem Wasser gelöst, um eine 500-μM-Lagerlösung herzustellen. Doxorubicin bei verschiedenen Konzentrationen (1 bis 20 μM) wurde mit TDN (100 nM) oder Apt-TDN (100 nM) für 6 h bei Raumtemperatur (24–26 °C) gemischt. Die gemischten Lösungen wurden dann bei 12.000×g für 10 min zentrifugiert, um die medikamentenbeladenen TDN zu erhalten. Dann wurden 50 μL der Überstände entnommen und im 1:1 Verhältnis mit PBS gemischt. Ein Varioskan LUX Mikroplattenleser (Kalifornien, USA) wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität von Doxorubicin (λ_ex = 480 nm und λ_em = 590 nm) zu messen, um die Menge an Doxorubicin in den Überständen zu bestimmen. Die Konzentration von in den TDN beladenem Doxorubicin wurde durch die Standardkurve und Fluoreszenzintensität berechnet. Wir mischten auch Doxorubicin mit den TDN bei steigenden molaren Verhältnissen.

Serumstabilität der TDN In Vitro

Die TDN wurden mit vollem Medium gemischt und bei 37 °C für 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 oder 24 h inkubiert. Die TDN-Lösungen wurden im 1:1 Verhältnis mit FBS gemischt und bei 37 °C für 1, 3, 5 oder 7 h inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Gemische auf ein 3 % Agarose-Gel aufgebracht.

Zytotoxizität der TDN In Vitro

Zur Bestimmung der Zytotoxizität der Nanostruktur wurde der CCK-8-Test verwendet, um die Zelllebensfähigkeit von U87MG-Zellen nach Behandlung mit den TDN bei einer Reihe von Konzentrationen zu bewerten. U87MG-Zellen bei einer Konzentration von 1 × 10⁴ Zellen/Well wurden auf eine 96-Well-Platte aufgebracht. Das Zellkulturmedium wurde entfernt, und frische Medien mit 0–500 nM TDN wurden hinzugefügt und nach übernächtiger Inkubation für weitere 24 h und 48 h inkubiert. Dann wurden 10 μL CCK-8-Lösung zu jedem Well hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 1 h inkubiert. Die Absorption bei 450 nm wurde dann mit einem Mikroplattenleser gemessen.

Fluoreszenzbildgebung

Die zelluläre Aufnahme von DOX und TDN wurde durch Fluoreszenzmikroskopie (Olympus, Tokyo, Japan) untersucht. U87MG-Zellen wurden auf Deckgläser in 24-Well-Platten mit Medium, das 10 % hitze-inaktiviertes fetales Kälberserum und 1 % Penicillin und Streptomycin enthielt, aufgebracht und für mindestens 1 Tag bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ gewachsen, bis die Zellen mindestens 75 % Konfluenz erreichten. Nach der Inkubation wurden die Kulturmedien entfernt. Vollständige Medien mit 100 nM Cy3-TDN und Cy3-Apt-TDN wurden hinzugefügt und für 3 h inkubiert. TDN und Apt-TDN wurden mit Cy3 markiert, um die intrazelluläre Aufnahme der Nanopartikel zu detektieren. Zur Bewertung der zellulären Aufnahme von DOX wurden DOX (DOX 2 μM), DOX@TDN (DOX 2 μM) und DOX@Apt-TDN (DOX 2 μM) zu U87MG-Zellen hinzugefügt und für 3 h inkubiert. Nach 3 h Behandlung wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 20 min im Dunkeln fixiert und anschließend mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 min gefärbt. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.

Durchflusszytometrie

Insgesamt 1 × 10⁶ U87MG-Zellen wurden in 6-Well-Platten implantiert. Nach übernächtiger Inkubation wurden die Kulturmedien entfernt, und Medien ergänzt mit 100 nM Cy3-TDN, 100 nM Cy3-Apt-TDN oder 100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 μM freiem Apt wurden hinzugefügt und für 3 h inkubiert. Dann wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 20 min fixiert, und Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Prozentsätze der Cy-3-positiven Zellen zu analysieren.

Zellzyklus und Apoptose

Nach Behandlung mit DOX, DOX@TDN oder DOX@Apt-TDN für 24 h wurden 5 × 10⁵ Zellen gesammelt und in 75 % ice-kaltem Ethanol über Nacht fixiert. Dann wurden die Zellen mit RNase und Propidiumiodid für 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Der Zellzyklus wurde durch Durchflusszytometrie untersucht. Zusätzlich wurden nach den verschiedenen Behandlungen die Zellen mit Annexin V-FITC/DAPI gefärbt, und frühe Apoptose wurde erforscht.

CCK-8-Tests

Zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit wurden U87MG-Zellen (5 × 10³) auf 96-Well-Platten mit 100 μL Medium aufgebracht und über Nacht bei 37 °C unter einer Atmosphäre mit 5 % CO₂ kultiviert. Das Medium wurde anschließend entfernt, und frisches Medium mit DOX, DOX-TDN oder DOX-Apt-TDN wurde hinzugefügt. Nach 24 h Inkubation wurden 10 μL CCK-8-Lösung hinzugefügt, und die Zellen wurden für weitere 1 h kultiviert. Ein Mikroplattenleser wurde verwendet, um die Absorption bei 450 nm zu messen.

Statistische Analyse

Alle Experimente in dieser Studie wurden in Triplikaten durchgeführt, und alle Daten werden als Mittelwert mit seiner Standardabweichung (Mittelwert ± SD) präsentiert. Statistische Analyse wurde mit dem SPSS 24.0 Programm (IBM, USA) durchgeführt. Signifikante Unterschiede wurden mit dem Student's t-Test bestimmt, wobei P < 0,05 signifikante Unterschiede zwischen Gruppen anzeigte.

Ergebnisse

Synthese und Charakterisierung der TDN und Apt-TDN

Die TDN wurde aus vier Oligonukleotiden (Tabelle 1) durch Ein-Schritt-Synthese wie zuvor berichtet selbst-assembliert. Der tumor-targetende Aptamer Gint4.T wurde verwendet, um TDN über Watson-Crick-Basenpaarung zu modifizieren. Der DNA-Tetraeder enthält vier Flächen, wobei jede Fläche durch ein Oligonukleotid gebildet wird. Somit hybridisierten vier Oligonukleotide miteinander, um einen DNA-Tetraeder zu bilden (Abbildung 1a). Gelelektrophorese-Analyse zeigte ein einzelnes prominentes Band in den Lanes 4 und 5, was darauf hindeutet, dass TDN und Apt-TDN erfolgreich konstruiert wurden. Die Mobilität des Apt-TDN war im Vergleich zu der des TDN verringert, was suggeriert, dass der Gint4.T-Aptamer die TDN erfolgreich modifizierte.

Die Größen der TDN und Apt-TDN wurden durch DLS und AFM bestimmt. Die TDN und Apt-TDN zeigten Partikelgrößen von 10,1 nm bzw. 13,5 nm, was die Addition des Gint4.T-Liganden reflektiert (Abbildung 1c (A), (B)). Da der hydrodynamische Durchmesser Wassermoleküle einschließt, waren die Partikel größer als ihre theoretischen Größen. Die Höhen sowohl der TDN als auch der Apt-TDN, bestimmt durch AFM-Bilder, betrugen ~2 nm (Abbildung 1b), was anzeigt, dass die Aptamer-Modifikation die 3D-Struktur nicht veränderte. Die durchschnittlichen Zeta-Potenziale der TDN und Apt-TDN betrugen -5,69 mV (C) bzw. -7,3 mV (D) (Abbildung 1c (C) (D)). Basierend auf diesen Parametern schlossen wir, dass TDN und Apt-TDN erfolgreich assembliert wurden.

Stabilität und Zytotoxizität der TDN In Vitro

Gelelektrophorese-Analyse zeigte, dass die TDN intakt blieb, wenn sie 24 h bei 37 °C in vollem Medium inkubiert wurde (Abbildung 2a (A)). Darüber hinaus blieb die TDN stabil für mindestens 7 h, wenn die Konzentration von fetalem Kälberserum auf 50 % erhöht wurde (Abbildung 2a (B)), was mit früheren Berichten konsistent ist. Zur Bestimmung der Zytotoxizität der Nanostruktur wurde der CCK-8-Test verwendet, um die Zelllebensfähigkeit von U87MG-Zellen nach Behandlung mit den TDN bei einer Reihe von Konzentrationen zu bewerten. Wie in Abbildung 2b gezeigt, wurde keine signifikante Zytotoxizität in U87MG-Zellen beobachtet, die mit TDN bei 0–500 nM für 24 h und 48 h behandelt wurden. Daher können DNA-Nanopartikel als stabile und biosichere Träger für Medikamentenlieferung verwendet werden.

Medikamentenbeladungskapazität der TDN und Apt-TDN

Doxorubicin ist ein Breitspektrum-Chemotherapeutikum, das in DNA-Doppelstränge intercalieren kann. Wir berechneten eine Standard-Doxorubicin-Kurve (Abbildung 3a) und untersuchten dann die Interkalation von Doxorubicin in die TDN. Die Menge an interkaliertem Doxorubicin in den TDN und Apt-TDN stieg allmählich mit steigender Doxorubicin-Konzentration. Als die Doxorubicin-Konzentration 14 μM betrug, erreichte die Menge an interkaliertem Doxorubicin in den TDN und Apt-TDN ihren Höhepunkt bei 5,5 μM bzw. 6,0 μM und plateauierte anschließend (Abbildung 3b), was anzeigte, dass die DNA-Stränge vollständig besetzt waren. Gleichzeitig mischten wir Doxorubicin mit den TDN bei steigenden molaren Verhältnissen. Das Fluoreszenzspektrum von Doxorubicin wurde zur Analyse gescannt. Wie in Abbildung 3c gezeigt, wurde das Fluoreszenzspektrum von Doxorubicin bei einem molaren Verhältnis von 0,05 gequencht. Basierend auf diesen Ergebnissen schlossen wir, dass ungefähr 55 Moleküle Doxorubicin in einem einzelnen TDN enthalten waren, während 60 Moleküle in einem einzelnen Apt-TDN enthalten waren.

Gezielte zelluläre Aufnahme der Apt-TDN

DNA ist ein negativ geladenes Makromolekül, was seinen Eintritt in die negativ geladene Zellmembran erschwert. Typischerweise müssen einzelne DNA-Moleküle mit Hilfe von Transfektionsreagenzien in Zellen gelangen. Hier markierten wir TDN und Apt-TDN mit Cy3, um die intrazelluläre Aufnahme der Nanopartikel zu überwachen. Nach Inkubation mit U87MG-Zellen für 3 h erschien rotes Cy3-Fluoreszenzsignal im zellulären Zytoplasma, was anzeigte, dass die TDN die Zytomembran banden und ohne Hilfe von Transfektionsmitteln in die Zelle aufgenommen wurden (Abbildung 4a). Die Apt-TDN zeigte höhere rote Fluoreszenz, was suggeriert, dass die Präsenz des Gint4.T-Aptamers die DNA-Tetraeder-Aufnahme durch U87MG-Zellen signifikant erhöhte. Allerdings verringerte sich die Cy3-Fluoreszenz auf das Niveau der TDN allein, als freier Aptamer hinzugefügt wurde. Aufgrund kompetitiver Inhibition durch den freien Aptamer schließen wir, dass der Aptamer auf der TDN die Aufnahme der TDN nicht fördern konnte. Basierend auf dieser kompetitiven Inhibition bewiesen wir, dass die Apt-TDN U87MG-Zellen targetieren kann. Durchflusszytometrie bewies weiter, dass der Prozentsatz der Cy3-positiven U87MG-Zellen in der Apt-TDN-Gruppe höher war als in der TDN-Gruppe. Freier Apt verringerte den Prozentsatz der Cy3-positiven U87MG-Zellen in der Apt-TDN-Gruppe (Abbildung 4b).

Zelluläre Aufnahme von DOX@TDN und DOX@Apt-TDN

Wir nutzten das charakteristische Fluoreszenzspektrum von Doxorubicin, um die Medikamentenaufnahme-Effizienz zu bewerten. Nach 3 h Behandlung wurde intrazelluläres Doxorubicin durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet (Abbildung 5a). Freies Doxorubicin konnte in U87MG-Zellen eintreten und war im Zellkern lokalisiert. Mit der Zugabe von DOX@TDN war die Fluoreszenz höher als die von freiem Doxorubicin. Dieses Ergebnis suggierte, dass DNA-Nanopartikel die zelluläre Aufnahme von Doxorubicin verstärkten. Als DOX@Apt-TDN hinzugefügt wurde, war das rote Signal im Zellkern sogar höher als das der Zellen, denen DOX@TDN hinzugefügt wurde. Semi-quantitative Analyse der intrazellulären Aufnahme von DOX bestätigte weiter, dass die Apt-TDN eine mehr als zweifache Erhöhung der intrazellulären DOX-Aufnahme im Vergleich zum Einzelmedikament ermöglichte. Wir schließen, dass dies auf Gin4.T-spezifische Bindung an Rezeptoren zurückzuführen ist, woraufhin mehr Nanopartikel in die Zelle eintreten können. Nach Verdauung in Lysosomen kann Doxorubicin in das Zytoplasma freigesetzt werden und weiter im Zellkern funktionieren.

Zytotoxizität von DOX, DOX@TDN und DOX@Apt-TDN

Für die Zytotoxizitätsstudie wurden drei Gruppen von U87MG-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Doxorubicin behandelt (Abbildung 6a). Die IC₅₀-Werte für Doxorubicin betrugen 13,39 μM für DOX-Behandlung, 7,826 μM für DOX@TDN-Behandlung und 4,205 μM für DOX@Apt-TDN-Behandlung. Unter den drei Behandlungen zeigte DOX@Apt-TDN die höchste Zytotoxizität nach 24 h, was die Spezifität der Apt-TDN für U87MG-Zellen anzeigte. Nach 24 h wurden Zellen in den DOX, DOX@TDN und DOX@Apt-TDN Gruppen gesammelt und verwendet, um frühe Apoptose zu erforschen. Unsere Daten demonstrierten, dass die frühe Apoptoserate in der DOX@Apt-TDN-Gruppe höher war als in den anderen beiden Gruppen (Abbildung 6b). Darüber hinaus war der Anteil der Zellen in der G0/G1-Phase in der DOX-Apt-TDN-Gruppe im Vergleich zu den DOX- und DOX-TDN-Gruppen erhöht (p < 0,01), und das Verhältnis der Zellen in der S-Phase war in der DOX-Apt-TDN-Gruppe verringert (p < 0,01) (Abbildung 6c). Der Prozentsatz der Zellen in der G2-Phase änderte sich nicht (Daten nicht gezeigt).

Diskussion

Ob durch in vitro oder in vivo Experimente, die Stabilität eines Medikaments und seines Trägers muss bestimmt werden. Nach Assemblierung der TDN wurde ihre Stabilität zuerst in vitro bestimmt. Diese Studie zeigte, dass die 3D-Struktur von DNA-Nanopartikeln ihre Stabilität im Serum durch Inhibition der Enzymbindung verbessern kann. Die biologische Sicherheit der relevanten Nanostruktur ist die wichtigste Anforderung für ihre Anwendung. Keine signifikante Zytotoxizität wurde in U87MG-Zellen beobachtet, die mit verschiedenen Konzentrationen der TDN für 24 h oder 48 h ko-kultiviert wurden. Keine der in dieser Studie verwendeten DNA-Sequenzen kodiert genetische Informationen, und keine Nebenwirkungen wurden im Zytotoxizitätstest berichtet. Daher kann die TDN als sicheres und stabiles Medikamenten-Trägersystem dienen.

Die Targeting-Effizienz eines aptamer-modifizierten Nanostruktur ist entscheidend für die selektive Medikamentenlieferung an Krebszellen. Im Gegensatz zu Antikörpern sind Aptamere chemisch stabil, kostengünstig und können in Massenproduktion hergestellt werden. Darüber hinaus können Aptamere im Gegensatz zu anderen Materialien leicht an einen DNA-Tetraeder binden, indem sie das Prinzip der Basenkomplementarität nutzen. Somit legt die Kombination von Aptameren und DNA-Tetraedern die Grundlage für gezielte Medikamentenlieferung und Behandlungen der nächsten Generation. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die TDN in Zellen ohne Transfektionsmittel eintreten konnten, was ähnlich den Ergebnissen von Walsh et al. und Ma et al. ist. Im Vergleich zur TDN war die Aufnahme der Apt-TDN durch U87MG-Zellen signifikant erhöht. Nach Zugabe von freiem Aptamer verschwand dieser Anstieg. Dieses Ergebnis suggeriert, dass Gint4.T ein PDGFRβ-spezifischer Antagonist ist. Unsere Studie demonstrierte, dass der Gint4.T-Aptamer U87MG-Zellen aufgrund der hohen Expression von PDGFRβ auf der Oberfläche von Gliomzellen targetieren kann. Camorani et al. zeigten auch, dass der Gint4.T-Aptamer Tumorzellen durch spezifische Interaktion mit der extrazellulären Domäne von PDGFRβ targetieren kann. Die Vorteile der Gint4.T-Aptamer-Targeting wurden durch in vitro Studien bis zu einem gewissen Grad demonstriert, aber weitere in vivo Tests sind erforderlich, um diese Ergebnisse zu bestätigen. Diese Studie bestätigte auch, dass DOX@Apt-TDN zytotoxischer ist als DOX oder DOX@TDN, was wahrscheinlich auf zwei Faktoren zurückzuführen ist. Erstens kann der Gint4.T-Aptamer spezifisch an PDGFR extrazelluläre Domänen binden, Tumorzellproliferation blockieren und Tumorzellwachstum inhibieren. Dies ist konsistent mit unseren experimentellen Ergebnissen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe änderten sich die U87MG-Zellzyklen nach Behandlung mit DOX, DOX@TDN und DOX@Apt-TDN signifikant: Zunahme in der G0/G1-Phase, Abnahme in der S-Phase, Blockade der Tumorzellen in der G0/G1-Phase, was anzeigt, dass sie den Zellzyklus von U87MG-Zellen inhibieren und ihre Proliferation hemmen können. Im Vergleich zu den DOX- und DOX@TDN-Gruppen hatte die DOX@Apt-TDN-Gruppe eine signifikant stärkere Fähigkeit, die Proliferation von U87MG-Zellen zu inhibieren. Zusätzlich bindet Gint4.T spezifisch Tumorzellen und verbessert das Zell-Targeting des DOX@Apt-TDN-Komplexes. Somit können wir die Medikamenten-Targeting-Effizienz erhöhen und die systemische Verabreichungsdosis von Antitumor-Medikamenten reduzieren, um ihre systemischen Nebenwirkungen zu verhindern.

Schlussfolgerungen

Die Modifikation mit Gint4.T erhöhte die Spezifität und Effizienz von TDN in der Gliombehandlung durch Targeting des PDGFRβ, das in großen Mengen auf Gliomzellen exprimiert wird. Zusätzlich konnte es, wenn mit Apt-TDN beladen, die Anti-Gliom-Effekte von DOX signifikant fördern. Daher kann DOX@Apt-TDN als vielversprechende therapeutische Strategie gegen Gliom für Patienten dienen. Der Mangel dieser Studie ist, dass sie nur in vitro verifiziert wurde. In späteren Studien werden wir weitere Untersuchungen in Tiermodellen durchführen.